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Universidade Federal de Goiás Instituto de Ciências Biológicas Curso de Biomedicina Efeito da concentração de Substrato e Efeitos de concentração da Enzima Discente: Renata Marques De Souza Kran Goiânia 2017 Renata Marques De Souza Kran Efeito da concentração de Substrato e Efeitos de concentração da Enzima Relatório requerido pela disciplina de Bioquímica Ministrada pelo Professora: Rosália Santos Amorim Jesuino Goiânia 2017 3 Sumário 1 Introdução……………………........………………………………..04 2 Materiais e Métodos.........……………………….........................04 3 Resultados e Discussões…………………………………….......06 4 Conclusão........…………............................................................08 5 Referências bibliográficas…...……….......................................09 1 Introdução Enzimas são proteínas que catalisam uma reação química específica e em sua maioria são conjugadas, estando associadas a grupos não-protéicos. Sua atividade catalítica depende da conservação da sua estrutura original e qualquer variação nessa estrutura altera significativamente sua atividade. Uma característica comum de todas as enzimas é a presença e uma fenda em sua estrutura, formada principalmente por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos dentro dos quais se fixam o substrato. Certos resíduos de aminoácidos que são responsáveis pela interação estérica com o substrato e, portanto, pela especificidade do sistema, estão localizados nesta fenda, bem como os aminoácidos envolvidos no aspecto catalítico da reação. Na maioria dos casos estes resíduos são do tipo iônico e mais reativo. Além disso, a união dos íons precedentes da solução podem também cooperar na presença do substrato na catálise da reação. OBJETIVO Verificar a influência da concentração de substrato e da enzima na atividade enzimática. Determinar o valor de Km. . 2 Materiais e Métodos Materiais · Enzima invertase (0,1 mg proteína/mL). Observação: manter no gelo depois de descongelada. · Tampão acetato 0,05 M; pH 4,7 · Sacarose 0,01 M; 0,02 M; 0,05 M; 0,1 M; 0,2 M. · Reativo: ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) · Pipetas graduadas de 1 e 10 mL · Tubos de ensaio · Banho Maria · Espectrofotômetro Método: Seguir o protocolo abaixo: Reativos Tubos 1 2 3 4 5 6 Tampão acetato 0,05M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Água destilada (mL) 1,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Sacarose 0,01 M (4 mM) (mL) -- 1,0 -- -- -- -- Sacarose 0,02 M (8 mM) (mL) -- -- 1,0 -- -- -- Sacarose 0,05 M (20 mM) (mL) -- -- -- 1,0 -- -- Sacarose 0,1 M (40 mM) (mL) -- -- -- -- 1,0 -- Sacarose 0,2 M (80 mM) (mL) -- -- -- -- -- 1,0 Invertase 0,1 mg/mL (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Incubação: 25°C (temperatura ambiente) durante 5 minutos. ADNS (ácido 3,5-dinitrossalicílico) (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Aquecer a 100°C durante 5 minutos Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 RESULTADOS (Absorbância) 0,000 1,339 1,637 1,289 1,289 0,961 Resfriar os tubos. Homogeneizar. Ler as absorbâncias a 540 nm Procedimento para efeito de concentração da enzima Reativos Tubos 1 2 3 4 5 6 Tampão acetato 0,05 M pH 4,7 (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Água destilada (mL) 1,0 0,9 0,8 0,6 0,2 --- Sacarose 0,2 M (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Invertase 0,1 mg/mL (mL) -- 0,1 0,2 0,4 0,8 1,0 Incubação: 25°C (temperatura ambiente) durante 5 minutos ADNS (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Aquecer a 100°C durante 5 minutos Água destilada (mL) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 RESULTADOS (Absorbância) 0,016 0,103 0,189 0,258 0,386 0,637 Resfriar os tubos em bacia contendo gelo 3 Resultados e Discussões Tubo Absorbância Concentração de glicose (mg/mL) Como a solução foi diluída, calculou-se as reais concentrações de glicose em cada tubo: Quadro 4: Concentrações reais de glicose em cada tubo TUBO 2 (mg/mL) TUBO 3 (mg/mL) TUBO 4 (mg/mL) TUBO 5 (mg/mL) TUBO 6 (mg/mL) TUBO 7 (mg/mL) A partir das concentrações acima é possível calcular a velocidade da reação usando a seguinte relação: Com os dados de velocidade de formação de glicose, e sabendo-se a concentração de sacarose de cada tubo é possível construir o gráfico da velocidade de reação versus concentração de substrato (gráfico 3). Quadro 5: Concentrações de sacarose e as respectivas velocidades de formação Tubo Concentração de sacarose (g/L) Velocidade de formação de glicose (mg/min) Gráfico 2: Curva de substrato Vmáx e Km só podem ser calculados quando V0 é medida em função de várias concentrações de substrato. E para tal determinação é necessário que com estes valores proceda-se com uma transformação matemática denominada Lineweaver-Bürk, que consiste em inverter os dois lados da equação de Michaelis-Menten, dando origem a um gráfico de 1/V versus 1/[S], que é uma função do primeiro grau. A vantagem deste método é a determinação acurada de Vmáx e Km. Outra característica do gráfico de Lineweaver-Bürk é que quando a reta intercepta o eixo y tem-se o valor de 1/Vmáx e quando a reta intercepta o eixo x tem-se o valor de -1/Km. 4 Conclusão Nota-se uma eficiência catalítica admirável das enzimas devido ao seu alto grau de especificidade por seus substratos, acelerando reações químicas específicas. Observa-se que tais reações ocorrem em condições necessárias para que ocorra uma boa atividade da enzima, já que elas funcionam em condições suaves de temperatura e pH. Pôde-se verificar também que a velocidade da reação enzimática está relacionada com a concentração do substrato e que através da equação de Michaelis-Menten é possível descrever o comportamento cinético de grande maioria das enzimas. Vale ressaltar que o bom conhecimento da estrutura das enzimas e suas condições de funcionamento são de fundamental importância uma vez que a indústria farmacêutica utiliza os parâmetros de atividade enzimática para potencializar os efeitos dos medicamentos. 5 Referências bibliográficas CAMPBELL, Mary K. Bioquímica. 3 ed. Porto Alegre: Artes Médicas Sul, 2000. HOLME, David J; PECK, Hazel. Bioquímica Analítica. Zaragoza, Espanha: Editorial Acribia, 1987. LEHNINGHER, Arthur. et al. Princípios de Bioquímica. 2 ed. São Paulo: Sarvier Editora, 1995.
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