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modulação do UVB induzido por furocumarinas em staphylococcus aureus
ABSTRACT
as furocumarinas são compostos fotoativos capazes de cegarem para o DNA e, uma vez excitados pela luz UVA, são de fotoades- tutos que podem levar a mutagenicidade e letalidade. No entanto, os efeitos biológicos dos FCs combinados com a luz UVB ainda são pouco investigados. No presente estudo, o efeito letal da luz UVB isoladamente e combinado com diferentes concentrações de 8-metoxipsoralen ... foi avaliado em uma cepa de Staphylococcus aureus 8 MOP-UVB e TMP-UVB foram mais efetivos na indução de letalidade comparada com a UVB isolada, indicando que estes FCs atuam como agentes fotossensibilizantes para UVB. o aumento na concretização de TMP 8-MOP resultou em uma maior mortalidade. No contraty, um decréscimo na mortalidade foi encontrado com um aumento na concretização do TMP. 3-CPs protegeram as bactérias contra danos induzidos por UVB, o que pode ser atribuído à inibição da formação de dímeros de ciclobutil pirimidina. Os diferentes efeitos modulatórios na letalidade induzida por UVB, demonstrados pelos FCs testados, podem estar relacionados a diferenças na especificidade de cada composto para determinadas seqüências nucleodídicas, assim como outras características químicas de cada molécula podem influenciar o número e tipos de adutos formados, contribuindo aos efeitos de fotossensibilização ou fotoprotetores observados.
INTRODUÇAO 
As furocomarinas (FCs), uma classe importante de compostos fotoativos, são compostos tricíclicos naturais ou sintéticos formados pela fusão de um anel de furano com uma cumarina. As FCs na presença de UVA causam efeitos biológicos letais em uma variedade de sistemas celulares devido à sua fotorreatividade com o DNA e outras macromoléculas e componentes celulares.
  As reações fotoquímicas de FC de um complexo intermolecular pela intercalação de FC entre pares de bases de DNA; ap exposio a UVA, ligam-se covalentemente a bases de pirimidina na ligao dupla 5,6, formando monoaductos de 4 ', 5' furano ou 3,4 pirona-lina (MA). Em relação à FC bifuncional, como 8-metoxipsoraleno (8-MOP) e 4,5,8- trimethypsolaren (TMP), uma segunda reação fotoquímica, envolvendo uma pirimidina localizada na cadeia oposta em um par de bases adjacente, converte o MA de furano para inter-cross-links (CL). A MA do lado de pirone só é convertida em biaductos (BA) no comprimento de onda. o monofuncional F 3 -carbetoxipsolaren (3 CP) forma apenas MA do lado furano em vista da ligação dupla 3,4 bloqueada.
      O efeito de FCs em combinação com UVC foi estudado muito menos. Igali et al. descobriram que o tratamento com 8 MOP antes da irradiação UVC diminuiu o rendimento de mutantes prototróficos em Escherichia coli. Pontes e hass e webb mostraram que o dano de UVC. O mesmo efeito protetor foi demonstrado em Staphylococcus aureus não apenas para 8-MOP, mas também para TMP, 3 CPs e angelicina. Além disso, a letalidade por UVC é aumentada se o 8-MOP for reenviado no meio de placas pós-irradiação, devido à introdução de reparo de DNA.
    Os estudos do efeito de FCs em combinação com UVB são mais limitados a 8-MOP e questões de fototerapia, ou tratados tacitamente no curso de uma investigação de "espectros de ação". Para obter mais informações sobre este assunto, fomos solicitados a determinar o efeito de vários FCs em combinação com UVB em S. aureus.
MATERIAIS E METODOS 
2.1 MÉDIA DE BACIA E DE CULTURA BACTERIANA
A tensão ISP 255 de S. aureus, caracterizada fenotipicamente como proficiente no reparo do DNA, foi usada durante este trabalho. As células foram normalmente cultivadas em caldo de infusão de cérebro e coração.
2.2 FUROCOUMARINAS
8-MOP e TMP foram adquiridos da sigma-Aldrich Co; 3-CPs foi sintetizado pelo Dr. E. Bisagni e gentilmente fornecido pelo Dr. J.A.P. Henriques (faculdade federal do rio grad do sul, brasil). As soluções de strock dos FCs foram preparadas em etanol a 40%, etanol a 50% ou eyanol absoluto (TMP) e armazenadas no darlk a 4 GRAUS CELCIUS. Eles foram usados ​​nas seguintes concentrações; 0,02875. 0,0575. 0,115 e 0,23 mM.
2.3 TRATAMENTO COM FCs PLUS UVB LIGHT
   As bactérias foram cultivadas em BHI até reagirem à fase estacionária (18-24 h a 37 graus celcius) e ressuspensas em solução fisiológica a uma densidade de cerca de 10 * 5 ufc mL. Adicionou-se FC nas concentrações apropriadas e a suspensão foi incubada no escuro durante 20 min à temperatura ambiente. As células foram irradiadas à temperatura ambiente com UVB em uma placa de Petri aberta com sharking suave em um ambiente de luz amarela usando duas lâmpadas TL20W / 12RS philips emitindo principalmente a linha de 312 nm. A taxa de fluência foi de 13,3 W / m * 2, monitorada com um radiômetro Vilber Lourmat VLX-3W (fotocélula UVB). Uma suspeita bacteriana não contendo FC também foi irradiada. As doses de irradiação foram dadas cumulativamente usando a mesma suspensão bacteriana. Depois de cada irradiação. Alíquotas de 0,1 mL foram divididas em série, diluídas em soro fisiológico e propagadas em BAB. Após 24h de incubação a 37 graus celcius por 24 h, as colônias foram contadas e as taxas de sobrevivência calculadas (título bacteriano em um tempo de irradiação / título bacteriano no tempo 0). Nenhum dos FCs testados no escuro (em qualquer concentração usada por até 30 min) produziu morte celular significativa.
3.0 RESULTADOS
A fração de sobrevivência foi contra a dose. Todas as experiências foram realizadas em triplicado . O efeito letal causado pelas combinações 8-MOP-UVB apareceu na sensibilidade bacteriana à UVB. Em contraste, as bactérias mostraram uma maior sensibilidade à UVB em menor concentração de TMP, com uma redução gradual na sensibilidade à medida que a concentração desta FC foi aumentada. Os resultados indicam que os 3-CPs fornecem proteção em todas as concentrações testadas.
4.0 DISCUSSÃO
 Os resultados obtidos indicaram que 8-MOP e TMP atuam como agentes fotossensibilizantes para UVB. Comparando os resultados para 8-MOP-UVB apresentados aqui com os obtidos anteriormente com 8-MOP-UVA, foi observado um efeito letal mais alto para o tratamento com 8-MOP-UVB. Na ausência de FC (ou algum outro xenobiótico excitável por UV), UVA e UVB mostram efeitos diferentes nos sistemas celulares. O principal alvo da UVB é o DNA, enquanto a maioria dos eventos biológicos mediados pelo UVA são dependentes do oxigênio. Portanto, FCs-UVA e FCs -UVB provavelmente poderiam afetar a célula de diferentes maneiras, mas sem descartar algum mecanismo em comum para a inativação celular. FCs podem se ligar reversivelmente no escuro e de MA e BA no DNA após a exposição à radiação com um comprimento de onda superior a 300nm. Assim, o efeito fotossensibilizador demonstrado pelas combinações 8NOP-UVB e TMP-UVB pode ser atribuído ao acúmulo de MA e BA formado no DNA.
UVB, da mesma forma que um UVC, provoca a formação de dímeros de ciclobutilpirimidina (CPDs), cuja formação, pode ser inibida por FCs interligados, o que pode ser explicado após o tratamento com 8-MOP-UVB ou TMP-UVB é a reflexão de dois efeitos provocados pela FC: fotosensibilização, devido à inibição da formação de CPDs. No entanto, os resultados de contração obtidos entre 8-MOP-UVB e TMP-UVB, quando a cepa bacteriana foi tratada com diferentes concentrações de cada FC, poderiam ser explicados pela especificidade diferencial de intercalação das FCs twp para certas arestas nucleotídicas.
  O 8-MOP apresenta uma especificidade elevada para locais (AT) n, que são propensos a sofrer uma formação BA devido à proximidade de timoses em cadeias de ADN opostas. Tais sequências são importantes para a viabilidade celular, uma vez que estão frequentemente localizadas nos locais de origem de replicação, locais de integração, locais de recombinação e promotores de genes. Portanto, a intercalação preferencial de 8-MOP nessas esguichos biologicamente importantes pode resultar principalmente na formação de BA, que juntamente com MA e CPDs contribuem para a maior sensibilização da linhagem com aumento na concentraçãode 8-MOP, podendo ser que o reparo dessas lesões seria mais lento e mais complexo, resultando na maior mortalidade.
O aumento na concentração de TMP resultou em uma redução na sensibilidade das bactérias ao UVB. O TMP, assim como outros FCs metilados, apresenta alta reatividade com DNA e baixa especificidade para sítios fortes (ATs) n, mas é capaz de cegar para sítios contendo thymines adjacentes ou isoladas, que são considerados locais fracos ou não preferenciais para fotorreação de diferentes CFs com DNA. Neste caso, é possível que a redução na sensibilidade com aumento na concentração ocorra devido a uma maior inibição da formação de CPDs. Apesar da maior disponibilidade de moléculas para a intercalação, um menor número de BA será formado devido à baixa especificidade do TMP. para sites (AT) n.
Por outro lado, não podemos descartar a possibilidade de ligação de proteínas no escuro afeta a biodisponibilidade de uma determinada FC para intercalação em DNA. A constante de associação de complexação escura com proteína é muito alta para TMP protege contra UVC apenas em concentrações (resultados prévios não publicados).
    3-CPs têm baixa afinidade por DNA, ligando-se quase exclusivamente a sítios fortes. Dada a sua natureza monofuncional, devido à presença do grupo varbethoxy no carbono 3, este composto forma apenas 4 ', 5'-MA. Dall'acqua et al. Sugeriram que o 3,4-MA corresponde a 74-93% de todas as lesões de DNA após o tratamento com Uolar psolaren, enquanto que as lesões de 4 ', 5'-MA e BA são menos frequentes. O efeito fotoproctetor deste composto pode estar relacionado à inibição da formação de CPDs em locais importantes para a viabilidade celular, para sua incapacidade de BA, para o baixo número de MA induzido e para o reparo eficiente de MAs e CPDs remanescentes.
   Esses resultados fornecem evidências de que o 8-MOP e o TMP atuam como fortes agentes fotossensibilizantes para UVB, o que provavelmente está relacionado à sua capacidade tp de BA. Isso indica que combinações de FCs e UVB bifuncional podem ser usadas na terapia fotodinâmica de doenças de pele, como a psoríase. Por outro lado, em virtude do efeito fotoprotetor exercido pelas 3-CPs frente ao dano induzido pela UVB em S. aureus, seria interessante a realização de estudos utilizando outros sistemas biológicos, incluindo estudos in vivo para melhor visualização do potencial terapêutico da espécie. Combinação 3-CPs-UVB. 4.0 DISCUSSÃO
 Os resultados obtidos indicaram que 8-MOP e TMP atuam como agentes fotossensibilizantes para UVB. Comparando os resultados para 8-MOP-UVB apresentados aqui com os obtidos anteriormente com 8-MOP-UVA, foi observado um efeito letal mais alto para o tratamento com 8-MOP-UVB. Na ausência de FC (ou algum outro xenobiótico excitável por UV), UVA e UVB mostram efeitos diferentes nos sistemas celulares. O principal alvo da UVB é o DNA, enquanto a maioria dos eventos biológicos mediados pelo UVA são dependentes do oxigênio. Portanto, FCs-UVA e FCs -UVB provavelmente poderiam afetar a célula de diferentes maneiras, mas sem descartar algum mecanismo em comum para a inativação celular. FCs podem se ligar reversivelmente no escuro e de MA e BA no DNA após a exposição à radiação com um comprimento de onda superior a 300nm. Assim, o efeito fotossensibilizador demonstrado pelas combinações 8NOP-UVB e TMP-UVB pode ser atribuído ao acúmulo de MA e BA formado no DNA.
UVB, da mesma forma que um UVC, provoca a formação de dímeros de ciclobutilpirimidina (CPDs), cuja formação, pode ser inibida por FCs interligados, o que pode ser explicado após o tratamento com 8-MOP-UVB ou TMP-UVB é a reflexão de dois efeitos provocados pela FC: fotosensibilização, devido à inibição da formação de CPDs. No entanto, os resultados de contração obtidos entre 8-MOP-UVB e TMP-UVB, quando a cepa bacteriana foi tratada com diferentes concentrações de cada FC, poderiam ser explicados pela especificidade diferencial de intercalação das FCs twp para certas arestas nucleotídicas.
  O 8-MOP apresenta uma especificidade elevada para locais (AT) n, que são propensos a sofrer uma formação BA devido à proximidade de timoses em cadeias de ADN opostas. Tais sequências são importantes para a viabilidade celular, uma vez que estão frequentemente localizadas nos locais de origem de replicação, locais de integração, locais de recombinação e promotores de genes. Portanto, a intercalação preferencial de 8-MOP nessas esguichos biologicamente importantes pode resultar principalmente na formação de BA, que juntamente com MA e CPDs contribuem para a maior sensibilização da linhagem com aumento na concentração de 8-MOP, podendo ser que o reparo dessas lesões seria mais lento e mais complexo, resultando na maior mortalidade.
O aumento na concentração de TMP resultou em uma redução na sensibilidade das bactérias ao UVB. O TMP, assim como outros FCs metilados, apresenta alta reatividade com DNA e baixa especificidade para sítios fortes (ATs) n, mas é capaz de cegar para sítios contendo thymines adjacentes ou isoladas, que são considerados locais fracos ou não preferenciais para fotorreação de diferentes CFs com DNA. Neste caso, é possível que a redução na sensibilidade com aumento na concentração ocorra devido a uma maior inibição da formação de CPDs. Apesar da maior disponibilidade de moléculas para a intercalação, um menor número de BA será formado devido à baixa especificidade do TMP. para sites (AT) n.
Por outro lado, não podemos descartar a possibilidade de ligação de proteínas no escuro afeta a biodisponibilidade de uma determinada FC para intercalação em DNA. A constante de associação de complexação escura com proteína é muito alta para TMP protege contra UVC apenas em concentrações (resultados prévios não publicados).
    3-CPs têm baixa afinidade por DNA, ligando-se quase exclusivamente a sítios fortes. Dada a sua natureza monofuncional, devido à presença do grupo varbethoxy no carbono 3, este composto forma apenas 4 ', 5'-MA. Dall'acqua et al. Sugeriram que o 3,4-MA corresponde a 74-93% de todas as lesões de DNA após o tratamento com Uolar psolaren, enquanto que as lesões de 4 ', 5'-MA e BA são menos frequentes. O efeito fotoproctetor deste composto pode estar relacionado à inibição da formação de CPDs em locais importantes para a viabilidade celular, para sua incapacidade de BA, para o baixo número de MA induzido e para o reparo eficiente de MAs e CPDs remanescentes.
   Esses resultados fornecem evidências de que o 8-MOP e o TMP atuam como fortes agentes fotossensibilizantes para UVB, o que provavelmente está relacionado à sua capacidade tp de BA. Isso indica que combinações de FCs e UVB bifuncional podem ser usadas na terapia fotodinâmica de doenças de pele, como a psoríase. Por outro lado, em virtude do efeito fotoprotetor exercido pelas 3-CPs frente ao dano induzido pela UVB em S. aureus, seria interessante a realização de estudos utilizando outros sistemas biológicos, incluindo estudos in vivo para melhor visualização do potencial terapêutico da espécie. Combinação 3-CPs-UVB.