Introdução às Análises Bioquimicas - 2019

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MARIA GORETTI RODRIGUES DE QUEIROZ
TIAGO LIMA SAMPAIO
- 2019 -
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS
AULA PRÁTICA
(INTRODUÇÃO ÀS ANÁLISES BIOQUÍMICAS)
MATERIAL DE LABORATÓRIO
PONTEIRAS AMARELAS (1-200µL) E AZUIS (200-1000µL)
PIPETAS
TUBOS DE ENSAIO
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.panreac.com/new/esp/productos/images/vtilab/1519.jpg&imgrefurl=http://www.panreac.com/new/esp/productos/vitlab02.htm&h=272&w=355&sz=26&hl=pt-BR&start=3&tbnid=gGx1XPLnl3-RqM:&tbnh=93&tbnw=121&prev=/images?q=pipetas+graduadas&gbv=2&hl=pt-BR
PIPETAS
VIDRO AUTOMATIZADAS
VOLUME FIXO
VOLUME AJUSTÁVEL
UNIDADES DE VOLUME
(MICROLITROS OU MILILITROS?)
1mL = 1000µL
0,5mL = 500µL
0,2mL = 200µL
….
Para transformar mL em µL basta
multiplicar por 1.000
APARELHOS E EQUIPAMENTOS 
MICROSCÓPIO
AGITADOR
CENTRÍFUGA
ESPECTROFOTÔMETRO 
MANUAL
ESPECTROFOTÔMETRO 
SEMI- AUTOMÁTICO
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http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.biociclo.com.br/phoenix/imagens/ap56.jpg&imgrefurl=http://www.biociclo.com.br/phoenix/phoenix_agitadores.html&h=331&w=377&sz=17&hl=pt-BR&start=4&tbnid=rUZrTQ9qS-KDgM:&tbnh=107&tbnw=122&prev=/images?q=agitador+de+tubos&gbv=2&hl=pt-BR&sa=X
TIPOS DE AMOSTRA
❖ URINA: aleatória, 1ª da manhã, 24h
❖ SANGUE: sangue total, soro, plasma
❖ LÍQUOR, LÍQUIDO SINOVIAL, LÍQUIDO PLEURAL
SANGUE URINA
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ufrgs.br/hcv/lacvet/avestruz_edtacitrato1.JPG&imgrefurl=http://www.jornallivre.com.br/72980/hematologia-a-contagem-de-plaquetas-tambem-e-realizada-na-camara-de-neubauer.html&h=425&w=308&sz=26&hl=pt-BR&start=2&tbnid=WgcOciA_EzpmcM:&tbnh=126&tbnw=91&prev=/images?q=tubo+de+sangue&gbv=2&hl=pt-BR
METODOLOGIAS FOTOMÉTRICAS
❖ NEFELOMETRIA
Medição do desvio da luz por uma solução contendo
complexos imunológicos (IgA, IgG, IgM).
❖ TURBIDIMETRIA
Medição da diminuição da luz ao passar por um complexo
antígeno-anticorpo (Ex: microalbuminúria).
•Ambas são utilizadas para detecção de partículas maiores,
utilizam complexos antígeno-anticorpo.
❖ESPECTROFOTOMETRIA
ESPECTROFOTOMETRIA
Grande parte dos métodos utilizados em bioquímica clínica 
são baseados na medida quantitativa da absorção de luz 
pelas soluções.
A concentração de uma substância em solução é 
proporcional à quantidade de luz absorvida.
Partes de um espectrofotômetro:
✓Fonte de radiação (luz incandescente);
✓Amostra (em tubos de ensaio ou cubetas);
✓Detector (sensível à radiação).
ESPECTROFOTOMETRIA
UV – DEUTÉRIO
VISÍVEL - TUGSTÊNIO
NEFELOMETRIA/ TURBIDIMETRIA
ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotômetro: é um aparelho que faz passar um feixe de luz
monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz
que foi absorvida ou dispersa por essa solução.
REDUÇÃO DE
TRANSMISSÃO
DE LUZ
A quantidade de radiação absorvida pode ser medida de diversas formas: 
Transmitância T = P / P0
Absorbância A = - log10 T
ESPECTROFOTOMETRIA
ESPECTROFOTOMETRIA
A Lei de Lambert - Beer
A absorbância é proporcional à concentração da
espécie química absorvente, sendo constantes:
✓o comprimento de onda,
✓a espessura atravessada pelo feixe luminoso
Verifica-se uma relação linear entre absorbância e
concentração, e de uma relação logarítmica entre
transmitância e concentração (A = - log10 T).
ENTENDENDO A LEI DE LAMBERT-BEER...
solução 10g/L
Io IT1
solução 20g/L
IT2Io
feixe de luz de
intensidade Io
SOLUÇÕES DE 
CONCENTRAÇÕES 
DISTINTAS
↑ absorbância
↓ absorbância
ENTENDENDO A LEI DE LAMBERT-BEER...
0 0.1M 0.2M 0.4M 0.5M0,3M
Menor 
concentração
Maior
concentração
E = Absortividade
c = concentração
l = distância
DILUIÇÕES
✓ Amostras lipêmicas
✓Perda da linearidade
Limite de linearidade = limite de 
concentração para o qual a lei de 
lambert beer é válida
APRENDENDO UM POUCO 
SOBRE AS CORES...
De acordo com o comprimento de onda tem-se a luz:
✓ UV (<380nm);
✓ Visível (380 – 750nm);
✓ Infravermelha (>750nm).
ESPECTROFOTOMETRIA
Cores Intervalos de comprimento de onda
Ultravioleta (não visível) < 380nm
Violeta 380 a 450nm
Azul 450 a 500nm
Verde 500 a 570nm
Amarela 570 a 590nm
Alaranjada 590 a 620nm
Vermelha 620 a 750nm
Infravermelha 750 a 2000nm
INTERVALOS DE COMPRIMENTO DE ONDA
Cores Complementares: 
1. O vermelho é complementar do verde. 
2. O azul é complementar do laranja. 
3. O amarelo é complementar do violeta. 
ESTUDO DAS CORES
SORO
Obtido sem 
anticoagulantes
Necessário esperar 
entre 30-180min para 
formação do coágulo e 
completa obtenção do 
soro
Não contém 
fibrinogênio
PLASMA
Obtido com 
anticoagulantes
Não ocorre a 
coagulação, centrifuga-
se imediatamente.
Contém fibrinogênio
TUBOS DE COLETA À VÁCUO
A ESCOLHA DO TUBO CORRETO DEPENDERÁ DA 
ANÁLISE A SER REALIZADA
1) EDTA – ácido etileno-diamino-tetra-acético
(tampa roxa):
✓Nome comercial: sequestrene
✓É o mais utilizado na rotina hematológica
✓Proporção 0,1mL para 5mL de sangue (não há alterações
morfológicas)
✓Possui dois radicais ácidos que reagem com o cálcio
plasmático, formando um quelato insolúvel.
2) Fluoreto de sódio (tampa cinza):
✓Determinação da glicose;
✓Impede o metabolismo desse açúcar pelas hemácias e
leucócitos, através da inibição in vitro das enzimas da via
glicolítica dessas células.
✓Forma sais insolúveis ao se ligar com o cálcio
plasmático, impedindo a formação de coágulos
✓Preserva a glicose por até 8hs
TUBOS DE COLETA À VÁCUO
3) Heparina (tampa verde): 
✓ Nome comercial: liquemine (obtido de mastócitos de
camundongos) – mucopolissacarídeo.
✓ Gasometria e algumas determinações bioquímicas;
✓Age inibindo a ativação do fator IX e ativa a antitrombina
III que então inibe a atividade de vários fatores da
coagulação, incluindo a trombina.
✓Não é indicado para o hemograma pois altera a
morfologia das células.
TUBOS DE COLETA À VÁCUO
4) Citrato de sódio (tampa azul): 
✓ Testes de coagulação (TAP – via extrínseca,
TTPA – via intrínseca) pois preserva os fatores V e
VIII;
✓É quelante de cálcio formando sais insolúveis
✓Inibe a atividade da fosfatase alcalina e amilase
TUBOS DE COLETA À VÁCUO
5) Sem anticoagulante (tampa vermelha):
✓Determinações bioquímicas e testes sorológicos
✓Obtenção do soro.
6) Sem anticoagulante com gel (tampa amarela ou
vermelha e amarela):
✓Determinações bioquímicas, sorologia, marcadores 
cardíacos, hormônios;
✓Obtenção do soro.
✓Camada de gel entre soro e coágulo
TUBOS DE COLETA À VÁCUO
ORDEM DA COLETA
Tubo para hemocultura 
Tubo com citrato (coagulação)
Tubo com ativador de coágulo c/ ou 
s/ gel separador (soro)
Tubo com heparina
Tubo com EDTA (hemograma)
Tubo com fluoreto de sódio (glicose)
Sequência correta 
baseada na CLSI 
(Collection of Diagnostic
Blood Specimen)
Empresas podem 
preconizar uma 
seqüência distinta!
ORDEM DA COLETA
Tubo para hemocultura 
Tubo sem ativador de coágulo c/ ou 
s/ gel separador (soro)
Tubo com citrato (coagulação)
Tubo com heparina (plasma)
Tubo com EDTA (hemograma)
Tubo com fluoreto de sódio (glicose)
Ex: Sequência correta de 
acordo com o fabricante 
VACUETTE®
Reações colorimétricas
Exemplo
TIPOS DE REAÇÕES 
REAÇÕES 
DE PONTO 
FINAL REAÇÕES 
CINÉTICAS
• DE TEMPO FIXO
• CONTÍNUA
• DE DOIS TEMPOS
TIPOS DE REAÇÕES 
REAÇÕES DE PONTO FINAL
São reações cuja concentração máxima do produto, quando
atingida, permanece inalterada por um determinado tempo
(ex: 60min, 30 min..).
A estabilidade do produto formado está diretamente
relacionada às características dos reagentes utilizados na
reação. Podem ser colorimétricas (TG, CT,GL, UR, AU) ou
ultravioletas (Fosfato UV, URÉIA UV).
REAÇÕES CINÉTICAS
Classificação:
✓De tempo fixo, contínua e de dois tempos.
A velocidade da formação do produto é medida durante um
intervalo de tempo pré-estabelecido pelo fabricante, que pode
ser em horas, minutos ou segundos.
Em alguns casos a formação do produto está diretamente
relacionada à temperatura. Devem ser realizadas
preferencialmente em aparelhos que possuam cubetas
termostatizadas, a fim de se obter resultados mais precisos.
TIPOS DE REAÇÕES 
CLASSIFICAÇÃO DAS REAÇÕES 
CINÉTICAS
De tempo fixo: a velocidade de formação do
produto é medida durante um intervalo de tempo
fixo. São semelhantes às reações de ponto final, ou
seja, a velocidade de formação do produto é medida
após um tempo fixo, em que a reação enzimática é
interrompida, adicionando um reagente próprio.
Contínua: a velocidade da reação é medida em
intervalos de tempo pré-estabelecidos.
(no mínimo 3 intervalos).
CLASSIFICAÇÃO DAS REAÇÕES 
CINÉTICAS
De dois tempos: é uma variação da reação
cinética contínua. Nesses casos, faz-se uma leitura
em 30s e outra em 90s. Para calcular a [ ] do
analito, emprega-se o ΔA obtido entre as leituras
fotométricas entre C-B ou D-C. Serve para
diminuir o tempo de reação e a influência de
interferentes, como é o caso da creatinina.
CLASSIFICAÇÃO DAS REAÇÕES 
CINÉTICAS
EXEMPLO PRÁTICO!
Kit de AST 
cinético de ponto 
final.
Duração do teste: 
cerca de 1h e 30 
min.
Kit de AST 
cinético.
Duração do teste: 
cerca de 5 
minutos.
Como escolher entre um kit de reação de ponto final e cinético??
SITUAÇÃO: Determinação bioquímica de AST/TGO de 200 amostras
200 em 1h e 30min. 200 em 16,7h
BRANCO X PADRÃO
CÁLCULOS
❖ Absorbância do padrão = 0,36
❖ Concentração do padrão = 100mg/dL
❖ Absorbância da amostra desconhecida = 0,40
❖ Concentração da amostra desconhecida = ????
0,36 --------- 100mg/dL
0,40 ---------- X
X = 0,40 x 100  100 (fator)
0,36 0,36
X = 111,0 mg/dL
BRANCO E PADRÃO
Dúvidas?