Aula 02 - Extração de DNA

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AULA 02
EXTRAÇÃO DE DNA
Profº Dr. Rodrigo de Oliveira
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
ESTRUTURA DA CÉLULA
O QUE ACONTECE DENTRO DA CÉLULA?
CÉLULA EUCARIONTE CÉLULA PROCARIONTE
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
ESTRUTURA DA CÉLULA
O QUE ACONTECE DENTRO DA CÉLULA?
REAÇÕES METABÓLICAS
METABOLISMO DE NUCLEOTÍDEOS
NUCLEASES
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
ESTRUTURA DA CÉLULA
O QUE ACONTECE DENTRO DA CÉLULA?
NUCLEASES
• Desoxirribonucleases (DNases)
• Ribonucleases (RNases)
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
ESTRUTURA DA CÉLULA
O QUE ACONTECE DENTRO DA CÉLULA?
CÉLULA EUCARIONTE CÉLULA PROCARIONTE
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
ESTRUTURA DA CÉLULA
O QUE ACONTECE DENTRO DA CÉLULA?
CÉLULA EUCARIONTE CÉLULA PROCARIONTE
COMO EXTRAIR O 
DNA?
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
MEMBRANA PROTEÍNAS ESTRUTURAIS NUCLEASES
QUAL O PRIMEIRO PASSO?
Romper a célula! (lise celular)
• Temperatura: Nitrogênio líquido.
• Mecânica: Equipamentos, “esferas”
• Enzimática: Digestão
• Detergentes: SDS (Dodecil sulfato de sódio)
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
MEMBRANA PROTEÍNAS ESTRUTURAIS NUCLEASES
QUAL O SEGUNDO PASSO?
BLOQUEIAR AS NUCLEASES! 
• Tris-HCl pH 8,0 (Tampão)
• EDTA: Substância Quelante.
• Proteinase
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
MEMBRANA PROTEÍNAS ESTRUTURAIS NUCLEASES
E AGORA? O QUE FAZER?
PURIFICAR O DNA!
• Fenol: Desnaturação de proteínas
• Clorofórmio: Desnaturação de proteínas 
• Alcool Isoamílico: Evita formação de espuma.
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
MEMBRANA PROTEÍNAS ESTRUTURAIS NUCLEASES
E AGORA? O QUE FAZER?
PURIFICAR O DNA!
• Fenol: Desnaturação de proteínas
• Clorofórmio: Desnaturação de proteínas 
• Alcool Isoamílico: Evita formação de espuma.
FENOL:CLOROFÓRMIO: ALCOOL ISOAMÍLICO
(25:24:1)
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
MEMBRANA PROTEÍNAS ESTRUTURAIS NUCLEASES
E AGORA? O QUE FAZER?
PURIFICAR O DNA!
• Fenol: Desnaturação de proteínas
• Clorofórmio: Desnaturação de proteínas 
• Alcool Isoamílico: Evita formação de espuma.
FENOL:CLOROFÓRMIO: ALCOOL ISOAMÍLICO
(25:24:1)
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
MEMBRANA PROTEÍNAS ESTRUTURAIS NUCLEASES
E AGORA? O QUE FAZER?
PURIFICAR O DNA!
• Fenol: Desnaturação de proteínas
• Clorofórmio: Desnaturação de proteínas 
• Alcool Isoamílico: Evita formação de espuma.
FENOL:CLOROFÓRMIO: ALCOOL ISOAMÍLICO
(25:24:1)
CENTRIGUFAÇÃO DIFERENCIAL
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
MEMBRANA PROTEÍNAS ESTRUTURAIS NUCLEASES
E AGORA? O QUE FAZER?
PURIFICAR O DNA!
• Fenol: Desnaturação de proteínas
• Clorofórmio: Desnaturação de proteínas 
• Alcool Isoamílico: Evita formação de espuma.
FENOL:CLOROFÓRMIO: ALCOOL ISOAMÍLICO
(25:24:1)
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
MEMBRANA PROTEÍNAS ESTRUTURAIS NUCLEASES
E AGORA? O QUE FAZER?
PURIFICAR O DNA!
• Fenol: Desnaturação de proteínas
• Clorofórmio: Desnaturação de proteínas 
• Alcool Isoamílico: Evita formação de espuma.
FENOL:CLOROFÓRMIO: ALCOOL ISOAMÍLICO
(25:24:1)
FASE ORGÂNICA
FASE AQUOSA
INTERFASE
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
MEMBRANA PROTEÍNAS ESTRUTURAIS NUCLEASES
E AGORA? O QUE FAZER?
PURIFICAR O DNA!
• Fenol: Desnaturação de proteínas
• Clorofórmio: Desnaturação de proteínas 
• Alcool Isoamílico: Evita formação de espuma.
FENOL:CLOROFÓRMIO: ALCOOL ISOAMÍLICO
(25:24:1)
AULA 03
EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
MEMBRANA PROTEÍNAS ESTRUTURAIS NUCLEASES
FENOL:CLOROFÓRMIO: ALCOOL ISOAMÍLICO
(TAMPONADO A PH 8,0)
FASE ORGÂNICA
FASE AQUOSA
• Menor que pH 8,0 : 
• DNA fica na interfase
• Maior que pH 7,0: 
• DNA desnatura e fica na fase orgânica.
INTERFASE
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EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
E AGORA? O QUE FAZER?
PURIFICAR O DNA!
• Fenol: Desnaturação de proteínas
• Clorofórmio: Desnaturação de proteínas 
• Alcool Isoamílico: Evita formação de espuma.
FENOL:CLOROFÓRMIO: ALCOOL ISOAMÍLICO
(25:24:1)
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EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO DE DNA
E AGORA? JÁ ACABOU?
PRECIPITAR O DNA!
• Etanol absoluto
• Acetato de sódio
CENTRIGUFAÇÃO DIFERENCIAL
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EXTRAÇÃO DE DNA
E AGORA? JÁ ACABOU?
PRECIPITAR O DNA!
• Etanol absoluto
• Acetato de sódio
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EXTRAÇÃO DE DNA
CUIDADOS COM O DNA
• ARMAZENAMENTO: 
• Tris-HCl pH 8,0 (Tampão)
• Baixas temperatura
• VERIFIQUE A QUALIDADE DA EXTRAÇÃO: 
• Quantidade
• Pureza
• Integridade.