Aula Citogenetica - I

Prévia do material em texto

1. Porque não se amplifica (ou se replica) todo o genoma de um organismo 
durante a PCR?
2. A enzima helicase rompe as pontes de hidrogênio durante a replicação, 
quem realiza essa função durante a PCR?
3. Qual o motivo de se utilizar a enzima Taq polimerase e não uma outra DNA 
polimerase qualquer?
4. Na PCR utilizamos primers (iniciadores) obtidos a partir de sequências de 
DNA já conhecidas, empresas habilitadas confeccionam esses elementos. Na 
célula viva ocorre essa etapa? Quem produz os primers?
Questões
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=J_CjF1geLSrw0M&tbnid=kWXKeYTY7oowTM:&ved=0CAUQjRw&url=http://flaviobiologo.blogspot.com/2012/10/charge-sobre-dna.html&ei=Vu8uUc7JOJL08ASyyIDYDA&psig=AFQjCNG6nFXiBePIriJVX30BMbxar07jVQ&ust=1362116801769119
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=J_CjF1geLSrw0M&tbnid=kWXKeYTY7oowTM:&ved=0CAUQjRw&url=http://flaviobiologo.blogspot.com/2012/10/charge-sobre-dna.html&ei=Vu8uUc7JOJL08ASyyIDYDA&psig=AFQjCNG6nFXiBePIriJVX30BMbxar07jVQ&ust=1362116801769119
Introdução a Citogenética
Mutações
Afetam a 
sequência 
de um gene
Gênica
Alteração de 
número
Alteração de 
estrutura
Cromossômica
Efeito da mutação depende da REGIÃO 
ACOMETIDA
• Cariótipo é o conjunto de cromossomos dentro do núcleo de uma
célula.
Podem ser observados durante a metáfase na sua forma duplicada e condensada.
Cariótipo
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=s1ZAQg9ASuC3tM&tbnid=GeYb1u9r1g86VM:&ved=0CAUQjRw&url=http://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/practiques_on-line/cariotips/nous_cariotips/metodes/giemsaStain1.html&ei=Pl9xUqjVD9O3sASo2YGYCg&bvm=bv.55617003,d.eW0&psig=AFQjCNGcD7Y5eVmJMRCm4Y2RDkYZo-xk4g&ust=1383248028703297
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=s1ZAQg9ASuC3tM&tbnid=GeYb1u9r1g86VM:&ved=0CAUQjRw&url=http://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/practiques_on-line/cariotips/nous_cariotips/metodes/giemsaStain1.html&ei=Pl9xUqjVD9O3sASo2YGYCg&bvm=bv.55617003,d.eW0&psig=AFQjCNGcD7Y5eVmJMRCm4Y2RDkYZo-xk4g&ust=1383248028703297
• 46 cromossomos
• Metacêntricos, Sub-metacêntricos e Acrocêntricos
Cariótipo
ISCN (international system for 
cytogenetic nomenclature)
Braço p / q
Centrômero = p10 / q10
Xp22.3
Número cromossomo
Braço
Região
Banda
Sub-banda
Cromossomo: nomenclatura
Autossomos: 
Divididos em 7 grupos
Sexuais
Os cromossomos
• Normal: 46, XX ou 46, XY
• Alterações cromossômicas
– Alterações estruturais: Balanceadas e Não Balanceadas
– Alterações numéricas
• Euploidias: inviáveis
• Aneuploidias: Trissomias (autossomos e sexuais) e Monossomia X.
• Erros de segregação durante a MEIOSE
– Formação de gameta com 24 ou 22 cromossomos.
Cariótipo
• Alterações no cariótipo  ANOMALIAS CROMOSSÔMICAS
– Anomalias Numéricas
• Erros na separação entre cromossomos na meiose, resultando 
em alterações numéricas de cromossomos nos gametas
– Anomalias Estruturais 
• Erros no processo de crossing over, resultando em deleções 
parciais: perda de parte de cromossomos
A estabilidade do número e da estrutura dos cromossomos é fundamental para
que o desenvolvimento ocorra de maneira correta. Como os genes estão
dispostos nos cromossomos, qualquer modificação pode alterar a
expressão gênica, produzindo um indivíduo fenotipicamente inviável ou
anormal.
Cariótipo
• As alterações cromossômicas geram modificação na expressão
gênica (aumento ou diminuição) Síndromes
– Causa de 42% dos abortos espontâneos
– Incidência de 1/140 nascidos vivos em um estudo com 100 mil
nascidos vivos
– Consequências dependem de:
• Natureza da alteração (numérica, estrutural, gene único)
• Desequilíbrio resultante
• Genes afetados
• Probabilidade de transmissão
– Em geral, a perda é pior que ganho (monossomias autossômicas:
inviáveis!)
Anomalias cromossômicas
• Euploidias: conjunto(s) haploide a mais (indivíduos 3n ou 4n)
A triploidia é a aberração mais frequente
em abortamentos de primeiro trimestre.
Anomalias numéricas
Incompatível com a vida
• Euploidias: múltiplos de 46
(inviáveis)
– Triploidia: origem materna
(incorporação do
corpúsculo polar; paterna
(dois espermatozoides)
• 69, XXX ou XXY ou XYY
– Tetraploidia: endomitose
(erro na clivagem do
zigoto)
• 92, XXXX ou XXXY
Anomalias numéricas
• Aneuploidias: número de cromossomos a mais não são relacionados
ao conjunto haploide.
Erros na meiose
50% de abortamentos 
espontâneos
Origem materna mais frequente 
relação com idade materna avançada
Anomalias numéricas
– Monossomias
• Autossômicas: incompatíveis
• 45, X – Síndrome de Turner
Anomalias numéricas
Orientação do
cinetócoro
Alteração do 
fuso mitótico
 Falhas na
recombinação
Anomalias numéricas
• Puderam ser observadas com o
advento das técnicas de bandeamento
• Algumas são muito pequenas e devem
ser diagnosticadas por Citogenética
molecular
• Podem ocorrer em mosaico
• Balanceadas X não balanceadas
Anomalias estruturais
Defeitos no 
processo de 
Crossing-over
Anomalias estruturais
• Não Balanceadas vs. Balanceadas
• Monossomia: um dos cromossomos do par não está presente
As monossomias 
dos cromossomos 
autossômicos não 
são compatíveis 
com a vida.
Anomalias numéricas: 
Síndrome de Turner
 Aneuploidias
 Trissomias – um cromossomo a mais que o par normal –
5% das gestações
▪ Principais: 18, 21, 13, X e Y
▪ Ex. 47, XX, +21
▪ Ex. 47, XY, +18
 Tetrassomias/pentassomias
▪ Autossômicas: incompatíveis
▪ Sexuais: inativação de todos os X menos 1
▪ Ex. 49, XXXXY – Síndrome de Klinefelter (variação)
Anomalias numéricas
• Trissomia: aneuploidias em que a constituição cromossômica tem um
cromossomo a mais (terceiro em relação ao seu par normal).
Situação mais 
comum de distúrbios 
cromossômicos 
humanos, ocorrendo 
em 
aproximadamente 
5% de todas as 
gestações 
conhecidas.
Anomalias numéricas
• Trissomia do cromossomo 21
Ex. 47, XX, +21
Anomalia mais comum
em nascidos vivos
(1:730) e a maior causa
de retardo mental
devido a anomalia
cromossômica.
Anomalias numéricas: 
Síndrome de Down
46 cromossomos
Metacêntricos
Sub-metacêntrico
Acrocêntrico
Após coloração 
adquirem um padrão 
de bandas –
CORANTE GIEMSA
(bandas G ou GTG)
Os cromossomos
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=s1ZAQg9ASuC3tM&tbnid=GeYb1u9r1g86VM:&ved=0CAUQjRw&url=http://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/practiques_on-line/cariotips/nous_cariotips/metodes/giemsaStain1.html&ei=Pl9xUqjVD9O3sASo2YGYCg&bvm=bv.55617003,d.eW0&psig=AFQjCNGcD7Y5eVmJMRCm4Y2RDkYZo-xk4g&ust=1383248028703297
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=s1ZAQg9ASuC3tM&tbnid=GeYb1u9r1g86VM:&ved=0CAUQjRw&url=http://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/practiques_on-line/cariotips/nous_cariotips/metodes/giemsaStain1.html&ei=Pl9xUqjVD9O3sASo2YGYCg&bvm=bv.55617003,d.eW0&psig=AFQjCNGcD7Y5eVmJMRCm4Y2RDkYZo-xk4g&ust=1383248028703297
Autossomos: 
Divididos em 7 grupos
Sexuais
Os cromossomos
 Autossomos/sexuais
 Numéricas
▪ Euploidias
▪ Aneuploidias 
 Estruturais
▪ Não balanceadas
▪ Balanceadas
▪ Genes únicos
▪ Dominantes 
▪ Recessivas
▪ Ligadas ao X/Y
Tipos de alterações cromossômicas
• Euploidias
– Incorporação de corpúsculo polar (triploidia)
– Falha na primeira divisão mitótica (tetraploidia)
• Aneuploidia
– Erros na meiose
• 45, X; +16; +21.
– Erros na mitose
• Mosaicos
– Origem predominante materna!!!
Causas
Mitose - fases
Estudo de Caso
1) Trata-se de um cariótipo de 
menina ou menino?
2) 20 Podemos representar este 
cariótipo por:
a) 46,XX
b) 47, XX
c) 47, XY
d) 47, XX+18
e) 47, XY+18
3) O cariótipo acima:
a)É normal
b)possui anomalia estrutural
c)Possui anomalia numérica
4) O cariótipo acima representa: 
a)Uma triploidia
b)Uma trissomia
c)Uma tricrossomia
5) Quala diferença entre triploidia e trissomia?
6) Responda as questões abaixo:
a)Qual o nome da síndrome?
b)Quais alterações morfológicas caracterizam a síndrome?
c)O exame pré-natal pode detectá-lo? Em que mês de gestação?
d)Qual a frequência de nascimentos de crianças com esta síndrome?
e)Qual a expectativa de vida destes indivíduos?
f) O que uma mãe pode fazer estando grávida de uma criança com esta síndrome?
g)Trata-se de uma euploidia ou aneuploidia?
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=trissomia&source=images&cd=&cad=rja&docid=5pgfsIIOq6jRjM&tbnid=DFpMMIxMpaVogM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.virtual.epm.br/cursos/genetica/htm/t18.htm&ei=KshAUarZBI_c8ATmuoCoCQ&bvm=bv.43287494,d.eWU&psig=AFQjCNEY_pPVfwMNclP6EIyZGu-x0_Jf3Q&ust=1363286419289643
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=trissomia&source=images&cd=&cad=rja&docid=5pgfsIIOq6jRjM&tbnid=DFpMMIxMpaVogM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.virtual.epm.br/cursos/genetica/htm/t18.htm&ei=KshAUarZBI_c8ATmuoCoCQ&bvm=bv.43287494,d.eWU&psig=AFQjCNEY_pPVfwMNclP6EIyZGu-x0_Jf3Q&ust=1363286419289643
2º anomalia mais comum em 
nascidos vivos.
Anomalias numéricas: 
Síndrome de Edwards
• Trissomia do cromossomo 18
Ex. 47, XX, +18
Técnicas de cultura e 
bandeamento
Introdução...
• Pacientes pré ou pós-natal
• Vários tecidos podem ser usados
– Tumores, 
– Medula óssea
– Sangue 
– Líquido amniótico (amniocentese 15ª -
20ª semana)
• Tecidos: baixa taxa de mitose
• Céls em suspensão X céls aderidas
Regras gerais
• ASSEPSIA durante todo o processo
• Meio de cultura adequado
• Ambiente apropriado para trabalho
– Capela de fluxo laminar
• Produtos estéreis descartáveis
• Estufa de CO2/O2
Cultura de sangue periférico
• Ampla utilização
• Coleta em seringa estéril com heparina
• 10-15 gotas em 5 mL de meio de cultura
• Meio de cultura RPMI 1640 por 72h
– Add: agente mitótico – Fitohemaglutinina !!!
colchicina 
Interrupção da mitose
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=SYAa2H5m0g7-MM&tbnid=_6cXNoIV9SqerM:&ved=0CAUQjRw&url=http://team6cell.pbworks.com/w/page/20044055/Mitosis&ei=_5V6UuHkBI2ekQe5g4DgCw&bvm=bv.55980276,d.eW0&psig=AFQjCNFn2FYcvH9JwiQQXM4WZ08FpUvGUg&ust=1383851887960853
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=SYAa2H5m0g7-MM&tbnid=_6cXNoIV9SqerM:&ved=0CAUQjRw&url=http://team6cell.pbworks.com/w/page/20044055/Mitosis&ei=_5V6UuHkBI2ekQe5g4DgCw&bvm=bv.55980276,d.eW0&psig=AFQjCNFn2FYcvH9JwiQQXM4WZ08FpUvGUg&ust=1383851887960853
Choque hipotônico
• Add solução de KCl 0,075 M
• Fixar com Solução Carnoy (metanol:ácido 
acético, 3:1)
BANDEAMENTO
• 1900s...
– Cromossomos corados Giemsa e Orceína
– Baixa resolução
– Diagnóstico máximo de aneuploidias (alterações numéricas)
• Técnicas
– Bandeamento
• Q, G, R, C, RON, DAPI/DA etc.
• Mais recentes
– Detecção de alterações
estruturais
Técnicas
• Bandeamento G - Giemsa
– Ampla utilização
– Utiliza tripsina (Bandeamento GTG)
– Bandas escuras (A/T) – Genes pouco ativos (heterocromatina) ; Bandas 
claras (C/G) – Genes muito ativos (eucromatina) 
– Bandas Claras – maior importância!!!
GTG-BANDDING
Preparo G-bandding
• Cultivas células com PHA; Após 72 h...
• Add colchicina 30 – 90 min
• Transferir toda cultura para tubo cônico e centrifugar
• Add solução hipotônica KCl
• Fixar (metanol:ac. acÉtico)
• Preparar lâmina
– Pingar 2 gotas e esperar secar (30’ – 24h)
• Corar
Preparo G-bandding
A suspenssão de células é centrifugada por 5 min
Preparo G-bandding
O meio é aspirado e as células recuperadas em 5 mL de solução hipotônica
Preparo G-bandding
Incubadas por 20 min 37 oC 
Preparo G-bandding
O fixador é adicionado lentamente à solução de KCl
Preparo G-bandding
A suspenssão de células é centrifugada por 5 min, recuperadas novamente em 
fixador e congeladas a -20 oC 12 horas.
Preparo G-bandding
Todo fixador é removido
Preparo G-bandding
As células são recuperadas em 1 mL de fixador “fresco”
Preparo G-bandding
Duas gotas da suspensão são depositadas em uma lâmina (necessário deixar 
secar 12 horas a 60 oC ou 30 min a 180 oC) 
Preparo G-bandding
Preparo G-bandding
Submeter ao tratamento com tripsina, SFB (neutralizador), PBS (lavagem) e Giemsa 
(coloração), por 5 min.
Coloração 
• Análise: 15 – 20 metáfases
Cariótipo - cariograma
• Técnica utilizada para detectar a presença ou “ausência” de uma
sequência de DNA específica em cromossomos através do uso de
sondas.
• Diagnóstico de alterações numéricas, estruturais e monogênicas
• Vantagem: análise de células fora da metáfase; detecta alterações
pequenas
• Desvantagem: microscópio de fluorescência; sondas específicas.
Técnica: FISH
(fluorescent in situ hybridization)
Técnica: FISH
Sondas
• Desenhadas de forma 
específica contra região 
de interesse
• 20-40 nucleotídeos
• Sondas para centrômero, 
telômero, locus e “whole 
chromosome”
Sonda – COMPLEMENTAR E ESPECÌFICA
Técnica: FISH
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=hybridization&source=images&cd=&cad=rja&docid=78--RYFFVleHmM&tbnid=2FrI7iq4nfWm-M:&ved=0CAUQjRw&url=http://11biogeogondomar.blogspot.com/2010_09_19_archive.html&ei=K2pcUZNcju70BICwgKAG&bvm=bv.44697112,d.dmQ&psig=AFQjCNEn10Dk02JsbY1As0Y-mOKFr-MEKg&ust=1365097359166843
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=hybridization&source=images&cd=&cad=rja&docid=78--RYFFVleHmM&tbnid=2FrI7iq4nfWm-M:&ved=0CAUQjRw&url=http://11biogeogondomar.blogspot.com/2010_09_19_archive.html&ei=K2pcUZNcju70BICwgKAG&bvm=bv.44697112,d.dmQ&psig=AFQjCNEn10Dk02JsbY1As0Y-mOKFr-MEKg&ust=1365097359166843
REGIÃO CONTROLE
REGIÃO TESTE
Sondas
a) Sondas de biblioteca de DNA (”pintura cro- mossômica”)
b) Sondas de biblioteca de DNA para um braço cromossômico (“pintura cromossômica parcial”).
c) Sondas locus‐específicas. Região crítica da síndrome de Cri‐du‐Chat (5p15.2,verde) e sonda
controle (5q31, vermelho).
d) Sonda locus‐específica em intérfase e metáfase. Região crítica Wolf-Hirschhorn (4p16.3, vermelho)
e sonda controle (4p11.1-q11.1, verde).
e) Sonda centromérica do cromossomo 4.
f) Sondas subteloméricas do cromossomo 3, braço curto (verde) e braço longo (vermelho).
FISH
Técnica: FISH
Etapas
A partir de células fixadas em uma lâmina de microscopia...
1) desnaturação (ação do calor ou álcalis)
2) hibridização (formação de duplex SONDA+REGIÃO ALVO)
3) inspeção ao microscópio
Técnica: FISH
Aplicações
A FISH tem uma grande variedade de aplicações dentro de diferentes campos
de investigação, incluindo:
• Mapeamento genético
• Genômica comparativa
• Biologia evolutiva
• Análise de danos cromossomais
• Diagnóstico de doenças
Translocações
– BCR/ABL t(9;22)(q34;q11) 
– PML/RARα t(15;17)(q22;q21) 
– AML1/ETO t(8;21)(q22;q22)
– Emanuel syndrome - t(11;22)(q23;q11.2)
Técnica: FISH
E mais...
Tumores cerebrais e neurais
1p36/1q25
19q13/19p13
TP53/CEN17
Câncer de mama
CCND1/CEN11
ERBB2/CEN17(HER2) E
SR1/CEN6
Técnica: FISH
Câncer de pulmão
ALK/EML4
ERBB2/CEN17(HER2)
SOX2/CEN3
Carcinoma de células renais
CCND1
TFE3
VHL/CEN3
Leucemia Linfóide Aguda
ETV6/RUNX1
Leucemia Mielóide Aguda
EGR1/5p15
PML/RARA
TP53/CEN17
Leucemia Linfocítica Crônica
CCND1
TP53/CEN17
Técnica: FISH
Leucemia Mielóide Crônica
BCR/ABL1
Mieloma Múltiplo
CCND1
IGH
TP53/CEN17
Síndrome Mielodisplásica
EGR1/5P15
Linfoma de Burkitt
IGH
Linfoma não- hodgkin
CCND1
IGH
Pré natal- pós natal e pré implantação genética
13/CEN18/SPEC21 TRIPLE
Técnica: FISH