Cromatografia de bioafinidade

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CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE – CB 
A cromatografia por bioafinidade distingue-se dos outros métodos cromatográficos por se 
basear, principalmente, nas propriedades biológicas ou funcionais das espécies que interagem: a 
substância a ser separada e a fase estacionária. 
PRÍNCIPIO 
O princípio da cromatografia por bioafinidade é o isolamento seletivo de macromoléculas 
biológicas, através da utilização das propriedades dessas substâncias de unirem-se 
reversivelmente a ligantes específicos. 
Envolve a preparação de uma fase estacionária seletiva, por imobilização covalente de ligantes 
específicos à matriz ou suporte sólido. A amostra é aplicada à coluna contendo o ligante 
específico da amostra ligado ao suporte sólido. As moléculas que não possuem boa afinidade 
pelo ligante passam pela coluna sem serem ligadas, enquanto que as macromoléculas que se ligam 
são retidas. 
 
PROCEDIMENTO 
1. Escolha da F.E. 
• Agarose 
É um gel de rigidez considerável e inércia biológica relativa, amplamente utilizado. Consiste 
de uma cadeia linear de polissacarídeos, sem ligações covalentes cruzadas, que implica em 
instabilidade térmica; dificuldade de congelamento ou secagem, pronta solubilidade na 
presença de agentes desnaturantes e mudanças drásticas e irreversíveis da estrutura do gel 
na presença de solventes orgânicos, como álcool e acetona. 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS 
Instituto De Ciências Exatas / Departamento De Química 
DISCIPLINA: IEQ645 – Introdução à cromatografia / PROFESSOR: Emmanoel Vilaça Costa 
DISCENTE: Jéssica Fernandes Auzier / Matrícula: 21851606 
DATA DE ENTREGA: 17/06/2021 
Resumo do capítulo cromatografia por bioafinidade (CB) 
 
 
Retenção específica de proteínas é devido à presença de grupos iônicos como éster sulfatos, 
metoxil e grupos carboxílicos. A eliminação ou diminuição dos efeitos indesejáveis desses 
grupos procede por tratamento do gel com borihidreto, em solução alcalina, por duas horas. 
• Celulose 
Bipolímero linear de glicose, apresenta algumas limitações devido à sua estrutura física 
instável (perda de porosidade) e forma geométrica irregular. Contudo, essas limitações 
podem ser contornadas por obtenção de esferas mais regulares e porosas, sem 
comprometer a sua rigidez mecânica. 
• Dextrano 
Polímero de unidades de glicose unidades por ligações α-1-6, é utilizado como matriz após 
tratamento com epicloroxidrina para a formação de ligações cruzadas covalente entre as 
cadeias polissacarídicas. Devido ao elevado número de hidroxilas, torna a molécula mais 
hidrofílica que a agarose. Possui como limitações a formação de ligações cruzadas 
indesejáveis, tornando o gel menos poroso, dificultando a vazão da fase móvel da coluna. 
• Poliacrilamida 
É um gel formado por uma estrutura de hidrocarbonetos, na qual estão ligados grupos 
amidas. Apresentam estabilidade em pH 1 a 10, não conterem grupos ionizáveis, de serem 
biologicamente inertes e de não serem atacados por micro-organismos. A limitação é a perca 
de estabilidade mecânica. 
• Trisacril 
É um gel sintético derivado da polimerização de um monômero, que é suporte para a 
cromatografia por exclusão, troca iônica e bioafinidade. Possui um caráter hidrofílico útil 
para a separação de macromoléculas e do polímero deste gel. 
2. Preparação da F.E. seletiva 
A preparação da fase estacionária seletiva envolve duas etapas: a ativação da matriz e o 
acoplamento do ligante. 
• Ativação da matriz 
Compreende a ligação de grupos reativos à matriz inerte. 
Matriz Ativação 
Grupos hidroxílicos ou aminas livres Reagentes bifuncionais do tipo A-R-B 
Dextrano e agarose Por brometo de cianogênio e derivados 
Poliacrilamida Hidrazina e aminoetil 
 
• Acoplamento do ligante à matriz ativada 
A matriz, após ativação, está pronta para receber o ligante específico ou o espaçador, quando 
se faz necessário. O acoplamento de ligantes específicos pode ser realizado diretamente na 
matriz ativada ou em grupos funcionais de moléculas espaçadoras ligadas à matriz. 
Dependendo do tipo de matriz ativada e do agente ativador, os principais grupos funcionais 
disponíveis para o acoplamento são os grupos carboxílicos, aminas, tióis, imidazóis e 
derivados sulfonados. 
3. Preparo da coluna 
A coluna para a cromatografia por bioafinidade é composta por um material de recheio 
sólido e poroso, no qual a fase estacionária será adsorvida. Geralmente, utiliza-se sílica ou 
terra diatomácea como suporte, adsorvendo-se a fase estacionária no mesmo. 
As dimensões são comumente de 3,0 x 0,8 cm ou 5,0 x 0,5 cm e o seu tamanho varia 
conforme a concentração da amostra. 
4. Preparo da amostra 
A amostra é dissolvida no tampão onde se inicia o processo. O volume da amostra a ser 
aplicada não é crítico se a substância que se quer isolar é fortemente ligada à fase estacionária 
seletiva, nas condições em que se executa o processo. Porém, para as substâncias que são 
moderadamente ou fracamente ligadas a essa fase, deve ser utilizado pequeno volume de 
amostra, em torno de 5% do volume da coluna, prevenindo uma co-eluição com substâncias 
que não são ligadas. 
5. Efeito da vazão e temperatura 
A vazão tem que ser otimizada com cuidado, pois, quando alta pode diminuir a eficiência da 
ligação entre o ligante e a substância alvo. Seu efeito é mais perceptível em colunas pequenas 
que possui baixa afinidade da substância que se quer reter. 
A temperatura é outro fator que se deve ter atenção, pois, o seu aumento interfere na 
diminuição da afinidade da substância alvo pela F.E. seletiva. Isto pode ser usado como uma 
vantagem ou desvantagem, caso provoque mudanças funcionais irreversíveis. 
6. Métodos de eluição 
A eluição é realizada por meio de agentes específicos como não específicos. 
• Agentes de eluição específicos 
O deslocamento da substância alvo da F.E. seletiva é baseada na ligação preferencial 
dessa substância ao agente específico do que o ligante da fase estacionária. Geralmente, 
os agentes de eluição específicos apresentam estruturas químicas semelhantes ao ligante 
da fase estacionária. 
• Agentes de eluição não específicos 
 
A variação do pH e/ou força iônica do tampão pode provocar alterações no complexo 
macromolécula-ligante específico por ionizar ou modificar a estrutura das moléculas que 
participam do processo. Usualmente é utilizado variações de pH ou da concentração 
salina, ambas crescentes ou decrescentes, em etapas discretas ou em gradientes. 
• Agentes caotrópicos 
Quando a força iônica ou o PH sofre alteração ou o uso de reagentes específicos forem 
ineficazes para o deslocamento da substância alvo do conjunto suporte-ligante, é 
adicionado substâncias que provocam a desnaturação de macromoléculas (Agentes 
caotrópicos). Onde depois da eluição é removido por diálise ou ultrafiltração. 
São exemplos: Uréia, cloreto de guanidina, percloratos, tiossulfatos e iodetos em 
concentrações molares elevadas. 
 
 
APLICAÇÕES 
Purificação de macromoléculas 
• Enzimas 
As enzimas purificadas podem ser divididas em duas: a primeira é as enzimas de 
especificidade restrita, as quais são purificadas com auxílio de inibidores ou substratos; 
a segunda é as enzimas que se ligam a um ligante geral, isto é, um ligante comum para 
um grande número de proteínas. 
• Imunoafinidades 
A imobilização de anticorpos monoclonais e policlonais e matrizes ativadas tem 
permitido a purificação de um grande número de proteínas, incluindo enzimas. Sob 
condições ideais, colunas com anticorpos ligados à matriz permitem a separação de 
proteínas específicas de misturas, através, de um único passo de purificação. A maior 
dificuldade é a alta afinidade por antígenos, necessitando de condições drásticas de 
eluição como o uso de agentes caotrópicos. 
• Glicoconjugados 
As lectinas podem ser imobilizadas em matrizes para a purificação de glicoconjugados, 
que, devido à interação fraca, podem ser deslocados prontamente da colunaem meio 
neutro. 
• Receptores 
É uma molécula que reconhece uma entidade química específica, liga-se a esta e inicia 
uma série de eventos bioquímicos resultando em uma resposta fisiológica característica. 
Purificação de pequenas moléculas 
A purificação usando macromoléculas insolúveis permite isolar em uma única etapa peptídeos 
presente em uma mistura. Esse método é amplamente utilizado na purificação de peptídeos 
sintéticos e naturais, e no isolamento de peptídeos modificados, obtidos da hidrólise química de 
proteínas modificadas. 
Exemplos comuns de eluentes utilizados para dessorver a substância-alvo 
Substância-alvo Ligante Eluente 
Alonina desidrogenase NADP NaCl 
Antranilato sintetase Antranilato pH (tampão) 
Anidrase carbônica Sulfonamidas ClO4-, I- e NaCl 
Celulase Celulose Temperatura 
Flavoquinase (Riboflavina Quinase) Flavinas Riboflavina 
γ-Glutamilcisteína sintase ATP, Cestamina ATP, DTT 
3β-hidroxiesteróide oxidase Colesterol Triton X-100 
Metilmalonil-CoA mutase Vitamina B12 Vitamina B12 
Neuramidae Ácido tirosil, ácido p-nitrofenil 
oxâmico, ácido colomínico. 
pH, Acetato, 
NaCl