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1 LPI – Proliferação Celular Proliferação Celular 2 LPI – Proliferação Celular Sumário 1 DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO E MOLECULAR .......................................................03 1.1 Diagnóstico Molecular ...................................................................................................03 1.1 Diagnóstico Imunológico ..............................................................................................10 2 BIOINFORMÁTICA ..............................................................................................................15 2.1 Histórico ..............................................................................................................................15 2.2 Noções de bioinformática .............................................................................................15 3 RECOMENDAÇÕES DE MATERIAIS ..............................................................................20 *Diagnóstico Imunológico e Molecular inclui o assunto “Extração de DNA/RNA” 3 LPI – Proliferação Celular Diagnóstico Imunológico e Molecular Diagnóstico Molecular ↳ FUNÇÕES Os testes moleculares tem oferecido uma ampla gama de exames que auxiliam a: 1. Prever; 2. Predizer; 3. Fazer triagem; 4. Diagnosticar; 5. Realizar prognóstico de diversas doenças Possuem grande rapidez e eficácia. São bastante sensíveis, específicos e fidedignos/precisos. Eles são usados em: 1. Mapeamento de doenças de natureza genética, como o câncer; 2. Triagem pré-natal ou Teste pré-natal não invasivo (NIPT) que detecta, além do sexo do bebê, possíveis alterações cromossômicas e as trissomias mais comuns nos bebes; 3. Diagnóstico e prognóstico de doenças infecciosas; 4. Medicina de precisão para tratamentos personalizados ↳ AMOSTRAS Podem ser saliva, sangue, plasma, medula, líquor, entre outros. A maior parte dos testes genéticos são por sangue ou saliva. O objetivo é extrair material genético (DNA, RNA) No COVID-19, são feitos, por exemplo, teste a partir de secreção em nasofaringe, sangue ou saliva. ↳ APLICAÇÕES Identificação de doenças hematológicas como trombofiliais, hemocromatose (acúmulo de ferro. Ligação muito intenso de ferro ao grupo Heme na hemoglobina), entre outras Identificação de mutações relacionadas à leucemia Alterações moleculares que indiquem a ocorrência de câncer, como o de mama, o de pulmão e o câncer colorretal Nas doenças genéticas raras Identificação e diagnóstico de doenças infecciosas, como hepatites, HIV e outras Identificação de infecções respiratórias e identificação de agentes, como influenza A, B, C; coronavírus e outros 4 LPI – Proliferação Celular ↳ TIPOS DE TESTES ⦁ Amplificação de DNA pela reação em cadeia de DNA polimerase: A reação em cadeia de polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Muito feito para diagnóstico de COVID-19. ⦁ Western blot – diagnóstico de doenças: Detecta anticorpos contra vírus ou bactérias no soro. A técnica de Western Blotting é o teste confirmatório para HIV. Detecta anticorpos anti-HIV no soro do paciente. Útil para detectar proteínas defeituosas ⦁ Sequenciamento de ácidos nucleicos: Identifica o organismo ao qual pertence uma amostra, determina diagnóstico de doença genética e diferencia cepas de microrganismos patogênicos ⇾ TÉCNICA ASSOCIADA: ⦁ Eletroforese: Método de separação de macromoléculas, como DNA, RNA, proteínas e enzimas com tamanhos e cargas diferentes por aplicação de corrente elétrica. É como se fosse uma forma de “revelar” o resultado EXTRAÇÃO DE DNA/RNA ⦁ Para realizar a análise molecular de forma eficiente, é preciso separar os ácidos nucleicos dos demais constituintes das células, usando técnicas de extração de DNA ou RNA ⦁ Existem vários protocolos de extração de DNA e RNA. O mais adequado deve considerar: 1. A molécula desejada (DNA e/ou RNA); 2. O tipo de amostra; 3. O grau de pureza; 4. O rendimento desejado; 5. A disponibilidade de recursos para realização da técnica → ACODICIONAMENTO DAS AMOSTRAS É essencial para a sua preservação até o momento da extração O DNA apresenta estabilidade maior, enquanto o RNA é rapidamente degradado após a coleta. → PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS Amostras líquidas (sangue, urina, liquor) são geralmente centrifugadas para a separação de células nucleadas, no precipitado), ou de partículas virais, no sobrenadante. Os tecidos sólidos (músculos, pedaços de órgãos) precisam passar por uma etapa de quebra das estruturas rígidas, com o objetivo de aumentar a superfície de contato para a ação dos reagentes nas etapas seguintes. Ex.: Extração do DNA de morango – Maceração do morango → LISE CELULAR Envolve o rompimento das células e deve ser realizada em soluções tamponadas, geralmente contendo um detergente e os reagentes tris-hidroximetil aminometano (Tris), cloreto de sódio (NaCl) e ácido etileno diamino tetra-acético (EDTA) Ex.: Extração do DNA de morango – Uso de detergente e solução de cloreto de sódio. 5 LPI – Proliferação Celular ⦁ FUNÇÃO DOS REAGENTES ⇾ TRIS: Mantém o pH da solução tampão de lise estável (próximo a 8,0) evitando que o DNA, ao ser liberado, sofra ataque de enzimas DNases (desobirribonucleases) endógenas que o degradam, as quais atuam em pH ótimo de 7,8. ⇾ EDTA: É um agente quelante (transforma isso em complexos hidrossolúveis) que auxilia na inibição das DNases por se ligar aos cofatoresCa+2 e Mg+2 das enzimas DNase ⇾ NaCl: Rompe as ligações iônicas das cadeias peptídicas, auxiliando na desnaturação das proteínas e adicionalmente promove a aglomeração das moléculas de DNA → SEPARAÇÃO DOS CONSTITUINTES Os ácidos nucleicos são liberados na solução aquosa juntamente com outros constituintes celulares dos quais devem ser isolados Para esse fim, são usados solventes orgânicos, como o fenol ou clorofórmio, que desnaturam proteínas Nessa etapa, após a centrifugação, o DNA permanecerá solúvel na fase aquosa (sobrenadante) → PRECIPITAÇÃO DO DNA Em condições de baixa temperatura e elevada concentração salina (devido ao NaCl presente no tampão de lise), a adição de etanol absoluto, isopropanol ou soluções acetatos de amônio ou sódio resulta na precipitação do DNA → LAVAGEM E RESSUSPENSÃO DO DNA A lavagem do DNA é realizada com etanol 70% para a remoção dos sais, detergentes e de outras impurezas. Após a secagem por evaporação, o DNA é solubilizado preferencialmente em solução tampão TE (Tris-HCI e EDTA) 6 LPI – Proliferação Celular ELETROFORESE Coloca-se o material em um gel e separa-se as estruturas nessa corrida. Os mais pesados ficam na parte superior, os menos pesados ficam mais embaixo. Na imagem, tem-se um gel de agarose onde se coloca o material para correr. Coloca-se o DNA nos poços. Uma intensidade de energia será aplicada e, com isso, os fragmentos de DNA irão correr no gel. O resultado está na segunda imagem. A visualização não é possível a olho nu. Utiliza-se alguma substância fluorescente. Antigamente, utilizava-se bastante o brometo de etídio. 7 LPI – Proliferação Celular PCR É dividido em três etapas: 1. Desnaturação (96°C); 2. Anelamento dos primers (55°C) – Os primers devem se ligar a regiões específicas; 3. Extensão dos primers (72°C) – Formam- se duas fitas idênticas à origianl Resumindo: Tem-se um DNA molde que, após desnaturação, terá sua fita aberta. Os primers se ligarão em regiões específicas no sentido 5’ 3’. Tem-se a extensão e, por fim, a formação de fitas iguais duplicadas. Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados através do uso da eletroforese em gel. Há cada ciclo de PCR, tem-se um número de moléculas duplicado. As 3 etapas são repetidas, geralmente, de 20 a 30 ciclos, dando uma grande quantidadede material A PCR é realizada em um equipamento chamado termociclador que permite a variação de temperatura de forma rápida. No termociclador são colocados microtubos contendo os reagentes necessários para que ocorra a reação enzimática As reações incluem: ⇾ Água ultrapura; ⇾ DNA molde; ⇾ Primers; ⇾ Enzima DNA polimerase; ⇾ Solução de cloreto de magnésio (Cofator da enzima DNA polimerase); ⇾ Solução tamão para a DNA polimerase 8 LPI – Proliferação Celular WESTERN BLOT Separação das proteínas por peso molecular, através de uma eletroforese, seguindo-se da transferência para uma membrana e a detecção da proteína de interesse com um anticorpo específico ↳ ETAPAS 1. Extração e quantificação das proteínas; 2. Eletroforese em gel de poliacrilamida; 3. Transferência das proteínas para uma membrana; 4. Incubação da membrana com um anticorpo por uma noite (overnight) para detectar a proteína específica a ser analisada; 5. Revelação dessa membrana para análise dos dados. O teste de HIV indeterminado é quando não se tem padrão de positividade/negatividade. Deve-se considerar a janela imunológico: Período em que o vírus está em latência, ou seja, não se tem uma quantidade vírus suficientemente detectável. Com isso, pode ter resultado indeterminado. 9 LPI – Proliferação Celular Exemplos de testes Western Blot com resultados positivos, negativos e indeterminados SEQUENCIAMENTO A determinação da sequência nucleotídica é possível graças à técnica desenvolvida por Sanger e colaboradores na década de 1970. Essa técnica se tornou acessível por avanços recentes na fabricação de equipamentos automáticos Equipamentos automatizados de sequenciamento utilizam capilares extremamente finos nos quais, por meio da migração por eletroforese capilar, os fragmentos são alinhados com base no seu tamanho, do menor ao maior, e são detectados por um feixe de laser A marcação de cada um dos quatro ddNTPs (A, T, C ou G) com uma molécula fluorescente diferente permite identificar qual foi o nucleotídeo adicionado em cada posição terminal dos fragmentos, construindo-se assim a sequência da molécula de DNA alvo. 10 LPI – Proliferação Celular Diagnóstico Imunológico ↳ FUNÇÕES 1. Detectar a presença de anticorpos contra parasitar, fungos, bactérias ou vírus; 2. Detectar a presença de antígenos desses agentes, indicando diretamente a sua presença no hospedeiro A segunda resposta imunológica (secundária) é maior do que a primeira resposta imunológica (primária) As IgGs são as imunoglobulinas de MEMÓRIA IMUNOCROMATOGRAFIA ↳ DETECÇÃO ANTÍGENO: Para detectar antígeno. Emprega-se um anticorpo de captura ligado à matriz e um anticorpo marcado com partículas coloridas que é específico para o antígeno pesquisado ↳ DETECÇÃO ANTICORPO: Para detectar anticorpo. Utiliza-se um antígeno específico ligado à amtriz e um anticorpo antiimunoglobulina marcado com partículas coloridas HEMAGLUTINAÇÃO Detecta-se o tipo sanguíneo. Coloca-se uma gota de sangue e verifica-se se irá aglutinar ou não. Sangue AB: Pode receber de todos Sangue B: Pode receber de B e O Sague A: Pode receber de A e O Sangue O: Pode receber de O. 11 LPI – Proliferação Celular ELISA Etapas: 1. Sensibilização (ou cobertura) da fase sólida – Placa sensibilizada para um determinado tipo de Ac; 2. Adição de Ag ou do Ac; 3. Bloqueio (proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado); 4. Adição da amostra (em diluente); 5. Adição do conjugado: Anticorpo purificado marcado com enzima (ex.: peroxidase) *Outro tipo de teste é o teste rápido ⇾ DIAGNÓSTICO DE HIV: Pode ser por testes Elisa, Western Blot ou por testes moleculares (PCR) 12 LPI – Proliferação Celular HIBRIDIZAÇÃO IN SITU Muito utilizado para diagnóstico de HPV Quando se observa o microscópio, o DNA estará marcado por fluorescência VDRL Muito utilizado para diagnóstico de sífilis Verifica-se se a amostra é reagente ou não reagente e se é primária ou não. É uma técnica de aglutinação HTLV Faz um teste de triagem que, se reagente ou inconcludente, segue para Western Blot. A partir dos resultados do Wester Blot, determina-se a necessidade de PCR. 13 LPI – Proliferação Celular HEPATITE B Pode fazer com teste rápido conjugado 14 LPI – Proliferação Celular JANELA IMUNOLÓGICA DAS HEPATITES B e C Janela imunológica (testes sorológicos) Janela imunológica (testes de biologia molecular) HBV 30-60 dias 25 dias** HBC 33 a 129 dias (ELISA 2ª geração) 49 a 70 dias (ELISA 3ª geração) 22 dias INTERPRETAÇÃO DOS MARCARDORES SOROLÓGICOS DA HEPATITE B AGUDA 15 LPI – Proliferação Celular Bioinformática Histórico ↳ DESCOBERTA DO DNA ⇾ 1869: Johan Friedrich – Ácidos nucleicos ⇾ 1953: Watson e Crick – Estrutura tridimensional do DNA; dupla hélice de nucleotídeos; adenina, citosina, guanina e timina ⇾ 1958: Francis Crick: Transcrição e tradução; ⇾ Maxan e Gilbert: Degradação química (Sequenciamento de DNA); ⇾ 1977: Frederick Sanger: Sequenciamento de Sanger; Primeira geração; Sequenciar genoma pequeno; Interrupção da cadeia (ddNTPs); ⇾ 1986: Sequenciadores automáticos ⇾ 1990: Projeto Genoma Humano: Determinar todas as sequências de pares de base do DNA humano; Identificar seus genes; Desenvolvimento da bioinformática ⇾ 2005: NGS (next Generation sequencing); sequenciamento muito mais rápido; bilhões de fragmentos ao mesmo tempo Noções de Bioinformática ↳ CONCEITO União da Ciência da Computação com a Biologia Molecular que tem como objetivo analisar, interpretar e processar dados biológicos. Conjunto das ciências, que utiliza conhecimentos de diversas áreas para o tratamento de dados e informações por meio do uso de computadores. A bioinformática faz isso a partir de pesquisas e desenvolvimento de ferramentas computacionais, matemáticas e estatísticas “A computação está para a biologia da mesma forma que a matemática está para a física” – Harold Morowitz 16 LPI – Proliferação Celular A bioinformática pode ser vista de diversas formas sob diferentes olhos, pois é uma disciplina interdisciplinar e está presente em várias áreas — cada uma atuando sobre um problema diferente de maneira distinta —, como: ⇾ Ciência da computação; ⇾ Biologia; ⇾ Tecnologia da informação; ⇾ Biomedicina; ⇾ Farmácia; ⇾ Engenharia ↳ UTILIDADE DA BIOINFORMÁTICA Para que serve a bioinformática? O que faz o bioinformata? Aonde a bioinformática atua? • Sequenciar o DNA, identificar os genes, ver o funcionamento de estruturas, a regulação e expressão gênica e as funções de proteínas; • Reconstrução de vias metabólicas • Construção de árvores filogenéticas e analisar as relações evolutivas (Genômica Comparativa) • Identificação de Doenças Genéticas • Produção de novas terapêuticas • Nutrigenética • Farmacogenética • Epigenética • Agrogenética • Engenharia Genética; • Mineração de dados; • Construção e manutenção de bancos de dados; • Análise estatística; • Análise de imagens; • Biologia sintética; • Biologia de sistemas (ciências ômicas); • Desenvolvimento de algorítmicos; • Inteligência artificial. Resumindo: A bioinformática trata do desenvolvimento e implementação de ferramentas e algoritmos com o uso de análise estatística. ↳ ALGUMAS APLICAÇÕES: ⦁ Desenvolvimento de fármacos: Objetiva analisar alvos em busca de sítios de ligação. Utiliza métodos in sílico de bioinformática estrutural – design de drogas. ⦁ Sequenciamento de DNA: Extração e sequenciamento de DNA – “A genômica se tornou pessoal”. É bastante acessível atualmente. ⦁ Genômica Bacteriana: Estudo das resistências bacterianas a antibióticos.Realizam-se estudos evolutivos, objetivando desenvolver novos medicamentos / vacinas ⦁ Agricultura: Genômica comparativa entre organismos modelo e de interesse agropecuário. Identifica genes de valor agropecuário. Ex.: Herbaspirillum seropedicae – fixação de nitrogênico – Crescimento de plantas 17 LPI – Proliferação Celular ↳ OBJETIVO ⦁ Permitir descobertas na biologia, a partir de: 1. Desenvolvimento de ferramentas e algoritmos; 2. Implementação de ferramentas e algoritmos; 3. Organização da informação em bancos de dados ⦁ Proporcionar aos cientistas um meio de explicar e entender os processos biológicos ⦁ Prover ferramentas para facilitar/permitir extrair padrões e informações biologicamente úteis ↳ CIÊNCIAS ÔMICAS É A base da bioinformática Busca identificar, caracterizar e quantificar todas as moléculas biológicas que estão envolvidas na estrutura, função e dinâmica de um tipo celular, tecido ou organismo especifico. Permitem analisar milhares de variações genéticas, genes, proteínas e metabólitos ao mesmo tempo. O Projeto Genoma Humano revelou que o genoma humano possui um número menor de genes do que se imaginava, concluindo que os processos biológicos não são particularmente regulados na sequência do DNA, mas, sim, por processos em vários outros níveis moleculares. A partir disso, surgiu o estudo das Ômicas Essas tecnologias permitem uma abordagem holística em torno do dogma central da biologia molecular (imagem ao lado), através da integração da genômica, transcriptômica, proteômica, metabolômica, epigenômica, lipidômica, entre outras. Elas são muito utilizadas na biomedicina para pesquisa sobre novas abordages diagnósticas, terapêuticas e preventivas ⇾ GENÔMICA: Estudo do genoma completo dos organismos. Determina toda a sequência de nucleotídeos. Foi a primeira ciência ômica a ser desenvolvida Permitiu vários avanços desde o projeto genoma humano, que identificou os genes e loci genéticos envolvidos no desenvolvimento de doenças hereditárias humanas. • Estrutura, função, caracterização, quantificação de genes • Etapas • Banco de dados; NCBI; FASTA; GB • Compartilhar guia A genômica pode ser dividida em: 1. Estrutural: Organização e localização dos genes (onde os genes estão, notação dos genes...) 2. Funcional: Fenótipo; 3. Comparativa: Evolução – A relação entre os organismos no tempo, a filogenia vinculada entre os organismos com base nos genomas que eles possuem 18 LPI – Proliferação Celular → Formas de sequenciamento: ⦁ Análise da sequência de DNA, a partir da metodologia de Sanger: Utilização de nucleotídeos terminadores de cadeia quimicamente modificados durante a replicação do DNA in vitro – Padrão ouro. (Alto custo x Baixo rendimento) ⦁ NGS: Sequenciamento de nova geração. Permite a replicação simultânea de milhões de fragmentos curtos de DNA, a baixo custo e alta velocidade = Alto rendimento. Essas estratégias incluem: • Sequenciamento de painel de genes específicos, para análise de uma determinada condição clínica; • Sequenciamento do exoma, que corresponde à região codificante (apenas 2% do genoma, mas que contem 85% das varientes causadoras de doença) • Sequenciamento do genoma completo (localizando polimorfismos, inserções/deleções, alterações no número de cópias, variantes estruturais) Sequenciamento ⇾ Montagem ⇾ Anotação ⇾ Genoma de Referência ⇾ Re-sequenciamento ⇾ Alinhamento com G. R. ⇾ Descobertas de variantes A genômica busca detectar o que gera variabilidade genética, como: ⇾ Indels (Inserções/Deleções) ⇾ Inversões ⇾ Translocações ⇾ Variação no número de cópias (CNVs) ⇾ Regiões repetitivas em tandem (Mini/Microssatélites) ⇾ Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) Exemplos do uso da genômica: Teste de paternidade, identificação de doenças e características produtivas. A genômica realiza, ainda, estudo de efeitos, como heterose, pleiotropia e epistasia – Interação entre locus e alelos dos genomas. A genômica tem gerado novas ferramentas para os programas de melhoramento – marcadores moleculares, que já são usadas em larga escala em diversas espécies. ⇾ TRANSCRIPTÔMICA: Estudo dos transcriptos (RNA), seja funcional ou codificante. Inclui: • Etapa de Transcrição • Análise dos Transcritos • Sequência de mRNA • Transcriptase Reversa –cDNA • Expressão Gênica • Epigenética • Específica • muita variação (estado fisiológico, estímulos físicos, químicos, biológicos ou doenças) • Expressão gênica comparativa (diferencial) • Interesse especial em doenças como câncer • Entendimento dos processos da diferenciação celular • Ferramenta para a fertilização in vitro, clonagem, etc. 19 LPI – Proliferação Celular ⇾ PROTEÔMICA: Estudo das proteínas. ✓ Etapa de Tradução ✓ Análise das Proteínas ✓ Sequências de Aminoácidos Inclui a expressão do DNA (o que realmente é produzido a partir do nosso genoma), a funcionalidade e estrutura. Constrói mapas proteicos (interação) Imunoproteômica: identificação de antígenos envolvidos na resposta imune através de técnicas de proteômica Histoproteômica: aplicação de proteômica em tecidos processados para imunohistoquímica ⇾ METABOLÔMICA: Estuda a dinâmica das concentrações de metabolitos ao longo do tempo: açucares, nucleotídeos, aminoácidos, lipídios... O metaboloma representa o conjunto de todos os metabólitos em uma célula, fluido biológico, tecido ou organismo, sendo estas substâncias consideradas os produtos finais dos processos celulares Pode fornecer um panorama geral sobre o estado fisiológico do organismo • Análise dos Metabolitos • Produtos dos processos celulares ⇾ EPIGENÔMICA: Trata das modificações herdáveis, mas que não fazem parte da sequência de nucleotídeos. Ex.: Metilação. Considera a influência do ambiente. ⇾ METAGENÔMICA: É a área que trata do conjunto de genomas de um ambiente, realiza análise de comunidades de organismos e constrói bibliotecas de metagenomas (ex.: Descobrir qual é a comunidade de organismos presente em uma amostra de, por exemplo, solo) Todas essas áreas acabam interagindo Todos esses níveis possuem bancos de dados vinculados para dar conta do grande volume de informações 20 LPI – Proliferação Celular Recomendações de Materiais FIALHO, E.; MORENO, F. S.; ONG, T. P. Nutrição no pós-genoma: fundamentos e aplicações de ferramentas ômicas. Rev. Nutr, Campinas, v. 21, n. 6, p. 757-766, 2008. DOI https://doi.org/10.1590/S1415-52732008000600014. Disponível em: https://www.scielo.br/j/rn/a/HyFY3wfmJzrF7T9vN3FJcCp/?lang=pt&format=pdf. Acesso em: 6 set. 2021. INTRODUÇÃO (Introdução à Bioinformática - Parte 1). Gravação de Camila P. Perico. Online: Discentes Bioinformática UFPR, 2021. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=9pkCA01EWy0&list=PL-F08sZPKH8EImaRGACttYjNSsI04- KaJ&index=1. Acesso em: 6 set. 2021. OLIVEIRA, M. C. S. et al. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase. 1. ed. São Carlos: Embrapa, 2003. Disponível em: https://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pdf. Acesso em: 6 set. 2021. TÉCNICAS ômicas: estudos integrados de modelos biológicos. Gravação de RENETA. Online: [s. n.], 2021. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=wdxcZjLpchU. Acesso em: 6 set. 2021.
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