GPS2 e SMRT controlando enhancer/silencer no lócus Ccl2

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Camila, Isabella, Laura B., Laura H.
Figuras 1 e 2
Introdução ao ChIP-Seq - Chromatin Immunoprecipitation sequencing
● Investiga interações entre DNA e proteínas
Passo a passo:
- Crosslink: Cola as proteínas no DNA pela 
adição de formaldeído;
- Quebra o DNA em fragmentos menores, 
sonicação ou enzimas de restrição;
- Anticorpos específicos para cada proteína 
são adicionados e se ligam nelas;
- Purificação: Beads magnéticos recuperam 
as nossas proteínas de interesse ligadas 
aos anticorpos;
- Reversão do crosslink (desgrudar a proteína 
do DNA);
- Sequenciamento do DNA,
Introdução ao ATAC-Seq - Assay for Transposase-Accessible Chromatin using 
sequencing
- É uma técnica para ver a acessibilidade da 
cromatina.
- Tn5 se liga nas regiões abertas da 
cromatina, cortando em fragmentos 
deixando adaptadores para sequenciamento
- Os fragmentos de DNA marcados são então 
purificados, amplificados por PCR e 
sequenciados usando o sequenciamento de 
próxima geração
- Aplicação: inferir regiões de acessibilidade 
aumentada, bem como mapear regiões de 
locais de ligação de fator de transcrição e 
posições de nucleossomo
Figura 1 - Mapping of GPS2/MED1/CBP/H3K27ac-positive macrophage 
enhancers and functional dissection at the Ccl2 locus
Figura 1a - GPS2 se liga se sobrepondo 
a MDE1 e CBP
◆ Comparar recrutamento de GPS2 (complexo repressor) x enhancers 
conhecidos (H3K27ac, PU.1, MED e CBP) no lócus de Ccl2 => ChiP-seq
- Figura 1b - GPS2 está localizado tanto 
distal como proximal mas se liga mais a 
enhancers (distal) do que a promotores.
- Células BMDM (macrófagos 
derivados da medula óssea) e 
RAW.
- Co-ocupância no ChIP-Seq 
mostrou dois agrupamentos 
de enhancers: E1 e E2.
- ATAC-seq mostra que foi em 
regiões de cromatina aberta.
- Knockdown de GPS2 e SMRT, 
diminuindo a ação repressora 
sobre o lócus.
- Isso fez com que a ligação de 
H3K27ac aumentasse na 
região E1 e também no 
promotor de Ccl2, comparado 
com o controle que é GFP.
- Isso leva a uma maior 
expressão de Ccl2-> estado 
inflamatório
 FIGURA - 1E
➔ Análise de qRT-PCR da expressão 
de mRNA de Ccl2 em células 
RAW.
➔ Comparação de tratamento com 
LPS e controle 
 FIGURA - 1F
➔ Rastreamento do genoma de 
H3K27ac ChIP-seq no locus de 
enhencer deletado de genes Ccl2 
em células RAW.
➔ Mudanças foram calculadas em 
comparação de WT com deleções 
de enhencer
 FIGURA - 1G
➔ Análise de qRT-PCR da expressão 
de mRNA de Ccl2 e Gps2 após a 
depleção de GPS2 em células 
RAW WT e células RAW com 
enhencer deletados.
➔ Foi utilizada ANOVA para 
comparações múltiplas
Figura 2- Differential role of enhancer and silencer in
transcription complex assembly at the Ccl2 locus
● Fatores de Transcrição e correguladores 
aliados à Polimerase II: como, quando, 
onde?
● A. ChIP-SEQ CBP, MED1 e Pol II em Wild 
Type, deleção enhancer e deleção 
silenciador.
● Deleção enhancer: recrutamento abolido
● Deleção silenciador: recrutamento 
aumentado
● Conclusão: enhancer é essencial para 
montar complexo transcricional ativo com 
MED1 e CBP, junto da Pol II no Ccl2
E= enhancer S= silenciador P= promotor
In genetics and cell biology, repression is a mechanism often used to decrease or inhibit the expression of a 
gene. Removal of repression is called derepression. This mechanism may occur at different stages in the 
expression of a gene, with the result of increasing the overall RNA or protein products. Dysregulation of 
derepression mechanisms can result in altered gene expression patterns, which may lead to negative 
phenotypic consequences such as disease
Figura 2- Differential role of enhancer and silencer in
transcription complex assembly at the Ccl2 locus
● B. ChIP-SEQ fatores de transcrição 
relevantes (RUNX1, PU.1 e JunB) em Wild 
Type, deleção enhancer e deleção 
silenciador.
● Deleção enhancer: aboliu ligação em E e 
P, mas não em S.
● Deleção silenciador: aumentou ligação em 
E e P
● Conclusão: ligação de fatores de 
transcrição à S é não-funcional. E e S são 
pontos iniciais de ligação para transcrição, 
mas somente ligação dos fatores em E 
estão associados ao promotor.
● Ccl2 gene specific, as their binding was not 
affected at neighboring genes
Figura 2- Differential role of enhancer and silencer in
transcription complex assembly at the Ccl2 locus
● C. ChIP-SEQ correpressores (SMRT e 
GPS2) em Wild Type, deleção enhancer e 
deleção silenciador.
● Deleção enhancer: aboliu ligação em E e 
P, mas não em S.
● Deleção silenciador: permitiu ligação em E 
e P
● Conclusão: segue padrão da fig B (fatores 
de transcrição) pois, provavelmente esses 
FT são necessários para enhancer recrutar 
SMRT e GPS2
● The recruitment of SMRT and GPS2 at 
neighboring genes was not affected
Figura S2- Differential role of enhancer and silencer in
transcription complex assembly at the Ccl2 locus
● S2H. ChIP-SEQ comparando todas as 
maquinarias citadas anteriormente
● Conclusão: Pol II, MED1, CBP, PU.1, JunB, 
and RUNX1 tiveram ligação em E, S e 
promotor normal, enquanto GPS2 e SMRT 
tiveram ligação diminuída
Figura 2- Differential role of enhancer and silencer in
transcription complex assembly at the Ccl2 locus
● Coletivamente, dados representam como fatores de transcrição, coativadores e correpressores 
coordenam a interação enhancer-silenciador-promotor no gene Ccl2;
● Dados sugerem que enhancer e silenciadores são mais influenciados pelo recrutamento desses 
elementos do que por marcadores de histona;
● Dados sugerem que correpressores (GPS2 e SMRT) estão intimamente ligados tanto com 
enhancer, quanto com silenciador, ligados à fator de transcrição.