Testes sorológios

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TESTES SOROLÓGIOS 
Identificam um antígeno ou anticorpo. à são utilizados fluidos 
biológicos diferentes para cada caso: 
o Fluido biológico para procurar o anticorpo (IgM e IgG) contra 
a dengue - plasma proveniente do sangue 
o Fluído biológico para procurar o antígeno da dengue - 
sangue
 
o Fluído biológico para ver se tem o antígeno da meningite - 
liquor 
o Fluído biológico para ver se tem o anticorpo da meningite - 
sangue 
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DAS INFECÇÕES 
A maioria das infecções causadas por microrganismos geram 
anticorpos específicos. 
Sabendo disso, são geradas aplicações clínicas para: 
o Determina o status imunológico do indivíduo; 
o Para detectar infecção prévia ou infecção presente; 
DETECÇÃO DE ANTICORPOS: IMPORTÂNCIA DIAGNÓSTICA 
Utilização de anticorpos para clínica 
Há 5 imunoglobulinas básicas no organismo: IgM, IgG, IgA, IgD e IgE 
à no diagnóstico clínico as mais importantes são IgM e IgG. 
o As imunoglobulinas 
são produzidas em 
resposta a estímulos 
antigênicos
 
o São moléculas 
funcionais e 
heterogêneas 
que se ligam aos 
antígenos para 
ação efetora
 
DETECÇÃO DE IGM: 
o Detecta 
infecção recente 
(infecção aguda) à fica aumentado em média em 4 dias. 
o É uma estrutura “semi-pronta”à por isso, é mais rápida de ser 
produzida e não tão específica 
o É um anticorpo de estrutura pentamerico 
o Para COVID-19, não funciona como exame diagnóstico de 
infecção. 
 DETECÇÃO DE IGG: 
o São células de memória, detectando Infecções anteriores 
(infecções crônicas) 
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o Caso haja uma reinfecção, o IgG aumenta rápido pois há 
memória imunológica. 
CARACTERÍSTICA DO ANTICORPO 
 
 
IgM – estrutura pentamerica (possui 5 imunoglobulinas) e por isso 
atua tão bem no início da doença. 
IgA – É um dímero 
 
Estrutura em Y em que há porção variável (FAb)e não variável (Fc) 
PORÇÃO VARIÁVEL (FAB) 
o Varia de acordo com o patógeno presente no organismo, se 
ligando e reconhecendo o epítopo (região antigênica do 
antígeno à onde há a ligação do anticorpo e o 
reconhecimento); 
o Quanto mais porções FAb de anticorpos no organismo, melhor. 
o Os anticorpos são produzidos com a região FAb específica para 
determinados antígenos para serem usados dentro do 
laboratório 
PORÇÃO NÃO VARIÁVEL (PORÇÃO FC) 
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É uma porção de identificação para fagocitose que se liga as 
células do ser humano de resposta imunológica, e por isso não varia. 
INTERAÇÕES AG-AC 
Um anticorpo se liga a um epítopo específico por meio de interações 
não covalentes (reversíveis) 
 
 
PRODUZINDO ANTICORPOS NO LABORATÓRIO 
 POLICLONAIS 
Muitos anticorpos vindos de vários linfócitos B. (se liga em vários 
epítopos) 
1. Injeta o antígeno no animal 
2. O antígeno ativa os linfócitos B 
3. Os linfócitos B produzem anticorpos policlonais contra esse 
antígeno 
4. Obtém-se o soro do animal contendo os anticorpos 
policlonais 
 
Anticorpos apresentam heterogeneidade; Alta avidez, comparada 
com anticorpo monoclonal. 
MONOCLONAIS 
Anticorpo em de somente um linfócito B 
1. Insere o antígeno no animal 
2. Retira seu linfócito B e uma célula infectada, fundindo com 
uma célula que está no laboratório (tal fusão se chama 
hibridoma) 
3. Separa célula por célula deste hibridoma 
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4. Produção de monoclones 
 
o O anticorpo policlonal liga-se a múltiplos epítopos em um 
antígeno. Os anticorpos monoclonais só podem se ligar a um 
único epítopo 
 
A principal diferença entre os anticorpos monoclonais e policlonais 
encontra-se em sua origem; os anticorpos monoclonais são 
anticorpos idênticos porque são produzidos a partir de uma única 
célula híbrida de linfócitos B, e eles reconhecem não só o mesmo 
antígeno, mas também se ligam ao mesmo epítopo do mesmo. Os 
policlonais, por outro lado, são produzidos a partir de uma mistura de 
linfócitos e reconhecem múltiplos epítopos no mesmo antígeno 
Podem trazer diferenças para a sensibilidade dos ensaios. 
MÉTODOS SOROLÓGICOS 
Serão observados reação de formação de imunocomplexo (ligação 
do antígeno com anticorpo) 
REAGENTES NÃO MARCADOS 
(A ligação do Ac altera o estado físico do Ag) 
o Reação de aglutinação 
 
o Reação de precipitação 
 
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REAGENTES MARCADOS 
 
o RIA 
 
o ELISA 
 
o IF, citometria de fluxo 
 
o Western Blotting 
 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
Observando o imunocomplexo, pode-se tentar identificar um 
antígeno ou um anticorpo 
Caso queira identificar um antígeno, deve-se ter um anticorpo 
correspondente e observar se ocorre a ligação entre eles, caso 
ocorra é observado o fluorocromo que brilha no microscópio de 
fluorescência. (sendo assim, o paciente é positivo para a patologia 
pesquisada) 
TÉCNICAS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IF) 
Combinam corantes fluorescentes (fluoresceína) com anticorpos e 
quando expostos à luz UV AC fluorescentes. 
 TESTES IF DIRETOS 
Detecta antígenos à deve ter o anticorpo ligado ao fluorocomo à 
específico para o que está sendo pesquisado. 
Se for procurar o antígeno é utilizado como fluido biológico 
dependendo da patogenia do microrganismo, deve ser coletado no 
foco da infecção à Procura direto do tecido que estamos 
pesquisando. 
Caso haja a formação do imunocomplexo: o fluorocromo brilha 
TESTES IF INDIRETOS 
Identifica o anticorpo. à deve-se possuir o antígeno para então 
pesquisar a imunoglobulina do individuo e um anti-anticorpo 
(imunoglobulina anti-humano) ligado ao fluorocromo não especifico 
para o antígeno 
Quando for procurar anticorpo deve-se usar o sangue como fluido 
biológico (soro) 
Antígenos expressos em células ou tecidos são fixados em uma 
superfície/lâmina (fase sólida). O soro do paciente é então 
adicionado na superfície para que anticorpos contra o antígeno 
pesquisado se liguem, formando um sítio de ligação antígeno-
anticorpo. 
Em uma segunda etapa, anticorpos marcados com fluorocromo e 
direcionados contra os anticorpos do paciente são adicionados a 
superfície, de modo que se liguem aos anticorpos do paciente 
EXEMPLO: SÍFILIS - TESTES TREPONÊMICOS FTA-ABS 
O São realizadas técnicas de imunofluorescência indireta para 
pesquisa de anticorpo 
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o Ocorre interação entre anticorpos específicos do soro e 
antígenos treponêmicos pré-fixados em lâmina de microscopia. 
o Revelação anti-IgG/IgM humana marcada com fluorocromo à 
FTA-ABS – para a pesquisa de anticorpos IgM e IgG 
IMUNOHISTOQUÍMICA 
o Detecção de células infectadas em cortes histológicos 
o As amostras são, então, incubadas com substratos enzimáticos 
(quando Ac está marcado com enzima), gerando uma 
coloração castanha ou vermelha, que reflete a distribuição do 
antígeno alvo no tecido/célula analisado. 
CITOMETRIA DE FLUXO 
o Princípio: Cito (célula)+metria (medida) + fluxo (movimento). 
o Imunofluorescência modificada – FACS classificador de células 
ativado por fluorescência 
o Usado para contar as diferentes sub-populações de células (ex: 
TCD4, TCD8) 
o Usado para acompanhar a progressão da AIDS 
o São utilizados contadores automáticos 
o Separação de células marcadas por fluorescência 
o Anticorpos dirigidos contra moléculas de membrana ou 
Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) 
o Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente 
o Teste qualitativo e quantitativo (ele da o número de células que 
pegamos) 
 
 
A partir de um feixe de laser incidente, é feita a medição da 
dispersão e da fluorescência do feixe de laser refletido pela da 
amostra celular 
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO 
Direta: Detectam anticorpos contra quantidades relativamente 
grandes de antígenos celulares como hemácias, bactérias e fungos 
Indireta (Passiva): Os Anticorpos contra antígenos solúveis podem ser 
detectados por testes de aglutinação. Os antígenos são adsorvidos 
em partículas como bentonita ou mais frequentemente esferas de 
látex minúsculas. 
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quando não temligação antígeno- anticorpo, o sangue não 
aglutina 
 
 
O ensaio de aglutinação para hemácias bactérias 
a) Para procurar anticorpos: há o antígeno ligado às bolas de 
látex, aonde o anticorpo (IgM) liga-se, ocorrendo a 
aglutinação e formando uma grande rede. 
b) Ao procurar antígeno, ele já possui o epítopo e então a bola 
de látex possui o anticorpo ao seu redor, que ao se ligarem, 
também formam a malha 
SISTEMA ABO – GRUPOS SANGUÍNEOS 
 
TESTE DE AGLUTINAÇÃO 
 
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TESTE DE COOMBS 
Fator Rh é um dos dois grupos de antígenos eritrocitários de 
importância clínica, envolvido nas reações transfusionais hemolíticas 
e na Doença Hemolítica do Recém-Nascido (DHRN ou Eritroblastose 
fetal). 
 
Material analisado: sangue – Hemaglutinação (Quando reações de 
aglutinação envolvem a agregação de hemácias) 
TESTE DE COOMBS DIRETO OU TESTE DE ANTIGLOBULINA DIRETO 
(TAD): 
Consiste em detectar a presença de IgG ligados às hemácias de um 
indivíduo – detecção anemia hemolítica. à avalia diretamente o 
eritrócito 
 
Em caso de anemia hemolítica: 
1. Amostra de sangue (fluído biológico) é retirada de paciente 
portador de anemia hemolítica com anticorpos ligadas a suas 
hemácias. 
2. Algumas gotas de reagente de Coombs são misturadas com 
a amostra de sangue do paciente 
3. Os anticorpos do reagente de Coombs reconhecem as 
imunoglobulinas humanas sendo visível a reação de 
aglutinação depois da ligação dos anticorpos. 
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TESTE DE COOMBS INDIRETO OU TESTE DE ANTIGLOBULINA 
INDIRETO (TAI): 
Deve ser feita em caso de transfusões e gestante Rh negativo e 
parceiro com fator Rh positivo e/ou desconhecido à avalia se há 
anticorpos no soro do paciente 
É detectado o sangue e centrifugado para ser coletado o soro: 
1. Soro do paciente contém anticorpos 
2. Sangue do doador (hemácia com Rh+) é adicionado na 
amostra 
3. Anticorpos do paciente se juntam nas hemácias do doador 
4. Algumas gotas de reagente de Coombs (anticorpo que 
reconhece a imunoglobulina humana) são misturadas na 
amostra 
5. A reação de aglutinação é observada 
 
 
DILUIÇÃO SERIADA 
o Uma diluição seriada é basicamente uma série de diluições 
simples que amplifica o fator de diluição 
o Pode ser importante para avaliar status imunológico de alguns 
pacientes. 
o Diluir é deixar menos concentrado, ao diluir uma amostra numa 
proporção. EX: se tenho uma amostra de ¼ de café com água 
quero dizer que tenho 1 porção de café para 3 de água (1+3=4). 
Sendo assim, ½ (= 1:1) seria 1 porçao do soluto + 1 porçao do 
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solvente. (deixando a proporção 1:1, ou seja, se há um tubo de 
ensaio com 100ml de solvente, deve ter 100ml de soluto) 
o A fonte da amostra para diluição de cada etapa vem da 
diluição anterior. 
o Todas as diluições na série têm o mesmo fator de diluição, em 
que a amostra da diluição anterior é usada para fazer a diluição 
subsequente. 
o Por exemplo, se eu tiver uma diluição 1/2, meu fator de diluição 
é 2. Todas as diluições seguintes serão multiplicadas por 2. à 1/2 
X 2 = 1/4 X 2 = 1/8 X 2 = 1/16 ... 
o O objetivo desse tipo de diluição é ir diminuindo 
progressivamente a quantidade de soluto (amostra) em relação 
ao diluente. 
COMO FAZER? 
Exemplo: digamos que você quer fazer uma diluição começando 
com 1/2 para uma curva padrão com 7 pontos (a partir da amostra 
pura). 
Isso que dizer que teremos 7 tubos identificados da seguinte forma: 
1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 e 1/128. 
 
1. DETERMINE O VOLUME DO DILUENTE PARA CADA ETAPA: 
Suponhamos que vamos precisar de no mínimo 100 uL. Adicione um 
volume extra, por exemplo 20 uL, para compensar erros de 
pipetagem. Desse modo, colocaremos em cada tubo 120 uL de 
diluente. 
 
2. CALCULE O VOLUME A SER TRANSFERIDO DE UM TUBO PARA 
OUTRO: Volume transferido = 120 uL / (2-1) = 120 uL. 
 
3. CALCULE O VOLUME TOTAL MISTURADO: Volume total misturado 
= 120 uL + 120 uL = 240 uL. 
 
4. PREPARE OS TUBOS, COLOCANDO 120 UL DE DILUENTE EM 
CADA UM. 
 
5. PREPARE A PRIMEIRA DILUIÇÃO, QUE SERÁ DE 1/2, COM 120 
UL DE AMOSTRA MAIS 120 UL DE DILUENTE (QUE JÁ ESTÁ NO 
TUBO). 
 
6. TRANSFIRA 120 UL DO TUBO 1 (DILUIÇÃO 1/2) PARA O 
SEGUNDO TUBO E MISTURE BEM. 
 
7. FAÇA O MESMO PARA TODOS OS TUBOS SEGUINTES. 
 
8. QUANDO CHEGAR NO ÚLTIMO TUBO, RETIRE 120 UL, PARA NÃO 
FICAR COM 240 UL. 
 
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Para observar status imunológico, quanto mais diluído, melhor. Para 
observar agente infeccioso, quanto mais diluído, pior prognostico. 
APLICAÇÕES: 
As diluições seriadas são muito utilizadas nas análises clínicas e em 
pesquisas científicas. 
 
Em alguns exames com resultados positivos, como por exemplo 
VDRL, Coombs indireto, ASO, PCR e Fator Reumatoide (aglutinação 
em látex), a diluição seriada é utilizada para ver em qual diluição da 
série houve o último sinal de reatividade. 
 
Por exemplo: tenho um resultado de VDRL positivo. Faço a diluição 
seriada e constato que a última reatividade ocorreu na diluição de 
1/256. Esse é o resultado do exame, que a gente chama de título da 
reação 
TESTE IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) 
ELISA DIRETO OU SANDUICHE 
o É procurado o antígeno 
o Anticorpo primário é usado para capturar primeiro um antígeno 
(anticorpo de captura) 
o Um anticorpo secundário é conjugado a uma enzima que 
também reconhece epítopos no antígeno 
o Após a adição do cromógeno, um espectrofotômetro mede a 
absorbância do produto (o tanto de luz que é absorvido), que é 
diretamente proporcional à quantidade de antígeno capturado 
(a enzima, ao se juntar com o substrato, muda o ambiente de 
cor) 
o Concentrações mais altas resultam em uma cor final mais escura. 
o EX: caso um paciente com febre amarela esteja sendo 
pesquisado para essa doença, o antígeno estará ligado ao 
anticorpo. Se ligará então um segundo anticorpo, específico 
para febre amarela e ligado à um conjugado. Após os processos 
de lavagem, é colocado um substrato que reagirá com o meio, 
o mudando de cor. 
ELISA INDIRETO 
o É procurado o anticorpo. (O fluído biológico utilizado é o soro) 
o O ELISA indireto é usado para quantificar anticorpos específicos 
para antígenos no soro do paciente para o diagnóstico da 
doença. 
o O antígeno do agente de doença suspeito está ligado a placas 
de microtítulo. 
o O anticorpo primário vem do soro do paciente, que é 
subsequentemente ligado pelo anticorpo secundário conjugado 
à enzima. 
o A medição da produção do produto nos permite detectar ou 
quantificar a quantidade de anticorpo específico para o 
antígeno presente no soro do paciente. 
WESTERN BLOTTING 
o Detecção de proteínas. No caso do teste de HIV, seriam 
procuradas proteínas de partícula viral. 
o É um teste mais específico. (utilizado quando o ELISA é 
indeterminado por estar no “cutoff”) 
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TESTES RÁPIDOS 
Testes rápidos são aqueles cuja execução, leitura e interpretação 
dos resultados são feitas em, no máximo, 30 minutos. Além disso, são 
de fácil execução e não necessitam de estrutura laboratorial. 
São uteis no diagnostico clinico. 
IMUNOCROMATOGRAFIA DE FLUXO LATERAL (LATERAL 
FLOW) 
Utilizam uma membrana de nitrocelulose subdividida em quatro 
áreas. 
o Área de amostra (A), onde é aplicada a amostra e a solução 
tampão.
 
o Área intermediária (I), que contém o conjugado, 
geralmente composto de ouro coloidal ligado a anticorpos 
(imunoglobulinas).
 
o Área de teste (T), que contém os antígenos fixados à 
membrana de nitrocelulose, onde se lê o resultado da 
amostra testada.
 
o Área de controle (C), local de controle da reação e que 
permite a validação do teste. 
 
COVID-19 BUSCA DE ANTICORPOS 
O sangue é o fluido biológico utilizado para a busca de anticorpos 
COVID-19. 
 
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o Reagente: Quando houver formação de pelo menos duas linhas 
coloridas: uma na área teste (IgG ou IgM) e outra, na área de 
controle (C). 
o Não Reagente: Quando houver formaçãode uma linha colorida 
na área de controle (C). 
o Inválido: Quando NÃO houver formação de linha colorida na 
área de controle (C). 
Esses testes normalmente identificam os anticorpos da região núcleo 
capsídeo (parte que envolve o material genético do vírus), 
observando se há anticorpo anti-N sendo assim, não é indicado para 
se fazer a fim de observar a eficácia da vacina, já que estas atuam 
na proteína Spike e produzem anticorpo anti-S. (o teste resultará em 
negativo). 
COVID -19 BUSCA DE ANTÍGENO 
O fluido biológico utilizado é o swab nasofaringeo 
 
 
REFERÊNCIAS: 
https://www.biomedicinapadrao.com.br/2016/04/como-fazer-
diluicoes-seriadas.html 
Wallach 10ed Interpretação de Exames Laboratoriais