Anotacões AULA replicacao DNA

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· SLIDE 2:
· Toda e qualquer célula tem q ter capacidade de replicar o material genético para as células filhas exercerem a correta atividade.
· Cada octâmero de histonas é um nucleossomo.
· DNA + histonas = cromatina.
· Enovelamento total: cromossomo.
· SLIDE 3:
· Foco na fase S: replicação do DNA (síntese) para chegar em pontos de checagem, se tiver tudo certo ocorrer a divisão celular.
· SLIDE 4:
· Origem de replicação: cromatina esticada (para fins didáticos. nunca fica pura assim, sempre tem nucleossomos). 
· Existe algumas regiões nesse genoma com facilidade maior para se abrir (região com muito adenina e timina (duas lig de H). 
· Algumas proteínas específicas se ligam nessa região para a fita se abrir é onde se origina o processo de replicação.
· Forquilhas de replicação: exatamente a região onde essa fita dupla de DNA está se abrindo para que seja duplicada. 
· Em cada um dos 10.000 pontos duas forquilhas vão se afastar a partir desse ponto vai replicando até uma forquilha se encontrar com a outra, terminando de abrir - região genômica completamente replicada.
· SLIDE 5:
· Topisomerase: desenrola, distorce. 
· 2 polimerase (uma começa e termina e a outra é trocada de tempos em tempos)
· Complexo proteico representado em azul (uma pra esquerda e outra pra direita)
· Forquilha de replicação com característica bidirecional (uma se afasta da outra e replica o DNA)
· Fita antiga, amarela, se abrindo pela forquilha e pela enzima produzindo uma fita secundária.
· SLIDE 7:
· Fita dupla de DNA, enzima dna polimerase lê a fita que já existe e sintetiza uma nova com base na pré existente.
· As duas fitas novas vão ser compostas metade por um fita antiga e a outra metade por uma fita recém sintetizada. 
· Fita antiga foi parcialmente conservada.
· SLIDE 9:
· Uma fita dupla azul prestes a ser replicada.
· Enzima DNA polimerase atrelada a essa fita de cima, caminhando junto com a forquilha e sintetizando a fita vermelha ao passo que vai caminhando.
· Direção de síntese da DNA polimerase: 5’-3’.
· Fita molde e fita recém sintetizada sempre de 5’-3’ (fita contínua - sem interrupção. possibilita que seja sintetizada do lado certo)
· Obrigatoriamente a fita molde tem que ser 3’-5’.
· Fita molde ja está na posição ideal para que haja replicação contínua da fita.
· Já quando a fita molde esta no sentido 5’-3’ - não está na posição ideal para que a polimerase consiga sintetizar de uma vez só (só sintetiza de 5’-3’). 
· Por isso gera fragmentos de okasaki para a polimerase sintetizar passo a passo.
· Na ribose: 2 hidroxilas. 
· Na desoxirribose: uma hidroxila.
· Para que a DNA polimerase inicie sua atividade, só vai conseguir montar um nucleotídeo depois do outro, se tiver a disposição dela uma extremidade 3’ com uma ribose. Não vai funcionar se tiver uma hidroxila livre no carbono 3.
· Nesse ponto inicia a atividade da primase - se prende na região, sintetiza um pequeno fragmento de RNA (primer) - a primase consegue inserir nucleotídeo sem apoio. 
· A DNA polimerase precisa de apoio.
· Primer possibilita a disposição da hidroxila no carbono 3’ para começar a síntese de forma contínua.
· Para as duas fitas, ação da primase - livre a hidroxila no carbono 3’.
· Na fita contínua um primer de DNA é resolvido.
· Fragmentos de okasaki: Inserção de um primer, uma hidroxila OH livre ai vem a DNA polimerase e sintetiza a partir daí. A primase insere outro prime, libera outra hidroxila OH livre e vai sintetizando até chegar no fragmento que já foi realizado. 
· Na fita continua a primase atua somente uma vez.
· Na fita descontínua a primase atua várias vezes.
· A fita de cima será contínua pq o molde já está em condição ideal
· A fita debaixo descontínua.
· Cada ponto verde é um primer.
· SLIDE 10:
· DNA helicase: quebra as ligações de H entras as duas fitas e possibilita a abertura das fitas.
· Topoisomerase: manipula a estrutura do DNA para que não se enrole demais conforme é aberto pela helicase. Quebra as ligações que formam o DNA, desenrola o DNA, para possibilitar a função da helicase.
· SLIDE 11:
· DNA polimerase III é a que sintetiza de fato o DNA.
· Importante que haja mutações para ocorrer variabilidade genética (necessárias no processo evolutivo).
· SLIDE 12:
· Nessa imagem tem uma OH a mais (é uma ribose, não é de DNA é de RNA)
· O nucleotídeo de DNA será com uma OH.
· Existência do primer para permitir que haja a OH de carbono 3’ para que a DNA polimerase inicie seu trabalho.
· SLIDE 13:
· Primase vai inserir alguns nucleotídeos de RNA para ter a disposição hidroxilas de carbono 3’.
· Enzima nuclease vai remover o RNA: enzima que degrada nucleotídeo 
· Depois que remover o nucleotídeo, vem a polimerase 1 - polimerase de reparo e fecha esse buraco. Agora só tem DNA só que a ultima ligação fosfodiester, a DNA polimerase de reparo, não consegue fazer. 
· A nuclease vai preencher o buraco. Depois precisa da ligase para fazer a ultima ligação fosfodiester para fechar o buraco como um todo.
· Primer removido pela ação nuclease.
· Buraco que fica é tapado pela dna polimerase 1.
· Por fim, a ação da dna ligase para fechar o buraco.
· SLIDE 15:
· Fita semiconservativa: Dupla fita se abre, sofre a ação da DNA polimerase: fita formada metade pela antiga e metade pela nova (semiconservativa).
· SLIDE 16:
· Cada fita que está sendo sintetizada está sendo sintetizada por uma DNA polimerase diferente.
· Fita contínua: inteira sintetizando por uma única dna polimerase porque a fita molde já está na posição ideal.
· A fita debaixo, na contra mão, não tá na posição ideal - fragmentos de okasaki 
· Como que a DNA polimerase que está sintetizando a de cima consegue caminhar com a debaixo sendo que estã em sentidos opostos? Quando você tem uma fita se abrindo na forquilha, essa fita simples de cima, assim que sai da forquilha já cai direto dentro de uma dna polimerase e já passa do lado de cá ja com DNA sintetizado.
· Do outro lado, a fita debaixo está ao contrário, quando ela sai da helicase, passa por fora, vai na frente, vira ao contrario e ai sim passa dentro da DNA polimerase ao contrário - síntese para a direita até bater nas costas do fragmento anterior.
· DNA polimerase empurra essa fita pra fora, vira ao contrário e fica na posição ideal - mesma posição da de cima.
· SLIDE 22:
· O gene fmr1 codifica a proteina fmrp (intimamente relacionada com a plasticidade e manutenção de relações sinápticas).
· Se não tem essa proteína funcionando, vai fazer falta no processo de funcionamento do sistema nervoso caracterizando os problemas mentais observados.
· Síndrome de x frágil pouca ou nenhuma função dessa proteína - gene foi desligado.
· A mutação está no número de repetições CGG (tanto cgg faz com que a cromatina naquele ponto se condense de tal forma que a as proteínas que participam do processo de transcrição não conseguem reconhecer a região - gene desativado). não está no gene.
· A quantidade de cópias de cgg aparece no genoma por conta de um erro no processo de replicação (causa aumento de numero de copias de cgg, a cromatina se condensa demais e ai afeta a transcrição).
· SLIDE 23:
· Menos que 45 cópias na região anterior ao gene não afeta o indivíduo.
· A cada processo de replicação alguns erros podem ocorrer. De 45-54: zona de risco.
· Conforme essa quantidade vai aumentando, a cromatina vai se condensando mais.
· Mais de 200, cromatina tão condensada que não ocorre transcrição do gene.
· SLIDE 24:
· Região bastante descondensada, expoe o DNA - faz com q a maquinaria de transcrição consiga reconhcer a região.
· Se aumenta demais, transcrição afetada pq a cromatina está muito condensada. As proteínas que fazem transcrição não conseguem interagir com esse DNA e o gene não vai ser transcrito.
· SLIDE 25:
· Cada seta: CGG.
· Em baixo: GCC.
· Pareamento 1-1, 2-2 …
· Como as regiões são todas iguais, pode se ligar uma cada pra tras, surgindo uma bolsa de CGG que não foi pareada (CGG a mais) expansão - aumento de CGG.
· Fita resultando também vai ter um CGG a mais - processo de expansão desse CGG a cada vezque a fita da um deslize para tras.
· A fita que tá sendo recém sintetizada, se depreende momentaneamente, quando se liga, se liga 3 nucleotídeo adiante - fita recém sintetizada vai ter uma fita a menos porque a polimerase pulou uma fita - contração (diminuição de CGG).
· A ligação de H, não precisa de enzima para catalisar, só precisa das bases pareadas para se formar.
· Na hora que as fitas se juntam, pela natureza repetitiva pode se juntar um pouco para trás - formação da bolha (CGG 3 ja foi replicada, será replicado de novo. Quando essa fita for servir de molde vai ter um CGG mais longo que o normal e todos as fitas de DNA que forem sintetizadas com base nessa fita, vai ter um CGG a mais).
· Expansão a cada replicação da enzima, até que as células do sistema nervoso ficam com repetições de mais de 200 CGG.
· SLIDE 26:
· Tecnica molecular chamada de pcr - analisa o tamanho desses fragmentos - identifica em quais amostras a região está maior do que devia.
· pcr (reação em cadeia da polimerase): existe uma amplificação, milhões de cópias que acha que está com defeito, analise para ver se existe defeito ou não.
· Nesse caso: comprimento exagerado.
· Prepara um gel líquido, polimeriza (esfria e endurece). Dentro dele acaba formando uma estrutura fibrosa. Aplica nos pontos em cima (buracos), coloca amostra de DNA depois de fazer a pcr.
· Aplica-se uma corrente elétrica no gel. Faz com q o DNA caminhe em direção ao eletrodo. Esse DNA não caminha de forma homogênea. Como gel de agarose é formado por fibras, fragmentos menores do DNA migram mais rapidamente pelo gel. Fragmentos mais longos têm mais dificuldade em migrar no gel.
· Mais curta - migra rápido - chega mais longe.
· Mais longa - não migra muito.
· Da pra ver em que mostra tem número exagerado de cópias.
· No quadro A: amostra de meninos pq tem uma banda só e esse gene está presente no x.
· No quadro B: amostra de meninas - comprova q são amostras de meninas pq tem duas bandas XX (uma originada d ecada X).