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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E BIOMEDICINA Manual de aulas práticas Imunologia Clínica Professores: Áquila Carolina Fernandes Herculano Ramos Milaré Daniele Stéfanie Sara Lopes Lera Elaborado por: Maria Valdrinez Campana Lonardoni Sandra Mara Alessi Aristides Thaís Gomes Verzignassi Silveira 2021 MANUAL DE IMUNOLOGIA CLÍNICA ÍNDICE PREPARAÇÃO E PADRONIZAÇÃO DE REAGENTES................................ 1 DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DA GRAVIDEZ.......................................... 9 IMUNOHEMATOLOGIA................................................................................. 18 PROVAS REUMÁTICAS................................................................................ 25 IMUNODIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS BACTERIANAS - BRUCELOSE........................................................................................ - LEPTOSPIROSE.................................................................................. - INFECÇÕES POR ESTREPTOCOCOS.............................................. - SÍFILIS.................................................................................................. 41 43 47 52 IMUNODIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS PARASITÁRIAS - DOENÇA DE CHAGAS......................................................................... - TOXOPLASMOSE................................................................................ - LEISHMANIOSES................................................................................. - ESQUISTOSSOMOSE......................................................................... - MALÁRIA.............................................................................................. - CISTICERCOSE................................................................................... 59 64 71 74 76 77 NORMAS DE SEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE PATOLOGIA CLÍNICA.......................................................................................................... 79 3________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV PREPARAÇÃO E PADRONIZAÇÃO DE REAGENTES 1) COLHEITA DE SANGUE DE CARNEIRO Colher o sangue de carneiro esterilmente em solução Alsever, volume a volume. Distribuir em tubos estéreis com tampão de algodão hidrófobo. Armazenar em geladeira até o uso. Estável até 3 meses em geladeira. 2) PREPARAÇÃO E PADRONIZAÇÃO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS DE CARNEIRO A 2% a) Filtrar as hemácias em algodão para um tubo de centrífuga. b) Lavar as hemácias 3 vezes por centrifugação (1.500 rpm - 10 min.), com solução fisiológica. Após a última lavagem o sobrenadante deve estar límpido. c) Preparar a suspensão a 2% em solução fisiológica, p.ex., para 10 ml da suspensão: 0,2 ml da papa de hemácias + 9,8 ml de solução fisiológica. d) Conferir a concentração através de leitura no espectrofotômetro: - tomar 0,3 ml da suspensão a 2% e acrescentar 2,7 ml de água destilada. - em 545 nm, a absorbância deve ser de 0,44 ± 0,02. e) Para corrigir a suspensão a 2%, caso a D.O. não esteja nesta faixa, proceder assim: Se a D.O. for superior, acrescentar solução fisiológica.- Se, for inferior, acrescentar hemácias. - em qualquer dos dois casos, repetir o ítem "d" para conferir. f) Pode-se usar a seguinte fórmula para a correção: D.O.1 x V1 = D.O.2 x V2 V1= D.O.2 x V2 D.O.1 D.O.1: 0,44 D.O.2:obtida V2: vol. final da suspensão (10,0 - 0,3 = 9,7) Exemplos de aplicação da fórmula: Ex. 1: D.O.2 = 0,40 Ex. 2: D.O.2 = 0,50 V1 = 0,40 x 9,7 V1 = 8,8 ml V1 = 0,50 x 9,7 V1 = 11,02 ml0,44 0,44 Ambos resultados referem-se ao volume de suspensão para a quantidade de hemácias usada Portanto: V1 = 9,7 - 8,8 V1 = 11,02 - 9,7 V1 = 0,9 ml V1 = 1,32 ml Acrescentar hemácias p/ este volume ficar a 2% 18µl) Volume de solução fisiológica a ser acrescentado 3) TITULAÇÃO DA HEMOLISINA a) Materiais e reagentes: - suspensão de hemácias de carneiro padronizada a 2% 4________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV - hemolisina pura (Tubos de 1 a 5: é o soro de coelho anti-hemácia de carneiro) - soro fresco de cobaia (fonte de complemento) diluído a 1/50 - solução fisiológica - duas estantes com 15 tubos de ensaio e uma estante com 15 tubos de ensaio, em banho de gelo - banho maria a 37°C b) Diluir a hemolisina pura a 1/100 em solução fisiológica. c) Prepare sua estante com os tubos arranjados da seguinte forma: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 d) Agora distribua solução fisiológica, como indicado no esquema abaixo (observe que cada tubo recebe um volume diferente de solução fisiológica): 1 2 1 ml 3 2 ml 4 3 ml 5 4 ml 6 1 ml 7 1 ml 8 1 ml 9 1 ml 10 1 ml 11 1 ml 12 1 ml 13 1 ml 14 1 ml 15 1 ml e) Agora você vai distribuir 1,0 ml da solução de hemolisina diluída 1/100 (ver item b) nos tubos de no. 1 a no. 5 f) Observe o próximo esquema e transfira 1,0 ml de cada tubo, conforme a direção da flecha. 5________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV 1 (1/100) 2 1,0 ml (1/200) 3 2,0 ml (1/300) 4 3,0 ml (1/400) 5 4,0 ml (1/500) 6 1 ml (1/600) 7 1,0 ml (1/800) 8 1,0ml (1/1000) 9 1,0ml (1/1200) 10 1,0ml (1/1600) 11 1,0ml (1/2000) 12 1,0ml (1/2400) 13 1,0ml (1/3200) 14 1,0ml (1/4000) 15 1,0ml (1/4800) "Você terminou de fazer a diluição da hemolisina. Se colocar os tubos em ordem crescente poderá observar que embora o volume de cada tubo varie, cada um deles tem uma diluição diferente: 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/600, 1/800, 1/1000, 1/1200, 1/1600, 1/2000, 1/2400, 1/3200, 1/4000 e 1/4800." g) Terminada esta etapa, pegue outra estante com 15 tubos de ensaio numerados e transfira 0,5ml de cada diluição para o novo tubo com o mesmo número, iniciando pelo tubo no. 15 e usando a mesma pipeta. Ao final você terá as diluições em ordem crescente, de 1/100 até1/4800, e volumes iguais em todos os tubos. h) Na próxima etapa você deve acrescentar 0,5ml de uma suspensão de hemácias de carneiro padronizada a 2% a cada tubo. "Nesta etapa você está sensibilizando as hemácias com doses cada vez menores de anticorpos. Qual será o tubo que contém a concentração ideal de hemolisina (anticorpos)?" i) Para descobrir isso você vai incubar os tubos em banho-maria a 37o.C por 30 minutos. j) Use este tempo para preparar outra estante com 15 tubos numerados, em uma bandeja com gelo. Distribua em cada tubo 0,5ml de uma solução contendo o soro fresco de cobaia (é a fonte do complemento) diluído 1/50 ATENÇÃO!!! l) Quando terminar o tempo de incubação retire a estante do banho-maria agite bem e transfira 0,2ml de cada tubo contendo a suspensão de hemácias para o tubo correspondente contendo o complemento. Inicie pelo tubo no. 15. Use a mesma pipeta. 6________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV m) Leve em banho-maria a 37o.C durante 30minutos. n) Ao término deste tempo, retire a estante do banho-maria, agite bem e faça a leitura: Observe todos os tubos e verifique qual apresenta hemólise total. Exemplo: Hemóliseaté o tubo no. 4 diluição: 1/400 Então a diluição de hemolisina capaz de sensibilizar as hemácias de forma adequada, fixando o complemento é 1/400. A diluição 1/400 da hemolisina é considerada 1 unidade. Nas reações são usadas 2 unidades de hemolisina. RESPONDA: Na titulação da hemolisina que você fez, qual diluição de hemolisina contém duas unidades? ...................................................................................................................................................................... Veja o cálculo: - exemplo com hemólise até o tubo n° 8: 1 unidade hemolisina diluída 1000 vezes 2 unidades hemolisina diluída 500 vezes Portanto, quando você for fazer uma reação que use o "Sistema Hemolítico" ou "Sistema Indicador" (como a reação de Waaler-Rose e a Reação de Fixação do Complemento) você deve diluir a hemolisina a 1/500, ou seja, 500 vezes. 4) PREPARO DO SISTEMA HEMOLÍTICO OU INDICADOR: a) Em primeiro lugar observe a reação que você vai fazer: qual o volume de sistema hemolítico ou indicador você vai usar?________________________________________________________________ b) Definido o volume, pegue um tubo de ensaio de volume apropriado e misture, aplicando a regra: 5) TITULAÇÃO DO COMPLEMENTO a) Materiais e reagentes: - soro fresco de cobaia (fonte de complemento) diluído a 1/50 - solução fisiológica gelada - bateria com 10 tubos de ensaio em banho de gelo - banho Maria a 37° C - sistema hemolítico preparado como no item "4" "Não se esqueça! O Sistema hemolítico deve ser preparado 30 min antes do uso." b) Diluir o soro de cobaia a 1/50 em solução fisiológica gelada. Tubo com hemólise -Hemácias não íntegras -Conteúdo transparente. Tubo sem hemólise -Hemácias íntegras -Conteúdo opaco Uma parte de hemolisina diluída de modo a conter 2 unidades Agitar e incubar a 37°C por 30 minutosUma parte de suspensão de hemácias de carneiro a 2% 7________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV c) Distribuir conforme o esquema: Tubo Complemento 1/50 Sol. fisiológica Sistema Hemolítico 1 0,05 0,45 0,2 2 0,10 0,40 0,2 3 0,15 0,35 Incubar 0,2 Incubar 4 0,20 0,30 60min minutos 0,2 30min 5 0,25 0,25 a 37°C 0,2 a 37°C 6 0,30 0,20 0,2 7 0,35 0,15 0,2 8 0,40 0,10 0,2 9 0,45 0,05 0,2 10 0,50 - 0,2 c) Leitura: o primeiro tubo com hemólise completa contém 1 unidade de complemento d) Na reação de Fixação do Complemento são usadas 2 unidades de C’: Veja o cálculo: Cálculo de 2 unidades: - Como o volume de complemento diluído usado na reação de Fixação do Complemento é de 0,2 ml, deve ser feito o cálculo para este volume: 0,3 ml de complemento diluído 50 vezes 0,20 ml de complemento diluído x vezes X= 33,3 Portanto, o complemento puro (soro de cobaia) deve ser diluído 1/33 6) PREPARAÇÃO DE LÂMINAS PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA E FIXAÇÃO DO ANTÍGENO Para imunofluorescência são usadas lâminas extrafinas e quadriculadas. Antes da fixação do antígeno, as lâminas devem ser mergulhadas em álcool e enxugadas uma a uma. Uma vez colocado o antígeno (volume e concentração pré-determinadas), a lâmina deve ser mantida a temperatura ambiente ou a 37°C para fixação do antígeno. Após a fixação, as lâminas são acondicionadas em papel impermeável, posteriormente em papel alumínio e armazenadas em freezer (pacotes com cerca de 5 lâminas). 7) TITULAÇÃO DO CONJUGADO PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA A quantidade de conjugado empregada na reação de imunofluorescência indireta deve ser exata, dando um máximo de fluorescência, sem apresentar colorações inespecíficas. Para se determinar a quantidade, ou seja, a diluição ideal do conjugado, deve-se fazer a sua titulação. Normalmente, os conjugados comerciais trazem pré-determinado seu título. É necessário adaptá-lo às condições de trabalho do laboratório, re-titulando com cada antígeno e soros controles próprios. 1 unidade no tubo 3 .......................contém 0,15 ml de C’ 1/50 2 unidades .....................................contém 0,3 ml de C’ 1/50 8________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV Antes de ser titulado, o conjugado deve ser diluído com glicerina pa, distribuído em alíquotas que devem ser conservadas em freezer (-20°C). Para a titulação, fazem-se diluições do soro controle positivo e do soro controle negativo, e diluições do conjugado em estudo, próximas ao título pré-determinado pelo fabricante. Executa-se a reação para cada antígeno específico. 8) TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Titulação de Conjugado 1- Materiais e reagentes: - lâminas quadriculadas contendo o antígeno fixado, mantidas a - 20°C; - conjugado antigamaglobulina humana; - Azul de Evans, PBS pH 7,2; - soros controle negativo e positivo de título conhecido; - glicerina alcalina, lamínula, câmara úmida e pipetas. 2- Técnica: a- Preparar diluição do soro controle negativo em PBS (esta diluição é sempre igual a primeira diluição do soro positivo); b- Diluir o soro controle positivo conforme o esquema: Tubos 1 2 3 4 PBS (ml) ..... ..... ..... ..... Soro (ml) ..... - - - Transferir (ml) - ..... ..... ..... Diluição 1/..... 1/..... 1/..... 1/..... c- Transferir cada diluição para um dos quadradinhos da lâmina; d- Incubar em câmara úmida a 37°C por 30 minutos; e- Lavar 3 vezes em PBS, sendo de 5 minutos cada lavagem; f- Enxaguar a lâmina com água destilada; g- Secar cuidadosamente a lâmina; h- Diluir o conjugado conforme o esquema: Tubos Conjugado Volume Conjugado Dil. Inicial Azul de Evans Volume Diluição Final 1 .............l 1/............ .............l 1/............ 2 .............l 1/............ .............l 1/............ 3 .............l 1/............ .............l 1/............ 4 .............l 1/............ .............l 1/............ i- Adicionar o conjugado diluído para cada quadradinho da lâmina conforme o esquema abaixo; j- Repetir os ítens d, e, f e g; k- Colocar uma gota de glicerina alcalina, cobrir com lamínula. 9________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV 3- Leitura: a- A reação será positiva quando, em pelo menos 20 campos, 50% ou mais dos antígenos apresentarem fluorescência. O padrão da fluorescência dependerá do antígeno utilizado. Na reação negativa o antígeno apresenta-se vermelho. b- Anotar os resultados no esquema a seguir: Soros Conjugado Positivo Negativo 1/...... 1/...... 1/...... 1/...... 1/...... 1/...... ................ ................ ................ ................ ................ 1/...... ................ ................ ................ ................ ................ 1/...... ................ ................ ................ ................ ................ 1/...... ................ ................ ................ ................ ................ c- Título: O título do conjugado será dado pela maior diluição do conjugado na qual o soro positivo apresenta seu título correto e o soro negativo apresenta-se negativo. 10________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV PREPARAÇÃO DE REAGENTES a) Salina Fisiológica Solução Estoque (5 vezes concentrada) NaCl ...................................42,50 g água destilada q.s.p........... 1000 ml Solução Uso (0,85%) Solução Estoque .............. 200 ml água destilada q.s.p. ...... 1000 ml b) Tampão Fosfato pH 7,2 (PBS - PhosphateBuffered Saline) Solução Estoque (4 vezes concentrada) Na2HPO4. 12H2O ..........................11,10 g NaH2PO4.H2O ..................................1,56 g NaCl ...............................................32,68 g água destilada q.s.p. ............................1000 ml Solução Uso Solução Estoque ..............................250 ml Água destilada q.s.p. .......................1000 ml Ajustar o pH para 7,2. c) Azul de Evans Solução Estoque Azul de Evans ......................................10 mg Tampão Fosfato pH 7,2 q.s.p. .............100 ml Conservar em geladeira. Solução Uso Solução Estoque........................................ 10 ml Tampão Fosfato pH 7,2 q.s.p. ........1000 ml Conservar em geladeira. Azul de Evans com Tween 80 Tween 80............................................2 ml Azul de Evans Uso q.s.p. ...............100 ml conservar em geladeira. d) Glicerina Alcalina Glicerina....................................................90 ml Tampão Carbonato-bicarbonato.................10 ml Tampão Carbonato-Bicarbonato pH 8,7 Solução "A": Na2CO3 0,5M Na2CO3 ............................5,3 g água destilada q.s.p. ... 100 ml Solução "B": NaHCO3 0,5M NaHCO3 ......................... 4,2 g água destilada q.s.p. 100 ml Solução Uso Solução "A" ......... 0,4 ml Solução "B" .......... 10 ml Acertar pH para 8,7. e) Solução Alsever Dextrose ................................. 2,05 g Citrato de Sódio .......................0,84 g Cloreto de Sódio ..................... 0,42 g Àgua destilada q.s.p. ............... 100 ml Ajustar o pH para 6,1 com solução de ácido cítrico a 5%. Esterilizar em autoclave 110°C durante 15 minutos no frasco para colheita de sangue de carneiro. DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DA GRAVIDEZ 11________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV O diagnóstico imunológico da gravidez fundamenta-se no achado do hormônio gonadotrofina coriônica (hCG) na urina e sangue da mulher. O hCG é um hormônio pré-hipofisário e ovariano, quimicamente definido como uma sialoglicoproteína produzida por células de Langhans da vilosidade coriônica da placenta e secretada para sangue e urina. Tem peso molecular de aproximadamente 46 kDa, cujos níveis se elevam durante a gravidez. É secretada inicialmente pelas células trofoblásticas de blastócitos em desenvolvimento logo após a fixação do óvulo fertilizado à parede uterina, e mais tarde pelas células sincitiotrofoblásticas da placenta. O hCG humano é constituído por 2 subunidades não idênticas, as quais são designadas e . Estas duas subunidades diferem tanto estrutural como imunologicamente. Devido à similaridade estrutural da subunidade com outros hormônios (LH, FSH e TSH), muitas vezes os testes podem apresentar reações cruzadas, falseando os resultados. Em contraste, a subunidade beta determina a especificidade biológica e imunoquímica. O hCG desempenha um importante papel na manutenção do corpo lúteo, o qual suporta a gravidez pela produção de progesterona e estradiol. Parece também estimular a formação de células de Leidig e produção de testosterona no feto masculino. Imunizando-se coelhos com hCG altamente purificado ou pela produção de anticorpos monoclonais, obtém-se anti-soros específicos, utilizados em testes imunológicos para o diagnóstico da gravidez. Os valores de hCG na urina e no soro de homens e de mulheres sã, não grávida são inferiores a 5 mUI/ml. Os níveis de -hCG entre 5 e 25 mUI/mL podem ser indicativos de uma gravidez inicial. Títulos mais elevados aparecem no sangue e na urina, ao redor da sétima semana de gestação, persistindo até a décima segunda semana, e depois decaindo até a negativação, no final da gravidez. Podem aumentar até mais de 100.000 mUI/mL no primeiro trimestre. Durante o primeiro trimestre de gravidez, a análise semiquantitativa e quantitativa de hCG ajuda no prognóstico de aborto. Quando se alcançam os níveis mais elevados de hCG, ao redor de 50 a 90 dias após o último período menstrual, um achado inferior a 3.000 mUI/mL na urina de 24 horas associa-se com um aborto inevitável. Se for empregada a primeira urina da manhã, ao invés da urina de 24 horas, níveis de hCG menores que 5.000 mUI/mL sugerem que a gestação é inviável. Um aborto inevitável pode apresentar, a princípio, valores normais de hCG, que depois diminuem com o curso dos dias. Portanto, para ter valor prognóstico, a análise semiquantitativa deve ser realizada em dias sucessivos. A determinação semiquantitativa ou quantitativa de hCG também é útil no diagnóstico de carcinomas uterinos como a MOLA HIDATIFORME. Embora alguns pacientes com MOLA HIDATIFORME apresentem valores muito elevados de hCG urinário (superiores a 6.000 mUI/mL), a maioria tem taxas semelhantes as da gravidez normal e alguns tem mesmo taxas relativamente baixas (5 mUI/mL). Para o diagnóstico diferencial dos processos com valores elevados de hCG, ajuda o fato de que durante a gravidez normal, a seqüência analítica tende a uma curva uniforme, enquanto que nas enfermidades trofoblásticas, a repetição de análises durante várias semanas mostra flutuações irregulares. O CORIOCARCINOMA‚ um tumor maligno raro, procedente do tecido trofoblástico, se desenvolve em mulheres a partir da mola hidatiforme. No homem, o CORIOCARCINOMA‚ é um tumor testicular raro, porém muito maligno. Em ambos os sexos, a maioria dos CORIOCARCINOMAS dão valores elevados de hCG ou valores normais de uma gravidez. Entretanto, não se pode detectar hCG em alguns casos. Tem sido comunicado casos de TERATOMAS OVARIANOS e TESTICULARES, SEMINOMAS e CARCINOMAS EMBRIONÁRIOS com índices elevados de hCG urinário. Estes se devem, talvez, a pequenos focos de coriocarcinomas que tenham passado despercebidos durante o estudo histológico. 12________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV Todos os homens com tumores testiculares deveriam submeter-se a uma prova de sensibilidade para hCG, como ajuda para o diagnóstico. O hCG também pode ser detectado em várias neoplasias, por exemplo, de mama, pulmão, próstata, fígado, estômago e intestino. Quando um coriocarcinoma é tratado com êxito, ocorre uma diminuição progressiva do hCG urinário. Persistência de excreção associa-se com a persistência do tumor, metástase ou recidivas. Valor muito elevado sugere prognóstico desfavorável. Vários métodos são empregados para se determinar a gravidez: - Teste de inibição da hemaglutinação; - Teste de inibição da aglutinação de partículas de látex revestidas com hCG; - Testes imunoenzimáticos (EIA, MEIA); - Radioimunoensaio (RIE). - Test Pack (ELISA e Cromatográfico) - Strip Test (Cromatográfico) Existem disponíveis comercialmente reagentes de qualidade, mas a sensibilidade varia de acordo com o método. Teste Sensibilidade Teste de inibição da hemaglutinação 200 - 700 mUI/mL de hCG Detecta gravidez após 5 dias de atraso menstrual; Teste de inibição de partículas de látex 1500 - 8000 mUI/mL de hCG Detecta gravidez 10 a 12 dias após o atraso menstrual; Teste imunoenzimático 50 mUI/mL de hCG Detecta gravidez uma semana após a concepção; RIE 25 mUI/mL de hCG Detecta gravidez 5 a 6 dias após a concepção; Test Pack 50 mUI/mL de hCG Detecta gravidez uma semana após a concepção; Strip Test 25 a 50 mUI/mL Pode detectar gravidez uma semana após a concepção. COLHEITA E PREPARO DA AMOSTRA (URINA) Deve ser colhida uma amostra da primeira urina da manhã em recipiente limpo, sem traços de detergente. As amostras devem ser testadas logo que possível. Se a amostra permanecer durante longo período (8 horas ou mais) à temperatura ambiente, o hCG pode perder sua atividade, levando a resultados falsos negativos. As amostrasdevem ser refrigeradas entre 2-8°C, por um período que não ultrapasse 72 horas. O hCG é estável durante muitos meses a -20°C, porém, aconselha-se que sejam descartadas todas as amostras após o degelo. As amostras liofilizadas são estáveis indefinidamente. Não se pode utilizar conservantes para a urina. Amostras altamente contaminadas por bactérias não devem ser submetidas ao teste. Ao se executar o teste semiquantitativo, deve ser usada urina de 24 horas para maior exatidão na medida do hormônio excretado. Em testes de inibição da aglutinação, níveis elevados de proteína, hemoglobina, glicose, bilirrubinas e glicoproteínas como LH, TSH, FSH ou GH na urina podem reduzir a intensidade de aglutinação, produzindo 13________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV resultados falsos positivos. Recomenda-se, assim, testar amostras que não contenham níveis anormais destas substâncias. Resultados falsos positivos e falsos negativos, observados em testes menos sensíveis e específicos, foram relatados em pacientes sob tratamento com drogas como: fenotiazínicos, prometazina, clorpromazina, psicotrópicos, beta-bloqueadores, anticoagulantes, acetaminofen, ácido acetilsalicílico, ácido ascórbico, atropina, cafeína e ácido gentísico. REAÇÃO DE INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO Princípio: O hCG é ligado quimicamente às partículas de látex ou às hemácias, sensibilizando-as. Na presença de hCG livre na urina, a aglutinação é inibida, pois os anticorpos anti-hCG adicionados são neutralizados, sendo a reação POSITIVA. Quando a concentração de hCG na urina for inferior a sensibilidade do método, haverá aglutinação, sendo a reação NEGATIVA. 1) urina contendo hCG + anti-hCG = antígeno-anticorpo 2) antígeno-anticorpo + hemácia-hCG ou látex-hCG = não aglutinação = POSITIVO OU 1) urina sem hCG + anti-hCG = anticorpo livre 2) anticorpo livre + hemácias-hCG ou látex-hCG = aglutinação = NEGATIVO INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO Técnica qualitativa: 14________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV 1) Centrifugar a urina a 2000 rpm durante 10 minutos. Utilizar o sobrenadante para o teste ou filtrá-la. 2) Deixar os reativos à temperatura ambiente. 3) Homogeneizar bem os reativos. 4) Colocar 20 L do soro anti-hCG na área delimitada de uma lâmina de fundo escuro. 5) Acrescentar 20 L da urina. 6) Misturar bem utilizando um bastão. 7) Oscilar a lâmina levemente, com movimentos circulares, durante 30 segundos. 8) Acrescentar 20 L do antígeno (partículas de látex sensibilizadas com hCG). 9) Misturar bem com um bastão, e oscilar a lâmina, em movimentos circulares e delicados para que a mistura anti-soro + urina + antígeno se movimentem na lâmina. 10) Verificar a ocorrência de aglutinação, que deve acontecer em até 2 minutos após a mistura. 11) Empregar controles positivos e negativos. Não usar solução salina fisiológica como controle negativo, pois não reproduz os constituintes da urina. 12) RESULTADO: Se houver aglutinação o teste será NEGATIVO, se não houver aglutinação o teste será POSITIVO. DETERMINAÇÃO SEMIQUANTITATIVA DO hCG 1) Colher urina de 24 horas, homogeneizar e retirar uma alíquota. 2) Preparar diluições seriadas (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, ...) em solução salina fisiológica. 3) Executar o teste pelo método qualitativo para cada diluição. 4) O resultado final é determinado pela maior diluição da urina que apresentar resultado POSITIVO (não aglutinação). 5) Resultado semi-quantitativo é dado pela seguinte fórmula: UI/l = S x D S = Sensibilidade do teste D = Recíproca da diluição positiva Exemplo: S = 2.000 UI/L (sensibilidade média do kit) D = 16 (urina positiva até 1/16) UI/L = 2.000 x 16 UI/L = 32.000 Interpretação: Valores abaixo da faixa normal indicam possíveis anormalidades na gravidez. Valores de hCG inferiores a 10.000 mUI/mL são prognosticamente desfavoráveis entre a oitava e décima sexta semana de gravidez. Objetivos da determinação semi-quantitativa de hCG: 15________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV - acompanhamento da gravidez em casos de aborto freqüente e ameaça de aborto entre a oitava e décima semana de gravidez; - suspeita de mola hidatiforme e corioepitelioma; - gravidez ectópica; - menopausa com aumento de excreção de hMG (Human Menopausal Gonadotropin) de origem hipofisária. REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO DE PARTÍCULAS DE LÁTEX Princípio do método: Diagnóstico da gravidez em amostras de urina usando partículas de látex revestidas com anticorpo monoclonal anti-hCG por aglutinação indireta. Sensibilidade: Concentração superior a 200 mUI/mL. Material necessário: - Suspensão de látex revestida com anticorpo monoclonal anti-hCG - Urina controle positivo - Urina controle negativo - Espátulas plásticas - Cartões testes Procedimento: Deixar o kit em temperatura ambiente e homogeneizar bem o látex reagente antes de usar. Pipetar 25 L da urina a testar em uma área do cartão teste. Homogeneizar o reagente de látex e pipetar 25 L na mesma área da amostra. Com uma espátula plástica misturar muito bem a urina e o látex. Fazer movimentos suaves de rotação, sob uma boa fonte de luz, observar durante 2 minutos a formação de aglutinação. Para cada série de testes deve-se fazer um controle positivo e negativo para verificar a correta execução da técnica e o estado de conservação dos reagentes. Esquema: Urina + Látex-hCG = Aglutinação = POSITIVO 16________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV Resultados: Resultado positivo: aglutinação nítida do látex Resultado negativo: total ausência de aglutinação Resultado duvidoso: aglutinação tênue do látex. Deve-se repetir o teste com nova amostra urina, colhida 3 a 5 dias após a coleta anterior. Semanas após o último período menstrual Variação aproximada de hCG (mUI/mL) 3 - 4 semanas 9 - 130 4 - 5 semanas 75 - 2.600 5 - 6 semanas 850 - 20.800 6 - 7 semanas 4.000 - 100.200 7 - 12 semanas 11.500 - 289.000 12 - 16 semanas 18.300 - 137.000 16 - 29 semanas (2° trimestre) 1.400 - 53.000 29 - 41 semanas (3° trimestre) 940 - 60.000 Referência: Bula do Kit de -hCG Total (Microparticle Enzyme Immunoassay MEIA) da ABBOTT TEST PACK – hCG Card Princípio: Teste rápido, imunocromatográfico para determinação qualitativa de hCG em soro ou urina – fração beta. O ensaio imunocromatográfico é baseado no princípio de enzimaimunoensaio por “sanduíche” para a detecção de hCG. O teste consiste em uma membrana pré-sensibilizada com um anticorpo monoclonal de camundongo anti-hCG na zona de teste, com anticorpo policlonal IgG de cabra anti- camundongo na zona de controle e também com um anticorpo monoclonal anti-hCG conjugado com ouro coloidal. A amostra é adicionada e se move ao longo da membrana, por capilaridade, junto ao conjugado com ouro coloidal até atingir o anticorpo monoclonal na zona de teste. O antígeno, se presente na amostra, liga-se ao anticorpo monoclonal da zona de teste e ao anticorpo conjugado com ouro coloidal formando um “sanduíche”. Neste ponto há a formação de uma linha de coloração avermelhada, indicando um teste positivo. Sensibilidade: 20 – 25 mUI/mL Procedimento: - Deixar as amostras e o kit estabilizarem à temperatura ambiente; - Abrir a embalagem e retirar o card e a pipeta descartável; - Dispensar 4 gotas (200 L) de soro ou urina na cavidade para amostras com a pipeta descartável na posição vertical; - Aguardar o aparecimentode linhas coloridas. Dependendo da concentração de hCG na amostra, poderão ser observados resultados positivos dentro de 40 segundos; - Ler o resultado em 10 minutos. Desconsiderar resultados lidos após este tempo. 17________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV STRIP TEST - hCG Princípio: teste da fita (Tira) – Cromatográfico Sensibilidade: concentrações 25 - 50 mUI/mL na urina. Procedimento: -Pegar uma fita e colocá-la num tubo contendo a urina; -Deixar a fita na urina durante 5 minutos; -Tirar a fita da urina e proceder a leitura. Cavidade de Local de visualização do Local para identificação do paciente C D C D C D POSITIVO NEGATIVO INVÁLIDO Amostra de urina Nível máximo de urina Zona de reação 18________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV Resultados: DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DO -hCG – TOTAL Método: Enzima Imunoensaio de Micropartículas (MEIA; Abbott – Axsyn -hCG Total) Material: Soro ou plasma humano. Procedimento técnico: Vide instruções do fabricante. Sensibilidade: Este teste foi calculado para ser 2,0 mUI/mL Princípio: É fundamentado na tecnologia do imunoensaio enzimático de Micropartículas (MEIA). O soro contendo ou não -hCG e o conjugado anti--hCG : fosfatase alcalina e anti--hCG ligado às micro- partículas são incubados nas células de reação. O -hCG liga em ambos anticorpo marcado com enzima e a anticorpo ligado à micro-partícula formando um complexo Ac-Ag-Ac. O substrato, 4-methylumbelliferyl phosphate, é adicionado na matrix e o produto fluorescente é medido pelo sistema óptico do aparelho. NEGATIVO Linha de controle Linha do resultado POSITIVO 19________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV IMUNOHEMATOLOGIA A composição antigênica dos tecidos no homem é muito complexa e variada. A variabilidade encontrada é definida por herança genética. As técnicas empregadas na demonstração desta variabilidade permitem caracterizar praticamente a individualidade biológica do homem, embora não seja possível a demonstração de todos os sistemas. A complexidade antigênica das hemácias humanas é menor que a dos tecidos, o que facilita na prática a transfusão sangüínea sem a necessidade do uso de terapia imunossupressora. O sistema “ABO”, o mais importante, possui padrão de herança do tipo Mendeliana com codominância. Sua expressão é representada por 2 genes (paterno e materno) compartilhados com três alelos possíveis de combinações. Os alelos “A” e “B” são codominantes. Isto significa que o indivíduo de fenótipo “A” pode possuir um genótipo “AA” ou “AO” e o indivíduo “B” pode possuir um genótipo “BB” ou “BO”. O alelo “O” é recessivo, isto é, “OO”. A demonstração do fenótipo “ABO” é baseada em testes sorológicos, mais especificamente através de uma reação de aglutinação direta entre um antígeno e um anticorpo específico. A verdadeira função destes antígenos nas membranas das células é ainda desconhecida. Os anticorpos pertencentes ao sistema “ABO” (naturais ou imunes), têm a temperatura ótima de ação, para aglutinação, a 20°C. DETERMINAÇÃO DA COMPATIBILIDADE SANGUÍNEA Tem o objetivo de selecionar doadores para a transfusão de sangue. Pode-se efetuá-la pelas provas diretas: determinação dos grupos a que pertencem o doador e o receptor e pelas provas indiretas ou cruzadas, que permitem confirmar a primeira. 1) DETERMINAÇÃO DOS GRUPOS SANGUÍNEOS DO SISTEMA “ABO” O procedimento pode ser realizado em lâminas ou em tubos. a) Técnica para o teste em lâmina -Preparar uma suspensão de hemácias a 3 a 5% (50L de sangue total + 1 mL de solução fisiológica) ou em seu próprio soro ou plasma ou empregar o próprio sangue total. - Colocar em uma lâmina de microscopia bem limpa, uma gota de soro anti-A, uma gota de soro anti-B e uma gota do anti-AB. - A cada gota acrescentar uma gota de suspensão de hemácias ou sangue total do paciente. - Misturar bem, individualmente, o sangue e o soro de cada tipo com espátulas plásticas. - Assegurar-se de ter obtido uma mistura perfeita entre soro e sangue, fazendo oscilar a lâmina com movimentos circulares. - Os testes que não mostrarem aglutinação devem ser mantidos sob observação por mais dois minutos. Não interpretar secagem periférica como aglutinação. b) Técnica para o teste em tubo de ensaio 20________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV - Preparar a suspensão de hemácias de 3 a 5% (50L de sangue total + 1 mL de solução fisiológica). Colocar 50l da suspensão em três tubos. Ao tubo 1 acrescentar uma gota de soro anti-A. Ao tubo 2 acrescentar uma gota de soro anti-B e ao tubo 3, uma gota de anti-AB. - Centrifugar os tubos a 1.000 rpm por 1 minuto. - Observar a presença ou não de aglutinação. - O tubo que apresentar aglutinação com o anti-soro A, ou com anti-soro B indica que o indivíduo possui antígeno A ou B na superfície de suas hemácias. Se apresentar aglutinação com os anti-soros A e B, o indivíduo possui os antígenos A e B em suas hemácias. Nestas três situações deve ocorrer aglutinação com o anti-AB. Se não apresentar aglutinação com estes anti-soros, o indivíduo não possui os antígenos A e B em suas hemácias. 2) DETERMINAÇÃO DOS ANTÍGENOS Rh (D e D fraco) - O método em tubo é melhor do que o método em lâmina. - Os anticorpos imunes do sistema Rh (salinos ou albuminosos ou incompletos) aglutinam em temperatura ótima de 37°C. 2.1) Técnica para o antígeno Rh: a) Técnica para o teste em lâmina: - Preparar uma suspensão de hemácias 3-5% em salina fisiológica ou empregar o sangue total. - Em lâmina pré-aquecida (40 - 50°C) colocar uma gota de soro anti-Rh (Anti-D). - Acrescentar uma gota de suspensão de hemácias. - Misturar bem. Agitar a lâmina com movimentos de rotação. - Os testes que não apresentarem aglutinação deverão ser observados por mais 2 min. Não interpretar secagem periférica como aglutinação. - Se o teste for negativo (não aglutinação), fazer o teste para detecção do D fraco (Variante Du) b) Técnica para o teste em tubo de ensaio: - Preparar uma suspensão de hemácias 3 a 5% em salina. - Colocar 50 l desta suspensão em dois tubos. - Colocar uma gota de soro anti-Rh no tubo 1 e uma gota de controle do Rh no tubo 2. - Centrifugar a 1.000 rpm por 1 min. - Examinar os tubos, fazendo a suspensão oscilar levemente e anotar se ocorreu aglutinação. - Se aglutinar o paciente é Rh positivo. - Se não aglutinar, incubar a 37°C por 15 min., centrifugar e reexaminar. - Se não ocorrer aglutinação, a reação deve prosseguir para a pesquisa de possível presença de D fraco. 2.2) Técnica para o antígeno D fraco: 21________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV - Preparar três tubos com 50 L da suspensão de hemácias. Acrescentar no tubo 1, uma gota de soro anti-Rh, ao tubo 2 uma gota de soro anti-Rh e uma gota de albumina e ao tubo 3 uma gota de controle de Rh. - Acrescentar uma gota de soro de Coombs em cada tubo, agitar levemente os tubos. - Centrifugar a 1.000 rpm por 1 min. - Realizar a leitura. Interpretação: - Não aglutinação nos dois primeiros tubos: Rh negativo. - Aglutinação nos tubos 1 e 2: D fraco (Rh positivo). - Aglutinação nos três tubos: a interpretação deve ser feita como na prova de Coombs Direto positivo, o qual indica estarem as hemácias em exame previamentesensibilizadas. Essas hemácias não podem ser testadas com segurança quanto a presença do antígeno Du. - Algumas vezes, um indivíduo classificado pela tipagem sangüínea como Rh negativo, possui em menor proporção antígenos D na superfície de suas hemácias. Em transfusões sangüíneas estes indivíduos reagem como aqueles Rh positivos (eles tem o antígeno D na superfície de suas hemácias), são “D fraco”. Isto é, indivíduos “D fraco” positivos podem ser erroneamente classificados como Rh negativos devido às dificuldades das ligações dos anticorpos anti-D com o antígeno D. 3) DETERMINAÇÃO DAS AGLUTININAS SÉRICAS: PROVA DA TIPAGEM REVERSA Seu emprego, simultâneo com a pesquisa de aglutinogênios globulares, proporciona maior segurança na determinação dos grupos sangüíneos. As aglutininas séricas são pesquisadas com glóbulos conhecidos do grupo A e do grupo B. TÉCNICA: - Obter o sangue do paciente por punção venosa sem anticoagulante, centrifugar para obter o soro e inativá-lo a 56°C por 30 min. - Obter suspensões de glóbulos dos grupos A e B com anticoagulante. Separar o plasma e com o sangue preparar suspensões a 3 a 5% em solução fisiológica. Reação em lâmina: - Misturar 50 L das suspensões A e B com 50 L do soro. - Homogeneizar com bastonete plástico e observar a aglutinação. Reação em tubo: Misturar 50L das suspensões A e B (3 a 5%) com 50L do soro em dois tubos de ensaio para cada suspensão. Agitar levemente os tubos e observar a aglutinação. Para melhor visualização, centrifugar a 1.000 rpm por 1 min. Se não ocorrer aglutinação dos glóbulos dos dois grupos, o soro desconhecido não contém as aglutininas anti-A e anti-B, pertencendo ao grupo AB. Se forem aglutinados os glóbulos do grupo B, o soro 22________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV desconhecido contém a aglutinina anti-B, pertencendo ao grupo A. Se há aglutinação apenas dos glóbulos do grupo A, o soro desconhecido só contém a aglutinina anti-A, pertencendo ao grupo B. Se forem aglutinados os glóbulos de ambos os grupos, o soro desconhecido possui ambas as aglutininas, pertencendo ao grupo O. Os anticorpos anti-A e anti-B identificados são chamados de completos ou naturais (IgM) e requerem apenas as células e salina para a reação. Estes anticorpos são também da variedade incompleta ou imune (IgG) e requerem albumina ou soro antiglobulina ou ainda enzimas proteolíticas para desenvolver reação. 4) PROVAS DE COOMBS Existem duas modalidades de prova de Coombs: a direta e a indireta. A prova direta se destina a demonstrar anticorpos fixados nas hemácias quando há suspeita de Doença Hemolítica do Recém-Nascido (DHRN) ou de qualquer outra forma de anemia de base imunológica (AHAI). A prova indireta é usada para demonstrar a existência de anticorpos bloqueadores no soro de uma gestante Rh negativa, suspeita de estar sensibilizada pelos antígenos do sistema Rh. 4.1) Reação de Coombs Direto: - Colher sangue do paciente, em um tubo simples, com anticoagulante (EDTA) e deixar à temperatura ambiente. - Preparar uma suspensão de 3 a 5% com o sangue (50 L de sangue total + 1 mL de salina fisiológica). - Colocar 50L desta suspensão de hemácias em um tubo. - Lavar três vezes com salina. - Após a última centrifugação decantar completamente o sobrenadante. - Acrescentar uma gota de soro de Coombs ao sedimento e homogeneizar. - Centrifugar a 1.000 rpm por 1 min. - Observar presença ou ausência de aglutinação. - Se aglutinar, significa que as hemácias estão sensibilizadas. 4.2) Reação de Coombs Indireto: - Em dois tubos de ensaio colocar 50 L de soro do paciente. - Acrescentar nestes dois tubos 50 L de uma suspensão de hemácias 3 a 5%, tipo "O", Rh positivo. - No tubo n° 2 adicionar 1 gota de solução de albumina bovina a 22%. - Deixar os tubos incubando a 37°C por 15 minutos. - Lavar os tubos três vezes com salina, desprezando completamente o sobrenadante após a última centrifugação. - Acrescentar uma gota de soro de Coombs sobre o sedimento. - Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto. - Observar presença ou ausência de aglutinação. Interpretação: - Aglutinação: indica presença de anticorpos anti-D no soro da paciente. 23________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV Observação: Pode-se também determinar o título de anticorpo, fazendo-se diluições do soro (1/2, 1/4, 1/8...). 5) DETERMINAÇÃO DA PROVA CRUZADA A transfusão de sangue será possível sempre que as hemácias do doador não forem aglutinadas pelo soro do receptor. Mesmo que ocorra uma compatibilidade teórica quanto aos sistemas ABO e Rh, entre os sangues do doador e do receptor, podem ocorrer reações resultantes de incompatibilidades ocasionais relacionadas a outros sistemas (Kell, Duffy, Lewis, M, I, Kidd, etc.), aglutininas atípicas (crioaglutininas), subgrupos, e por esta razão, é conveniente a realização da prova de compatibilidade prétransfusional pela prova cruzada. Dois tipos de provas cruzadas: a prova cruzada maior e a prova cruzada menor. A prova cruzada maior é fundamental para a transfusão. Ela consiste em reagir hemácias do doador com o soro do receptor (na presença ou ausência do soro de Coombs). De menor importância, tem-se a prova cruzada menor que consiste na mistura das hemácias do receptor com o soro do doador (com ou sem soro de Coombs). A prova cruzada maior é realizada para demonstrar anticorpos capazes de danificar ou destruir os glóbulos vermelhos do doador. É de maior importância, porque a introdução de sangue incompatível na circulação do receptor é a causa mais comum das reações hemolíticas. Na prova cruzada menor pesquisa- se anticorpos no soro do doador capazes de agredir as células do receptor. Já que os anticorpos do doador serão muito diluídos "in vivo" pelo plasma do receptor, eles são considerados de menor importância. 5.1) Prova Cruzada Maior Técnica: - Tubo n° 1: 100 L de soro recente do receptor (inativado) 100 L de suspensão de 3 a 5% de hemácias do doador (50 µL de sangue + 1 mL solução fisiológica) - Tubo n° 2: 100l de suspensão de 3 a 5% de hemácias do doador 2 gotas de albumina bovina 100 L de soro recente do receptor - Centrifugar os tubos a 1.000 rpm por 1 minuto. Observar: -Se não apresentar aglutinação ou hemólise: - Incubar os tubos a 37°C por 15 min. - Centrifugar os tubos a 1000 rpm por 1 min. - Observar aglutinação ou hemólise. - Se não apresentar aglutinação ou hemólise: - Lavar três vezes com solução fisiológica o tubo n° 2, a 1500 rpm por cinco minutos. - Acrescentar ao sedimento uma gota de soro de Coombs. - Centrifugar os tubos a 1.000 rpm por 1 min. Se não houver nenhuma aglutinação a amostra é considerada compatível. 24________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV A permuta do soro do receptor pelo do doador e das hemácias do doador pela do receptor é considerado como prova cruzada menor. Causas de erros: - Presença de crioaglutininas* - Agregação espontânea por contaminação bacteriana, anemia hemolítica adquirida, e outros. - Formação de Rouleaux (em casos de mieloma múltiplo). - Centrifugação demorada e acelerada pode dar falso positivo. *Crioaglutininas são anticorpos aglutinantes (IgM) que reagem ao frio. Estes ocorrem em várias condições patológicas como: pneumonia primária atípica (micoplasma), síndrome de Raynauld, anemia hemolítica auto-imune, hemoglobinúria paroxística ao frio, neoplasias, malária, etc. 25________________________________________________________________________________________________________Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV ESQUEMA PRÁTICO TIPAGEM ABO Rh E COOMBS ABO Reversa ABO Direto Rh Coombs Indireto Direto Tubo A B A B AB Rh C Alb C Rh 1 2 1 Sangue 3 - 5% 50 L “A” 50 L “B” 50 L 50 L 50 L 50 L 50 L 50 L 50 L “O+” 50 L “O+” 50 L Soro/anti- soro 50 L 50 L 1 gt “A” 1 gt ”B” 1 gt ”AB” 1 gt ”Rh” 1 gt ”Rh” 1 gt C ”Rh” 50 L 50 L ---- Albumina bovina ---- ---- ---- ---- ---- ---- 1 gt ---- ---- 1 gt ---- Centrifugar 1 minuto a 1.000 rpm – Proceder a leitura ---- ---- 37°C 15 min ---- Lavar 3 x 5 min (1500 rpm) com 2 mL de solução fisiológica Soro de Coombs 1 gt 1 gt 1 gt 1 gt 1 gt 1 gt Centrifugar 1 min 1000 rpm - Leitura PROVA CRUZADA MAIOR Tubo 1 2 Soro do receptor 100 L 100 L Sangue 3 - 5% do doador 100 L 100 L Albumina bovina 22% ---- 2 gt Centrifugar 1 min em 1.000 rpm Proceder a leitura Incubar a 37°C durante 15 min Centrifugar 1 min em 1.000 rpm Proceder a leitura Lavar 3 vezes de 5 min em 1.500 rpm c/ 2 mL de salina fisiológica Soro de Coombs 1 gota Centrifugar 1 min em 1.000 rpm Proceder a leitura 26________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV PROVAS REUMÁTICAS A ARTRITE REUMATÓIDE (AR) TÉCNICAS DE PESQUISA DO FATOR REUMATÓIDE O QUE É FATOR REUMATÓIDE É um autoanticorpo dirigido contra aminoácidos de regiões constantes das moléculas de IgG. A causa pode estar relacionada a uma deficiência adquirida da enzima galactosil-transferase em linfócitos B, levando à redução na glicosilação na região Fc da cadeia de IgG; estas moléculas de IgG então se tornariam imunogênicas, e seriam formados anticorpos anti-IgG. Os Fatores Reumatóides (FR) podem ser anticorpos das classes IgG, IgA e IgM. Predominantemente são formados FR da classe IgM. O FR é um fator prognóstico para um curso erosivo severo da doença, mas não correlaciona com a atividade da doença. Pode aparecer precocemente, até vários anos antes do início da AR (~10 anos). Os FRs podem ser pesquisados por diferentes técnicas: látex, nefelometria, eritrócitos de carneiro recobertos com IgG, etc. 1. LÁTEX - FR É uma reação de aglutinação indireta tendo como suporte, partículas de látex (= 810 nm) e como antígeno reagente gamaglobulina humana agregada pelo calor e adsorvida às partículas. É uma técnica de alta sensibilidade, porém de pouca especificidade para os casos de Artrite Reumatóide - AR (82%). Podem ocorrer positivos falsos em 10 a 40% dos casos de macroglobulinemia de Waldenström, calazar, sarcoidose, sífilis, doenças hepáticas, hepatites, malária, tripanossomíases, doenças infecciosas crônicas (lepra, tuberculose), endocardite bacteriana subaguda e fumantes. Também observados em doenças do tecido conectivo, principalmente no lúpus eritematoso sistêmico (LES; 20 a 30% dos pacientes com esta doença). É negativo em casos de febre reumática. Também pode ser positivo em acima de 15% da população normal; há uma positividade progressiva com o aumento da idade, sendo positivo em 25 a 30% das pessoas com mais de 70 anos. Títulos significativos são 80. Na artrite reumatóide pode se encontrar títulos como 640 a 5120 e algumas vezes >320.000. Em outras condições que não a artrite reumatóide os títulos usualmente são menores que 80. Podem ocorrer resultados negativos em 1/3 dos pacientes com artrite reumatóide. Estes casos geralmente tornam-se positivos de 3 a 6 meses após a doença se manifestar. O teste em lâmina somente deve ser usado como triagem. Para confirmar um resultado positivo, deve ser usada a reação de Waaler-Rose. 27________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV TÉCNICA: (Teste de Triagem - qualitativo) a. Deixar o Látex reagente e os soros adquirirem a temperatura ambiente; b. Diluir cada soro teste a 1:20 em tampão salina-glicina pH 8,2 (20 L de soro + 0,38 mL de tampão) e distribuir 20 µL de cada soro diluído em uma área distinta de uma placa de fundo escuro – Dependente do kit empregado; c. Distribuir também 20 L de soro positivo e 20 L de soro negativo. Os soros já vêm previamente diluídos. d. Adicionar a cada um deles 20 L do látex reagente e misturar com espátulas descartáveis, uma para cada amostra; e. Agitando em movimentos circulares, observar a aglutinação num prazo de até 2 minutos, comparando o resultado do soro teste com os soros positivo e negativo. Se, positivo (aglutinação) sua concentração (FR) deverá ser titulada por meio de técnica semiquantitativa. f. Técnica semi-quantitativa Reação positiva: prosseguir as diluições, a partir de 1/20, na razão 2, em tampão glicina pH 8,2; - Testar cada diluição segundo a técnica descrita acima (no teste de triagem); - O título do soro em fator reumatóide, expresso em UI/mL é: Última diluição positiva x sensibilidade do Kit Exemplo: Sensibilidade expressa na caixa: 1,25 UI/mL e soro positivo até 1/80 Título do soro em UI/mL = 1,25 x 80 100 UI/mL 2- TESTE DE WAALER-ROSE EM LÂMINA Princípio: A técnica de Waaler-Rose é um teste rápido em lâmina para a detecção do fator reumatóide. O teste é constituído por uma suspensão de hemácias de ovelha, estabilizadas com IgG de coelho anti- ovelha. Quando o FR está presente na amostra observa-se uma reação de aglutinação nítida. Sensibilidade: O limite de detecção é de 8 UI/mL de FR no soro do paciente, necessitando que o reagente seja calibrado de acordo com a Referência Internacional de Preparação da Organização Mundial da Saúde (WHO). Amostra: Utilizar soro não hemolisados, contaminados ou lipêmicos, pois podem interferir nos resultados. Preparação dos reagentes: 28________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente antes da realização do teste (20ºC a 25ºC) e devem ser agitados antes de serem utilizados. Evitar a formação de espuma. Limitações do teste: Um resultado positivo baixo ou suspeito deverá ser confirmado. O diagnóstico não deve ser feito com base unicamente num só resultado. É recomendado levar todos os dados clínicos em consideração. Os testes do FR são importantes na distinção entre artrite reumatoide, doenças autoimunes e outras doenças inflamatórias. Deve-se ter em conta que os testes positivos para FR não aparecem em todos os testes os casos onde se suspeita da presença de artrite reumatoide. Indivíduos saudáveis podem apresentar reações positivas para testes de FR, com incidência de 3 – 5% na população. Reações positivas ocorrem em condições tais como na mononucleose infecciosa, sífilis, hepatite e outras situações clínicas. Estes falsos positivos fornecem, normalmente, títulos muito baixos nos testes. Procedimento: Método qualitativo: - Pipetar 25 L do soro a testar na área circular de um cartão de teste - Pipetar 25 L do soro controle positivo em outra área circular do cartão de teste - Pipetar 25 L do soro controle negativo em outra área circular do cartão de teste - Pipetar 25 L do reagente do Waaler-Rose - Misturar os soros e os reagentes do Waaler-Rose com espátulas plásticas individuais - Colocar o cartão de teste sobre a bancada e aguardar 2 minutos - Agitar suavemente o cartão de teste e deixar mais uma vez o cartão de teste sobre a bancada - Após 1 minuto ler o cartão de teste observando a presença de hemaglutinação. Método semiqualitativo: - Preparar uma série de diluições do soro a ser testado em solução fisiológica (1/2, 1/4, 1/8, 1/32, 1/64, etc.) - Repetir o procedimento com descrito no método qualitativo para cada diluição da amostra.Resultados e interpretação: - Examinar sob uma luz forte após 2 minutos - Um resultado positivo no teste qualitativo é indicado pela aglutinação do reagente. Um resultado negativo é indicado quando não se verifica alteração na suspensão do reagente no cartão teste. - Se o teste tiver limite de detecção de 8 UI/mL os resultados positivos serão obtidos a uma concentração de FR no soro superior a este valor e negativos quando inferior a 8 UI/mL. - A concentração de FR no soro pode ser calculada aproximadamente pela multiplicação do fator de diluição (ex. 2, 4, 8. etc) pelo limite de detecção (8 UI/mL). Ex. Se a diluição da aglutinação aparecer a 1/8 a concentração de soro FR é de 8 X 8= 64 UI. Podem ser detectados títulos de 1074 no teste, sem o efeito de prozona. 3. NEFELOMETRIA - FR 29________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV Princípio: Partículas de poliestireno (látex) recobertas com um imunocomplexo de -globulina humana e anti-- globulina humana de carneiro aglutinam-se quando misturadas com uma amostra que contenha fator reumatóide. A intensidade de luz dispersa no nefelômetro depende da concentração de FR na amostra, de forma que este pode ser medido por comparação com diluições de um padrão de concentração conhecida. O método nefelométrico permite uma quantificação dos níveis de FR no soro de pacientes suspeitos de doença reumática. A presença ou a exclusão de FR tem grande significado diagnóstico, porque permite confirmar ou pôr em dúvida um diagnóstico-suspeito, baseado em dados de anamnese ou dados clínicos. Uma AR soro-positiva tem um prognóstico geralmente menos favorável do que as soro-negativas. Títulos aumentados de FR indicam freqüentemente uma evolução grave ou um quadro clínico generalizado. Um resultado de laboratório de “AR soro-negativo” deve entender-se no sentido de que nem o método de aglutinação ao látex nem o teste de Waaler-Rose acusaram a presença de FRs. Os resultados de uma determinação quantitativa de FRs devem ser sempre interpretados em conjunto com os dados clínicos e outros resultados biológicos, pois um nível baixo de FR não exclui AR, assim como, concentração elevada de FR não é exclusiva das doenças reumáticas; outras análises podem ser necessárias para confirmar a presença de uma doença. Metodologia: Seguir as instruções do fabricante. Limitações e fontes de erro: Turbidez e presença de partículas podem interferir no teste devido à coagulação incompleta ou desnaturação de proteínas. É necessário eliminar por centrifugação estas partículas, antes da execução dos testes. Amostras lipêmicas devem ser centrifugadas e não sendo clarificadas, devem ser rejeitadas. Valores de Referência: Análise de soros de doadores europeus determinou o valor de 15UI/mL como normal. Valores mais baixos não devem ser avaliados como positivos para FR. 4. TURBIDIMETRIA – FR Teste para determinação quantitativa imunológica da concentração dos fatores reumatóides humanos em soro e plasma. Problemas próprios de métodos semiquantitativos, utilizando partículas de látex e hemácias, são as fracas precisão e reprodutibilidade interlaboratorial, associadas a dificuldades de padronização, levaram ao desenvolvimento de novos métodos de ensaio, como a turbidimetria, a nefelometria, os imunensaios enzimáticos e os rádioimunoensaios. Rastreabilidade: O método foi padronizado contra a preparação de referência da Organização Mundial da Saúde para fatores reumatóides (1ª preparação, - Anderson et al., Bull Wld Hlth Org, 1970;42:311-318). 30________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV Princípio: No ensaio imunoturbidimétrico, a IgG (antígeno) inativada pelo calor, ligada à partículas de látex, reage com os anticorpos anti-FR na amostra e forma complexos antígeno/anticorpo. Estes após a aglutinação são determinados por turbidimetria. Amostras: Soro ou plasma [heparina (Li, Na) ou EDTA (Na2, K2)] que contêm precipitado têm de ser centrifugadas antes da realização do ensaio. Analisador (turbidímetro) fornecerá leitura em absorbância, comprimento de onda de 583 nm e efeito de prozona típico quando >600 UI/mL. Intervalo de medição: Entre 10 – 130 UI/mL. Possibilidade de reanálise quando a concentração for superior ao limite. As amostras são diluídas a 1:5 através da função reanálise. Os resultados obtidos de amostras diluídas são multiplicadas automaticamente pelo fator 5. Limite inferior de medição: O limite inferior de detecção do teste é de 10,0 UL/mL. O limite de detecção representa o nível de analito mais baixo mensurável passível de ser distinguido de zero. É calculado como o valor situado 3 desvios padrão (DP) acima de uma amostra zero (amostra zero + 3 DP, reprodutibilidade, n = 30). Valores de referência: Num estudo com 541 indivíduos aparentemente saudáveis, o intervalo de referência foi inferior a 14 UI/mL. Cada laboratório deve verificar a transferibilidade dos valores teóricos para a sua população de pacientes e, se necessário, determinar os seus próprios intervalos de referência. 5. REAÇÃO DE WAALER-ROSE É uma reação de hemaglutinação indireta tendo como suporte hemácias de carneiro e como antígeno reagente a hemolisina (anticorpo de coelho anti-hemácias de carneiro). Em relação ao Látex-FR, é mais específica, porém de menor sensibilidade (63% positividade). Falso-positivos poderão ocorrer em algumas doenças infecciosas crônicas (lepra, tuberculose), endocardite bacteriana subaguda. A reação de Waaler Rose pode ser realizada utilizando-se kits comerciais, como também no laboratório de rotina tendo- se em mãos apenas a hemolisina (Ac de coelho anti-hemácias de carneiro) e o complemento de cobaia, como segue: TÉCNICA DE WAALER ROSE FASE 1: Remoção de anticorpos heterófilos (absorção do soro): 31________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV - Anticorpos heterófilos são anticorpos da classe IgM existentes numa espécie e dirigidos contra antígenos de outras espécies (Ex: Ac no homem anti-hemácias de carneiro). Em um tubo de ensaio adicionar: a. Inativar o soro (56°C por 30 minutos); b. Diluir 0,2 mL de soro em 1,8 ml de hemácias de carneiro a 2% (1/10); c. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente; d. Centrifugar 10 minutos a 2.000 rpm. e. Retirar o sobrenadante com pipeta tipo Pasteur para outro tubo. f. Diluir este soro conforme a fase 3. FASE 2: Sensibilização de hemácias de carneiro: (sistema hemolítico) a. Misturar iguais volumes (1:1) de hemácias de carneiro a 2% e solução de hemolisina 2 U (conforme titulação obtida); b. Incubar 15 minutos a 37°C. FASE 3: Reação de Waaler-Rose: a. Realizar DUAS séries de diluições do soro tratado, como o esquema (Séries Controle e Reação): Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Soro absorvido-(mL; 1/10) 0,4 - - - - - - - - Sol. fisiológica (mL) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Transferir (mL) 0,4 Título 20 40 80 160 320 640 1280 2560 - b. Na primeira bateria (denominada série REAÇÃO) adicionar 0,4 mL de hemácias sensibilizadas; c. Na segunda bateria (denominada série CONTROLE) adicionar 0,4 mL de hemácias de carneiro a 2%; d. Incubar as baterias 1 hora a 37°C; e. Incubar uma noite (14 a 18 horas) a 4°C (geladeira); f. Ler os tubos trinta (30) minutos após terem sido retirados da geladeira, observando em qual tubo ainda houve AGLUTINAÇÃO nas duas séries de reação; g. Títulos significativos: iguais ou maiores a 80. PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-PROTEÍNAS CITRULINADAS Pacientes com artrite reumatóide possuem uma variedade de autoanticorpos no soro e no líquido sinovial (tabela 1).Entre eles, aqueles direcionados a proteínas citrulinadas, que são específicas para a doença, aparecem precocemente, até vários anos antes do início da AR (~14 anos) e são úteis para auxiliar no diagnóstico. Entre os antígenos citrulinados reconhecidos por auto-anticorpos (IgG) na AR, encontram-se Soro (0,2 mL) + Hemácias (1,8 mL) 32________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV a profilagrina, a filagrina e a vimentina. O papel dos antígenos citrulinados na fisiologia da AR é sugerido pela forte especificidade desses auto-anticorpos para a doença, pelo achado de proteínas citrulinadas na sinóvia inflamada, pela produção intra-articular desses auto-anticorpos e pela extrema afinidade de peptídeos citrulinados pro moléculas de HLA-DRB1 que contêm o epitopo compartilhado. Os anticorpos anti-CCP são produzidos na sinóvia reumatóide. Ademais, demonstrou-se que as células B do fluido sinovial de pacientes com AR produzem espontaneamente anti-CCP. Os auto-anticorpos anti-CCP mostraram-se mais específicos (tabela 2) do que o FR e, portanto, de maior utilidade para o diagnóstico da AR, principalmente na fase inicial. A descoberta de que os epitopos reconhecidos por esses auto-anticorpos eram peptídeos contendo citrulina permitiu o desenvolvimento de uma plataforma baseada em ELISA. O formato de ELISA possibilitou maior padronização e reprodutibilidade dos ensaios, resultando em ampla aceitação mundial como os auto- anticorpos mais específicos e precoces para o diagnóstico da AR (Alarcon & Andrade; Rev. Bras. Reumatol., v.47, n.3, p.180-187, 2007). Um teste usa vimentina citrulinada mutada (MCV), uma proteína que é altamente específica para a AR. A proteína é ubíqua do citoesqueleto, está presente na sinóvia de pacientes e pode estar envolvida na patogênese da doença. A presença de anti-MCV está associada com a doença mais severa. Várias marcas de kits são fornecidas comercialmente hoje. Tabela 1: Tabela 2: Valores diagnósticos de autoanticorpos FR, ACPA e anti-RA33 em pacientes com artrite recente. Sensibilidade (%) Especificidade (%) Valor preditivo positivo (%) FR (>20UI/mL)* 55 89 84 FR50 (≥50UI/mL)* 45 96 92 ACPA (anti-CCP) 41 98 96 Anti-RA33** 28 90 74 * Título do FR encontrado no soro dos pacientes. * Ac dirigido a ribonucleoproteína nuclear heterogênea (hnRNP) no tecido sinovial inflamado. 33________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV TÉCNICAS DE PESQUISA DA PROTEÍNA C REATIVA – PCR (CRP) 1. Definição Foi descrita inicialmente por Tillet e Francis em 1930, é uma proteína plasmática pentamérica cíclica, normalmente encontrada em concentrações inferiores a 1mg/L. É sintetizada nos hepatócitos e constituída de 5 subunidades idênticas ligadas não-covalentemente, com uma massa molecular de aproximadamente 105000 daltons. É membro da família pentraxina de proteínas oligoméricas ligantes de cálcio. A PCR liga-se dependentemente de cálcio a diferentes moléculas-alvo dos micróbios e resíduos de membrana celular, bem como, a diferentes materiais nucleares. A transcrição do gene da PCR nos hepatócitos é regulada positivamente por interleucina-6 (IL-6), IL-8 e fator de necrose tumoral (TNF-) secretados pelos monócitos/macrófagos. In vitro, precipita na presença de polissacáride C de pneumococo (origem do seu nome). É uma proteína termolábil, que perde a atividade a 70°C por 30 minutos e não atravessa a placenta. A CRP é o mais sensível dos reagentes da fase aguda. A resposta da CRP antecede, com frequência, os sintomas clínicos, incluindo a febre. Em indivíduos saudáveis normais, o CRP é uma proteína vestigial, com um intervalo que vai até aos 5 mg/L. A seguir ao aparecimento de uma resposta de fase aguda, a concentração sérica de CRP aumenta rápida e extensamente. São detectáveis alterações no prazo de 6 a 8 horas, e o valor de pico é atingido no prazo de 24 a 48 horas. Níveis até mil vezes superiores ao valor normal estão associados a estímulos graves, como enfarte do miocárdio, traumatismos graves, cirurgia ou neoplasias malignas. A CRP tem uma semivida de apenas algumas horas, o que faz com que seja um instrumento ideal para a monitorização clínica. A monitorização pós-operatória dos níveis de CRP dos doentes indica quer o processo de recuperação normal (diminuição dos níveis para o valor normal), quer complicações inesperadas (persistência de níveis elevados). A medição das alterações da concentração de CRP proporciona informações úteis, em termos de diagnóstico, para avaliar quão aguda e quão grave é uma doença. Permite também a avaliação da gênese da doença e de complicações ocorridas durante a doença. A persistência de uma concentração sérica elevada de CRP é, normalmente, um sinal de prognóstico grave, que geralmente indica a presença de infecção não controlada. PCR atinge seu nível máximo e retorna aos valores de referência muito mais rapidamente que outros marcadores de inflamação. Uma diminuição rápida (aproximadamente 50% em 72 h) é também observada uma vez que cesse o estímulo, por exemplo, durante tratamento efetivo de uma infecção bacteriana por antibióticos. A determinação da CRP pode substituir a determinação clássica da Velocidade de Sedimentação dos Eritrócitos (VHS), devido a sua resposta às alterações da atividade da doença e a sua boa correlação com a VHS. 2. Função Biológica Sua função precisa não é conhecida. Age como uma opsonina e ativa a via clássica do complemento, bem como a fagocitose de leucócitos, estimulação das funções de linfócitos e monócitos/macrófagos. A CRP complexada ativa o sistema complemento, com início em C1q. Depois a CRP inicia a opsonização e a fagocitose das células invasoras, mas a sua função principal é ligar e desintoxicar substâncias tóxicas endógenas produzidas em resultado de lesões teciduais. Também tem sido mostrado que a PCR liga-se a lipoproteína de baixa densidade (LDL) e com isto tem sido detectado em placas ateroescleróticas. 34________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV 3) Aplicações clínicas Como teste de diagnóstico é extremamente inespecífico, pois quando positiva indicará a existência de um processo inflamatório agudo ou necrótico, cuja origem deverá ser pesquisada por testes específicos. a) Aparecem em doenças como: Infecções por Gram-negativos e Gram-positivos; peritonites; meningites serosas e bacterianas; septicemias bacterianas; indicador de presença de infecção no período neonatal; doenças pulmonares: pneumonia bacteriana, tuberculose ativa e pneumonia por Haemophilus influenzae; infecções urinárias: pielonefrites; doenças intestinais: fase aguda de infecção por Campilobacter, doença de Crohn; apendicite (parâmetro seguro); pacientes queimados e após trauma cirúrgico; infecções seguindo à ruptura prematura de membranas (parto); infarto agudo do miocárdio (94%)*; tumores malignos, câncer coloretal; esclerose múltipla; hepatite infecciosa aguda; diabetes; doenças reumáticas: febre reumática, artrite reumatóide (85%), artrite crônica juvenil, ataques agudos de gota, casos ativos de poliarterite nodosa, só em 4% dos pacientes com LES ativo em infecção intercorrente. Tem provado ser importante como meio para diferenciar entre as infecções bacterianas e virais. *A medição da PCR pode contribuir para o diagnóstico dos pacientes com síndromes coronárias agudas. Ficou demonstrado que um valor de PCR >10mg/L no estado prematuro (6 a 24 horas após a ocorrência dos sintomas) indica um aumento de risco momentâneo (30 dias a 1 ano) para a repetiçãode ocorrências cardíacas. b) Como teste de acompanhamento de evolução ou tratamento de doenças inflamatórias/necróticas já diagnosticadas (doenças reumáticas, neoplasias, tuberculose, meningite) é o mais indicado, pois seus níveis correlacionam-se com a intensidade da injúria. c) VHS e PCR são testes com praticamente a mesma função. O que os diferencia é a maior fidedignidade da PCR, positivando e negativando precocemente e com isto reproduzindo mais fielmente o estado do paciente, além disto, o VHS é influenciado por certos estados fisiológicos (menstruação e gravidez, por exemplo). 4. Pesquisa de PCR – Técnicas Pesquisa de PCR pelas técnicas Sensibilidade Precipitação em capilar 10,0 - 20,0 g/mL Precipitação em gel: Ouchterlony modificado Mancini Eletroforese 10,0 - 20,0 g/mL 1,0 g/mL 1,0 g/mL Látex aglutinação 5,0 mg/L RIE 3,0 ng/mL Imuno turbidimetria 5,0 mg/L Nefelometria <5,0 mg/L 35________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV AGLUTINAÇÃO DE PARTÍCULAS DE LÁTEX – PCR (CRP) Utiliza-se soro, devendo-se rejeitar amostras fortemente lipêmicas e não utilizar plasmas, pois o fibrinogênio poderá causar aglutinação inespecífica. Deixar os reativos e os soros a testar alcançarem a temperatura ambiente, antes da realização do teste. a) Determinação qualitativa - Depositar sucessivamente em 3 subdivisões da lâmina: 20 L do soro positivo, 20 L do soro negativo, 20 L do soro a testar. - Ao lado de cada depósito, adicionar 20 L do reativo látex anti-PCR bem homogeneizado. - Misturar com uma espátula (uma para cada subdivisão). - Imprimir à lâmina um movimento suave de rotação. Observar o aparecimento de aglutinação entre 3 e 5 minutos; Leitura: Reação Negativa: a suspensão permanece homogênea. Reação Positiva: aglutinação nítida entre 3 e 5 minutos. Não considerar as aglutinações que podem surgir depois de 5 minutos (aglutinações inespecíficas). Os soros, cuja concentração em PCR é elevada, podem apresentar um fenômeno de prozona e fornecer resultados negativos no procedimento qualitativo. Em caso de suspeita clínica, repetir a reação fazendo reagir 10 L de soro com 50 L de látex anti-PCR. b) Determinação semiquantitativa 1. Depositar sucessivamente em 2 subdivisões da lâmina: - 10 l e 50 L de soro a testar - depositar 50 l de látex anti-PCR cuidadosamente homogeneizado, ao lado de cada gota de soro. 2. Misturar as gotas de cada subdivisão com espátulas distintas e imprimir à lâmina um movimento suave de rotação. Observar o aparecimento de aglutinação entre 3 e 5 minutos. Leitura: Concentração em PCR 10 L de soro 50 L de soro Inferior a 7 mg/L ± 1 - - Entre 7 e 20 mg/L - + Entre 20 e 200 mg/L + + Superior a 200 mg/L + - Pode-se fazer outra determinação semiquantitativa usando uma série de diluições do soro a examinar em solução salina, determinando a maior diluição que ainda fornece aglutinação. Interpretação Teor normal para adulto: 5 mg/L. 36________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV Para soros de pacientes que tem um teor elevado em fatores reumatóides, podem-se encontrar falso-positivos. Estudos estatísticos demonstram que este fenômeno acontece em aproximadamente 2% dos soros positivos em FR. Nesses casos, é necessário dosar a PCR por outro método. NEFELOMETRIA – PCR Princípio Metodológico: Partículas de poliestireno revestidas de um anticorpo monoclonal contra PCR, na mistura com amostras de soro ou plasma que contêm PCR, se aglutinam. A intensidade de luz difusa no nefelômetro depende da concentração de PCR da amostra, de forma que, por comparação com diluições de um padrão de concentração conhecida, é possível determinar a concentração de PCR da amostra. Valores de Referência: Os valores de referência para indivíduos normais são indicados na literatura como 5mg/l. No caso de utilização da PCR para avaliação de risco de doenças vasculares coronárias e periféricas, os valores medidos deverão ser comparados com os resultados anteriores. TURBIDIMETRIA - PCR Princípio Metodológico: A CRP humana aglutina-se com partículas de látex revestidas com anticorpos monoclonais anti- CRP. O aglutinado é determinado turbidimetricamente a 552 nm. Amostras: Soro ou plasma (heparina de lítio, EDTA, fluoreto ou citrato). As amostras que contêm precipitado têm de ser centrifugadas antes da realização do ensaio. Ensaio: O modo de medida no turbidímetro é por absorbância, com cálculo da absorbância cinético e com efeito prozona típico > 3100 mg/L (> 29512 nmol/L ou > 310 mg/dL). Utilização de calibradores e controles positivo e negativo. Valores de referência: Adultos: < 5 mg/L (<47,6 nmol/L ou < 0,5 mg/dL) Cada laboratório deve verificar a transferibilidade dos valores teóricos para a sua própria população de pacientes e, se necessário, determinar os seus próprios intervalos de referência. PCR ULTRA-SENSÍVEL (Nefelometria, Turbidimetria) 37________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV Devido ao melhor conhecimento dos processos fisiopatológicos que levam à arteriosclerose e que esta começa com um processo inflamatório, a PCR vem despertando um grande interesse para os cardiologistas. A PCR está associada à diversas doenças graves, como o infarto agudo do miocárdio, acidente vascular cerebral, arteriopatias periféricas (doenças vasculares), a arteriosclerose ocupa um lugar de destaque para a saúde e qualidade de vida. Portanto, além de ser útil na avaliação dos processos inflamatórios de um modo geral, a PCR-US é útil na predição de eventos coronarianos futuros em indivíduos saudáveis. Após nove anos de estudos referentes ao desenvolvimento de doenças arteriais periféricas, em 280 pacientes acompanhados, o Center for Disease Control (CDC) sugeriu o seguinte critério para avaliação de risco: Risco PCR - US (mg/L) Baixo Inferior a 1,0 Médio De 1,0 a 3,0 Alto Acima de 3,0 É importante salientar que o teste deve ser realizado em indivíduos saudáveis, sem doença inflamatória, para que seja interpretado como preditor de eventos cardiovasculares futuros. O LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO E OUTRAS DOENÇAS AUTOIMUNES PESQUISA DE ANTICORPOS CONTRA ANTÍGENOS CELULARES – PAAC - (FATOR ANTINÚCLEO - FAN) Os anticorpos antinucleares (ANA; grupo de anticorpos protéicos que reage contra o material nuclear celular), também chamado de fatores antinucleares, são utilizados para o diagnóstico de doenças auto- imunes, como o LES. Esses anticorpos são utilizados para a triagem destas doenças, sendo que um resultado negativo de ANA não exclui um diagnóstico. Quando ANA é positivo devem-se efetuar outros testes de anticorpos para confirmar o diagnóstico. 1. Técnica de Imunofluorescência Indireta - Substrato: Células HEp-2 (linhagem de célula cancerosa, epitelioma de laringe humana). Materiais e reagentes: lâminas contendo células HEp-2 cultivadas, são mantidas a 2 - 8°C; conjugado: anticorpos de cabra anti-imunoglobulinas IgG humano conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) diluído em Azul de Evans; PBS pH 7,2 – 7,4; soros controle negativo e controle positivo de padrão de fluorescência conhecido; 38________________________________________________________________________________________________________ Manual de Imunologia Clínica- DAB/UEM Aristides SMA, Demarchi IG, Lonardoni MVC, Silveira TGV meio de montagem: glicerol 78%, fosfato de sódio 6mmol/L, fosfato de potássio 1,6 mmol/L, cloreto de sódio 60 mmol/L, azida sódica 0,95 g/L; lamínulas, câmara úmida e pipetas; microscópio de imunofluorescência equipado
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