diagnostico graduação 2008

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Profa. Ana Maria Viana Pinto
Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Instituto Biomédico
Universidade Federal Fluminense
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 Confirmação do diagnóstico clínico  infecções com sinais clínicos confundíveis: gastrenterites, doenças exantemáticas, vesiculares
 Necessidade de confirmação de uma infecção devido às sérias implicações que a mesma pode ter para o paciente: AIDS, hepatite, rubéola gestacional, BVDV
 Para diferenciar a fase da doença  determinação de infecções aguda ou crônicas (p.ex. pesquisa dos marcadores sorológicos das hepatites virais), no prognóstico da doença e como critério de cura;
 No diagnóstico de doenças congênitas (pesquisa de Ac IgM): rubéola, parvovírus B19, citomegalovírus; AIE, BVDV.
 Na seleção de doadores de sangue: hepatites B e C, AIDS, HTLV e semem
 Quando a intervenção quimioterápica é importante e possível: infecções herpéticas, AIDS e hepatite C;
 QUANDO SOLICITAR O EXAME LABORATORIAL DE UMA VIROSE
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 Durante surtos epidêmicos  adoção de medidas profiláticas adequadas (vacinação, combate a vetores, etc.). Ex: febre amarela, dengue, sarampo, raiva, entre outras;
 Na busca de um agente etiológico de uma dada doença, seja ela nova ou não. Ex: Coronavírus da SARS.
 Na avaliação da imunidade naturalmente adquirida após uma infecção viral ou artificialmente induzida após vacinação, pela pesquisa de anticorpos da classe IgG;
 Em estudos epidemiológicos: 
 Avaliação da prevalência de diferentes doenças virais em uma determinada comunidade  pesquisa de anticorpos IgG
Verificação da erradicação de doenças 
Reintrodução de novos casos em áreas consolidadas
 QUANDO SOLICITAR O EXAME LABORATORIAL DE UMA VIROSE?
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 Infecção respiratória: aspirado de nasofaringe 				 swab de garganta
 Infecção entérica: Fezes
 Pele: líquido da vesícula, biópsia
 Urina
 Infecção no SNC: líquor, cérebro
 Sangue  soro
 Morte: qualquer tecido
AMOSTRAS CLÍNICAS:
OBS: Todo material deve ser acompanhado de uma ficha contendo:
nome, endereço, telefone, idade, dados clínicos, histórico de vacinas
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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES 
A colheita do material deve ser feita na fase aguda da doença. 
O material deve ser transportado imediatamente para o laboratório, mantido em temperatura baixa ( gelo). No entanto, sem congelar. As partículas virais apresentam instabilidade a fatores ambientes.
Quando o material for remetido para locais distantes, deve ser acondicionado em gelo seco. 
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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES
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Microscópio eletrônico
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Microscopia eletrônica
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Detecção de vírus
 Isolamento do vírus:
Métodos clássicos
 Cultura de células
 Ovos embrionados
 Animais
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 OVOS EMBRIONADOS
Albúmen
Saco vitelínico
Embrião
Membrana córioalantóica
Cavidade alantóica
Cavidade amniótica
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Inoculação na cavidade amniótica
 Isolamento primário de vírus influenza humano
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Inoculação na cavidade alantóica
 Isolamento vírus aviários (Influenza, Vírus da Doença de Newcastle)
 Propagação de vírus Influenza humano
 Preparação de vacinas
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Inoculação na membrana corioalantóica
Isolamento e propagação de vírus que produzem lesões – pocks - (poxvírus e herpesvírus)
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Inoculação no saco vitelino
 Produção de vacinas: vírus neurotrópicos
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Aplicação do Cultivo Celular
 Atividade intracelular. Mecanismos envolvidos nos processos intracelulares como transcrição, tradução e metabolismo energético.
Estudo de interação celular
Virologia: isolamento de vírus e produção de vacinas.
Estudo da biologia do câncer
Imunologia: Produção de anticorpos monoclonais.
 
Genética: Estudo de células somáticas e clonagem
Produção de proteínas: Interferon, insulina, hormônio de crescimento.
Terapia dos queimados (transplante de pele)
Farmacologia
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Frasco de cultura de tecido
Microscópio invertido
 Cultura de células
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ISOLAMENTO
 Células grandes são separadas das células pequenas, de células densas, de células não densas por centrifugação fraccionada
Fig.6 - Centrifugação fraccionada
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MEIO MÍNIMO ESSENCIAL
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Efeito citopático 
Vírus Influenza em Cultivo celular
Herpes simplex 1
Herpes simplex 1
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Citomegalovírus em CC 
(H & E): inclusão nuclear com aparência de um “olho de coruja” 
Citomegalovírus em CC: inclusão nuclear observada com Ac específico marcado com HRP
IMUNOPEROXIDASE
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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES
Reação de Hemadsorção
Uma suspensão de hemácias é adicionada à cultura e estas irão se ligar às proteínas virais expressas na superfície das células infectadas.
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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES
Reação de Hemaglutinação
Os vírus se ligam às hemácias aglutinando-as
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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES
Reação de Inibição da Hemaglutinação
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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES
Reação de Neutralização 
Os vírus interagem com os anticorpos específicos são neutralizados e perdem a capacidade de infectar as células permissivas
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Diagnóstico Laboratorial das Viroses
Reação de Imunofluorescência Direta
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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES
Reação de Imunofluorescência Indireta
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Reação de Aglutinação Passiva
Ag livres são agrupados com partículas carreadoras com Ac específicos
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES
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Aglutinação Visível
Resultado Macroscópico
 da Reação
Formação de
 Grumos
Reação Antígeno-Anticorpo
TESTE DE AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX
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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES
 Reação Imunoenzimática (ELISA) Ac conjugado com enzima.
O resultado é dado pela mudança de cor da reação.
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ELISA
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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES
 
Immunoblotting Western Blotting (WB)
Blotting significa transferência de DNA.
Separação das proteínas virais usando o método de eletroforese em gel de poliacrilamida.
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ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA - ROTAVÍRUS
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 Detecção do Ácido Nucléico Viral
 Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
 Reação de Hibridização in situ
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
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 Para o estudo de vírus que não podem ser isolados em cultura de células, como os papilomavírus e alguns agentes associados a gastrenterites,
 Para vírus com alta diversidade antigênica, como os enterovírus, o que dificulta a utilização de técnicas sorológicas de detecção de antígeno,
 A análise do genoma viral diretamente da amostra clínica pode ser vantajosa principalmente para aqueles vírus com genoma RNA, que podem sofrem mutações através de sucessivas passagens in vitro.
QUANDO A DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL É PARTICULAMENTE IMPORTANTE:
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PRINCÍPIO
Todo ser vivo tem seqüências de ácido nucléico que são específicas e podem ser detectadas por uma reação de hibridização ou de amplificação
Técnicas de Biologia Molecular:
DNA
RNA
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As fitas da molécula de DNA (dupla hélice) podem ser separadas. Esse processo é denominado desnaturação.
A renaturação ocorre quando se volta às condições físico químicas iniciais.
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Uso de sondas marcadas para detecção de genoma em tecido com alterações patológicas (material de arquivo)
SONDA: fragmento de DNA marcado com substância reveladora (radioisótopo, enzima...)
 Triagem X Tipagem
 Sensibilidade: 100 cópias DNA/célula
 Relevância clínica
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
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Sonda
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REAÇÃO DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
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Uso de sondas marcadas para detecção de genoma em membrana de nitrocelulose.
Amostra clínica: soro, fezes, tecido
 Triagem
 Sensibilidade: 10-50 cópias DNA/célula
 Pode ocorrer falso-positivos
Dot blot
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Dot Blot
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Sonda marcada com P32
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
A
B
C
D
E
F
G
H
Sonda marcada com biotina
DOT BLOT
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REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE : PCR
Método para produzir cópias de uma segmento de DNA específico
Polimerização de DNA em Cadeia
Polimerização é feita por uma DNA polimerase
termoestável
São utilizados dois “primers”, o que delimitam o segmento amplificado e determinam o crescimento exponencial do número de moléculas de DNA
Sensibilidade : 10 cópias de genoma
Primers genéricos x primers específicos
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PCR AMPLIFICA UMA SEQÜÊNCIA ALVO
ALTERNÂNCIA DE TEMPERATURAS A CADA CICLO:
DESNATURAÇÃO
ANELAMENTO
POLIMERIZAÇÃO
Replicação “in vitro” do DNASeqüência AlvoDNADNA SupercoiledCromossomo
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Extensão
Seqüência alvo 
Primer1
Primer2
Primer1
Primer2
DNAPolymerase
5’
5’
Anelamento dos primers 55-64°C
Denaturaçãopelo calor 95°C 
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REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE : PCR
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Qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR
A localização da seqüência alvo é feita pelos “primers”. 
Oligonucleotídeos com 20 -24 bases são usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade, tal como o genoma humano.
O pareamento dos “primers” com a seqüência alvo se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, segundo o pareamento convencional descrito por Watsone Crick:
A =T
C =G
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VISUALIZAÇÃO DO PRODUTO DA PCR
Cuba de eletroforese
Produtos da reação de PCR em um gel de agarose
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NESTED PCR PODE SER UMA ALTERNATIVA PARA MELHORAR A ESPECIFICIDADE E A SENSIBILIDADE DA PCR
 427bp
 MW 1 2 3 4 MW 5 6 7 8
 Primers externos Primers internos
681 pb  
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EIA - DNA
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ENSAIO DE CAPTURA DE HÍBRIDO
 Detecção e tipagem de HPV
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SEQUENCIAMENTO DE DNA
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 Detecção de IgM específica
 Conversão sorológica: 
  soro de fase aguda
  soro de fase de convalescência
Diagnóstico de infecção recente:
MÉTODOS INDIRETOS: DETECÇÃO DE AC NO SORO
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 Reações Imunológicas 
Imunofluorescência (IF)
Ensaio Imunoenzimático (EIE)
Radioimunoensaio (RIE)
Western Blot
MÉTODOS INDIRETOS: DETECÇÃO DE AC NO SORO
Mecanismos para separar os diferentes tipos de células presentes numa suspensão celular.
Diferenças das propriedades físikas