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AULA PRÁTICA: CULTIVO CELULAR APLICADO A PRÁTICAS VIROLÓGICAS 
Profs. Ana Maria V. Pinto 
 Elisabeth Martins da S. da Rocha 
 Marcelo de Lima 
1.OBJETIVOS : 
a).Abordar a importância do cultivo celular no diagnóstico virológico, quantificação 
viral e pesquisas relacionadas a antivirais, produção de vacinas etc. Vantagens e 
desvantagens do método. 
b). Demonstrar os procedimentos para passagem celular enfatizando os diferentes 
tipos de culturas de células, as funções dos reagentes utilizados como os tampões, 
nutrientes ,antibióticos, soro fetal e tripsina. 
c). Discutir métodos para visualização de crescimento viral (efeitos citopáticos) e 
identificação viral (microscopia eletrônica, imunofluorescência, soroneutralização entre 
outros) 
d). Discutir e demonstrar testes quantitativos de vírus: Diluição Limitante (cada grupo 
de alunos efetuará esse teste) e Ensaio de placa (placas demonstrativas serão 
preparadas). 
 2.INTRODUÇÃO: 
Os vírus são parasitas intracelulares obrigatórios e requerem células vivas 
(sistemas hospedeiros) para sua replicação. Os sistemas celulares para isolamento de 
vírus são: as culturas de células in vitro, os ovos embrionados de galinha e os animais de 
laboratório. A técnica do isolamento viral é muito sensível e detecta a presença de vírus 
infecciosos no material suspeito. É considerada o método ”padrão ouro” no diagnóstico 
viral. Pela praticidade e por questões de bioética o mais utilizado modelo biológico é a 
cultura de células in vitro. 
O cultivo celular possui as seguintes aplicações: 
1. Isolamento e identificação viral para fins diagnósticos 
2. Obtenção de estoques virais para caracterização biológica e molecular 
3. Uso em testes sorológicos 
4. Produção de estoques virais para estudos de patogenicidade, antivirais etc 
5. Produção de antígenos para imunização 
6. Produção de vacinas. 
 As vacinas produzidas a partir de vírus multiplicados em culturas celulares se 
mostram mais seguras quando comparadas as produzidas em ovos embrionados e em 
passagens em animais pois é possível obter uma pureza maior da massa viral (ausência 
de substâncias altamente alergênicas como a ovoalbumina, resíduos teciduais, etc) com 
redução dos riscos de ocorrência de efeitos adversos graves. 
Quanto ao isolamento viral, a simples detecção do agente viral em uma amostra 
clínica deve ser considerada com cautela, pois sua presença pode não ser um indicativo 
seguro da etiologia da doença assim como resultados negativos não afastam a 
possibilidade de infecção viral. Além disso, é um método que não é aplicável a alguns vírus 
e a demora (em até semanas) na obtenção dos resultados restringe sua aplicação. 
 Mesmo uma cultura de células supostamente inócua, ainda não inoculada com 
nenhum tipo de vírus deve ser manipulada com cautela, pois pode conter vírus adventícios. 
A escolha do tipo de célula adequada ao vírus que se pretende isolar é crucial. 
Exemplos: para isolamento de poliovírus as células mais indicadas são as culturas 
primárias ou células de linhagens diplóides de rim de macaco verde (GMK) ou rim de 
Macaca mulata (LLC-MK). Para isolamento de adenovírus células de carcinoma epitelial 
humano (HEP-2_HEK293 (rim de embrião humano), para isolamento de sarampo e 
Herpesvírus a linhagem celular mais indicada é VERO (rim de macaco). 
É importante ressaltar a necessidade de cuidados especiais na coleta e transporte 
das amostras no sentido da manutenção da viabilidade viral. As amostras devem ser 
obtidas na fase aguda da infecção e a escolha da amostra deve ser apropriada: Exs: Fezes 
para vírus entéricos, aspirado nasal para vírus respiratórios, sangue para vírus de 
transmissão sanguínea, etc. As amostras coletadas em swabs devem ser ressuspensas 
em salina tamponada ou meio de cultivo, transportadas para o laboratório em ambiente 
refrigerado e assim mantidas até o processamento da amostra. 
Uma vez inoculados em culturas adequadas, alguns vírus causam no tapete celular 
efeitos específicos (efeito citopático - ECP). Estas alterações morfológicas podem ser 
observadas ao microscópio óptico e ocorrem quando as células em cultura são infectadas 
por vírus. O ECP, de certo modo, são característicos para grupos ou famílias de vírus. 
Portanto, NÃO permitem a identificação final, mas fornecem uma base para a identificação 
viral. Técnicas adicionais devem ser utilizadas no visando a identificação final do vírus 
isolado. 
Podemos citar como EFEITOS CITOPÁTICOS : 
1) Picnose nuclear (células pequenas, arredondadas e soltas do tapete) Ex : 
Picornavírus 
2) Sincícios ( células gigantes multinucleadas) Ex : Paramixovírus, Herpesvírus 
3) Células grandes, refringentes, formando aglomerados em cachos de uva Ex.: 
Adenovírus 
4) Corpúsculos de inclusão (acúmulo de proteína viral no local de replicação do vírus 
- núcleo ou citoplasma). Os corpúsculos de inclusão podem ser acidófilos ou 
basófilos. Em geral, a localização e a coloração do corpúsculo são características 
de determinados grupos de vírus. Ex: Corpúsculo de Negri ⇒ Vírus da Raiva . 
Os corpúsculos podem ser visualizados também em cortes histológicos de tecidos 
infectados por vírus, provenientes de necrópsias ou biópsias. 
Alguns vírus não causam efeitos citopáticos e a sua replicação deve ser confirmada 
pela demonstração da atividade biológica, antígenos ou ácidos nucléicos. 
 A detecção e identificação dos vírus pode ser realizada por diferentes métodos 
como por exemplo pela microscopia eletrônica que permite a identificação da família 
do vírus por aspectos morfológicos e estruturais. Outra possibilidade é a detecção de 
antígenos virais a partir da utilização de anticorpos específicos marcados com 
fluoresceína (imunofluorescência - IFA) ou conjugados com enzimas 
(imunoperoxidase- IPX) . 
3. MEIOS DE CULTIVO CELULAR 
 A finalidade dos meios de cultivo celular é fornecer à célula os nutrientes 
indispensáveis para sua sobrevivência e que permitam o seu desenvolvimento. 
Para a propagação de células in vitro é necessário estabelecer condições 
osmóticas, de pressão e pH, assim como concentrações adequadas de íons 
inorgânicos essenciais. Isto é conseguido através do emprego de soluções salinas 
balanceadas. 
Portanto, o meio de cultivo celular é constituído de : 
- glicose como fonte de energia 
- solução tampão com bicarbonato para manter o pH entre 7.2 e 7.4 
- indicador de pH ( vermelho de fenol) 
- íons como Ca++, Mg++, Na+, Cl-, P_, K+, Zn++ 
- vitaminas 
- aminoácidos 
- antibióticos ( penicilina e estreptomicina) 
- água, que deve ser destilada e deionizada 
 
4.TIPOS DE CULTIVOS CELULARES: 
 Alguns tipos de células são capazes de sobreviver indefinidamente in vitro, 
desde que sejam passadas para um novo frasco contendo meio de crescimento. 
Outras, no entanto, tem um período de vida bastante limitado. Baseadas nestas 
características as culturas de células podem ser classificadas em três tipos: Cultura 
de células primária, linhagem diplóide ou linhagem contínua. 
 
 Tipos de cultura 
 Primária Linhagem diplóide Linhagem contínua 
Origem Estabelelecidas 
diretamente a partir 
do tecido fresco 
Células de cultura 
primária que 
resistiram ao repique. 
Tumores ou tecido normal 
(diplóide) transformado in 
vitro. 
Morfologia Morfologia do tecido 
original 
Fibroblastóide Epitelióide 
Cariótipo Diplóide Diplóide Aneuplóide (n, 3n, 4n, etc). 
Vantagens São mais sensíveis que as demais para o 
cultivo de vírus 
Podem ser utilizadas 
na produção de 
vacinas e isolamento 
de alguns vírus 
Podem ser utilizadas 
tanto para isolamento 
e propagação de vírus 
como no preparo de 
vacinas. 
 
Propagam indefinidamente 
in vitro ⇒ perderam a 
inbição de contato 
Muito utilizadas no 
isolamento de vírus para 
diagnóstico, pois podem 
ser mantidas no laboratório 
através de repiques 
sucessivos 
Desvantagens Maior dificuldade na 
obtenção 
Baixa resistência a 
repiques ⇒ morremapós 2 ou 3 
passagens 
São resistentes a 
aproximadamente 50 
cultivos. 
Infecção por vírus 
adventício 
Não podem ser usadas no 
preparo de vacinas 
Infecção por vírus 
adventício 
 
 
 
 
 
 
 
Estabelecimento de cultura de células : 
 
 
 ⇒ ⇒ ⇒ 
 estufa a 
 37oC 
Fragmento de órgão Digerido com Células suspensas Formação do 
 ou tecido Tripsina * em meio de cultivo tapete ou 
 monocamada 
 de células 
 * tripsina : age nas junções intercelulares separando as células 
 
 
Passagem ou Repique 
 
 células suspensas 
 ⇒ Tripsina ⇒ em meio de ⇒ 
 crescimento passagem 
 
 
5.QUANTIFICAÇÃO DE VÍRUS 
 O procedimento de quantificação é denominado de titulação, e o valor obtido é 
o título viral. As técnicas se baseiam-se infecciosidade viral e podemos citar duas 
técnicas clássicas: Diluição Limitante e o Ensaio em Placa. 
 Diluição Limitante: suspensão viral é submetida à diluição seriada e cada 
diluição serve como inóculo para um número conhecido de células. Essa técnica é 
geralmente realizada em placas de 96 orifícios sendo que diluição da amostra viral é 
plaqueada em réplicas (geralmente oito) para um resultado mais preciso. Após um 
período de incubação (48-96h), os cultivos são monitorados em relação aos efeitos 
citopáticos (ou submetidos a IFA ou IPX para detecção de antígenos virais). O título é 
expresso como a recíproca da maior diluição capaz de provocar reação especifica 
(ECP ou ags virais) em 50% dos cultivos e a unidade será TCID50 (tissue culture 
infection dose). Os valores obtidos são submetidos a cálculos matemáticos que 
convertem os dados de infectividade em valores numéricos. 
 Ensaio de Placa: Diluições seriadas da suspensão viral são inoculadas em 
monocamadas celulares pré-formados. Após adsorção e a remoção do inóculo, os 
tapetes celulares são recobertos com agarose (meio semi-sólido) e incubados por 24-
72 horas. As partículas virais que penetraram nas células durante a adsorção irão 
replicar e produzir progênie viral. A cobertura semi-sólida impede a disseminação para 
o meio de cultura e a transmissão viral ocorrerá apenas para as células vizinhas. Após 
alguns dias, são observados focos de destruição celular nos tapetes (placas). Cada 
placa representa um determinado número de células infectadas e destruídas a partir 
de uma célula originalmente infectada. O número de placas corresponde ao número 
aproximado de unidades infecciosas presentes na diluição inoculada. Para uma 
melhor visualização e contagem das placas, os poços são corados com corantes 
vitais. Nessa técnica, a quantificação é expressa como unidade formadora de placas 
(PFU). Para o cálculo final do título, leva-se em consideração o número de placas 
produzidas em cada diluição e o volume utilizado para inoculação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ROTEIRO - AULA PRÁTICA: CULTIVO CELULAR APLICADO A PRÁTICAS 
VIROLÓGICAS 
I- Explicar os sistemas de hospedeiros para isolamento viral, vantagens e 
desvantagens 
II- Citar as aplicações do cultivo celular na virologia em geral 
III- Diferenciar os tipos de culturas 
IV- Explicar os procedimentos e cuidados para manutenção das células: 
esterilidade, componentes do meio de cultura etc 
V- Explicar métodos para detecção de vírus em cultura de células, efeitos 
citopáticos etc. 
VI- Explicar os procedimentos para a passagem das células 
VII- Explicar os métodos e aplicações de titulação viral. 
 
PROCEDIMENTOS DA AULA PRÀTICA: 
1. VISUALIZAÇÃO E COMPARAÇÃO DE CÉLULAS INFECTADAS E NÃO 
INFECTADAS: 
 Cada grupo receberá : 
1. Uma frasco (T-25) com células da linhagem MDBK contendo 5 mL de meio de 
cultura ( MEM 10 % Soro fetal bovino). 
2. Uma frasco (T25) contendo a mesma linhagem celular infectada por 
herpesvirus bovino tipo 1. 
As células de ambos os frascos deverão ser visualizadas ao microscópio para a 
diferenciação dos aspectos morfológicos e efeito citopático característico. 
 
2.REPIQUE OU PASSAGEM DE CULTURAS DE CÉLULAS 
Material: 
- Ácool 70% 
- Recipientes para descarte com hipoclorito de sódio. 
- Frasco (T25) 
- Frasco contendo tripsina +EDTA (2 mL) 
- Frasco contendo meio de cultura (MEM) com 10% de soro fetal bovino (10mL) 
 
Procedimento: 
 
1. Efetuar a antissepsia das mãos antes de manipular a cultura de células com 
álcool a 70 % 
2. Descartar o meio de cultura no recipiente de descarte contendo hipoclorito de 
sódio 
3. Como são células aderentes, a cultura será submetida à tripsina/EDTA (2 mL) 
para romper a adesão das células na garrafa (deixar atuar por cerca de 3-5 
minutos) 
4. Acompanhar no microscópio a individualização das células. 
5. Acrescentar 10 mL de meio de cultura com 10% de soro para ressuspender as 
células 
6. Coletar 5 mL e transferir para nova garrafa. 
 
 
3.QUANTIFICAÇÃO DE VÍRUS: MÉTODO DE DILUIÇÃO LIMITANTE 
 
1. As células em suspensão obtidas pela tripsinização serão distribuídas em 
placas de 96 poços no volume de 50 ul/poço 
As células de uma das garrafas para o repique serão utilizadas para o 
plaqueamento 
2. A partir de uma suspensão viral serão efetuadas diluições seriadas (até 5 
diluições (base 10) ou seja, 100 microlitros da suspensão viral + 900 microlitros 
de MEM). As diluições serão efetuadas em eppendorfs (50ul +450 ul meio) 
 
 50ul 
 
 
 
Suspensão viral 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 
 
 
 Em todos os tubos: 450ul de meio 
 
3. Cada diluição será adicionada aos poços contendo as células em réplicas (8), 
50ul/poço. Começar pela maior diluição 
4. Levar as placas para estufa a 37 C por 24 a 72 horas. 
Esquema da microplaca : 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 
A dil 
10-1 
dil 
10-2 
dil 
10-3 
dil 
10-4 
dil 
10-5 
 Ctle 
Pos 
Ctle 
Pos 
Ctle 
Pos 
B dil 
10-1 
dil 
10-2 
dil 
10-3 
dil 
10-4 
dil 
10-5 
 
 C dil 
10-1 
dil 
10-2 
dil 
10-3 
dil 
10-4 
dil 
10-5 
 
 D dil 
10-1 
dil 
10-2 
dil 
10-3 
dil 
10-4 
dil 
10-5 
 
 E dil 
10-1 
dil 
10-2 
dil 
10-3 
dil 
10-4 
dil 
10-5 
 
 F dil 
10-1 
dil 
10-2 
dil 
10-3 
dil 
10-4 
dil 
10-5 
 
 G dil 
10-1 
dil 
10-2 
dil 
10-3 
dil 
10-4 
dil 
10-5 
 
H dil 
10-1 
dil 
10-2 
dil 
10-3 
dil 
10-4 
dil 
10-5 
 Ctle 
Neg 
Ctle 
Neg 
Ctle 
Neg