manual virologia prática

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Expressão de GFP 
- células GHOST
Manual Virologia Prática
Mestrado Integrado
em Ciências Farmacêuticas
HIV-2ALI; JM Azevedo Pereira resultados não publicados
3ª Edição
Lisboa 2008
Este manual foi elaborado com o objectivo de dar apoio às aulas práticas da cadeira de Virologia do 
Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. 
Aqui são abordados vários temas relacionados com o diagnóstico laboratorial das infeccões virais. Para 
algumas das infeccões virais mais importantes, são aprofundados os conceitos e procedimentos usados 
nesse diagnóstico.
Docentes: 
José Miguel Azevedo Pereira (Professor Auxiliar da FFUL)
 Contacto: Telf: 217946400; ext: 266
 e-mail: miguel.pereira@ff.ul.pt
 home page: http://web.mac.com/jmiguelap/Entrada_geral/Entrada.html
 http://www.ff.ul.pt/paginas/jazevedo/Site/Welcome.html
Quirina Santos Costa (Assistente da FFUL)
 Contactos: Telf.: 217946200; ext: 226
 e-mail: quirina.c@ff.ul.pt
 home page: http://web.mac.com/santoscostaq/santoscostaq/Santos-CostaQ.html
Abreviaturas usadas:
Ac- Anticorpo
Ag- Antigénio
CMSP- Células mononucleadas do sangue perifé-
rico
CMV- Citomegalovirus
DNA- Ácido Desoxirribonucleico
EBV- Vírus Epstein-Barr
EIA- Ensaio imunoenzimático
HHV-8- Herpes vírus humano tipo 8
HIV- Vírus da Imunodeficência Humana
HPV- Vírus do Papiloma Humano
HSV- Vírus Herpes Simplex
HTLV- Human T-cell Lymphotropic Virus
IF- Imunofluorescência
IHA- Inibição de hemaglutinação
LCR- Líquido céfalo-raquidiano
ME- Microscopia electrónica
PCR- Polymerase chain reaction
RFC- Reacção de fixação do complemento
RIA- Ensaio imuno-radioactivo
RNA- Ácido Ribonucleico
RSV- Vírus Respiratório Sincícial
TTV- Transfusion Transmited Virus
VZV- Vírus da Varicela-Zona
Índice
I- Métodos de diagnóstico em Virologia 4
1- Métodos directos 4
2- Detecção de anticorpos específicos (serologia) 12
3- Cultura de células eucariotas 15
II- Diagnóstico da Infecção por HSV 17
1- Características gerais 17
2- Diagnóstico 19
III- Diagnóstico da Infecção pelo citomegalovirus (CMV) 21
1- Características 21
2- Diagnóstico 21
IV- Diagnóstico da Infecção pelo vírus da rubéola 25
1- Características 25
2- Síndroma de Rubéola congénita 25
3- Diagnóstico laboratorial 25
V- Diagnóstico da Infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) 28
1- Características 28
2- Diagnóstico da infecção pelo HBV 28
VI- Diagnóstico da Infecção pelo HIV 32
1- Características 32
2- Organização genómica 32
3- Ciclo replicativo 33
4- Patogénese da infecção 35
5- Diagnóstico da infecção pelo HIV 35
6- Principais problemas no diagnóstico da infecção pelo HIV 39
7- Outros marcadores de diagnóstico e monitorização da infecção 40
8- Métodos usados na monitorização e prognóstico da infecção: 40
9- Quantificação da carga viral 41
Anexos 43
Perfil serológico de uma infecção crónica pelo VHB 43
Perfil serológico de uma infecção aguda pelo VHB 43
4
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
Duma forma geral, os métodos de diagnósti-
co usados no diagnóstico de viroses humanas 
podem ser agrupados em duas categorias di-
ferentes: os métodos directos e os métodos 
indirectos. 
Nos métodos directos pretende-se identificar, 
na amostra clínica, a presença do vírus ou de 
componentes desse vírus. Assim, englobam-se 
nesta categoria a microscopia electrónica (ME), 
a cultura viral, a detecção de antigénios virais 
(Ag) e a detecção do ácido nucleico viral.
Nos métodos indirectos pesquisa-se a presença 
de anticorpos específicos para um determinado 
vírus (serologia). Este tipo de métodos consti-
tuem a maioria das técnicas executadas num 
laboratório de virologia, uma vez que a maioria 
das infecções virais pode ser diagnosticada por 
este tipo de métodos. O diagnóstico serológico 
de uma infecção viral pode ser feito detectando 
a presença ou a subida do título de anticorpos 
específicos para um determinado vírus. Esta 
detecção envolve, normalmente, os anticorpos 
da classe IgG ou a totalidade de anticorpos cir-
culantes presentes (IgG+IgM). Em alguns casos 
é igualmente possível detectar-se a presença/
subida de anticorpos da classe IgM. As técnicas 
disponíveis para a detecção e quantificação de 
anticorpos são: 
Ensaios imunoenzimáticos (EIA: ELISA, •	
 ELFA, etc.)
Ensaios radioimunológicos (RIA)•	
Aglutinação•	
Western-blot•	
Recombinant immunoblot assay (RIBA)•	
Imunofluorescência•	
Fixação de complemento•	
Inibição de hemaglutinação•	
1- Métodos directos
1.1. Detecção de antigénio viral
A principal vantagem destes métodos é a rapi-
dez com que o resultado é obtido. No entanto, 
na maior parte dos casos, trata-se de técnicas 
que envolvem a correcta interpretação das ob-
servações feitas, o que torna os resultados me-
nos objectivos. A sensibilidade e especificidade 
são igualmente menores quando comparadas 
Figura 1- Célula epitelial infectada 
pelo HSV-1 detectada por IF
Figura 2- Antigénio pp65 do CMV 
detectado nos núcleos de neutrófilos do 
sangue periférico detectado por IF
Figura 1- Célula epitelial infectada pelo 
HSV-1 detectada por IF
Figura 2- Antigénio pp65 do CMV detecta-
do nos núcleos de neutrófilos do sangue 
periférico detectado por IF
I- Métodos de diagnóstico em 
Virologia
5
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
com outras técnicas. Está muito dependente da 
qualidade da amostra clínica. São ainda técni-
cas não automatizadas que envolvem a inter-
venção frequente do operador.
Exemplos de detecção de antigénios como mé-
todo de diagnóstico de viroses: detecção de 
células infectadas por RSV, ou adenovirus, em 
aspirados naso-faríngeos ou bronco-alveolares; 
detecção de HSV (Figura 1) ou VZV em zaraga-
toas de lesões cutâneas (exemplos em que se 
utiliza a técnica de imunofluorescência); detec-
ção de rotavirus ou adenovirus nas fezes (por 
reacção de aglutinação de partículas de látex); 
detecção de antigénio p24 do HIV no soro ou 
plasma (antigenémia); detecção de antigenémia 
pp65 do CMV (por métodos imunoenzimáticos 
- EIA).
1.2. Microscopia electrónica (ME)
As partículas virais são detectadas e identifica-
das com base na sua morfologia. A sua princi-
pal vantagem reside no facto de ser possível vi-
sualizar directamente a partícula viral. Desta 
forma é possível examinar a amostra sem que 
para tal seja necessário o conhecimento prévio 
dos possíveis agentes causais, em contraste 
com outros métodos que usam células (cultura 
celular) ou sondas específicas (PCR, detecção 
de antigénio, detecção de anticorpos). 
Figura 3- Partículas virais de Adenovirus pre-
sentes nas fezes
A rapidez é outra das vantagens da ME, poden-
do por isso ser usada em diagnóstico virológico 
rápido. No entanto, exige que na amostra clíni-
ca existam partículas virais em quantidade sufi-
ciente para poderem ser visualizadas (105-106 
partículas virais/ml). Devido a isso, a sua sensi-
bilidade é baixa, podendo, no entanto, ser aumen-
tada utilizando a imuno-microscopia electrónica 
(IME), onde são usados anticorpos específicos 
do vírus a pesquisar, por forma a aglutinar as 
partículas virais, tornando-as mais fáceis de vi-
sualizar e reconhecer. Para além da sua baixa 
sensibilidade, a ME tem como desvantagem ser 
uma técnica dispendiosa, quer na aquisição do 
equipamento, quer na sua manutenção e utili-
zação, exigindo pessoal devidamente treinado. 
Devido a isso, e ao facto dos métodos de de-
tecção de antigénios e de diagnóstico molecu-
lar, se terem tornado mais fiáveis, sensíveis e 
económicos, fizeram com que cada vez menos 
se utilize a ME como método de diagnóstico. Ac-
tualmente a ME é usada no diagnóstico de gas-
trenterites virais a partir das fezes (rotavirus, 
adenovirus - Fig 3, astrovirus, calicivirus, etc). 
Menos frequentemente pode ser usada para 
a detecção de vírus em lesões cutâneas, como 
por exemplo o HSV ou o HPV.
Figura 4- Corpos de Negri (setas) presentes 
no citoplasma de um neurónio infectado com 
o vírus da raiva
1.3. Detecção de corpos de inclusão
A replicação viral provoca, por vezes, alteraçõeshistológicas (corpos de inclusão) nas células in-
fectadas in vivo. Estas alterações podem ser 
6
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
características ou não-específicas. Os corpos 
de inclusão, observáveis por microscopia óptica 
nas células presentes na amostra clínica, são 
basicamente conjuntos de partículas virais que 
estão a ser produzidas pela célula infectada no 
núcleo ou no citoplasma. Exemplos de corpos 
de inclusão são os corpos de Negri (Fig. 4) e os 
corpos de inclusão citomegálicos, encontrados 
nas infecções pelos vírus da Raiva e pelo CMV 
(citomegalovirus), respectivamente. Embora 
pouco sensível e específica, a identificação his-
tológica dos corpos de inclusão pode, ainda as-
sim, ser útil no diagnóstico de algumas viroses, 
em conjunt com outros métodos mais específi-
cos e sensíveis.
1.4. Detecção do genoma viral
Os métodos baseados na detecção do genoma 
viral, são igualmente conhecidos como méto-
dos de biologia molecular. Embora estes méto-
dos tenham, nos últimos anos, aumentado de 
importância no contexto do diagnóstico viral, o 
papel desempenhado por eles na rotina labora-
torial é ainda pequeno, quando comparado com 
os outros testes convencionais.
Os testes clássicos de detecção do genoma 
viral englobam as técnicas de dot-blot e de 
Southern-blot os quais dependem do uso de 
sondas marcadas (com radioactividade ou com 
enzimas) específicas do DNA/RNA a pesquisar 
(por hibridação da sonda com a sequência alvo). 
A especificidade depende das condições usadas 
durante o processo de hibridação. A sensibilida-
de destas técnicas é, em geral, idêntica à obser-
vada para os testes convencionais.
As técnicas mais recentes, tal como a polymera-
se chain reaction (PCR), a ligase chain reaction 
(LCR), a nucleic acid based amplification (NAS-
BA), e branched DNA (bDNA), dependem todas 
elas de alguma forma de amplificação, seja do 
ácido nucleico a pesquisar, seja do próprio si-
nal emitido pela reacção final. Destas técnicas 
a mais sensível e a que mais usos tem tido no 
diagnóstico virológico é o PCR. Teoricamente, 
pela técnica de PCR é possível amplificar-se 
uma única cópia de DNA alvo presente na amos-
tra clínica. Devido a esta extrema sensibilidade, 
a execução desta técnica traz consigo alguns 
problemas, o maior dos quais tem a ver com 
a possibilidade de contaminações, uma vez que 
basta a presença duma quantidade mínima de 
DNA contaminante para se obter um resulta-
do falsamente positivo. Por outro lado, a detec-
ção por PCR de DNA de um determinado vírus, 
não significa necessariamente que se esteja na 
B
A
Figura 5- Exemplo de reacção de hibridação in situ. A- Detecção de células infectadas com o 
vírus do papiloma humano numa amostra obtida do colo do útero; B- Detecção de células 
infectadas com o HHV-8 numa amostra de uma lesão do Sarcoma de Kaposi
Figura 5- Exemplo de reacção de hibridação in situ. A- Detecção de células infectadas com o vírus 
do papiloma humano numa amostra obtida do colo do útero; B- Detecção de células infectadas com o 
HHV-8 numa amostra de uma lesão do Sarcoma de Kaposi
7
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
presença real duma patologia. Casos como a 
detecção de genomas virais identificados como 
sendo do vírus da hepatite G ou do TTV (transfu-
sion transmited virus) não permitem, por si só, 
fazer a respectiva associação com qualquer es-
tado patológico agudo ou crónico. Também nos 
casos de infecções por vírus que se mantêm 
latentes no hospedeiro, a detecção de genoma 
viral a nível celular, não implica necessariamen-
te que esteja a ocorrer uma manifestação pato-
lógica desse vírus.
Dentro deste grupo de testes há ainda a refe-
rir os que utilizam as reacções de hibridação in 
situ (Fig. 5). Neste caso a integridade da célula 
é mantida, sofrendo somente uma permeabili-
zação de forma a permitir a entrada da sonda 
molecular marcada com uma enzima. Uma vez 
que a estrutura celular e tecidular são manti-
das, permite quantificar o número de células in-
fectadas e quais os tipos de células, ou compar-
timentos celulares, onde o genoma viral existe.
1.5. Isolamento viral
O isolamento de vírus a partir de amostras clí-
nicas constitui um importante método de diag-
nóstico de infecções virais. Este pode ser conse-
guido por inoculação das amostras clínicas em 
células eucariotas mantidas em cultura in vitro, 
ou, em alternativa, por inoculação em animais 
ou ovos embrionados. Estas duas últimas alter-
nativas são usadas somente em casos muito 
particulares, devido principalmente à maior di-
ficuldade na sua manutenção. Assim, este tipo 
de método utiliza quase sempre culturas de cé-
lulas mantidas in vitro. 
As células eucariotas variam muito quanto à 
sua susceptibilidade aos diferentes vírus. É de 
importância crucial a escolha da(s) célula(s) 
mais susceptíveis para um determinado vírus 
suspeito de estar presente numa determina-
da amostra (dependendo dos sinais clínicos). 
Além disso, a amostra deverá ser enviada ao 
laboratório o mais rapidamente possível após 
a colheita.
Depois de recebida a amostra, esta é inoculada 
em diferentes tipos de culturas celulares depen-
dendo dos vírus supostamente envolvidos. Este 
inóculo é mantido durante pelo menos 1 hora 
até ao máximo de 16-18 horas (overnight). As 
células são mantidas a 37ºC em estufa com at-
mosfera controlada (5% CO2).
As culturas celulares podem ser de diferentes 
tipos. Assim podemos classificá-las quanto ao 
modo de cultura ou quanto ao tipo de células. 
Quanto ao modo de cultura, as células podem 
ser classificadas como células em suspensão 
ou células em monocamada. As primeiras, 
como o nome indica, crescem não aderentes 
ao suporte sólido, dispersas no meio de cultura. 
As segundas crescem aderentes às paredes 
internas do frasco de cultura ou outro suporte 
sólido. Esta característica está dependente da 
origem das células: se as células, in vivo, exis-
tirem em suspensão (células sanguíneas por 
exemplo) mantêm essa característica in vitro. 
Se in vivo as células formarem tecidos ou ór-
Figura 6- Exemplos de efeitos citopáticos (ECP) induzidos por alguns vírus. Da esquerda para a di-
reita: ECP do HSV-1, HIV-2 e RSV
8
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
gãos sólidos, existindo aderentes entre si, man-
terão essa propriedade in vitro.
Quanto ao tipo de células, estas podem ser clas-
sificadas como células primárias, células secun-
dárias e células contínuas (ver mais adiante no 
texto).
1.5.1. Detecção dos vírus em cultura
Após inoculação da amostra, e após o tempo 
necessário para que a replicação viral ocorra, 
a detecção de replicação viral nas células ino-
culadas pode ser feito pela visualização do efei-
to citopático (ECP - Fig 6). Com esse objectivo, 
as culturas inoculadas devem ser observadas 
diariamente. Regularmente também, o meio de 
cultura deve ser mudado por forma a manter 
as células em crescimento e em bom estado 
fisiológico.
Alguns vírus, no entanto, não induzem o apa-
recimento de ECP. Nesses casos tem que se 
recorrer a técnicas de detecção alternativas. 
Uma dessas técnicas é a hemadsorção. Esta 
técnica baseia-se no facto de alguns vírus (in-
fluenza e parainfluenza, por exemplo) induzi
rem a expressão de hemaglutininas, de origem 
viral, na membrana da célula infectada. Desta 
forma, a célula adquire a capacidade de fixar 
hemácias na sua membrana. Nesta técnica, 
o meio de cultura é removido e as células são 
incubadas com uma suspensão de hemácias a 
4ºC ou à TA durante 30 minutos. A suspensão 
de hemácias é removida e o tapete celular é ob-
servado ao microscópio. Caso exista hemadsor-
ção (Figura 7), as hemácias vão ficar aderentes 
a algumas células (células infectadas e por isso 
expressando hemaglutininas virais).
Alternativamente, a presença de vírus em cul-
tura pode ser feita recorrendo à técnica de he-
maglutinação ou à técnica de interferência viral. 
No primeiro caso, pesquisa-se a presença de 
proteínas com capacidade de aglutinar hemá-
cias de espécies animaisespecíficas (humanas 
tripsinizadas, de pombo, etc.). Essas proteínas 
são pesquisadas no sobrenadante da cultura 
infectada pondo em contacto esse sobrenadan-
te com uma suspensão de hemácias em placas 
com cúpulas de fundo em V. Caso existam he-
maglutininas, as hemácias ficam em suspensão 
não se concentrando no fundo da cúpula (vérti-
ce do V). Os resultados possíveis estão repre-
sentados na Figura 11.
A técnica de interferência viral é usada nos ca-
sos em que nenhuma das anteriores técnicas 
pode ser usada. O seu princípio baseia-se no 
facto de haverem determinados vírus que inter-
ferem com a replicação de outros que se mul-
tiplicam nas mesmas células, impossibilitando 
estes últimos de fazerem o seu ciclo replicativo. 
O sistema vírus-célula é portanto constituído 
por um tipo de células e por dois vírus: o vírus 
que se pretende detectar (vírus A que é inter-
ferente) e o vírus indicador (vírus B). Este últi-
mo terá de ser capaz de induzir um ECP claro e 
rápido. Caso na cultura celular inoculada existir 
o vírus A, ele vai impedir que, após inoculação 
posterior do vírus B, este possa fazer o seu ci-
clo de replicação e por isso não apareça o ECP 
esperado. Caso não exista o vírus A na cultura, 
a inoculação do vírus B irá resultar no apareci-
mento do ECP esperado e característico. Este 
procedimento é obviamente mais laborioso e, 
como já foi dito só é usado em casos particula-
res em que nenhuma das técnicas anteriores 
é passível de ser utilizada. Além disso, impõe a 
conhecimento presuntivo de qual o vírus que 
deverá estar presente em cultura para que a 
escolha do vírus B possa ser convenientemente 
feita. Essa suspeita baseia-se em vários parâ-
metros dos quais os mais importantes são: tipo 
de sintomatologia, amostra biológica usada e o 
facto de se verificar a ausência de ECP.
1.5.2. Identificação dos vírus em cultura
A identificação presuntiva de um vírus em cultu-
ra pode ser feita com base no seu ECP, na ca-
pacidade de induzir hemadsorção e no tipo de 
Figura 7- Exemplo de um resultado positi-
vo pela técnica de hemadsorção. Reparar 
na acumulação de hemácias junto de algu-
mas células (seta)
9
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
célula onde esse vírus foi capaz de se replicar 
(susceptibilidade celular). No entanto, para a 
identificação cabal e objectiva do vírus em ques-
tão, torna-se necessário recorrer a técnicas 
como a imunofluorescência, imunoperoxidase, 
neutralização, inibição da hemaglutinação, mi-
croscopia electrónica e eventualmente a técni-
cas de biologia molecular (amplificação, clona-
gem e sequenciação do genoma viral).
1.5.3. Vantagens e desvantagens do isola-
mento e cultura do vírus in vitro
A principal vantagem do isolamento viral, no 
âmbito do diagnóstico viral, é a especificidade 
e a capacidade de usar os vírus obtidos para 
futuras caracterizações. No entanto esta téc-
nica tem várias desvantagens: necessidade de 
existirem linhas celulares adequadas em cultu-
ra, laboratório devidamente apetrechado para 
a manipulação de amostras contendo vírus pa-
togénicos, pessoal devidamente treinado, cus-
tos elevados. Além disso, as culturas celulares 
são, devido aos meios de cultura extremamente 
ricos que são utilizados, facilmente contaminá-
veis por bactérias e/ou fungos.
10-5 10-6 10-7
Figura 9- Métodos das placas. Foram inoculadas as diluições 10-5,
10-6 e 10-7; as placas formadas em cada diluição são visíveis após 
adição do corante vermelho neutro
1.5.4. Cultura viral com centrifugação
Um dos avanços mais importantes, no diagnós-
tico rápido das infecções virais, foi a aplicação 
da centrifugação à cultura viral tradicional. Esta 
técnica baseia-se no facto de se conseguir au-
mentar a eficiência de infecção (infecciosidade) 
de alguns vírus quando, após inoculação da 
amostra, se submete as culturas a uma força 
centrífuga de baixa velocidade. As células assim 
tratadas são incubadas, 24-48 horas depois da 
inoculação, com anticorpos monoclonais mar-
cados, específicos de antigénios precoces do ví-
rus suspeito de estar presente na amostra bio-
lógica inoculada (presumido a partir dos sinais 
clínicos e do tipo de amostra colhida). Um dos 
melhores exemplos de aplicação desta técnica 
é o diagnóstico precoce da infecção pelo CMV 
(citomegalovirus). Neste caso a amostra é ino-
culada numa cultura de fibroblastos humanos 
(Fig.8).
1.5.5. Titulação de um vírus
Em Virologia, existem dois métodos para quan-
tificar (titular) uma suspensão viral: o método 
das placas e o da diluição limite.
Método das placas:
Baseia-se no princípio de que um vírus, ao infec-
tar uma célula e ao ser transmitido às células 
vizinhas, irá provocar a morte a essas células. 
Estas células mortas serão visualizadas, após 
adição de um corante vital (vermelho neutro).
As células susceptíveis ao vírus a titular são pos-
tas em cultura, numa placa de Petri ou numa 
cúpula de dimensões apropriadas, e usadas 
quando tiverem numa densidade correspon-
dente à sub-confluência. 
A suspensão viral a titular é diluída sucessi-
vamente, num factor de diluição 1:10 e cada 
Figura 8- Exemplo do resultado obtido pela 
técnica de cultura com centrifugação. Uma 
cultura de fibroblastos humanos (MRC-5) 
foi inoculada com uma amostra contendo 
CMV, submetida a centrifugação e incuba-
da com anticorpo monoclonal para o anti-
génio precoçe do CMV, pp72, marcado com 
fluoresceína
Figura 9- Métodos das placas. Foram inocula-
das as diluições 10-5, 10-6 e 10-7; as placas 
formadas em cada diluição são visíveis após 
adição do corante vermelho neutro
10
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
uma das diluições será inoculada numa placa 
individualmente. Na prática, serão inoculadas 
somente as diluições mais prováveis de darem 
uma leitura adequada (por exemplo as diluições 
10-5, 10-6 e 10-7). Após a inoculação as células 
inoculadas são inundadas com meio de cultu-
ra contendo agarose, por forma a favorecer as 
infecções célula-célula e não permitir a difusão 
das partículas virais entretanto formadas. Ao 
fim de algum tempo (variável consoante o tipo 
A diluição correspondente à TCID
50
 está localizada entre as diluições 10-5 e 10-6 (83% e 17%, 
respectivamente). Para se calcular essa diluição recorre-se à formula de interpolação:
% de infecção > 50% - 50%
% de infecção > 50% - % de infecção < 50%
No caso do exemplo será: 
83 - 50/83-17 = 33/66 = 0,5
O valor encontrado é multiplicado pelo negativo do log10 do factor de diluição, que no caso do 
exemplo dá igual a -1, ficando por isso
-1 x 0,5 = -0,5
O log10 da diluição que corresponde à TCID
50
 é obtido adicionando o valor obtido anteriormente 
ao valor do log10 da diluição acima dos 50%. Ou seja:
-5 + (-0,5) = -5,5
Ou seja, a diluição correspondente à TCID
50
 é igual a 10-5,5 e portanto o título da suspensão é 
105,5 TCID
50
Diluição 
viral
Nº de 
culturas 
infectadas/
inoculadas
Total 
acumulado 
de culturas 
infectadas
Total 
acumulado 
não 
infectadas
Taxa de 
infecção
Percentagem 
infectadas
10-4 5/5 10 0 10/10 100%
10-5 4/5 5 1 5/6 83%
10-6 1/5 1 5 1/6 17%
10-7 0/5 0 10 0/10 0%
Tabela 1- Esquema do cálculo da TCID50 por inoculação de células susceptíveis
de vírus), é adicionado o corante vermelho neu-
tro que irá corar de vermelho as células vivas 
e manter incolor as células mortas (Figura 9). 
O cálculo da concentração de partículas virais 
é feita usando a diluição que melhor contagem 
apresentar (nem demasiado elevada nem bai-
xa demais). Nessa, serão contadas as zonas de 
morte celular (denominadas placas), e multipli-
cadas pelo inverso da diluição usada como inó-
culo (exº: 50 placas na diluição 10-5, correspon-
11
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
de um título de 50x105 ou seja 5x106). Há ainda 
que ter em conta o facto de o título ser dado em 
PFU (plaque forming units; ou UFP, unidades for-
madoras de placas) por mililitro. Assim sendo, 
ter-se-à ainda que multiplicar o resultado pelo 
inverso da fracção de mililitro que foi usada(se 
só se inoculou 0,1 ml, terá que se multiplicar 
por 10 para se ter o valor por mililitro; ou seja, 
no exemplo dado anteriormente, ficará como 
resultado final: 5x107 PFU/ml).
Método da diluição limite:
Neste caso calcula-se a diluição que provoca 
a infecção em 50% das culturas inoculadas 
(TCID
50
 ou dose infectante 50%). A suspensão 
viral é diluída sucessivamente (factor de diluição 
1:10 normalmente) e as diferentes diluições 
são inoculadas individualmente em culturas de 
células susceptíveis. Para cada diluição, e ao 
fim do tempo adequado à replicação viral, vai-se 
observar qual o número de culturas inoculadas 
que apresentam sinal de infecção (por pesquisa 
do ECP, por exemplo). O objectivo é identificar 
aquela diluição para a qual se conseguiu infec-
tar metade das culturas inoculadas. Constrói-se 
assim uma tabela onde vão figurar o número de 
culturas infectadas e não infectadas para cada 
diluição, bem como os totais acumulados de cul-
turas infectadas e não infectadas para uma das 
diluição (Tabela 1). Os cálculos a realizar, para 
se calcular a TCID
50
 estão também esquema-
tizados na Tabela 1. Este método é mais labo-
rioso mas tem a vantagem de poder ser usado 
mesmo em vírus que não induzam a morte ce-
lular, a qual, como foi referido, é a marca que, 
no método das placas nos permite quantificar o 
título da suspensão viral em estudo.
1.5.6. Linhas celulares susceptíveis
No diagnóstico baseado no isolamento dos vírus 
in vitro, bem como na sua titulação, é importan-
te a escolha das células sobre as quais se vai 
Vírus Exemplos de Células Susceptíveis
Herpes Simplex (HSV) Vero, Hep-2
Varicela-Zona (VZV) Células diplóides humanas (HEK, HEL)
Citomegalovirus (CMV Fibroblastos humanos (MRC-5
Adenovirus Hep-2, HEK
Poliovirus MK, BGM, LLC-MK2, Vero
Coxsackie B MK, BGM, LLC-MK2, Vero
Echovirus MK, BGM, LLC-MK2
Influenza A e B MK, LLC.MK2, MDCK
Parainfluenza MK, LLC-MK2
Papeira MK, LLC-MK2, HEK, Vero
Respiratório Sincícial (RSV) Hep-2, Vero
Rinovirus HEK, HEL
Sarampo MK, HEK
Rubéola Vero, RK13
Tabela 2- Exemplos de alguns vírus possíveis de serem isolados in vitro e algumas células usadas 
para o seu isolamento.
12
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
inocular a amostra. Na Tabela 2 apresentam-se 
alguns exemplos de linhas celulares possíveis 
de serem usadas para vários vírus. Quando o ví-
rus é novo, ou seja em que a experiência é ainda 
restrita, deve-se seguir a norma de se utilizar 
in vitro as células mais prováveis de serem as 
células-alvo in vivo. Convém ainda realçar que, 
sempre que possível deverão ser usadas célu-
las primárias ou secundárias, pois são essas as 
que mais próximas estão da situação in vivo. 
2- Detecção de anticor-
pos específicos (serolo-
gia)
O diagnóstico baseado na detecção de anticor-
pos específicos, constitui a maioria dos ensaios 
de rotina em viroses humanas. Baseia-se no 
facto de, após a exposição a um antigénio, o sis-
tema imunológico responder com a produção 
de anticorpos específicos para esse antigénio. 
Os primeiros anticorpos a aparecerem são da 
classe das IgM, seguidos dos anticorpos da 
classe IgG. No caso de uma reinfecção, o nível 
das IgM específicas poderá aumentar, enquan-
to que as IgG aumentam significativamente. 
Existem vários tipos de técnicas serológicas. 
Nalgumas delas é possível descriminar a pre-
sença de IgM e de IgG (caso das técnicas EIA e 
RIA), enquanto que noutras somente é possível 
avaliar a presença da totalidade dos anticorpos 
(fixação do complemento, inibição da hemaglu-
tinação). De igual forma, a sensibilidade e espe-
cificidade dos métodos varia significativamente. 
Assim os métodos EIA e RIA são em geral mais 
específicos e sensíveis do que as técnicas de 
fixação do complemento (FC) ou inibição da he-
maglutinação (IHA).
2.1. Critérios para o diagnóstico duma 
primo-infecção
Um aumento significativo do título de anti-•	
corpos específicos (IgG ou totais) entre uma 
amostra colhida durante a existência de sin-
tomas (fase aguda) e a convalescença. Os 
principais problemas deste tipo de critério 
é a definição de subida significativa e o facto 
de ser um diagnóstico retrospectivo.
Presença de IgM: é uma forma rápida •	
de detectar uma primo-infecção, no entan-
to a detecção específica de IgM é por vezes 
difícil de se conseguir devido a reacções 
cruzadas/interferência (factor reumatói-
de), presença de IgM devido a reinfecções 
e ainda devido à persistência das IgM vários 
meses/anos após a infecção primária.
Seroconversão: definida como sendo a •	
evolução duma situação de ausência de anti-
corpos para uma outra onde esses anticor-
pos passam a estar presentes.
Uma única amostra com título elevado •	
de IgG (ou anticorpos totais): método muito 
pouco fiável pois não permite confirmar se 
se trata duma infecção primária, reinfecção 
ou vacinação.
2.2- Critérios para o diagnóstico duma 
reinfecção/reactivação
Na maior parte dos casos é difícil de distinguir 
uma reinfecção de uma reactivação, e, em 
certas circunstâncias, estas de uma infecção 
primária. Embora seja verdade que em muitos 
casos não é primordial distinguir uma primo-
infecção de uma reinfecção, outros há em que 
essa distinção é fundamental. É o caso da infec-
ção pelo vírus da rubéola (ver capítulo referen-
te ao diagnóstico por este vírus mais adiante) 
durante o primeiro trimestre da gravidez, onde 
uma primo-infecção está associada a um alto 
risco de mal-formações enquanto que a reinfec-
Figura 10- Evolução dos níveis de anticorpos 
em consequência de uma primo-infecção e rein-
fecção. De notar que, na reinfecção, as IgM 
podem estar ausentes ou presentes transito-
riamente a baixas concentrações.
13
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
ção não está.
Em geral, durante a reinfecção/reactivação, 
ocorre um aumento rápido dos níveis de IgG 
com ausência, ou presença de níveis muito bai-
xos, de IgM (Figura 10).
2.3- Limitações do diagnóstico seroló-
gico
A utilidade do diagnóstico serológico vai depen-
der do vírus em questão.
Assim:
Para vírus como os da rubéola ou da he-•	
patite A, o aparecimento dos sinais clínicos 
coincide com o desenvolvimento de anticor-
pos. Desta forma, a detecção de IgM ou títu-
los de IgG aumentados no soro do indivíduo, 
indica uma infecção activa
Noutros casos, no entanto, os sinais clí-•	
nicos surgem antes do aparecimento dos 
anticorpos. É o caso dos vírus responsáveis 
por infecções respiratórias ou por diarreias. 
Nestes casos, o diagnóstico serológico será 
sempre retrospectivo e por isso sem inte-
resse prático.
Outros vírus provocam o aparecimento •	
de manifestações clínicas muitos meses/
anos após a seroconversão. Servem de 
exemplos para esta situação o HIV e o vírus 
da raiva. Nestes casos a simples presença 
de anticorpos é suficiente para fazer um 
diagnóstico definitivo, excepto nas situações 
em que esses anticorpos possam ter sido 
transmitidos passivamente (caso da trans-
missão vertical do HIV).
Em casos de infecções localizadas, como •	
por exemplo as lesões herpéticas a nível la-
bial ou genital, podem não induzir uma res-
posta humoral significativa
Ocorrência de reacções cruzadas entre •	
vírus devidas a identidades antigénicas (por 
exº: HSV/VZV) que podem levar a falsos re-
sultados positivos
Ocorrência de falsos positivos devido a •	
anticorpos interferentes: frequente em do-
entes com Lupus Eritematoso disseminado 
ou com mononucleose infecciosa.
Indivíduos imunodeficientes podem ter •	
uma resposta humoral ausente ou muito 
reduzida.
Em indivíduos que sofreram transfusões •	
de sangue, podem existir anticorpos devido 
à transferência passiva desses anticorpos a 
partir do dador.
2.4- Presença de anticorpos no LCR
Numa pessoa saudável, poucos ou nenhuns an-
ticorpos devem ser detectados no LCR. Em situ-
ações de meningite ou encefalite, poderão ser 
produzidos anticorpos específicos do vírus em 
causa. A presença de anticorpos no LCR diz-se 
que é significativa quando a razão entre o título 
deanticorpos no soro e no LCR é inferior a 100. 
No entanto, isto só é verdade se a barreira he-
mato-encefálica estiver intacta (o que frequen-
temente deixa de ser verdade numa meningite 
ou encefalite). Caso contrário os anticorpos do 
soro podem passar facilmente para o LCR. O 
mesmo se passa quando a colheita do fluido 
espinal tiver sido feita com a ocorrência de he-
morragia. Nesse caso o LCR virá contaminado 
com sangue, o que invalida a interpretação da 
razão de anticorpos sangue/LCR. Uma forma 
de comprovar a não contaminação do LCR com 
sangue (seja por compromisso da barreira he-
mato-encefálica, seja por má colheita) é pesqui-
sar, no LCR, a presença de anticorpos específi-
cos para um vírus para o qual toda a população 
tenha sido vacinada (papeira, sarampo, rubéo-
la...). Caso não tenha havido contaminação com 
sangue, a presença de anticorpos no LCR será 
muito baixa ou nula.
2.5- Testes usados na detecção de an-
ticorpos específicos
2.5.1- Reacção de fixação do complemento 
(RFC)
A RFC é um testes simples, rápido e que exige 
pouco equipamento e reagentes. A sua utiliza-
ção é cada vez menor, tendo gradualmente sido 
substituído por testes mais sensíveis e específi-
cos (EIA e RIA). Este teste consiste em duas re-
acções antigénio-anticorpo (Ag-Ac) sucessivas, 
uma das quais (a segunda) serve de teste indi-
cador. A primeira reacção, entre um antigénio 
viral conhecido e titulado e o soro em estudo, 
ocorre na presença de uma quantidade pré-de-
terminada de complemento. Este complemento 
14
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
irá ser removida ou “fixada” pelo complexo Ag-
Ac eventualmente formado. A segunda reacção 
Ag-Ac consiste na junção de hemácias de car-
neiro e hemolisina (também esta previamente 
titulada). Quando este sistema indicador é adi-
cionado à primeira reacção, as hemácias serão 
lisadas somente na presença de complemento 
livre (não “fixado” pela primeira reacção Ag-Ac. 
Desta forma indirecta ficamos a saber se na 
amostra de soro em estudo existiam Ac espe-
cíficos do Ag usado. Exige a titulação prévia do 
antigénio, complemento e hemolisina usados.
2.5.2- Reacção de inibição da hemaglutinação 
(IHA)
Vários vírus possuem a capacidade de aglutinar 
hemácias de algumas espécies de mamíferos 
e de aves (Fig. 11). A espécie cujas hemácias 
são aglutinadas depende do vírus. Exemplos de 
vírus que possuem hemaglutininas são: influen-
za, parainfluenza, adenovirus, rubéola, flavivirus, 
e algumas estirpes de picornavirus. O princípio 
deste teste baseia-se no facto de, caso existam 
Ac específicos do vírus em estudo (com capa-
cidade hemaglutinante), estes Ac irão impedir 
a hemaglutinação por parte do Ag. Tal como 
a RFC, a IHA é um teste simples e que requer 
muito pouco equipamento/reagentes. É mais 
sensível que a RFC mas menos do que o EIA ou 
o RIA. Diluições sucessivas do soro em estudo 
(1:10, 1:20, 1:40, 1:80, ...) são postas em con-
tacto com uma quantidade constante e pré-de-
terminada de hemaglutinina viral. Em seguida é 
adicionada uma suspensão de hemácias. Caso 
existam Ac no soro em estudo, estes irão ligar-
se ao Ag específico (com capacidade hemaglu-
tinante), impedindo que este aglutine as hemá-
cias presentes. Uma vez que este ensaio envolve 
a diluição sucessiva do soro, permite quantificar 
qual a maior diluição, desse mesmo soro, para 
a qual ainda se verificou a inibição da hemaglu-
tinação. O inverso dessa diluição corresponde 
ao título de anticorpos específicos para o vírus 
Figura 12- Microplaca de um ensaio de ELISA: as cúpulas coradas 
indicam reacções positivas; as incolores revelam a ausência de 
anticorpos nas amostras testadas.
Figura 11- Reacção de hemaglutinação. Na au-
sência de hemaglutininas livres, as hemácias 
sedimentam no fundo da microplaca. Caso es-
sas hemaglutininas estejam presentes, irão 
aglutinar as hemácias impedindo a formação 
do “botão” devido à sua sedimentação
15
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
em estudo (exº: maior diluição=1:160, logo o 
título=160).
2.5.3- Métodos imunoenzimáticos (EIA) e imu-
no-radioactivos (RIA)
Baseiam-se na formação de complexos Ag-Ac 
e posterior detecção destes complexos pela 
adição de um segundo Ac marcado enzimati-
camente (EIA) ou radioactivamente (RIA). No 
segundo caso, quanto maior o número de com-
plexos Ag-Ac formados maior a quantidade de 
radioactividade presente. No primeiro caso, a 
quantidade destes imuno-complexos irá deter-
minar a quantidade de enzima presente e esta 
por sua vez irá degradar em maior quantidade 
o substracto adequado, entretanto adicionado 
à reacção, donde resulta um composto corado. 
Assim, quanto maior a intensi dade da colora-
ção, maior a quantidade de enzima e, portanto, 
maior a quantidade de complexo Ag-Ac forma-
dos no início (Fig 12).
Os métodos EIA e RIA apresentam maior sensi-
bilidade, maior especificidade e são mais práti-
cos de executar, tendo ainda a vantagem de se-
rem automatizáveis, com benefícios em termos 
de diminuição de erros de execução, de maior 
objectividade e rapidez e de permitir uma me-
lhor organização do laboratório.
3- Cultura de células 
eucariotas
As culturas celulares em virologia são funda-
mentais, na medida em que permitem a multi-
plicação in vitro dos vírus presentes nas amos-
tras biológicas. São, por isso, um elemento 
fundamental em todos as técnicas virológicas 
que envolvam o isolamento (no diagnóstico das 
infecções virais) ou a propagação (estudos de 
caracterização fenotípica) de vírus.
Tratando-se de vírus causadores de patologias 
no ser humano, as células a utilizar têm de ser 
necessariamente eucariotas (os fagos multi-
plicam-se em células procariotas). As células 
eucariotas são muito mais difíceis de manter 
em cultura do que as células procariotas. Elas 
exigem meios de cultura muito ricos e são, por 
isso, muito susceptíveis à contaminação por mi-
croorganismos como as bactérias e fungos.
Duma forma simples, podemos distinguir as 
culturas celulares de três formas: pela forma 
como se propagam in vitro, conforme a sua 
morfologia e consoante o tipo de células.
1- Quanto à forma de propagação, as culturas 
celulares podem-se classificar em:
Culturas em suspensão: as células cres-•	
cem sem estarem aderentes entre si ou ao 
suporte sólido (paredes interiores do frasco 
de cultura ou outro recipiente onde estejam 
a ser cultivadas)
Culturas em monocamada: crescem •	
aderindo ao suporte sólido e entre si. Estas 
células necessitam, para serem transferi-
das para outro suporte sólido, de serem dis-
sociadas entre si e do suporte sólido onde 
se fixaram. Os métodos de dissociação se-
rão referidos mais adiante.
2- Quanto à sua morfologia as células podem-se 
classificar em:
Epiteliais: com morfologia poligonal•	
Fibroblásticas: com morfologia fina e •	
alongada
Outras: com outros tipos de morfologias •	
(células sanguíneas, nervosas, musculares, 
etc.)
Figura 13- Células MRC5; 
fibroblastos de pulmão hu-
mano; são usadas para, por 
exemplo, isolar e propagar 
o CMV
16
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
3- Quanto ao tipo de células as culturas celula-
res podem-se classificar em:
Células primárias: constituem o melhor •	
sistema celular uma vez que permitem a re-
plicação de um maior número de vírus e são 
aquelas que mais se assemelham às células 
in vivo, constituindo, por isso, o modelo mais 
próximo desse sistema. São células normais, 
obtidas directamente de animais. Permitem 
um número muito limitado de passagens 
(1 a 2). Têm inibição de contacto: uma vez 
justapostas, param de se dividir. Para além 
disso são difíceis de manter em quantidade 
suficiente. Exemplos de culturas de células 
primárias: linfócitos humanos.
Células secundárias: São obtidas ori-•	
ginalmente a partir de um dador animal e, 
se as condições de cultura forem as ideais, 
podem-se dividir e crescer durante algum 
tempo in vitro (entre 50-100 gerações ou 
passagens). No entanto, elas não têm a ca-
pacidade de se dividirem e crescer indefini-damente e eventualmente, ao fim de algum 
tempo, as suas características alteram-se 
e acabam por entrar em senescência e 
morrem. Os factores que controlam a ca-
pacidade de propagação destas células in 
vitro estão relacionados com o grau de di-
ferenciação das células - em geral, as célu-
las mais diferenciadas são mais difíceis de 
manter em cultura do que as células menos 
diferenciadas (menos especializadas). Exem-
plo de cultura de células secundárias: célu-
las MRC5 (Fig 13) - fibroblastos humanos 
obtidos a partir do pulmão e que em geral 
conseguem atingir as 60-70 gerações.
Células contínuas: Também denomina-•	
das (erradamente) de células imortalizadas, 
as células contínuas têm a capacidade de 
crescerem indefinidamente in vitro, desde 
que as condições de cultura sejam as ade-
quadas. Também são denominadas células 
transformadas uma vez que as suas carac-
terísticas fisiológicas normais foram altera-
das. Em geral são obtidas a partir de tecidos 
neoplásicos (cancros, linfomas, leucemias) 
ou, alternativamente, são o resultado da 
transformação in vitro de células normais 
através, por exemplo, da infecção com ví-
rus com capacidade transformante (EBV, 
HHV-8, HTLV, etc). Estas células caracteri-
zam-se por, em geral, terem perdido a “ini-
bição por contacto”, isto é, quando duas 
células adjacentes se tocam, continuam a 
dividir-se, ao contrário do que acontece nas 
células normais em que esse facto sinaliza 
as células para pararem de se dividir. As cé-
lulas HeLa (Fig. 14) são um exemplo de cé-
lulas contínuas. Estas são células epiteliais 
obtidas dum carcinoma do colo do útero e 
estão infectadas com o vírus do papiloma 
humano tipo 18 (HPV 18).
Figura 14- Células HeLa; células epiteliais 
obtidas a partir dum carcinoma do colo do úte-
ro; são usadas, nomeadamente, no isolamento 
e propagação do HSV
17
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
1- Características gerais
A infecção pelos vírus Herpes simplex (HSV) é 
das infecções virais de maior prevalência na po-
pulação mundial. Existem dois serotipos: HSV-1 
e HSV-2. São vírus com genoma DNA, da famí-
lia Herpesviridae, possuindo cerca de 50% de 
homologia na sua sequência nucleotídica. Esta 
identidade leva à ocorrência de reacções cru-
zadas entre os dois tipos de antigénios. Apesar 
disso, é possível identificar e diferenciar os dois 
serotipos recorrendo a técnicas de detecção 
de anticorpos (no soro ou plasma) ou de anti-
génios (directamente nas células de lesões her-
péticas).
A transmissão ocorre por contacto com as mu-
cosas infectadas, principalmente se existirem 
escoriações ou quebras de continuidade da 
pele e mucosas, durante as relações sexuais e 
durante o parto. A disseminação do vírus ocor-
re por migração centrífuga das partículas vi-
rais através dos nervos sensoriais periféricos. 
Na porta de entrada, na derme e na epiderme, 
ocorre o processo de replicação, e as partícu-
las virais são transportadas pela terminação 
nervosa até ao núcleo dos neurónios sensitivos. 
Conhece-se menos a sucessão de eventos a 
partir desse ponto. Em alguns casos, ocorre a 
infecção com replicação viral e morte celular. 
Em outros, o vírus fica em estado de latência 
(Fig. 15). Os factores envolvidos nos mecanis-
mos de persistência do HSV e a sua reactiva-
ção periódica permanecem por esclarecer. 
Figura 15- Latência ao nível dos gânglios ner-
vosos do trigemio, associada à infecção oro-
labial pelo HSV
Após o primeiro contacto com o HSV (primo-
infecção), podem surgir sinais e sintomas 
envolvendo lesões nas mucosas. A duração 
dos sintomas, a infecciosidade das lesões e a 
possibilidade de complicações durante a pri-
mo-infecção é maior do que nos episódios de 
Figura 16- Exemplo de lesão oro-labial causada
por HSV-1
Figura 17- Exemplo de lesões vulvares 
causadas pelo HSV-2
II- Diagnóstico da Infecção 
por HSV
Figura 16- Exemplo de lesão oro-labial causa-
da por HSV-1
Figura 17- Exemplo de lesões vulvares causa-
das pelo HSV-2
18
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
reactivação. A gengivoestomatite aguda é a ma-
nifestação mais comum das primo-infecções, as 
quais ocorrem mais frequentemente entre 1 e 
4 anos de idade. O herpes labial e as úlceras da 
córnea (queratites herpéticas) são as manifes-
tações clínicas mais frequentes nos casos de 
reactivação.
As manifestações clínicas e a evolução da in-
fecção dependem da idade, da localização, do 
estado imunológico do paciente e do tipo anti-
génico do vírus. A exposição ao sol (luz ultravio-
leta), a imunossupressão e traumas cutâneos 
podem levar à reactivação. Ocasionalmente, 
várias estirpes do mesmo subtipo viral podem 
ser detectadas num mesmo paciente, princi-
palmente nos imunodeficientes (doentes com 
SIDA ou transplantados). Este facto sugere a 
possibilidade de poder haver infecção exógena 
por diferentes estirpes virais. 
A infecção pelo HSV tipo 1 (HSV-1) é, em ge-
ral, adquirida mais cedo do que a do tipo 2 
(HSV-2). 
Cerca de 90% dos adultos com idade de 50 
anos, apresenta anticorpos contra HSV-1. Nas 
populações socio-económicas mais desfavore-
cidas, esta percentagem é encontrada na fai-
xa etária dos 30 anos. Os anticorpos contra o 
HSV-2 não são normalmente detectados até 
a puberdade. As taxas de prevalência desses 
anticorpos correlacionam-se com o início da 
Figura 18- Esquema das possíveis localizações e manifestações 
clínicas das infecções pelo HSV-1 e HSV-2
vida sexual activa, o que distingue este vírus do 
HSV-1. A percentagem de indivíduos com anti-
corpos para o HSV-2 aumentou 30 pontos nos 
últimos 12 anos nos Estados Unidos. Numa 
avaliação obstétrica, 25% da população estu-
dada tinham anticorpos para o HSV-2; destes, 
apenas 10% apresentavam história clínica de 
lesões genitais. Cerca de 50% dos adultos he-
terossexuais, com vida sexual activa, apresenta 
anticorpos positivos, sendo a taxa 5% maior en-
tre as mulheres.
O HSV tipo 1 está associado a uma variedade 
de infecções envolvendo lesões mucocutâneas 
orolabiais (Fig. 16), oftálmicas, meningoencefá-
licas, podendo eventualmente causar lesões vis-
cerais e genitais, enquanto o HSV tipo 2 (HSV2) 
está associado a infecções genitais sexualmen-
te adquiridas (Fig. 17). Ambos os tipos podem 
causar lesões nas diferentes localizações, e os 
sinais clínicos são idênticos (Fig. 18).
Tanto o HSV-1 como o HSV-2 podem ser respon-
sáveis por lesões mucocutâneas primárias em 
qualquer localização. A duração e a intensidade 
da infecção não dependem do serotipo envolvi-
do. No entanto, o tipo de vírus e a localização 
da primo-infecção podem afectar a frequência 
e a probabilidade das recidivas. Estudos recen-
tes demonstram que tanto a frequência como 
a probabilidade são maiores quando a infecção 
é causada pelo HSV-2. A infecção genital por 
Figura 18- Esquema das possíveis localizações e manifestações clínicas das infecções pelo 
HSV-1 e HSV-2
19
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
HSV-2 ocorre com uma frequência oito a dez 
vezes maior que a infecção genital por HSV-1. 
Por outro lado, a infecção oral-labial por HSV-1 
ocorre mais frequentemente do que a infecção 
oral-labial por HSV-2. A probabilidade de reacti-
vação da infecção causada pelo HSV-2 é duas 
vezes maior. 
Em indivíduos imunocompetentes, a infecção 
limita-se às localizações mucocutanêas e aos 
gânglios sensoriais. Em indivíduos imunodefi-
cientes, as lesões causadas tanto pela primo-
infecção como pelas reactivações tendem a ser 
mais extensas e a persistir por muito mais tem-
po do que nos indivíduos imunocompetentes. 
Nesses pacientes, o quadro é grave, geralmen-
te com comprometimento esofágico, pneumoni-
te intersticial e infecção disseminada com com-
prometimento visceral. A infecção pelo HSV-2 é 
um tipo de infecção oportunista importante em 
indivíduos infectados pelo HIV. Calcula-se que 
até 90% desses indivíduos estejam coinfecta-
dos com o HSV-2. 
Num pequeno número de casos, a infecção 
pelo HSV pode levar a uma encefalite viral com 
danos neurológicos severos.O HSV, principal-
mente o do tipo 1, pode causar encefalite em 
adultos pela reactivação dos vírus latentes. As 
infecções mais agressivas, com risco de vida, 
são a perinatal e as que ocorrem em indivídu-
os imunodeficientes, em particular os doentes 
com SIDA.
Existem dados que demonstram que os pacien-
tes que apresentam uma infecção primária 
mais agressiva e não tratada têm índices mais 
elevados de recorrência a longo prazo.
As respostas imunológicas, humorais e celula-
res manifestam-se nas primeiras semanas e 
persistem por toda a vida. Embora não possu-
am capacidade neutralizante, induzem o apare-
cimento de manifestações clínicas mais atenua-
das e apresentam reacções cruzadas entre os 
dois subtipos.
2- Diagnóstico 
O isolamento viral em cultura de células eucario-
tas é o método de referência para o diagnóstico 
e tipagem do HSV. O HSV pode ser detectado 
em cultura 2 a 8 dias após inoculação, mas, em 
vários casos, como nos de baixos títulos virais, 
convalescença das lesões ou lesões atípicas, o 
vírus pode não ser isolado. A sensibilidade do 
isolamento do HSV em cultura de células é de 
aproximadamente 105 partículas virais por mL. 
A detecção é em geral conseguida pela visuali-
zação do ECP característico: arredondamento 
das células e formação de sincícios e ainda, 
após coloração com hematoxilina-eosina, pelo 
aparecimento de células apresentando uma in-
clusão eosinófila intra-nuclear (Fig. 19).
Actualmente, a reacção em cadeia da poli-
merase (PCR) é o método mais sensível para 
o diagnóstico da infecção por HSV (Fig. 20). É 
altamente sensível (até 5 viriões por amostra), 
específica (98-100%), e pode identificar o genó-
tipo e ainda permitir a quantificação viral. O PCR 
Figura 19- Exemplos de ECP induzido pelo 
HSV in vitro
Figura 19- Exemplos de ECP induzido pelo 
HSV in vitro
20
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
quantitativo pode ser útil para a monitorização 
da resposta à terapia antiviral. 
Além disso, o ensaio realizado por PCR, permite 
o diagnóstico utilizando-se diferentes amostras 
como sangue, LCR, líquido amniótico e sangue 
fetal.
O líquido amniótico poderá ser colhido a partir 
da 12ª semana até o final da gestação. No en-
tanto, a altura ideal situa-se entre a 14ª e a 16ª 
semana. Em relação ao sangue fetal a altura 
Figura 20- Esquema da reacção de PCRFigura 20- Esquema da reacção de PCR
ideal para essa colheita situa-se entre 18ª e a 
22ª semana de gestação. 
Em alternativa, o diagnóstico das infecções 
por HSV pode ser feito recorrendo à técnica 
de imunofluorescência (Fig. 21 e Fig. 1 da pá-
gina 3). Esta técnica é sensível e específica 
uma vez que se utilizam anticorpos monoclo-
nais dirigidos para o HSV-1 e HSV-2. Esses 
anticorpos são marcados com um fluorocro-
mo (FITC - isotiocianato de fluoresceína, por 
exemplo). Caso as células colhidas a partir da 
lesão estejam infectadas, vão expressar an-
tigénios virais que serão reconhecidos pelos 
respectivos anticorpos marcados. Assim, as 
células infectadas irão apresentar fluorescên-
cia enquanto que as não infectadas manter-
se-ão não fluorescentes (Fig. 21).
Esta técnica exige no entanto um particular 
cuidado na obtenção da amostra, uma vez 
que o que se pretende obter nessa amostra 
são células da base da lesão. É por isso ne-
cessário retirar previamente, 
com uma zaragatoa de algodão, os possíveis 
“contaminantes” e só depois proceder à co-
lheita de células da lesão propriamente dita 
com o recurso a uma zaragatoa abrasiva 
(em plástico com reentrâncias). Este cuida-
do na colheita é particularmente importante 
em lesões situadas no colo do útero, onde as 
células de descamação e outras, devem ser 
cuidadosamente retiradas, antes da colheita, 
por forma a evitar-se os resultados falsamen-
te negativos (devidos à má colheita).
Figura 21- Imunofluorescência em células não infectadas (esquerda) e infectadas pelo HSV-1 (direita). 
Fluorocromo usado: FITC; a cor vermelha das células não infectadas deve-se ao uso do contra-corante, 
azul de Evans
Figura 21- Imunofluorescência em células não infectadas (esquerda) e infectadas pelo HSV-1 (direi-
ta). Fluorocromo usado: FITC; a cor vermelha das células não infectadas deve-se ao uso do contra-
corante, azul de Evans
21
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
1- Características
O CMV pertence à família Herpesviridae, sub-fa-
mília Betaherpesvirinae, podendo ser também 
denominado por HHV-5. Encontra-se largamen-
te distribuído na espécie humana. Dados dos 
EUA apontam para que 50-80% da população, 
com mais de 40 anos, possua anticorpos para 
este vírus. A sua prevalência é maior quanto 
mais baixo for o nível sócio-económico das po-
pulações.
A transmissão ocorre por via vertical (durante 
a gestação, no trabalho de parto ou no aleita-
mento), ou por contacto com líquidos biológicos 
onde o vírus pode estar presente, nomeada-
mente: urina, saliva, sangue, sémen e fluidos va-
ginais. Para além disso a transmissão também 
pode ocorrer em consequência de transfusões 
ou transplantes de órgãos (Fig. 22).
Na maior parte dos casos, a infecção pelo CMV 
está associada à ausência de sintomatologia ou 
a situações benignas, podendo em alguns ca-
sos ocorrer um síndroma mononucleósico com 
febre ou ainda hepatite. Após esta infecção 
primária, o vírus fica latente podendo sofrer re-
activações ao longo da vida do hospedeiro. No 
entanto, em certos grupos de risco, a infecção 
urina, saliva 
in utero, parto, aleitamento, saliva 
esperma, fluidos vaginais, saliva 
mãe
infantário
criança
adolescente
adulto
transfusão
transplante
urina, saliva 
relações 
sexuais
Figura 22- Esquema das vias de transmissão da infecção pelo CMV
pelo CMV pode tornar-se extremamente preo-
cupante. Exemplos destes grupos são os imuno-
deficientes e a mulher grávida, esta última pelo 
risco de poder transmitir a infecção ao feto.
Durante a gravidez, o maior risco para o feto 
provém de uma primo-infecção (Fig. 23). Nas 
situações em que já tenha ocorrido uma infec-
ção por CMV no passado (reactivações), o risco 
para o feto é praticamente nula. Ainda dentro 
da infecção mãe-filho, é de referir que o risco 
maior está associado à infecção congénita (ad-
quirida durante a gestação). As infecções peri-
natal (trabalho de parto) ou pós-natal (aleita-
mento) estão, em geral. associadas a situações 
de muito menor gravidade para a criança.
2- Diagnóstico
O diagnóstico da infecção pelo CMV é feito re-
correndo a várias técnicas:
Detecção de anticorpos por reacção •	
 imunoenzimática (ELISA)
Detecção de antigénio viral (pp65) por •	
 IF
Cultura do vírus in vitro em fibroblastos •	
 humanos
Detecção do genoma viral por PCR•	
III- Diagnóstico da Infecção 
pelo citomegalovirus (CMV)
22
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
A detecção de anticorpos pode ser feita quer 
para as IgG quer para as IgM. A detecção de 
IgM é em geral problemática visto que podem 
ocorrer falsos positivos (devido por exemplo à 
presença de factor reumatóide) ou falsos nega-
tivos. Por outro lado, as IgM podem manter-se 
em circulação por vários meses (anos, eventu-
almente), podendo conduzir a falsas interpre-
tações relativamente ao momento da primo-
infecção. Há a acrescentar ainda o facto de, em 
alguns casos de reactivações, poderem surgir, 
de novo, IgM em circulação, conduzindo a falsas 
interpretações de primo-infecções.
Por outro lado, a presença de IgG no recém 
nascido não tem qualquer significado, visto elas 
terem sido adquiridas passivamente a partir do 
sangue materno. Também nas crianças, a pes-
quisa de IgM pode conduzir a interpretações 
erróneas, uma vez que a sua ausência pode ser 
somente devido à imaturidade do seu sistema 
imunológico e não à real ausência de uma pri-
mo-infecção.
Por tudo isto, o uso da detecção de anticorpos 
específicos para o CMV (IgG ou IgM) carece de 
uma cuidadosa interpretação. Mais recente-
mente, a quantificação do grau de avidez das 
IgG revelou-se extremamente útil como auxiliar 
da interpretaçãodos dados serológicos uma 
vez que permite, com alguma segurança, des-
criminar as infecções antigas (há mais de 3 
meses) das mais recentes. Pode-se assim con-
firmar, ou não, a existência de uma possível pri-
mo-infecção recente, o que, a verificar-se numa 
mulher grávida, constitui um grave risco para 
o feto devido à possibilidade de ocorrer uma in-
fecção congénita.
No contexto do diagnóstico da infecção por 
CMV na mulher grávida, há dois pontos de ex-
trema importância que convém aqui realçar:
Somente a infecção congénita apresen-•	
ta um risco elevado para o recém-nascido
Somente a primo-infecção apresenta ris-•	
co para o recém-nascido
Daí que o intuito do diagnóstico vise, por um 
lado, averiguar da presença ou não de uma 
primo-infecção recente, e por outro, localizar a 
infecção durante o período de gestação ou fora 
dele.
O diagnóstico de uma infecção pelo CMV pode 
ser feito:
No período pré-natal (durante a gesta-•	
ção), recorrendo ao sangue da mulher grá-
vida e pesquisando a presença de IgG e IgM. 
Pretende-se nesta fase identificar uma pos-
sível infecção primária.
Caso se suspeite de uma primo-infecção •	
pelo CMV, essa suspeita terá de ser confir-
mada recorrendo ao Western-blot para as 
IgM e à avidez das IgG.
No período pré-natal recorrendo à am-•	
niocentese para confirmar a infecção fetal, 
através da técnica de PCR ou cultura viral. 
De notar que, apesar de poder ter ocorri-
Figura 23- Esquema mostrando as consequências de uma infecção primária na mulher grávida
Infecção primária durante a gravidez
40% fetos infectados 60% fetos não infectados
10% recém-nascidos sintomáticos
A maioria afectando o SNC, surdez, 
icterícia, trombocitopénia, 
hepatoesplenomegália
90% recém-nascidos assintomáticos; dos 
quais cerca de 10-20% apresentam 
surdez, atraso mental a médio prazo
23
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
do uma primo-infecção na grávida, isso não 
significa forçosamente que tenha havido in-
fecção fetal (40% de possibilidades; ver Fig. 
23).
No período pós-natal precoce (até às 3 •	
semanas de vida do recém-nascido), recor-
rendo ao sangue ou (mais frequentemente) 
à urina do recém-nascido. As técnicas neste 
caso serão a pesquisa de IgM no soro (pou-
co sensível), ou de preferência a cultura viral 
ou PCR a partir das células do sedimento 
urinário.
No período pós-natal tardio (após as 3 •	
semanas de vida), recorrendo às mesmas 
técnicas referidas anteriormente e, caso 
o resultado aponte para um infecção do 
recém-nascido, a pesquisa do genoma viral 
por PCR no sangue dos Guthrie Cards, com 
vista a distinguir uma eventual infecção con-
génita de uma infecção adquirida após ou 
durante o parto.
Assim e em esquema, com as possíveis inter-
pretações (ver também as Figuras 24 e 25):
A- Diagnóstico serológico pré-natal (também 
aplicável a outros grupos para além das mulhe-
res grávidas); exemplos de situações prováveis:
Urina
Negativo Positivo
Sem infecção por CMV
Guthrie card - PCR
Negativo Positivo
Infecção perinatal Infecção congénita
Figura 24- Esquema do procedimento a seguir no diagnóstico pós-natal, no caso da amostra ser co-
lhida após as 3 primeiras semanas de vida
IgM-/IgG+•	
IgM-/IgG-•	
IgM+/IgG- •	
IgM+/IgG+•	
B- Diagnóstico pós-natal
Métodos 
Isolamento do vírus (método de referên-•	
cia)
PCR•	
Amostra•	
Urina•	
Saliva•	
Sangue•	
Quando: nas 3 primeiras semanas de vida
C- Diagnóstico pós-natal tardio (após as 3 se-
manas de vida; Fig. 24)
Amostra: Sangue (Guthrie cards)•	
Método: PCR (pesquisa de DNA viral)•	
Teste de avidez das IgG:
O teste de avidez das IgG é usado, como já foi 
referido, para distinguir infecções que ocorre-
ram à menos de 3 meses das que ocorreram 
há mais tempo. Baseia-se no facto de os anticor-
24
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
pos recentemente formados, terem uma me-
nor afinidade para os respectivos antigénios, do 
que os que resultam de infecções mais antigas. 
Esta diferença de afinidade pode ser posta em 
evidência se, durante a incubação do soro com 
os antigénios da fase sólida, estiver presente 
um agente desnaturante (ureia, normalmen-
te). A presença deste composto, irá dificultar a 
formação dos complexos antigénio-anticorpo, 
diminuindo a quantidade de complexos forma-
dos. No final, devido à redução de anticorpo li-
gado, o resultado da reacção colorimétrica (ou 
outra, consoante o formato do teste usado) virá 
significativamente menor, quando comparado 
com a mesma incubação feita na ausência de 
ureia. A razão do valor da reacção na presença 
da ureia, sobre o valor na ausência desta será, 
caso a avidez dos anticorpos seja baixa, signifi-
cativamente inferior a 1 (na realidade será infe-
rior a 0,65). Desta forma é possível identificar 
os soros provenientes de indivíduos que tiveram 
uma infecção recente dos que tiveram uma in-
fecção há mais tempo.
O recurso ao teste de avidez das IgG no caso do 
CMV (e em geral em todas as infecções virais) 
tem interesse sempre que os testes serológi-
cos apresentem resultado positivo ou duvidoso 
para IgM, com a presença óbvia de IgG especí-
ficas.
Para além do CMV, existem outras infecções 
virais nas quais se torna importante determi-
nar a avidez das IgG para identificar infecções 
recentes: 
Rubéola•	
VZV•	
HSV•	
HHV 6•	
Parvovirus B19•	
HCV•	
EBV•	
Vírus do Sarampo•	
Figura 25- Esquema do procedimento a ter no caso de uma amostra de uma grávida apresentar IgM 
positiva
IgM positiva
(desconhecimento do estado
imunitário antes da gravidez)
Avidez 
IgG
Compatível com
Infecção Primária
Recente
<0,6 >0,8
Semanas de 
gestação
Western-
blot IgM
Compatível com
Infecção antiga
Provável
Infecção Primária
Recente
Pos Neg
0,6- 0,8
>12
<12
Figura 25- Esquema do procedimento a ter no caso de uma amostra de uma grávida apresentar IgM 
positiva
25
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
1- Características
O vírus da Rubéola pertence à família Togaviri-
dae, género Rubivirus. É um vírus com invólucro 
e genoma RNA de cadeia simples, polaridade 
positiva.
Transmite-se por gotículas de saliva ou pelas 
secreções naso-faríngeas. O indivíduo infecta-
do é contagioso 8 dias antes a 8 dias após o 
início dos sinais clínicos. O período de incuba-
ção é de 14-21 dias (média: 15 dias), durante o 
qual ocorre a virémia e a disseminação do vírus. 
Os sintomas que estão em geral associados a 
esta infecção consistem em: erupção máculo-
papulosa generalizada (Fig. 26), aparecendo 
em primeiro lugar na face e alastrando para o 
tronco e membros; artralgias e lifoadenopatias 
acompanhadas de febre moderada.
Após esta infecção inicial (infecção primária ou 
primo-infecção) surgem anticorpos protecto-
res. Apesar disso, as situações de reinfecção 
podem ocorrer, sendo estas, no entanto, em 
geral assintomáticas. 
Devido à presença de sintomatologia inespecífi-
ca ou, na maior parte dos casos, à ausência de 
sintomatologia, o diagnóstico da infecção pelo 
vírus da rubéola só pode ser feito recorrendo 
aos dados laboratoriais. Estes envolvem a de-
tecção de anticorpos específicos (IgM e IgG), 
isolamento viral e detecção do genoma viral por 
RT-PCR.
2- Síndroma de Rubéola 
congénita
Durante a virémia, o vírus da rubéola pode, numa 
mulher grávida, atravessar a placenta e causar 
infecção fetal. Esta infecção ocorre em pratica-
mente todos os casos numa situação de primo-
infecção materna durante o primeiro trimestre 
de gravidez. Os riscos para o feto advêm dos 
mecanismos patogénicos envolvidos na infec-
ção por este vírus: morte celular, aberrações 
cromossomais e paragem do ciclo celular. Este 
conjunto de acontecimentos é particularmente 
gravoso durante a fase de embriogénese (pri-
meiro trimestre de gravidez), levando ao apare-
cimento de graves mal-formações. A partir do 
primeiro trimestre, o risco de mal-formações 
decresce significativamente.
Perante este cenário, é fácil perceber que o 
principal objectivo no diagnóstico da infecção 
pelo vírus da rubéola é o de identificar primo-
infecções namulher grávida e de as localizar 
no período de gestação: primeiro trimestre, vs. 
segundo ou terceiro trimestre.
3- Diagnóstico laborato-
rial
Testes serológicos 
A detecção de anticorpos específicos constitui 
a base do diagnóstico do vírus da rubéola. Uma 
infecção recente pelo vírus da rubéola pode ser 
identificada por:
Figura 26- Apresentação típica da erupção 
máculo-papulosa característica da infecção 
pelo vírus da rubéola
IV- Diagnóstico da Infecção 
pelo vírus da rubéola
26
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
Detecção de IgM específicas•	
Aumento do título de anticorpos nos en-•	
saios de ELISA ou de IHA (inibição de hema-
glutinação)
Seroconversão (ausência de anticorpos •	
na primeira amostra; presença de anticor-
pos numa segunda amostra)
A acompanhar os testes serológicos é funda-
mental obter o máximo de informação relativa-
mente à data e tempo da possível exposição ao 
agente viral, bem como a data de início dos sin-
tomas (caso haja sintomatologia). Uma história 
de vacinação anterior para o vírus da rubéola 
ou de testes anteriormente feitos, são também 
auxiliares importantes na interpretação dos da-
dos serológicos.
A amostra de sangue deve ser colhida o mais 
cedo possível após o possível contágio, ou o 
mais precocemente possível após o inicio dos 
sintomas. Desta forma, por comparação com 
uma segunda amostra colhida numa altura ade-
quada, será possível por em evidência uma subi-
da do título de anticorpos em IHA ou em ELISA. 
Esta segunda amostra (S2) deverá ser colhida, 
regra geral, 15 dias após a primeira (S1). Em 
alternativa, caso S1 tenha sido colhida ainda 
durante o período de incubação (menos de 15 
após o possível contágio), dever-se-à colher S2 
15 dias depois do início dos sintomas (ou 15 
dias após o final do período de incubação no 
caso de se tratar de uma infecção assintomá-
tica).
O soro S1 deve ainda ser colhido o mais preco-
cemente possível a fim de se poder observar 
um aumento nítido do título e anticorpos no 
soro S2. De referir a propósito que o título má-
ximo do anticorpos é atingido ao fim de 3 dias a 
3 semanas após o início dos sintomas, depen-
dendo do hospedeiro (Ver Anexo).
A pesquisa de IgM é um dado importante na 
identificação de uma primo-infecção. A sua in-
terpretação, no entanto, requer algumas caute-
las, principalmente se não houver dados relati-
vos a duas amostras espaçadas no tempo (S1 
e S2). Assim, há que ter em conta os seguintes 
dados:
A duração em circulação das IgM é, em •	
geral, entre a 3 e as 6 semanas após o início 
dos sintomas, após o qual tendem a desa-
parecer
A sua presença pode ser detectada em •	
situações de reinfecções, embora com ní-
veis baixos e transitoriamente
Podem perdurar em circulação para •	
além do tempo normal
Por tudo isto é necessário por vezes recorrer 
a testes adicionais a fim de confirmar uma pri-
mo-infecção recente. Uma vez mais, e tal como 
acontecia com o CMV, o teste da avidez das 
IgG pode ser extremamente útil, uma vez que 
nos irá permitir distinguir infecções antigas de 
infecções recentes (ver capítulo respeitante ao 
diagnóstico do CMV).
Isolamento viral
Esta técnica é usada normalmente nos casos 
de diagnóstico pós-natal de uma infecção pelo 
vírus da rubéola. Com ela é possível identificar 
infecções congénitas (adquiridas durante a ges-
tação) e determinar a duração da excreção do 
vírus pelo recém-nascido. A amostra (zaragatoa 
naso-faríngea) é inoculada em células RK13 ou 
SIRC. Alternativamente, pode ser inoculada em 
células Vero seguida de passagem para RK13 
ou SIRC. O ECP é lento a aparecer e pouco per-
ceptível, pelo que a identificação do vírus em cul-
tura é, em geral, feito recorrendo a técnica de 
IF ou de hemaglutinação.
Diagnóstico da infecção congénita
O diagnóstico de uma infecção adquirida duran-
te a gestação é feito, no recém-nascido, por:
Presença de IgM específica no sangue •	
do cordão ou no sangue do recém-nascido 
(a possibilidade de contaminação com san-
gue materno tem de ser cuidadosamente 
excluída)
Detecção de IgG para além do tempo •	
normal de duração dos anticorpos mater-
nos (para além dos 6 meses)
Isolamento viral•	
O diagnóstico de uma infecção congénita pode 
ser feito ainda durante o período pré-natal, re-
correndo às seguintes técnicas:
Pesquisa de IgM no sangue fetal. No en-•	
tanto o feto não produz IgM em quantidade 
suficiente para serem detectadas antes da 
22ª semana de gestação
27
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
Isolamento do vírus da rubéola a partir do •	
líquido amniótico
Detecção do genoma viral ou de proteí-•	
nas virais a partir do líquido amniótico.
Perfil serológico duma infecção pelo vírus da rubéola
Primo-infecção
Reinfecção
28
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
1- Características
O HBV é um vírus com invólucro pertencente à 
família Hepadnaviridae, com genoma DNA, par-
cialmente bicatenário.
A infecção por este vírus pode apresentar-se 
clinicamente de duas formas: infecção aguda 
(com ou sem sintomatologia) e infecção cróni-
ca (com ou sem sintomatologia). Uma infecção 
aguda pode ou não evoluir para uma infecção 
crónica, dependendo do tipo de vírus e, princi-
palmente, da resposta imunológica do hospe-
deiro. A transmissão ocorre por contacto com 
fluidos biológicos, nomeadamente, sangue, es-
perma, fluidos vaginais, saliva e leite materno. 
Após um período de incubação longo (45-180 
dias; em média: 60-90), surgem os sintomas 
que incluem icterícia (Fig. 27), fadiga, dores 
abdominais, perda de apetite, náuseas e vómi-
tos. Estes sintomas resultam da destruição dos 
hepatócitos infectados, mediada pela resposta 
imunológica do hospedeiro (reacção inflamató-
ria e resposta por linfócitos T-citotóxicos). Esta 
resposta imunológica vai, na maioria dos casos, 
ser suficiente para a resolução da infecção 
com eliminação do agente viral, convalescença 
e cura. No entanto, em cerca de 10% dos ca-
sos, a resposta imunológica é menos vigorosa, 
dando origem a sintomas mais atenuados, e 
favorecendo a manutenção da infecção. Nes-
tas circunstâncias não se dá a eliminação viral, 
havendo lugar ao surgimento de uma infecção 
crónica no seguimento da infecção aguda não 
resolvida. Esta infecção crónica pode conduzir a 
uma situação de hepatite crónica que, por sua 
vez, pode conduzir a cirrose hepática e a carci-
noma hepatocelular.
2- Diagnóstico da infec-
ção pelo HBV
Uma hepatite começa por ser diagnosticada 
clinica e bioquimicamente (aumento das tran-
saminases e bilirrubina). No entanto, devido 
às várias causas possíveis para essa hepatite, 
somente através do diagnóstico laboratorial é 
possível identificar o agente causal e, no caso 
das infecções provocadas pelo HBV, distinguir 
infecções agudas de infecções crónicas. O 
diagnóstico laboratorial da infecção pelo HBV 
baseia-se na detecção serológica de antigénios 
virais e dos respectivos anticorpos, bem como 
do DNA viral (constituinte do genoma viral). Os 
antigénios que são possíveis de detectar em cir-
culação são: AgHBe e AgHBs; por parte dos an-
ticorpos podem-se detectar: anti-HBs, anti-HBe 
e anti-HBc, (IgG e IgM). Vejamos as principais 
características de cada um destes marcado-
res:
1- AgHBs: antigénio de superfície do HBV
Juntamente com o DNA viral, é o primei-•	
ro marcador da infecção a ser detectável 
(2-6 semanas antes dos sintomas)
A sua presença, juntamente com o anti-•	
corpo anti-HBc, indica infecção activa
A sua persistência em circulação por •	
Figura 27- Icterícia devida a hepatite provocada por 
infecção pelo HBV
Figura 27- Icterícia devida a hepatite provoca-
da por infecção pelo HBV
V- Diagnóstico da Infecção 
pelo vírus da hepatite B 
(HBV)
29
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
mais de 6 meses após o início dos sintomas, 
indica uma infecção crónica
Em contrapartida, a sua desaparição do •	
soro sugere a resolução da infecção com 
a consequente convalescença e cura. Esta 
desaparição ocorre, em geral, ao fim de 4-6 
meses após o aparecimentodos sintomas e 
é seguida, após algumas semanas (por ve-
zes meses), pelo aparecimento em circula-
ção do respectivo anticorpo (anti-HBs).
É produzido em grande quantidade, po-•	
dendo por isso existir em circulação não as-
sociado a partículas virais.
2- AgHBe: antigénio de replicação viral
É considerado um marcador de replica-•	
ção e de infecciosidade do HBV, indicando, a 
sua presença no soro, que se trata de uma 
hepatite activa
Ag 
HBs
Ag 
HBe
Anti-
HBc 
IgM
Anti-
HBc 
IgG
Anti-
HBe
Anti-
HBs
DNA-
HBV
Interpretação
+ -/+ - - - - + Fase de incubação
+ + + + - - + Fase aguda
+ + - + -/+ - +
Infecção crónica c/ replicação 
viral
+ - - + -/+ - +
Infecção crónica c/ replicação 
viral (“mutantes do pré-core”)*
+ - - + -/+ - -
Infecção crónica s/ replicação 
viral (portador assintomático)
- - - + +/- - -
Período de “janela” ou anti-HBs 
com título baixo
- - - + +/- + -
Imunidade após infecção pelo 
HBV
- - - - - + - Imunidade após vacinação
- - - - - - - Ausência de contacto prévio
A sua presença está geralmente asso-•	
ciada com a detecção de DNA viral no soro.
Aparece em circulação pouco tempo •	
após o aparecimento do AgHBs, e normal-
mente antes do aparecimento dos sinto-
mas.
No caso de infecção aguda com reso-•	
lução, desaparece de circulação antes do 
AgHBs, dando-se a seroconversão para 
anti-HBe.
Deriva do AgHBc por modificações pós-•	
tradução
Nos indivíduos infectados por vírus com •	
mutações na região promotora do gene 
core e pré-core (denominados “mutantes do 
pré-core”), o AgHBe pode não ser detectado 
em circulação
Tabela 3- Interpretação dos marcadores serológicos da infecção pelo HBV
* Estes mutantes poderão prevalecer no início da infecção (estirpe infectante), ou serem seleccio-
nados no decurso da infecção. Têm sido associados a situações mais graves como hepatites fulminan-
tes, uma taxa mais elevada de cirrose e reactivações mais frequentes ao longo da infecção crónica.
30
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
Soro
AgHBs
Anti-
HBc
Anti-
HBc
Anti-
HBs
Anti-
HBs
Susceptível Imune
devido
a vacinação**
Quatro
interpretações
possíveis*
Imune
devido
a infecção
natural
Período
de
incubação
Anti-
HBc 
IgM
Anti-
HBs -
Anti-
HBs -
Infecção
crónica
Infecção
aguda
Neg
Neg
Neg Neg
Neg
Neg
Pos
Pos
Pos Pos
Pos
Pos
* Convalescença de uma infecção aguda (período de janela); Infecção antiga (a sensibilidade do tes-
te não é suficiente para detectar as baixas concentrações de anti-HBs); Susceptível (falso positivo 
para anti-HBc); Infecção crónica (níveis indetectáveis de AgHBs).
** Níveis protectores de anti-HBs pressupõem um título ≥ 10 mU/ml. O teste pós-vacinação deve ser 
efectuado 1-2 meses após a última (3ª) dose da vacina.
Figura 28- Algoritmo do diagnóstico da infecção pelo HBV
31
Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
3- AgHBc: antigénio do “core”
É um antigénio intracelular que é detec-•	
tado nos hepatócitos infectados mas não no 
soro
4- Anti-HBs: anticorpo específico do AgHBs
Marca a recuperação e resolução da in-•	
fecção pelo HBV, podendo persistir por toda 
a vida, conferindo imunidade protectora.
Em cerca de 10% dos pacientes com he-•	
patite aguda pelo HBV não se desenvolve o 
anti-HBs (infecções crónicas)
Pode coexistir com o AgHBs em situa-•	
ções excepcionais onde tenha havido lugar 
a sobre-infecção por subtipos diferentes de 
vírus.
Deve estar presente após vacinação efi-•	
caz.
5- Anti-HBc: anticorpo específico do AgHBc
 IgM
Predomina durante a fase aguda da in-•	
fecção
É o primeiro anticorpo a ser detectado•	
Surge cerca de 1 mês após o apareci-•	
mento do AgHBs, desaparecendo, em geral, 
ao fim de 6 meses.
Em geral a sua detecção significa uma •	
infecção aguda pelo HBV
Pode, no entanto, persistir, em baixos tí-•	
tulos, nas infecções crónicas.
 IgG
Não é indicador de imunidade, nem é in-•	
duzido pela vacinação
Pode aparecer isoladamente durante o •	
período de “janela”, quando o AgHBs já não é 
detectado e o anti-HBs ainda não apareceu.
Em certas circunstâncias pode ainda •	
surgir isoladamente muitos anos após a in-
fecção crónica pelo HBV (quando o anti-HBs 
tem níveis indetectáveis) ou durante a infec-
ção crónica quando o AgHBs apresente ní-
veis abaixo do limite de detecção.
6- Anti-HBe: anticorpo específico do AgHBe
Surge em circulação, nos casos de reso-•	
lução da infecção, antes do anti-HBs
Pode persistir durante anos após a reso-•	
lução de uma infecção aguda por HBV
Normalmente vem associado ao declínio •	
da infecciosidade e o seu aparecimento ge-
ralmente corresponde à resolução da infec-
ção activa
7- DNA-HBV: genoma do HBV
Aparece no soro ao mesmo tempo ou •	
ligeiramente antes do AgHBs
É o indicador mais sensível da replicação •	
viral activa
Os doentes AgHBe+ são, por regra, po-•	
sitivos para o DNA-HBV, excepto os “mutan-
tes do pré-core” que não possuem AgHBe
Desaparece nos casos de infecção resol-•	
vida (auto-limitada).
A tabela 3, apesar de não ser exaustiva em to-
das as circunstâncias que podem estar envolvi-
das numa infecção pelo HBV, dá uma ideia da 
complexidade de interpretação dos dados sero-
lógicos resultantes de uma infecção pelo HBV. 
No entanto, a maioria dos casos de diagnóstico, 
poderão ser interpretados usando um algorit-
mo mais simplificado (Fig. 28). Este algoritmo, 
convém realçar, não substitui a tabela anterior. 
Ver ainda o esquema duma infecção aguda e 
duma infecção crónica na secção Anexos.
Definições de alguns termos usados na infec-
ção pelo HBV:
Hepatite B crónica: doença necro-infla-•	
matória crónica do fígado causada por uma 
infecção persistente pelo HBV. Esta hepatite 
crónica pode ser AgHBe+ ou AgHBe-
Portador assintomático: Infecção persis-•	
tente do fígado pelo HBV sem doença ne-
cro-inflamatória significativa associada. Têm 
AgHBs+ e AgHBe-.
Hepatite B resolvida: também denomina-•	
da hepatite auto-limitada, indica a existência 
de uma infecção prévia pelo HBV sem evi-
dência, no presente, de sinais virológicos, 
bioquímicos ou histológicos de infecção.
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Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
1- Características
O vírus da imunodeficiência humana (HIV) per-
tence à família Retroviridae, sub-família Ortho-
retrovirinae e ao género Lentivirus. Existem dois 
tipos, HIV-1 e HIV-2, e são ambos os agentes 
causais do síndroma de imunodeficiência adqui-
rida (SIDA).
A estrutura da partícula viral (Fig. 29) revela a 
presença de um invólucro de natureza lipídica, 
onde se inserem duas proteínas de origem viral: 
a glicoproteína de superfície (SU) e a glicoprote-
ína transmembranar (TM). A sua cápside tem 
um formato cónico, contendo no seu interior as 
duas moléculas de RNA genómico e várias enzi-
mas necessárias ao ciclo replicativo viral, nome-
adamente a retrotranscriptase (RT). Esta DNA 
polimerase RNA-dependente é característica 
de todos os retrovírus e sintetiza uma cadeia 
de DNA a partir de um molde de RNA.
Figura 29- Esquema da partícula viral do HIV
2- Organização genómica
A sua estrutura genómica (Fig. 30) revela uma 
organização complexa, com três genes estru-
turais - gag, pol e env - que codificam para as 
proteínas que constituem a partícula viral. Para 
além destes, o genoma do HIV possui mais 6 
genes, ditos reguladores ou acessórios, que 
codificam para proteínas importantes no ciclo 
replicativo viral: vif, vpr, vpu (só no HIV-1), vpx 
(só no HIV-2), tat, rev e nef. Finalmente, o geno-
ma proviral é ainda composto por duas regiões 
não codificantes, iguais entre si, localizadas nas 
duas extremidades desse mesmo genoma. Es-
sas regiões, denominadas LTR (Long Terminal 
Repeat), contêm, entre outros elementos, as 
regiões de ligação de factores de activação ce-
lulares e virais, funcionando como regiões pro-
motoras.
VI- Diagnóstico da Infecção 
pelo HIV
Figura 29- Esquema da partícula viral do HIV
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Práticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira
3- Ciclo replicativo
Durante o seu ciclo replicativo, o HIV infecta cé-
lulas que possuam na sua