biologia molecular

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UMIVERDIDADE DE SAO PAULO 
FACULDADE DE CIENCIAS FARMACEUTICAS 
DEPARTAMENTO DE ANALISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS 
LABORATORIO DE BIOLOGAI MOLECULAR ALPLICADA AO DIAGNÓSTICO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Apostila de noções de Biologia molecular 
 
 
 
 
 
 
 
Prof. Dr. Mario H. Hirata 
Profa. Dra Rosário D. C., Hirata 
 
 
 
1999
 2 
ÍNDICE 
 
 
Tópico Página 
 
Aula número 1: 
 Introdução ......................................................................................................................................... 2 
Estrutura do DNA e RNA ....................................................................................................................... 2 
Replicação, transcrição e tradução ....................................................................................................... 4 
Organização do genoma de eucariotos, procariotos e viral .................................................................. 7 
Enzimas de restrição e suas aplicações ............................................................................................... 10 
 
Aula número 2: 
 Extração do DNA genômico ........................................................................................................... 13 
 
Aula número 3: 
 Princípios de eletroforese............................................................................................................... 19 
Fatores que influenciam na eletroforese ........................................................................................ 20 
Tipos de suporte............................................................................................................................. 22 
Tipos de eletroforese ..................................................................................................................... 22 
Aplicações da eletroforese nas técnicas moleculares ................................................................... 23 
 
Aula número 4: 
 Reação de polimerização em cadeia (PCR) ................................................................................... 28 
Princípios da reação de PCR ............................................................................................................... 28 
Protocolo geral para PCR ..................................................................................................................... 31 
Fatores que influenciam na PCR .......................................................................................................... 31 
Escolha de iniciadores para PCR ......................................................................................................... 35 
 
Aula número 5: 
 PCR no Diagnóstico das Doenças genéticas .................................................................................. 39 
Polimorfismo e mutações ..................................................................................................................... 39 
Diagnóstico de alguns polimorfismos por PCR .................................................................................... 41 
Polimorfismo de apolipoproteína .......................................................................................................... 42 
Polimorfismo de receptores da LDL ..................................................................................................... 44 
 
Aula número 6: 
 PCR no diagnóstico de Doenças infecto-contagiosas ------------------------------------------------------- 46 
Meningites bacterianas -------------------------------------------------------------------------------------------------- 47 
Tuberculose ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 50 
Infecção pelo virus da Hepatite C -------------------------------------------------------------------------------------- 59 
Infecção pelo virus HIV --------------------------------------------------------------------------------------------------- 64 
 
Aula número 7: 
 PCR e RFLP na identificação de indivíduos .................................................................................... 68 
 
 3 
APLICAÇÃO DA PCR EM LABORATÓRIO CLÍNICO E MEDICINA FORENSE 
 
 
 Aula número 1 
 
 
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata 
Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata 
 
 INTRODUÇÃO 
 
Os avanços nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido significantemente para 
o entendimento da etiologia das doenças humanas. As técnicas de recombinação dos ácidos nucleicos têm 
permitido aos pesquisadores identificar os vários genes responsáveis por doenças hereditárias, avaliar os 
mecanismos de infecção dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciação e 
proliferação celular (principalmente nos processos neoplásicos), entre outros. A biologia molecular vem 
também apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no 
diagnóstico laboratorial. Por outro lado, as diferenças nas sequências do DNA, observadas entre as espécies 
ou entre os indivíduos, são extremamente úteis para as análises forenses, os testes de paternidade, a 
identificação de antígenos de histo-compatibilidade, a identificação de allelos mutantes, a identificação de 
gêneros e espécies de bactérias, fungos, leveduras, vírus e outros. 
Nesta apostila serão abordados os princípios básicos de biologia molecular, bem como serão 
descritas as aplicações da técnica de PCR no diagnóstico clínico e nos testes de identificação. 
 
 
 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA E RNA) 
 
 As informações genéticas são armazenadas nos ácidos nucleicos. Há dois tipos de ácidos 
nucleicos: ácido desoxiribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). O DNA é encontrado principalmente 
nos cromossomos no núcleo das células, enquanto RNA está presente no citoplasma, havendo muito pouco 
nos cromossomos. 
 Os ácidos nucleicos consistem de cadeias de nucleotídeos. Cada nucleotídeo é constituido por 
uma base nitrogenada, uma molécula de açúcar e um grupamento de fosfato (PO4
=
). Há dois tipos de 
açúcar nos ácidos nucleicos: 2-deoxiribose no DNA e ribose no RNA (Figura 1A). As bases nitrogenadas 
são as pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) e as purinas: adenina (A) e guanina (G). O DNA 
contém A, C, G e T, enquanto que o RNA contém U em vez de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotídeos 
estão ligados formando uma longa cadeia cadeia polinucleotídica. Essa cadeia é formada por ligações entre 
o grupo fosfato do carbono 5 de um nucleotídeo e o carbono 3 do açúcar do nucleotídeo adjacente (Figura 
1B). 
 Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotídica simples, enquanto que o DNA é composto 
de duas cadeias polinucleotídicas pareadas, dispostas em direção contraria, sendo denominadas 
antiparalelas (Figura 1B). As ligações covalentes do esqueleto de açúcar-fosfato localizam-se na parte 
 4 
externa da estrutura e as bases nitrogenadas estão projetadas para a parte interna. O arranjo das bases na 
molécula de DNA segue uma sequência em que cada base de uma cadeia é pareada com outra base na 
segunda cadeia, de modo que guanina em uma cadeia é pareada com a citosina na outra cadeia e a adenina 
sempre pareia com a timina (Figura 1C). Dessa forma o DNA apresenta a estrutura tridimensional de dupla 
hélice, onde o ângulo e a distância entre um nucleotídeo e outro é sempre constante. 
 
 
(A) (B) 
 
 
O
OH
OH
4
5
CH2OH
3 2
1
 
2-deoxiribose 
 
 
1
23
CH2OH
5
4
OH
OH
O
OH 
ribose 
 
 
 
(C) 
N
N
H
N
N
H
HH
CH3
O
O
N
N
H
(para a cadeia)
(para a cadeia)
Timina Adenina
(para a cadeia)
(para a cadeia)
H
H
O
N
N
NH
H
H
H
N
N
N
N
O
H
Citosina Guanina
 
 
 5’ fosfato 3’ hidroxila 
 
O
CH2
P
P
CH2 O
O
CH2
P
P
CH2
O
A
G
T
C
T
C
A
G
O
CH2
P
P
CH2O
O CH2
P
P
CH2OOH
OH
 
 3’ hidroxila 5’ fosfato 
 
Figura 1. Características estruturais das moléculas dos ácidos nucleicos. (A) Molécula do açúcar. (B) 
Representação diagramática do arranjo antiparalelo das duas cadeias polinucleotídicas do DNA. P 
representa o grupo fosfato. (C) Pareamento da bases na molécula de DNA mostrando as pontes de 
hidrogênio. 
 
 
 E. CHARGAFF, em 1951, verificou que na molécula de DNA a relação entre as purinas e pirimidinas 
era constante na maioria das espécies animais, ou seja, a quantidade da purina, adenina, é igual a da 
pirimidina, timidina; da mesma forma, a quantidade da purina guanina é igual à da pirimidina citosina. Essa 
característica importante é definida pela propriedade fisico-química das moléculas com formas semelhantes 
se atrairem mutuamente com significante afinidade (força de atração de Van Der Waals), somada à força de 
atração entre os átomos de cargas opostas (ligações iônicas ou pontes de hidrogênio). Essas propriedades 
são bastante específicas e no caso do DNA elas operam de forma conjunta e simultânea com significante 
energia de interação, como se fosse um molde perfeito. Em resumo, pode-se dizer que a lei de CHARGAFF 
se baseia na especificidade da interação das bases puricas e pirimidicas, onde a citosina pareia apenas 
 5 
com a guanina e a adenina pareia apenas com a timidina ou uracila. É importante salientar que a ligação 
entre a A e T ou U ocorre por interação de 2 pontes de hidrogênio, enquanto que entre a C e a G a ligação se 
dá por 3 pontes de hidrogênio (ligação mais forte). Devido a essa especificidade do pareamento entre as 
bases; a sequência de uma das cadeias polinucleotídicas do DNA é complementar a outra (cadeia 
complementar). 
 A estrutura secundária de dupla hélice (duplex) do DNA, descrita por Watson & Crick em 1953, está 
disposta linearmente. Entretanto, pode ser também circular como nas bactérias, plasmídeos e certos vírus, e 
pode ser também de fita simples como em alguns tipos de fagos. Entretanto, a disposição da molécula de 
DNA nos organismos superiores é de particular importância, onde a informação genética está amplamente 
concentrada nos cromossomas dentro do núcleo. O comprimento total dos 46 cromossomas humanos tem 
menos que 0,5 mm, entretanto se extendido pode atingir muitos metros. Isto se deve a que o DNA é 
compactado na forma super-enrolada em vários níveis: primário, duplex; secundário, ao redor das proteinas 
ligadas ao DNA (histonas) formando os nucleossomos; terciário, enrolado com os nucleossomas formando 
um cilindro ou estrutura solenoide; e finalmente quaternária, formando voltas ou “loops”. Esta disposição 
super-enrolada é a forma natural do DNA. 
 
Propriedades dos ácidos nucleicos 
Os ácidos nucleicos podem ser dissociados e associados por processos físicos e químicos. Em 
condições fisiológicas, a estrutura de dupla hélice do DNA é bastante estável. No entanto, se essa estrutura 
for submetida a alta temperatura (90C a 100C) ou a pH extremos (menor que 3,0 ou maior que 10,0), ela 
se separa em duas fitas simples, sofrendo o processo de dissociação, desnaturação ou “melting”. Da 
mesma forma, ao submeter-se essas fitas simples a condições de associação (temperatura  a 65C, ou pH 
próximo de 7,0) por algumas horas, elas podem se reconstituir formando a dupla fita novamente, 
obedecendo a lei da complementariedade; ou seja a dupla fita somente se reassocia se as bases forem 
exatamente complementares. Esse fenômeno de associação é também denominado de renaturação, 
hibridização ou “annealing”. Esses processos de desnaturação e renaturação são essenciais para 
manipulação dos ácidos nucleicos in vitro, principalmente do DNA, contribuindo enormemente para o 
isolamento, comparação e identificação desses compostos. Outra propriedade física muito importante dos 
ácidos nucleicos é a sua capacidade de absorver energia na região do ultravioleta, apresentando o pico de 
absorbância máxima em 260 nm. Esta propriedade é útil tanto para a quantificação quanto para avaliar a 
pureza dessas substâncias. 
 
 
 REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO 
 
Replicação 
Toda vez que uma célula se divide, todo o seu conteúdo de DNA é duplicado na íntegra, transmitindo 
em absoluto as informações genéticas contidas na célula precursora, esse processo denomina-se 
 6 
replicação. A replicação ocorrre de forma semi-conservativa, com as duas cadeias precursoras (DNA de 
dupla fita, dsDNA) servindo de molde para a síntese da nova cadeia (Figura 2). Dessa forma, para a 
replicação ocorrer é necessário que dupla fita precursora se abra formando 2 cadeias independentes (fita 
simples, ssDNA). Esse é um processo energeticamente desfavorável e ocorre com a ação conjunta de uma 
proteina DNA-específica e várias enzimas; sendo as fitas simples precursoras replicadas, então, de forma 
independente e separada. A replicação pode ter início em vários sítios, mas cada origem de replicação é 
utilizada uma vez, durante um simples ciclo celular. A fita filha é sintetizada pela ação catalizadora da DNA 
polimerase III, enzima que utiliza como molde a cadeia precursora e incorpora os nucleotídeos de forma 
sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases. Como essa 
polimerase sintetiza DNA na direção de 5' para 3', a síntese de uma das cadeias complementares é realizada 
de forma contínua enquanto que a outra é sintetizada discontinuamente. Os fragmentos da cadeia 
discontínua são ligados pela enzima DNA ligase. Muitas outras proteínas estão envolvidas na estabilização e 
manutenção da integridade das cadeias simples que são precursoras para a síntese da dupla fita, assim 
como no reconhecimento dos sítios de iniciação. As DNA polimerases possuem também, além da função de 
sintetizar polinucleotídeos, atividade exonucleásica ou "a correção de leitura" na qual os nucleotídeos 
incorretamente incorporados são removidos. Essa propriedade é fundamental para a manutenção a 
integridade da sequência original. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Representação da molécula de DNA durante a replicação: as duas cadeias precursoras são 
separadas e as cadeias complementares que são sintetizadas. 
 
 
Transcrição 
A síntese protéica não é resultante da leitura direta da sequência nucleotídica do DNA. Sabemos que 
o DNA está localizado no cromossoma do núcleo da célula e a síntese protéica ocorre quase que na sua 
totalidade nos ribossomas, localizados no citoplasma. As informações genéticas contidas na sequência 
nucleotídica do DNA têm que ser transferidas para uma molécula intermediária que pode mover-se para o 
citoplasma, o RNA mensageiro (mRNA), e que ordena, então, a síntese da proteina. O processo de síntese 
de mRNA é conhecido por transcrição e o tamanho da molécula de mRNA é definido pela sequência de 
aminoácidos que o ácido nucleico codifica. 
Apenas uma das fitas do DNA é transcrita dando origem a uma única sequência de mRNA para cada 
gene. A indicação de qual fita do DNA deve ser transcrita é orientada por uma sequência específica 
 7 
denominada promotor, localizada antes (“upstream”) da sequência a ser transcrita, que é reconhecida pela 
RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente 
monofosfatos de ribonucleosídeo à extremidade 3’ da cadeia de RNA em crescimento, a polimerização 
ocorre na direção 5’ - 3’. Isto significa que cada molécula de mRNA será identica à sequência nucleotídica da 
fita de DNA que não é transcrita. O mRNA transcrito é transportado para os ribossomos (RNA ribossômico, 
rRNA) no citoplasma, onde ocorre a síntese protéica. 
 O material genético de certos virus (retrovirus) é o RNA e a informação genética segue, portanto, a 
direção reversa (de RNA para DNA). Este processo é conhecido por transcrição reversa, na qual a sintese 
de DNA é dirigida pelo RNA e a enzima responsável é denominada transcriptase reversa. Essa enzimatem 
importante função no ciclo vital dos retrovírus. 
 
Tradução 
 A relação entre a sequência de nucleotídeos do DNA e a sequência de aminoácidos da proteina 
correspondente é denominada código genético. Esse código é universal e é encontrado em todos os 
organismos vivos. O código genético é lido em grupos de três nucleotídeos, cada um codificando um 
aminoácido (Tabela 1). Cada sequência de trinucleotídeo é denominada codon e a sequência de condons 
que codifica um polipeptídeo específico é denominada cistron. 
 
Tabela 1. O código genético 
 
1
a.
base(5’) 2
a.
 base 3
a.
base (3’) 
 U C A G 
U Phe Ser Tir Cis U 
 Phe Ser Tir Cis C 
 Leu Ser Terminação Terminação A 
 Leu Ser Terminação Trip G 
C Leu Pro His Arg U 
 Leu Pro His Arg C 
 Leu Pro Glu Arg A 
 Leu Pro Glu Arg G 
A Isoleu Treo Asp Ser U 
 Isoleu Treo Asp Ser C 
 Isoleu Treo Lis Arg A 
 Met* Treo Lis Arg G 
G Val Ala AcAsp Gli U 
 Val Ala AcAsp Gli C 
 Val Ala AcGlu Gli A 
 Val Ala AcGlu Gli G 
* codon de iniciação 
 
 O processo de decodificação pelo qual a informação genética presente na molécula de mRNA dirige 
a síntese proteica é denominado tradução. Esse processo envolve o mRNA, o rRNA e o RNA de 
transferência ou tRNA, encontrado no citoplasma. Cada tRNA tem 70-90 nucleotídeos em comprimento e é 
de fita simples, mas devido ao pareamento de bases dentro da molécula, adquire a forma de uma folha de 
 8 
trevo. Dentro dessa estrutura, um trinucleotídeo de sequência variável forma o anti-codon que pode parear 
com um codon da molécula de mRNA. Na outra extremidade da molécula de tRNA está uma sequência para 
ligação a um aminoácido específico. Portanto, um codon particular no mRNA é relacionado através de um 
tRNA a um dado aminoácido. Na tradução, o ribossoma liga-se primeiramente a um sítio específico na 
molécula de mRNA (codon de iniciação, ATG) que ajusta a fase de leitura ("reading frame"). O ribossoma, 
então, se movimenta ao longo da molécula de mRNA, traduzindo um codon de cada vez usando tRNAs para 
adicionar aminoácios ao final da cadeia polipeptídica em alongamento. A tradução é finalizada quando o 
ribossoma reconhece na fita de mRNA o codon de terminação ("stop codon"). A direção da leitura é de 5’-
3’, sendo que a sequência de nucleotídeos da fita de DNA corresponde à sequência de aminoácidos da 
proteina traduzida na direção do N-terminal para o C-terminal. 
 Em princípio as sequências de bases nos ácidos nucleicos devem ser traduzidas em qualquer fase 
de leitura diferente, dependendo onde o processo de decodificação se inicia. Para uma dada sequência 
UUAGCAAAGCUGCGAAUG, as três fases de leitura possíveis são : 
 UUA GCA AAG CUG CGA A 
 UAG CAA AGC UGC GAA U 
 AGC AAA GCU GCG AAU G 
Entretanto, o código genético não se sobrepõe, pois a fase de leitura é ditada pelas sequências de iniciação 
e de terminação da tradução presentes na molécula de mRNA. A fase de leitura pode ser alterada por 
mutações que removem ou inserem bases na sequência nucleotídica. Esse tipo de alteração é conhecido 
como descolamento de fase ("frameshift") e pode causar a perda total da função da proteina produzida. 
 
DNA RNA Proteinas
Replicação
Transcrição
Transcrição reversa
Replicação e Transcrcição
do RNA
Tradução
Fluxo da informação genética intracelular
 
 
 
 ORGANIZAÇÃO DO GENOMA DE EUCARIOTOS, PROCARIOTOS E VIRAL 
 
Estrutura Gênica 
 Os cromossomas constituem-se de uma longa e ininterrupta sequência de nucleotídeos na qual 
estão dispostos muitos genes. O gene é uma unidade de herança constituida por uma sequência 
nucleotídeos que carrega as informações necessárias para a síntese de um dado polipeptídeo. O gene é 
uma entidade estável mas pode sofrer mutações, sendo que a nova forma do gene é herdada de modo 
 9 
estável, exatamente como a forma que lhe deu origem. Um gene pode existir em formas alternativas, 
denominadas alelos, que determinam a expressão de alguma característica particular. 
 Embora todos genes funcionais sejam transcritos, a maioria do DNA genômico não é totalmente 
transcrito. A quantidade total de DNA nuclear no genoma haplóide (gamético) humano compreende 3 x 10
6
 
kb. Como a maioria dos genes tem 1 a 20 kb em comprimento, deveria haver 1 milhão de genes, mas 
somente 3000 locos de doença foram identificados. Mesmo considerando todos os outros genes que 
conferem as características normais como altura e inteligência, uma grande porção do DNA genômico não 
tem função definida. Entretanto, mais e mais tem se observado que este DNA tem funções importantes, 
incluindo o controle de ação gênica. 
 Genes que são responsáveis pela síntese de enzimas específicas ou peptídeos são denominados de 
genes estruturais, enquanto que os genes reguladores modificam os efeitos dos genes estruturais. 
 
Controle da expressão gênica 
 Nas células existem mecanismos moleculares que controlam o número e a quantidade das proteinas 
produzidas. As diferenças na síntese proteica resultam de sinais moleculares que controlam as taxas em que 
as moléculas de mRNA são transcritas a partir do DNA (controle transcricional) ou traduzidas (controle 
traducional) 
 
Processamento pós-transcricional do mRNA 
 A transcrição e a tradução nos procariotos são processos concomitantes mas nos eucariotos são 
processos temporal e espacialmente desconectados. Como vimos, nos eucariotos a transcrição ocorre no 
núcleo e a tradução no citoplasma. Durante a passagem do núcleo para o citoplasma, o mRNA transcrito 
(denominado pre-mRNA) deve ser processado para que seja obtido o mRNA maduro. 
 Nos procariotos, a sequência de nucleotídeos do gene é colinear com a sequência de aminoácidos 
de uma dada proteína, entretanto, nos eucariotos a sequência codificante é geralmente interrompida por 
sequências adicionais. 
 A maioria dos genes dos eucariotos são compostos por regiões codificadoras denominadas exons e 
regiões não-codificadoras denominadas introns. Estes introns são sequências posteriormente removidas 
durante o processamento do transcrito primário. Esse processo é denominado processamento do RNA ou 
“RNA splicing”. Após a remoção dos introns, a RNA polimerase II adiciona uma sequência AAUAAA 
extremidade 3’ do mRNA, conhecida como poli-A. A maioria dos mRNAs eucarióticos possuem 100 a 200 
resíduos de adeninas ligadas à extremidade 3', denominada cauda de poli-A, adicionada pela enzima poli-A 
polimerase. Antes que ocorra a remoção dos introns, o mRNA sofre a adição de resíduos de 7-metil-
guanosina (Caps) na extremidade 5’, denominada metilação Cap. Esse processamento sofrido pelo mRNA 
torna a molécula mais estável e facilita o seu deslocamento para o citoplasma. Entretanto, mutações que 
ocorrem nas regiões de junção dos exons podem modificar o mRNA processado, produzindo um mRNA 
maduro que codifica para uma proteína diferente da original. 
 10 
 Alguns genes complexos tem moléculas de mRNA muito grandes, que são processadas de 
diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que são traduzidos em polipeptídeos diferentes. 
Esse processo é denominado processamento alternativo (“alternative splicing”) e ocorre no mesmo tecido 
mas em diferentes estágios de desenvolvimento e diferenciação e pode também ocorrer em diferentes 
tecidos. 
 
Estrutura gênica dos procariotos 
 Existem regiões específicas no DNA, denominadas promotores que identificam o sítio de início da 
transcrição do RNA (região na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição). 
 Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via metabólica são 
adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos junto com sequências 
regulatórias. Este conjunto é denominado operon, sendo que a sequência que regula a expressão desses 
genes é denominada operador. O operador encontra-se antes (“upstream”) da sequência do promotor, nas 
posições de -35 a -10antes do início da sequencia codificante. Nos procariotos, a regulação destes operons 
obedece a condições nutricionais ou ambientais. O estímulo da expressão de uma enzima em resposta à 
presença de um substrato particular é denominada indução. A lactose, por exemplo, pode servir como fonte 
de carbono e energia para a Escherichia coli. O metabolismo deste substrato depende da hidrólise de seus 
componentes, glicose e galactose, pela enzima -galactosidase. A presença de lactose (indutor) induz a 
síntese de -galactosidase por ativação do operon da lactose (operon lac), aumentando a taxa de ligação da 
RNA polimerase ao DNA e a taxa de síntese do mRNA da -galactosidase. Na ausência do indutor o operon 
é reprimido pela ação do repressor. O repressor liga-se a uma sequência especifica no operador, 
bloqueando a ligação da mRNA polimerase ao promotor, inibindo assim a síntese de mRNA que codifica 
para a  galactosidase. 
 
Estrutura gênica dos eucariotos 
 Os promotores dos eucariotos são elementos que sinalizam o sítio onde a transcrição deve iniciar-se 
e, possivelmente, controlam o nível de expressão do gene associado. Geralmente estão localizados cerca 
de 30 bases “upstream” do codon de iniciação (ATG) e ompreendemsêquencias denominadas “boxes” ou 
“motifs”. As mais frequentes são as TATA, CAT e CG “boxes. 
 Além dos promotores, os genes dos eucariotos possuem sequências regulatórias adicionais 
conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou 
depois, “upstream” ou “downstream”) e que potenciam a taxa de transcrição. É importante salientar que estes 
amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua 
vizinhança. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada 
combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das sequencias adjacentes. 
 O genoma dos eucariotos pode apresentam os pseudogenes que são replicas de genes ativos mas 
não produzem um produto reconhecível, geralmente ocorrem devido a mutações acumuladas no gene. 
 11 
 Transposons são elementos genéticos móveis que se deslocam de uma região para outra do 
genoma e, enzimaticamente, se integram a estes locais. Desta forma, a localização destes segmentos de 
DNA no genoma é instável. Estes transposons contém os genes que codificam para as enzimas necessárias 
à sua inserção e para remobilização para outro sítio. Geralmente, a inserção de um transposon produz 
mutação ou rearranjo cromossômico variável que abole a função do gene que recebe esse elemento móvel. 
 
 Polimorfismo de DNA 
 A análise do DNA humano progrediu na medida em que se conheceu a variabilidade de sequências 
entre os indivíduos. Mini e microsatélites são sequências curtas, repetidas consecutivamente, que estão 
distribuidas ao longo dos cromossomas humanos, representando cerca de 40% do DNA. Sua natureza 
repetitiva faz com que sejam instáveis durante a replicação do DNA de geração para geração. A 
consequência é que o número de repetições dentro de uma sequência varia largamente entre os indivíduos. 
Em função dessa variabilidade (polimorfismo de DNA), cada indivíduo, exceto gêmeos idênticos, terá um 
padrão ou perfil de DNA pessoal (“Fingerprinting”). Esses perfis são usados para estabelecer a identidade 
dos indivíduos em diversas situações. 
 As sequências de microsatélites mais comuns no DNA humano são CA ou GT, dependendo de qual 
das fitas de DNA está sendo lida, pois há milhares dessas sequências espalhadas no DNA humano. O 
tamanho da repetição pode ser muito variável e pode fornecer excelentes marcadores genéticos para 
estudar o comportamento fenotípido das famílias. A maioria dessas sequências repetitivas não produz efeito 
deletério, entretanto foi demonstrado que uma forma de retardo mental em homens, a síndrome do X frágil, é 
causada pela expansão de um triplete (CGG) contendo 6 a 54 repetições. Verificou-se também que 
disturbios neurológicos na distrofia miotônica e na doença de Huntington, estão associados a alterações no 
tamanho dos microsatétiles. Esta descoberta forneceu a base científica para o fenômeno de antecipação no 
qual os disturbios genéticos tornam-se mais severos nas gerações subsequentes. 
 
 
 IMPORTÂNCIA DAS ENZIMAS NA BIOLOGIA MOLECULAR 
 
Muitas enzimas que atuam na replicação e transcrição tem sido purificadas e a sua atividade 
biológica usada in vitro para reações moleculares específicas diretas. A maioria dessas enzimas é isolada 
de bactérias, fungos, leveduras ou virus. Essas enzimas são utilizadas das mais diversas formas, a saber: 
clonagem e amplificação de genes de interesse, preparo de sondas de ácidos nucleicos, ensaios de 
hibridização, entre outras aplicações. 
As nucleases representam uma categoria de enzimas específicas de ácidos nucleicos que 
hidrolizam as ligações fosfo-diester dos polímeros de ácidos nucleicos, uma de cada vez. As nucleases 
podem requerer um grupamento hidroxil terminal livre (exonucleases), com especificidade de 3' para 5', ou 
podem atuar somente em ligações internas (endonucleases). As nucleases podem ser específicas para 
 12 
DNA ou RNA. As nucleases DNA-específicas podem catalizar apenas cadeias únicas (por exemplo, a S1 
nuclease) ou cadeias duplas (DNAse I). 
As endonucleases de restrição são nucleases encontradas naturalmente em bactérias e são 
denominadas enzimas de restrição porque restringem sua atividade a DNA estranhos. O DNA do 
hospedeiro não é atacado porque os sítios vulneráveis a suas próprias enzimas são protegidos por um 
processo denominado metilação do DNA. Cada enzima é designada de acordo com o organismo do qual é 
derivada. A EcoRI, por exemplo, é uma enzima obtida de Escherichia coli cepa R e foi a primeira enzima 
desse tipo isolada. A maioria das enzimas de restrição reconhecem sequências de 4, 5 ou 6 nucletídeos. 
Muito poucas reconhecem sequências maiores. Algumas são denominadas isosquisomeros, por clivar em 
diferentes sítios dentro de uma mesma sequência (Ex. XmaI e SmaI) e por clivar o mesmo sítio mesmo 
sendo obtidas de diferentes microorganismos (Ex. HindIII e HsuI). Outras enzimas reconhecem diferentes 
sequências com o mesmo sítio interno (Ex. BamHI e Sau3A). Para cada região da molécula de DNA onde a 
sequência específica ocorre, a enzima de restrição corta ambas as cadeias de forma reprodutível, formando 
extremidades assimétricas ou coesivas (“stick-end”) ou simétricas ou cegas (“blunted-end”). Estas enzimas 
são utilissímas para cortar duplas fitas de grande tamanho em fragmentos reprodutíveis e para preparar DNA 
de diferentes fontes utilizado em procedimentos de clonagem. 
As Ligases, como a DNA-ligase usada durante a replicação, catalizam a formação de ligações fosfo-
diester entre dois segmentos de ácidos nucleicos. As DNA ligases requerem a presença de um molde 
complementar, no entanto, as RNA ligases não tem essa exigência para o processamento do mRNA. 
As Polimerases catalizam a síntese do polímero de ácido nucleico complementar usando uma 
cadeia precursora como molde. Essas enzimas são fundamentais para a clonagem e ampificação de genes. 
A Taq DNA polimerase, por exemplo, é uma enzima extremamente útil para a amplificação do DNA in vitro 
pela reação de polimerização em cadeia (PCR). 
A transcriptase reversa, presente apenas nos retrovírus, cataliza a síntese de DNA a partir de 
moldes de RNA ou DNA. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos vírus, mas pode ser usada in 
vitro para procedimentos de clonagem e para o preparo de sondas de DNA a partir de mRNA. A transcrição 
reversa constitui-se um método útil para produzir uma copia complementar de um gene (denominado cDNA) 
a partir do mRNA. Dessa forma, o genoma dos retrovirus pode ser identificado em amostras biológicas 
utilizando esse método.. 
 
Enzimas de restrição e suas aplicações 
 Tecnologia de DNArecombinante 
 Como vimos, as endonucleases de restrição são enzimas que clivam a molécula de DNA em sítios 
sequência-específicos. A especificidade de cada enzima proporcionou o desenvolvimento da tecnologia de 
DNA recombinante. Isto significa que fragmentos de DNA de tamanho reprodutível podem ser produzidos e 
esses fragmentos contendo um gene particular, por exemplo, podem ser removidos do restante da molécula 
de DNA e ser inseridos em um DNA carreador, produzindo moléculas de DNA recombinado biologicamente 
funcionais. Nos primeiros experimentos de recombinação foram utilizados os vetores plasmidiais para 
 13 
carrear fragmentos de DNA estranhos. Plasmideos são pequenos pedaços de DNA circular extra-
cromossômicos que ocorrem naturalmente no citoplasma das bactérias e se replicam independentemente do 
DNA bacteriano hospedeiro. Utilizando uma endonuclease particular, o plasmídeo pode ser aberto e um 
fragmento de DNA estranho pode ser inserido, por ação de uma DNA ligase, produzindo um plasmídeo 
recombinate. Os plasmídeos fornecem veículos úteis para carregar fragmentos de DNA ou genes e, quando 
transfectados em bactérias (usualmente Escherichia coli), podem produzir clones que ao serem replicados in 
vivo, produzirão cópias múltiplas do fragmento de DNA incorporado. 
 
 Identificação de genes 
 O DNA extraído de um fragmento de tecido, de leucócitos ou de células do líquido amniótico, contém 
milhares de genes, embora em algumas células muitos destes genes estejam desligados ou reprimidos e 
somente relativamente poucos estejam ativos. A identificação de um gene ou sequência nucleotídica 
especifica em todo esse DNA pode ser realizada através do método de Southern blot (E.M. Southern, 
1975). Nesse método, as enzimas de restrição são utilizadas para fragmenttar o DNA e os fragmentos 
resultantes são separados por eletroforese e identificados por hibridização de ácidos nucleicos, utilizando 
uma sequência de nucleotídeos específica (sonda genética) que é capaz de reconhecer o gene de 
interesse. 
 
 Polimorfismo de restrição 
 Em muitas doenças, o defeito genético é desconhecido e a produção de sondas gene-específicas é 
muito difícil ou não é possível. Entretanto, o gene produtor da doença pode estar muito proximo (ligado) a um 
sítio de reconhecimento de uma enzima de restrição particular. Sabe-se que variações nas sequências de 
DNA ocorrem aleatoriamente através do genoma inteiro e não estão associados a uma doença específica. 
Estas variações (alterações de bases) resultam na perda de um sítio de restrição existente ou de aquisição 
de um novo sitio. Tais alterações nas sequências de DNA significam que os fragmentos, produzidos por uma 
enzima de restrição particular, terão diferentes comprimentos entre diferentes indivíduos e podem ser 
reconhecidos por suas mobilidades em eletroforese. Eles são denominados polimorfismos de tamanho de 
fragmento de restrição (RFLP) e são herdados como características genéticas simples obedecendo as leis 
mendelianas de herança. Se for demonstrado, em estudos de famílias, que um gene produtor de doença 
está ligado a um RFLP, este pode, então, fornecer um meio de detectar o gene defeituoso sem efetivamente 
conhece-lo. 
 
Literatura recomendada 
 
Emery, A.E. An Introduction to Recombinant DNA in Medicine, 2a. Ed., 1995, A.E.H Emery & S. Malcon, eds., 
Johon Wiley & Sons Ltda, Chichester, England, 206 pág. 
Lewin, B. Genes V., B. Lewin, ed., 1994, Oxford University Press, New York, USA, 1272 pág. 
Strachan, T. Human molecular Genetics. T. Strachan & A.P.Read, eds., 1996, Bios Scientific Publications 
Ltd., Oxford, UK, 596 pág. 
Watson, J. Recombinant DNA, 2a. Ed., J. Watson, M. Gilman, J. Witkowrk, M. Zoller, 1992, Scientific 
American Inc., New York, USA, 626 pág. 
 14 
 Aula número 2 
 
 
EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO 
 
Profa.Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata 
Marcos de Oliveira Machado 
 
 INTRODUÇÃO 
 O potencial de aplicações das técnicas de DNA recombinante em laboratórios de Bioquímica Clínica 
estão se tornando altamente evidentes, especialmente para a análise do diagnóstico das várias doenças 
genéticas e de outras mais. Correntemente, as análises de DNA para o diagnóstico estão disponíveis 
somente para algumas desordens genéticas, mas o campo de estudo está rapidamente se expandindo e 
novas análises estão sendo desenvolvidas. A maioria dos testes de DNA para o diagnóstico envolve a 
extração de DNA dos leucócitos humanos. Tradicionalmente essas técnicas de extração consomem muito 
tempo e possuem procedimentos pouco eficientes. A maioria dos métodos populares para esse fim, envolve 
digestão com proteinase K, que leva aproximadamente dois dias, e requer um grande volume de sangue (10-
15 ml), ou utilizam solventes orgânicos como o fenol, clorofórmio e álcool isoamílico, os quais são altamente 
tóxicos. Embora esses métodos consigam recuperar o DNA de alto peso molecular de uma grande variedade 
de amostras, eles requerem muitos passos e podem incluir a transferência dos extratos de DNA para 
recipientes adicionais ou procedimentos de lavagem do material utilizando vários filtros comerciais ou 
colunas. Estes passos adicionais permitem o aumento das oportunidades de transferência cruzadas de 
amostras ou a introdução de contaminantes. Tais técnicas não são bem apropriadas para o uso na rotina dos 
laboratórios clínicos. Portanto, um método simples, rápido e econômico é necessário para a introdução das 
análises de DNA nos laboratórios de Bioquímica Clínica. 
 Os estudos de ligação genética utilizando a técnica de polimorfismo de tamanho de fragmentos de 
restrição (RFLP), a reação em cadeia da polimerase (PCR), a técnica de transferência de DNA (“”Southern 
blot””), e outras, necessitam que o DNA extraído esteja em boas condições de uso; ou esteja livre de 
contaminantes e interferentes que possam prejudicar a reação. 
 O uso da técnica de precipitação salina para a extração de DNA utilizando como detergente o Triton 
X-100, evita o uso dos perigosos solventes orgânicos e o alto custo e demorada digestão da proteinase K. 
Esta técnica envolve a desidratação e precipitação das proteínas celulares com solução de cloreto de sódio 
concentrada. O DNA extraído fica livre de RNA, de proteínas e da degradação de enzimas. A quantidade e a 
qualidade do DNA extraído é muito boa comparada com as outras técnicas de extração. O DNA é apropiado 
para as técnicas de biologia molecular, como as que utilizam o PCR e a digestão com enzimas de restrição. 
 
 
 
 
 
 15 
 PREPARAÇÃO E ANÁLISE DE ÁCIDOS NUCLEICOS 
 
 Os métodos de isolamento e purificação dos ácidos nucleicos consistem de três etapas: (1) lise das 
células e solubilização do DNA ou RNA; (2) médodo enzimático ou químico para remover as proteínas 
contaminantes e outras macromoléculas; e (3) precipitação alcoólica para isolamento do DNA. Os protocolos 
básicos geralmente são aplicáveis a um ampla variedade de materiais. 
 
1. Isolamento de DNA genômico de tecidos e células: 
 O método básico compreende a ruptura do tecido com um homogeinizador, a lise celular com o 
detergente iônico SDS, extração fenólica das proteinas e precipitação etanólica do DNA. Este método é útil 
para preparação de DNA genômico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um mínimo 
de consumo de tempo e trabalho. O DNA genômico produzido é adequado para amplificação por PCR ou 
para a disgestão com enzimas de restrição e análise de transferência de DNA. Uma quantidade substancial 
de RNA acompanha o DNA genômico, o que dificulta a quantificação por espectroscopia no UV. Algumas 
amostras de DNA não amplificam bem por PCR ou não são completamente digeridas com enzimas de 
restricão e devem, portanto, ser reextraidas. 
 Outro método compreende a solubilização dos tecidos ou células com SDS, que inativa as DNAses 
endógenas. A proteinase K é usada para digerir as proteinas celulares,seguida de digestão com Rnase para 
remover a maioria do RNA celular. O isolamento do DNA segue basicamente o princípio anterior. Este 
método é adequado para extrair DNA genômico para análise de DNA por Southern blot ou construção de 
bibliotecas genômicas. Porém não é adequado para extrair DNA de tecidos pois não há etapa de ruptura do 
tecido conectivo.. 
 O protocolo mais adequado à rotina laboratorial para avaliação de polimorfismos e mutações 
genéticas compreende a lise celular com SDS, remoção das proteinas por precipitação com cloreto de sódio 
concentrado (“salting-out”) e isolamento do DNA genômico por precipitação etanólica. 
 
2. Isolamento de RNA de células ou de amostras biológicas 
 A maioria dos procedimentos de purificação e concentração de RNA são semelhantes aos utilizados 
na purificação de DNA, exceto que 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineiramente para precipitação 
do RNA. É essencial que toda água usada diretamente ou nos tampões seja tratada com dietilpirocarbonato 
(DEPC) para inativar as RNases. 
 O método mais adequado para preparar RNA de boa qualidade envolve a solubilização simultanea 
do tecido ou células e inativação de Rnases endógenas na presença de isotiocianato de guanidina, com 
subsequente separação do RNA do DNA e das proteínas por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de 
césio. Dois outros métodos que não requerem ultracentrifugação podem se utilizados: (1) lise com 
detergente não-iônico para proporcionar um método rápido para preparação de amostras de RNA 
citoplasmático e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina, remoção das proteinas pela extração fenólica 
em pH ácido, seguida de precipitação do RNA. O segundo método é frequentemente utilizado para 
isolamento de genoma dos virus RNA a partir de amostras biológicas 
 16 
 Outros métodos de isolamento e identificação do RNA podem ser : (1) isolamento do mRNA por 
cromatografia com oligo-dT celulose; (2) separação eletroforética do RNA em gel de agarose contendo 
formaldeido para detecção e quantificação de espécies específicas de RNA por Northern blotting e 
hibridização; entre outros. 
 
3. Isolamento de DNA genômico de bactérias 
 As bactérias de uma cultura líquida saturada são lisadas e as proteinas removidas por digestão com 
proteinase K. Os debris de parede celular, polissacarídeos e as proteinas remanescentes são removidas pela 
extração fenólica e o DNA genômico é recuperado do sobrenadante resultante pela precipitaçao com etanol. 
 
 
 PURIFICAÇÃO E CONCENTRAÇÃO DE DNA DE SOLUÇÕES AQUOSAS 
 Os procedimentos de isolamento de dsDNA e ssDNA a partir soluções aquosas são úteis quando 
proteinas ou solutos necessitam ser removidos, ou quando soluções de DNA necessitam ser concentradas. 
O protocolo básico é apropriado para purificação de DNA a 1 mg/mL a partir de volumes menores que 0,4 ml. 
 
1. Extração fenólica e precipitação etanólica 
 Um dos métodos mais úteis e usados para isolamento e concentração de ácidos nucleicos de 
soluções aquosas é a extração com fenol/clorofórmio seguida de precipitação com etanol. Durante a 
extração orgânica, as proteinas contaminantes são denaturadas e mantidas na fase orgânica ou na interface 
entre as fases orgânica e aquosa, enquanto que os ácidos nucleicos permanecem na fase aquosa. O fenol 
usado nesse protocolo deve ser tamponado para prevenir que os produtos oxidados presentes no fenol 
danifiquem os ácidos nucleicos. Alcool amílico frequentemente é adicionado à mistura fenol/clorofórmio 
quando ocorre a formação excessiva de espuma durante a extração. 
 Durante a precipitação com etanol, os sais e outros solutos como os resíduos da extração 
fenol/clorofórmio permanecem em solução enquanto os ácidos nucleicos formam um precipitado que pode 
ser facilmente separado por centrifugação. Na presença de altas concentrações de cátions monovalentes 
(0,1 a 0,5 M), o etanol induz uma transição estrutural nas moléculas de ácido nucleico promovendo a 
agregação e precipitação das mesmas. Entretanto, como vários sais e pequenas moléculas orgânicas são 
solúveis em etanol a 70%, a precipitação etanólica e lavagem do sedimento elimina os sais no DNA. Embora 
cloreto de sódio, acetado de sódio, e acetato de amonio sejam capazes de induzir a precipitação, é mais 
difícil remover cloreto de sódio devido a sua baixa solubilidade em etanol a 70%. O sal recomentado para a 
maioria das aplicações de rotina deste método é o acetato de sódio a 0,3 M (concentração final), que é mais 
solúvel em etanol que cloreto de sódio a 0,3 M e, portanto, menos facilmente precipitável com a amostra de 
ácido nucleico. Para amostras contendo dodecil sulfato de sódio (SDS), o sal recomendado é cloreto de 
sódio 0.2 M, pois o SDS é solúvel em etanol nessas condições. 
 Soluções de DNA diluídas: quando soluções de DNA estão diluidas (< 10 g/mL) ou quando menos 
que 1 g de DNA está presente, deve-se aumentar a proporção de etanol para o volume aquoso (3:1) e 
aumentar o tempo de precipitação (4 a 16 horas), incubando-se a -20
o
C (ou em gelo seco). A centrifugação 
 17 
para separação do DNA precipitado deve ser feita a baixa temperatura para assegurar o máximo de 
recuperação do DNA dessas soluções. 
 Pequenas quantidades de DNA (nanogramas): pode-se utilizar um ácido nucleico carreador, como 
o tRNA de E. coli, levedura ou fígado bovino, em concentrações de 10 g/mL. Nessa condição o DNA é 
coprecipitado com o tRNA. O tRNA não interfere com a maioria das reações enzimáticas, mas será 
eficientemente fosforilado pela T4 polinucleotídeo quinase e não poderá ser usado se esta enzima for usada 
em marcações subsequentes. Recuperação de pequenas quantidades de fragmentos curtos de DNA e 
oligonucleotídeos pode ser aumentada pela adição de cloreto de magnésio a uma concentração inferior a 10 
mM antes da adição do etanol. Entretanto, o DNA precipitado de soluções mais concentradas que 10 mM de 
íons magnésio ou fosfato são dificeis de dissolver e devem ser dulidas antes da precipitação com etanol. Se 
a amostra de DNA está em baixa concentração em um grande volume, o volume pode ser reduzido pela 
extração repetida com sec-butanol (2-butanol). Cabe lembrar que apenas a água é removida com essa 
extração, todos os solutos e sais são concentrados com os ácidos nucleicos. Após essa etapa, o ácido 
nucleico deve ser extraido com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 
 DNA em grandes volumes aquosos: a extração pode ser simplesmente ampliada usando o mesmo 
procedimento. (tubos de poliestireno não resistem a mistura fenol/clorofórmio). As etapas de centrifugação à 
temperatura ambiente não podem exceder velocidades de 2500 rpm (1200 x g), pro 5 minutos. O precipitado 
etanólico deve ser centrifugado em um tubo Corning de parede reforçada por 15 minutos em fotor de angulo 
fixo a 10.000 rpm (8000 x g), a 4
o
C. Tubos de vidro devem ser siliconizados para facilitar a recuperação de 
pequenas quantidades de DNA (< 10g). 
 Remoção de oligonucleotídeos e trifosfatos: Pequenos oligonucleotídeos (< 30 bp) e nucleotídeos 
não incorporados usados na marcação ou outras reações de modificação do DNA podem ser efetivamente 
removidos das soluções contendo DNA por duas etapas de precipitação com etanol na presença de acetato 
de amonia. Este procedimento não é suficiente para remover completamente grandes quantidades de 
ligadores (“linkers”) utilizados nos procedimentos de clonagem. Acetato de amonia não é recomendável se a 
amostra de ácido nucleico for fosforilada na extremidade 5’ pela T4 quinase ou na extremidade 3’ com a 
transferase terminal, pois os íons de amonio tesiduais inibem essas duas enzimas. 
 Variações do procedimento de precipitação: O isopropanol pode substituir o etanol, quando se 
deseja manter mínimo o volume dos ácidos nucleicos precipitados. O isopropanol é menos volátil que o 
etanol e é, portanto, mais difícil de remover por evaporação. Algunssais são menos solúveis em 
isopropanol, e podem ser precipitados com os ácidos nucleicos. É recomendado que a precipitação com 
isopropanol seja seguida imediatamente por uma precipitação onvencional com etanol para eliminar 
isopopropanol residual e o sal. Alternativamente, cloreto de lítio pode ser usado como o sal de precipitação, 
pois o cloreto de lítio é muito mais solúvel no etanol e o precipitado resultante é relativamente isento de sal. 
Cloreto de lítio deve ser evitado, entretanto, se o precipitado de RNA for usado como molde para a 
transcrição reversa após precipitação. 
 Grandes mRNA e rRNA podem ser purificados de dsDNS e pequenos RNAs (tRNA e 5S RNA) por 
duas etapas de precipitação seletiva com cloreto de lítio na ausencia de alcool, seguida de uma precipitação 
convencional com etanol. 
 18 
 Soluções concentradas de ácidos nucleicos: se a concentração de ácidos nucleicos é muito alta ( 
> 300 g/mL), um precipitado pode-se formar sem resfriamento durante a precipitação etanólica. Se um 
precipitado visível é formado, não é necessário esfriar a amostra ou aguardar algum tempo antes de separar 
o precipitado por centrifugação. 
 
2. Fracionamento dos ácidos nucleicos 
 Geralmente todos os protocolo em biologia molecular requerem, em alguma etapa, o fracionamento 
dos ácidos nculeicos. Técnicas cromatográficas são apropriadas para algumas aplicações e podem ser 
usados para separação dos plasmídeos do DNA genômico, bem como separação de DNA genômico dos 
debris no lisado celular. A eletroforese, entretanto, tem muito mais resolução que métodos alternativos e é 
geralmente o método de fracionamento de escolha. As separações eletroforéticas podem ser analíticas ou 
preparativas e podem envolver fragmentos com peso moleuclar variando de menos que 100 Da a mais que 
10
8
 Da. Uma variedade de sistemas eletroforéticos foram desenvolvidos para acomodar essa ampla faixa de 
variação. Além disso, um fragmento individual pode ser identificado por tecnica de hibridização após a 
separaração eletroforética de uma mistura complexa (Southern blot). Este método tem contribuido 
grandemente para ao mapeamento e identificação de sequencias de cópia única ou múltipla em genomas 
complexos, e facilitado os experimentos iniciais de clonagem de DNA eucarioto. 
 
3. Purificação e isolamento de DNA 
 Os protocolos utilizados para purificação de DNA são geralmente divididos em três categorias: (1) 
eluição do DNA de um gel de agarose por diálise, (2) dissolução do gel de agarose e recuperação do DNA 
por ligação a partículas de vidro, e (3) eluição pelo aquecimento da agarose de baixo ponto de fusão a 70
o
C, 
e recuperação do DNA pela extração fenólica e precipitação etanólica ou usando uma matrix que liga 
especificamente o fragmento de DNA. Atualmente, há vários sistemas de purificação de fragmentos de DNA 
no mercado. Esses sistemas diferem no tamanho e o tipo de ácido nucleico que pode ser eficientemente 
isolado; nos efeitos dos sais, dos solventes orgânicos e de outras substâncias na eficiência de ligação da 
matriz; e no tipo de solvente que é usado para eluir o oligonucletídeo ou o polinucleotídeo da matriz. 
 Matriz de sílica (vidro) - na presença de iodeto de sódio, DNA e RNA ligam-se seletivamente à matriz 
de sílica. Outras substâncias presentes (sais, solventes, nucleotídeos, proteinas, nucleotídeos etc) são 
lavados com uma solução de etanol tamponada. O polinucleotídeo ligado é eluido em um reduzido volume de 
tampão Tris-EDTA (TE) ou água. 
 Resina de purificação - é uma resina de purificação com propriedades similares aos sistemas de 
matriz de sílica (Magic
1
, Promega). Esta matriz liga polinucleotídeos de dupla fita mais eficientemente que os 
de fita simples, e pouco eficientemente os RNAs pequenos (tRNA), DNA de dupla fita de menos que 220 bp 
ou oligonucleotídeos. 
 Adsorção - é um sistema de purificação de ácidos nucleicos, que contém um adsorvente estável 
(NENSORB 20, DuPont-NEN) que liga quantitativamente proteinas, RNA e DNA, incluindo oligonucleotídeos 
contendo menos que 12 resíduos. A ligação não é afetada por altas concentações de sais, ureia, ou outras 
 19 
substâncias, mas inibida por alguns solventes orgânicos. O material não ligado é removido com água e o 
DNA ou RNA (mas não proteinas) é quantitativamente eluido com um solvente alcoólico. 
 Gel filtração - os ácidos nucleicos podem ser purificados, separados e fracionados usando colunas 
de gel filtração ou colunas de centrifugação (spin columns). 
 
 
 QUANTIFICAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS 
 A concentração de DNA ou RNA pode ser estimada por espectrofotometria de absorção no UV ou a 
concentração de DNA pode ser realizada por espectroscopia de fluorescencia. Cubetas de quartzo devem 
ser utilizadas para a espectrofotometria no UV, enquanto que as de plástico ou vidro podem ser usadas para 
a região do visível. Um método alternativo é o método de placa de brometo de etídio agarose. . 
 
Literatura recomendada 
Davis, L.G. Basic Methods in Molecular Biology. 2a. Ed., L.G. Davis, W. M. Kuehl, J.F. Battey, Eds. 1994, 
Appleton & Lange, Norwalk, CN, USA, 777 p. 
Ausubel, F.M. Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., F.M. Ausubel, Ed.; Green Publising Associates 
and John Wiley & Sons, 1992, New York, NY. 
Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 
2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY. 
 20 
 
 Aula número 3 
 
 
PRINCÍPIOS DE ELETROFORESE 
Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata 
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata 
 
 INTRODUÇÃO 
 
 Eletroforese é uma técnica de separação que envolve o movimento de partículas com cargas em 
solução, sob ação de um campo elétrico. Portanto, qualquer partícula ou molécula carregada pode se mover 
nessas condições, e consequentemente podem ser separadas, desde que tenham diferentes cargas. 
A separação eletroforética das partículas pode ser realizada em meio líquido(eletroforese livre de Tisellius) 
ou em um suporte inerte. 
 A carga eletrica aplicada sob a solução é realizada através de eletrodos que são colocadas na 
solução. Um ion migra através da solução na direção ao eletrodo de carga oposta. Portanto, uma partícula 
carregada positivamente(catiosn) migra para o polo negativo (catodo), enquanto as partículas 
negativas(anions) migram para o polo positivo(anodo). 
 
 
 PRINCÍPIOS BÁSICOS DA ELETROFORESE 
 
Terminologia: 
ânion: partícula carregada negativamente ou íon 
cátion: partícula carregada positivamente 
tampão: Uma mistura de substâncias que doam e aceitam proton com a função de manter a concentração 
do proton (pH) constante ou dentro de um valor próximo. Um tampão pode ser feito com uma mistura de um 
ácido fraco com o respectivo sal. Ex: ácido acético e acetato de sódio. 
Condutividade: a propriedade de uma substância conduzir a corrente elétrica. Numa solução iônica, a soma 
do produto da concentração da carga e a mobilidade da mesma. 
eletrodos: substâncias em contato com um condutor. A substância estão conectadas a fonte elétrica. 
Fonte elétrica: Equipamento que transforma corrente alternada em corrente contínua, que possa ser 
controlada por um potenciometro, que permite variar a tensão, a corrente, a carga elétrica que se quer aplicar 
no sistema. Esse equipamento, pode medir a tensão elétrica (em Volts), a corrente elétrica(Amperagem), e a 
potência elétrica (Watts). 
eletro-osmose; tendência da solução se mover em relação a uma substâncias estacionária adjacente, 
quando uma diferença de potencial é aplicada. 
força iônica: É a soma da concentração de todos ions na solução, medido pelo quadrado de suas cargas. 
mobilidade: a velocidade de uma partícula ou ion que é dado pela voltagem aplicada. Uma medida relativa 
de quanto rápido um ions se movimenta em um campo elétrico. 
 21 
Mobilidade efetiva: A real mobilidade de uma substânciasob certas condições. Geralmente é menor que a 
mobilidade devido a menor carga, ou resistência do suporte ou meio. 
poder de resolução: E’ a habilidade de separar substâncias que migram muito próximas. 
gel: É uma malha de fibras, ou de polímeros que é sólida, mas retém uma grande quantidade de solventes 
nos poros ou nos canais internos das malhas. 
 
 
 FATORES QUE INFLUENCIAM NA SEPARAÇÃO E MOBILIDADE 
 ELETROFORÉTICA 
 
 A aplicação de um campo elétrico a uma solução que contém partículas carregadas pode separá-los. 
A separação depende de vários fatores que influenciam e que podem ser resumidas em: Força aplicada nas 
partículas (voltagem), carga da partícula, pH do meio, condutividade do meio, resistência da matrix, 
conformação da partícula, força iônica do meio, temperatura, eletroendosmose, etc 
 
1. Força na partícula 
 A força exercida em uma partícula carregada depende do campo elétrico, voltagem ou volts por 
centímetro, e a carga da partícula, Q. A força sob a partícula carregada é o produto: 
 
Feletrica=QV 
 
 A força elétrica, Feletrica, quando exercida na partícula, causará o seu movimento. No entanto, o 
movimento da partícula no solvente será também influenciado pela resistência, devido a viscosidade, a 
resistência, a qual exerce uma força é proporcional a velocidade: 
 
Fresistência= fv 
 
 A constante de proporcionalidade, f é chamada de coeficiente de fricção (medida de resistência de 
uma partícula oferece quando em movimento em um solvente). 
 
2. Coeficiente de fricção depende da viscosidade do solvente e do tamanho, e forma da partícula
 Quanto maior a viscosidade, menor o movimento. Quanto maior ou mais assimétrica a partícula, 
menor seu movimento através do solvente. O coeficiente de fricção de uma grande partícula tais como 
proteinas é uma propriedade característica de cada elemento. 
 
3. Mobilidade da partícula 
 Quando um campo elétrico é aplicado em uma partícula carregada, ela inicia a migração. A força 
eletroforética e a fricçional se opõe uma a outra, e a velocidade dessa aumenta até as forças se igualarem 
(Feletrico = Fresistencia ). A velocidade, v, que uma particula alcança em um campo elétrico, V, é determinado por 
duas propriedades das partículas - sua carga e seu coeficiente de fricção. Consequentemente, o valor de v/V 
é também uma propriedade característica das partículas e é importante o suficiente para receber o seu 
próprio nome: mobilidade. 
 
4. Efeito do pH do meio 
 22 
 Cada íon possui sua carga e mobilidade muito particular. No entanto, quando a solução contém uma 
substância a qual o pK é próximo do pH do meio, esta substância ocorre em ambas as formas: a carregada e 
a não carregada. 
 A fração com uma carga será dependente do pK da substância e o pH da solução. Quando o pH é 
igual ao pK de um ácido fraco, somente 50% das partículas estarão carregadas. Uma unidade de pH abaixo 
da pKa, 90% das partículas estarão sob a forma carregada. Desde que a carga efetiva de uma substância 
varia com o pH, a sua mobilidade efetiva também varia com o pH. 
 O pH da solução é escolhido de tal forma, que a partícula a ser separada pela eletroforese, se 
mantenha em um estado máximo de carga, para sua máxima separação. Os tampões são substâncias 
iônicas por si, portanto, exercem a função de manterem o pH o mais próximo possível da ideal e fazem parte 
do processo. 
 
5. Condutividade e movimento dos íons 
 Em qualquer sistema elétrico, a corrente produzida é proporcional a voltagem aplicada; 
 
V = resistência X Corrente ou V = corrente___ 
condutividade 
 
 Na eletroforese, a corrente é um fluxo de íons(em ambas direções). A condutividade é a soma das 
concentrações multiplicado pela mobilidade efetiva de todos os ions presentes. Um íon com maior 
mobilidade efetiva carreia uma maior fração da corrente 
 A voltagem, condutividade, e a corrente portanto estão todos relacionados. Se a condutividade está 
aumentada pelo aumento da concentração salina a corrente se mantém constante, a voltagem deve 
decrescer. Se decresce a voltagem reduz a força elétrica, Feletrica, nas partículas carregadas, diminuindo o 
movimento das macromoléculas. O aumento do tempo seria necessário para uma separação, e a resolução 
diminui devido ao aumento da difusão. Se a condutividade está aumentada numa voltagem fixa, a corrente 
deve aumentar, portanto aumentando o calor elétrico gerado pelo sistema, desde que o aquecimento é 
proporcional ao quadrado da corrente. O excesso do aquecimento produz distúrbios convectivo nas 
soluções, a qual distorce o padrão eletroforético e pode também desnaturar as macromoléculas. Desde que 
o aumento da condutividade mesmo em voltagem fixa ou corrente tenha efeito deletério, resultados ótimos 
podem ocorrer quando se conserva a concentração dos ions e portanto a condutividade em valores 
moderados. 
 
6. Carga e conformação 
 Como já se discutiu, o que determina a migração eletroforética é a carga da partícula que se quer 
separar. Muitas vezes, a distribuição das cargas não estão desvinculadas a sua conformação estérica, 
portanto, pode-se alterar a carga de uma partícula dependendo de sua conformação, principalmente em se 
tratando de macromoléculas. As macromoléculas, em seu estado relaxado, tendem a apresentar alguns 
eletrólitos ligados fortemente, portanto levando a uma alteração na sua mobilidade. 
 
7. Atmosfera iônica e o potencial zeta 
 Contra-íons, ou íons de carga oposta, naturalmente tendem a circundar próximos a grupos 
carregados das macromoléculas. No entanto, eles não chegam a neutralizar as cargas das macromolécuals 
mas, por sua vez estão localizados próximos dos grupos carregados das macromoléculas, formando uma 
dupla camada de carga em torno dessas, denominadas de atmosfera iônica. 
 23 
As macromoléculas movem-se com a camada de hidratação e com os contra ions. Esses reduzem a carga 
efetiva das macromoléculas, a um nível dado pelo potencial zeta. Esse potencial significa a energia 
produzida pela carga efetiva das macromoléculas na superfície de contato, que é a região limite do complexo 
macromolecular na solução e o material que o está envolvendo. 
 
8. Suportes 
 A grande meta da eletroforese é a separação de uma mistura heterogênea de substâncias iônicas 
seja ela macromoléculas ou íons simples, em zonas completamente identificáveis. Os suporte devem 
permitir a penetração do material a ser separado o máximo possível e ainda delimitar o fluxo de volume 
(eletroforese convencional). A maioria dos suportes oferecem esse princípio determinando o tamanho do 
poro para o movimento eletroforético das macromoléculas. O tubo capilar também exerce esse efeito. 
 
9. Eletroendosmose 
 O suporte não deve interagir com as moléculas a ser separadas, isso poderia impedir ou inibir a 
separação. Uma interação comum que pode ocorrer, não é a adsorção usual do material. Mais comumente é 
o efeito dos grupos carregados que estão ligados ao suporte, que resulta em eletro-endosmose. Como 
exemplo típico temos o suporte ágar, que é muito utilizado na eletroforese. O ágar é uma mistura de agarose 
e agaropectina. A agaropectina tem um número relativamente grande de grupos carboxil, que em pH neutro 
tem contra-íons. Se o campo elétrico for aplicado, os contra-íons irão se mover, mas o grupo carboxil ligados 
a matrix (agar) não migrarão. Os contra-íons carreia solvente o suficiente para que produza um fluxo 
significativo nesta direção, esse fenomeno denomina-se de eletro-osmose, que as vezes é denominado de 
endosmose. 
 
 
 TIPOS DE SUPORTE 
 
Os tipo de suporte podem variar desde uma solução de sacarose até em substância pouco solúveis como 
fibras de celulose. Os suportes de meio contínuo mais comuns são: agar, agarose, poliacrilamida e amido. 
A porosidade ou a média do tamanho do poro em alguns suportes é fixo. Entretanto, em alguns suportes 
podem ser controlados. Como exemplo, amudança da concentração do gel de agarose, agar e amido, pode 
mudar o tamanho do poro. O tamanho dos poros do gel de poliacrilamida mais utilizados para 
macromoléculas está em torno de 5% a 10%, que separam proteínas de 15.000 a 250.000 Daltons. Esse tipo 
de suporte separa tanto pelo tamanho do poro como por carga elétrica. 
 
 
 TIPOS DE ELETROFORESE. 
 
 
a. Dependendo da matrix 
 Eletroforese livre de Tiselius 
 Eletroforese em acetato de celulose 
 Eletroforese em gel de agar 
 Eletroforese em gel de agarose 
 Eletroforese capilar 
 
 24 
b. pH de separação 
 pH ácido 
 pH neutro 
 pH alcalino 
 
 
 APLICAÇÕES DA ELETROFORESE NAS TÉCNICAS MOLECULARES 
 
1. Gel de Agarose 
 Um dos métodos eletroforéticos mais comuns utilizados na prática diária em biologia molecular é a 
de gel em agarose. Essa técnica muito simples, rápida, prática e apresenta boa resolução na separação dos 
fragmentos de DNA, se comparados com outras bem mais demoradas como a separação por 
ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose. 
Uma boa separação eletroforética do DNA utilizando gel de agarose depende de vários fatores: 
 
1.1. Tamanho molecular do DNA. 
 As moléculas lineares, dupla fita de DNA migram inversamente proporcional ao log10 do peso 
molecular através do gel de agarose. 
 
1.2. concentração da agarose. 
 O fragmento do DNA migra em diferentes proporção através do gel contendo diferentes 
concentraçào da agarose. Existe uma relação linear entre a mobilidade logaritimica do DNA e a concentração 
do gel que é baseada numa equação matemática(Helling e cols , 1974) figura 1. 
 
Log=logo- Kr 
 Onde o é a mobilidade eletroforética livre e Kr é o coeficiente de retardamento,  = a constante que 
é relacionada as propriedades do gel e o tamanho e a forma da molécula em migração. 
 
 Baseada nessa correlação podemos separar várias moléculas de DNA (de variado tamanho) nas 
diferentes concentrações de agarose. 
 
Porcentagem de agarose intervalo da efficiência da separação da molécula de 
DNA em Kb 
0,3% 5 a 60 
0,6% 1 a 20 
0,7% 0,8 a 10 
0,9% 0,5 a 7 
1,2% 0,4 a 6 
1,5% 0,2 a 4 
2,0% 0,1 a 3 
 
 
 25 
 
1.3. Conformação do DNA 
 A forma circular (forma I), forma circular contorcida(forma II) e forma linear (forma III) do DNA com a 
mesmo peso molecular migra através do gel de agarose em diferentes posições (Thorne, 1966, 1967). A 
mobilidade relativa das 3 formas são dependentes primariamente da concentração do gel, mas são também 
influenciados pela corrente aplicada, força iônica do tampão e da densidade superhelicoidal da torção na 
forma I do DNA (Johnsom and Grossman , 1977). Em algumas condiçoes, a forma I do DNA migra mais 
rápido que a forma III, em outras condições pode ser de ordem inversa. Um método geral para identificar as 
diferentes conformações do DNA é utilizar na corrida eletroforética em agarose diferentes concentrações de 
brometo de etídio(concentração crescente). Quanto mais brometo de etidio mais se liga ao DNA. As torções 
superhelicoidal negativas da a forma I do DNA vão sendo progressivamente removida e seu índice de 
migração diminui. Numa concentraçao crítica do corante livre, onde não permanece a forma superhelicoidal, 
o índice de migração da forma I do DNA esta no seu mínimo valor. Se ainda mais brometo de etídio for 
adicionado, torções superhelicoidais positivas são gerados e a mobilidade da forma I do DNA aumenta 
rapidamente. Simultaneamente, as mobilidades das formas II e formas III do DNA são diferentemente 
diminuidas como consequência da neutralização da carga e da maior tenacidade é dada ao DNA pelo 
brometo de etídio. Para a maioria das formas I de DNA, a concentração critica do brometo de etídio livre é de 
0,1 a 0,5 g/ml 
 
A corre nte aplicada: A baixa voltagem, a razão da migração dos fragmentos de DNA linear é proporcional 
a da voltagem aplicada. Entretanto, a medida que a carga elétrica aumenta, a mobilidade dos fragmentos de 
DNA de alto peso molecular aumenta diferentemente. Dessa maneira o intervalo efetivo da separação do gel 
de agarose decresce a medida que a voltagem aumenta. Para obter a máxima resolução dos fragmentos de 
DNA, o gel deve ser submetido a uma corrente de no máximo 5V/cm 
 
Composição das bases e temperatura: O comportamento eletroforético do DNA em gel de agarose não é 
significantemente afetado pela composição das bases do DNA ou pela temperatura do gel na corrida. Dessa 
forma, os geis de agarose e a mobilidade eletroforética dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos não 
muda entre 4
0
C a 30
0
C. Em geral, os geis de agarose são submetidos a corrida em temperatura ambiente. 
No entanto, em concentrações muito baixas (0,5%) os géis são pouco consistentes, sendo convenientes 
trabalhar em baixas temperaturas, pois esses géis ganham mais firmeza, da mesma forma os géis de 
agarose de baixo ponto de fusão(“low melting” agarose). 
 
 
1.4. Tampões utilizados 
 Existem uma variedade de tampões que podem ser utilizados para separação eletroforética de DNA. 
 
 26 
TAMPÕES CONCENTRAÇÃO FORMULAÇÃO 
Tris-acetato (TAE) 0,04M Tris acetato 
0,01M EDTA 
50X 242g tris base 
 57,1 ml ácido acético 
 100ml EDTA 0,5M(pH8,0) 
Tris-fosfato (TPE) 0,08M Tris-fosfato 
0,002M EDTA 
10X 108 g Tris Base 
 15,5ml de ac. fosfórico 85% 
 40ml EDTA 0,5M (pH8,0) 
Tris-borato (TBE) 0,089M Tris borato 
0,089M ac. bórico 
0,002M EDTA 
5X 54g Tris-base 
 27,5g ác. bórico 
 20 ml EDTA 0,5M (pH8,0) 
 
1.5. Tipos de Agarose 
 Muitos tipos de agarose estão disponíveis, o que se recomenda para uso diário é o tipo II, baixa 
eletroendosmose. O inconveniente desta agarose é que possue contaminantes de polissacárides sulfatados 
que inibem enzimas, como ligases, polimerases, e endonucleases. No entanto, a sua utilização é muito 
difundida, pois o DNA pode ser purificado e ser utilizado com sucesso nas clonagens e como substratos de 
reações com essas enzimas 
 
1.6. Coloração do DNA em gel agarose 
 O método mais conveniente para visualizar o DNA no gel de agarose é a coloração por brometo de 
etidio, que fluoresce sob luz ultra violeta. Esse composto contém um grupo planar, que intercala entre as 
bases do DNA. A posição fixa do grupo e sua proximidade às bases causa uma ligação do corante com o 
DNA, que se destaca com um aumento da fluorescência comparada com o corante em solução sob a forma 
livre. A radiação UV absorvida pelo DNA a 260 nm é transmitida para o corante, ou a irradiação absorvida a 
300 nm e 360 nm pelo corante ligado propriamente dito, é emitido a 590nm na região da cor vermelho 
alaranjada, do espectro visível. 
 O brometo de etídio pode detectar tanto os ácidos nucleicos de simples ou de dupla fita. No entanto, 
a afinidade do corante pela fita simples é relativamente baixa, e a fluorescência emitida é fraca. 
Geralmente o brometo de etídio é incorporado no tampão de corrida e no gel a 0,5ug/ml. Nesse caso 
devemos considerar que a mobilidade linear das fitas duplas está reduzida na presença do corante em 
aproximadamente 15%. Uma vantagem deste procedimento é a possibilidade de visualizar o gel durante a 
separação eletroforética, sem a necessidade de remover o gel do suporte e da cuba, simplesmente incidindo 
a luz UV sob o gel. Mas, se houver necessidade da coloração posterior basta imergir o gel numa solução de 
brometo de etídio, no próprio tampão de corrida, po r 45 minutos a temperatura ambiente. A descoloração 
normalmente é dispensada, exceto se houver excesso de corante. Quando a quantidade de DNA é muito 
reduzida, a pouca fluorescência do brometo de etídio pode interferir na visuallização da banda de DNA. Neste 
caso recomenda-se imergir o gel em uma solução de sulfato de magnésio a 1mM por uma hora, a 
temperatura ambiente 
 27 
 
1.7. Documentação: 
 O gel de agarose é facilmente documentado, utilizando um sistema de fotografiainstantânea ou 
sistema automatizado de captura de imagem. O filme mais sensível para essa finalidade é fornecida pela 
Polaroid, tipo 57 ou 667, asa 3000. Sob a luz UV de no mínimo 2500uW/cm
2 
 e uma boa máquina , 
utilizando filtro laranja, expõe-se por alguns segundos. Recomenda-se para a máquina Polaroid modelo DS 
34 uma abertura de 5,6 ou 8 e uma velocidade de 4 ou 8 segundos, mas pode variar com a intensidade das 
bandas e do tamanho do gel. Para padronização tente vários tempos de exposição com várias aberturas. 
 
 
2. Gel de poliacrilamida 
O gel de poliacrilamida é um suporte bastante utilizado em biologia molecular para separação e 
caracterização de fragmentos de tamanho menores de DNA, que se tem dificudade por geis de agarose. 
Descrito por Raymond & Weintrab em 1959. O produto de polimerização da acrilamida, que é o monômero, 
com a N.N'metilenobisacrilamida, que realiza a reação de "cross linking" ou reação cruzada, gera o suporte 
de poliacrilamida. A polimerização ocorre por ligação vinílica, sob ação de catalisadores, o perssulfato de 
amônia, cuja fonte de radicais livres é o N,N,N'N' tetrametilenodiamina(TEMED). Portanto, o oxigênio é um 
inibidor da reação. O polímero formado são cadeias lineares de poliacrilamida, cuja reação cruzada entre 
elas é dada pela bisacrilamida. O comprimento médio das cadeias é determinado pela concentração relativa 
da acrilamida e a quantidade de bisacrilamida. Portanto a relação entre a quantidade de acrilamida e 
bisacrilamida determina as propriedades físicas do gel, que darão subsídios para separação nesse tipo de 
gel. 
 O gel de poliacrilamida é utilizado para os fragmentos menores que 1kb. Eles podem ser preparados 
em uma variada concentração (3,5% a 20%), dependendo do tamanho do fragmento de interesse para a 
separação e identificação. 
 
ACRILAMIDA (%) INTERVALO DE SEPARAÇÃO (NUCLEOTÍDEOS) 
3,5 10-1000 
5,0 80-500 
8,0 60-400 
12,0 40-200 
20,0 10-100 
 
 Os géis de poliacrilamida devem ser preparados entre duas placas de vidro, pois necessita de um 
ambiente isento de oxigêncio para se polimerizar. 
 O tamanho do gel pode variar de 10cm de altura por 10cm de largura até 20 a 30cm de largura por 
40 a 100 cm de altura dependendo da necessidade do sistema; de espessura normalmente para DNA utiliza-
se 0,75 a 1,5 mm. 
 28 
 
Literatura recomentada 
 
Kaplan, L.A. & Pesce, A.J. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation, 3a. Ed., J.F. Shanahar & J. 
Roche, eds., 1996, Mosby-Year Book, Inc., St Louis, USA. 
Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 
2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY. 
 
 
 29 
 Aula número 4 
 
 
REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR) 
 
Prof. Assoc.Mario Hiroyuki Hirata 
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata 
 
 PRINCÍPIOS DA REAÇÃO DE PCR 
 
 A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain reaction”, PCR) é a técnica que permite a 
amplificação do DNA ou RNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reação enzimática catalizada pela 
polimerase (enzima termoestável) cuja atividade depende de ions Mg++, e ocorre em 3 etapas: “Melting”(ou 
desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado), “annealing”( anelamento 
ou hibridização- ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado) e “extension”(extensão ou seja a 
polimerização propriamente dita) Metodologicamente a técnica de PCR requer três passos (SAIKI et al., 
1.988): 
1. Desnaturação - Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. 
A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a separação da fita dupla de DNA em duas fitas 
simples. Este procedimento é chamado “Desnaturação” ou “melting”, e muitas vezes a temperatura de 
desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina 
e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse. 
2. Anelamento - A polimerase para assumir suas funções, isto é, anexar as bases complementares, 
transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA já ligado na região 
previamente escolhida. A solução, então, é demarcar as extremidades do DNA-procurado ou de interesse 
nas duas longas fitas simples, tornando-as duplas, apenas nesse intervalo. Para isso adicionam-se, à 
solução, os “primers” ou iniciadores que são pequenos fragmentos sintéticos de DNA de fita simples, 
oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento, que são sintetizados in vitro baseado 
na sequência do DNA a ser amplificado sendo eles complementares à seqüência do segmento de DNA 
de interesse. O conhecimento da seqüência procurada é naturalmente pré-requisito para a síntese dos 
“primers”. Os “primers” perseguem na reação as regiões, as quais foram escolhidas, para hibridizar-se às 
seqüências complementares nas duas fitas simples (usualmente 5’). Nas duas fitas surgem, assim, um 
pequeno fragmento de DNA de dupla fita intacta. A hibridização dos “primers” descrito como “Annealing” 
(do inglês), deve ser feito a uma tempertura inferior à da desnaturação (45 a 60 C). 
3. Extensão - Quando os “primers” encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a DNA-
Polimerase pode assumir sua função. Inicia-se a partir dos pequenos fragmentos de DNA de fita dupla 
(resultado do anelamento do “primer”), incorporando um a um os nucleotídeos correspondentes, isto é, as 
bases juntamente com as moléculas de açúcar e fosfato. A DNA-Polimerase liga os nucleotídeos entre si, 
completando assim as fitas simples e tornando-as duplas (extensão). A DNA-Polimerase não reconhece 
 30 
apenas o bloco de início como também consegue diferenciar as duas extremidades dos “primers” (3’ e 5’). 
Ela inicia a reação sempre pela extremidade 3’ do “primer”, completando a fita simples daí em diante, 
portanto, sempre na direção do fragmento procurado. 
 Os fragmentos de DNA recém-formados fornecem mais moldes para a montagem de novas fitas nos 
ciclos subseqüentes, no entanto, com região já determinada, resumindo, temos uma reação em cadeia. 
Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica: de um formando-se 2, e então novamente 4, 8, 16, 32, 
64, 128... de tal forma que pode ser definida matematicamente por: 
 
 
 
 N = número de moléculas amplificadas 
 No = número de moléculas iniciais 
 n = número de ciclos de amplificação 
 
 O modelo teórico considera que a eficiência do processo de amplificação corresponde a 100%, o que 
não é observado na prática. Experimentalmente, a eficiência da reação está abaixo da ideal e gira entorno de 
78% a 97%, dependendo do gene amplificado. Teoricamente após 20 ciclos têm-se cerca de um milhão; 
após 30 ciclos, cerca de um bilhão de cópias do fragmento de DNA de interesse. 
 
 Automação da PCR 
 O procedimento da PCR foi tão aperfeiçoada desde a sua primeira descrição, que na atualidade 
transcorre de forma totalmente automática. Uma importante condição para isto foi a substituição da DNA-
Polimerase originalmente utilizada (extraída de E. coli) por uma DNA-Polimerase termoestável extraída da 
bactéria Thermus aquaticus (Taq-polimerase). Desta forma, os vários ciclos transcorrem, seguidamente, em 
um único tubo de ensaio, sem necessidade de interrrupção para a adição de nova DNA-Polimerase ativa. 
Todos os reagentes necessários (o DNA-template, os “primers”, a DNA-Polimerase, e os dNTPs) são 
misturados com uma solução tampão que ajusta o pH ótimo da reação. 
 Um aparelho de PCR ou um termociclo repete o correspondente programa de temperaturas. O 
operador deve apenas programar e dar início para que transcorra a amplificação. Um ciclo dura em média 
três minutos. Assim, em uma hora, podem ser produzidas cerca de um milhão de cópias e, em menos de 
duas horas, cerca de um bilhão de cópias da seqüência de DNA de interesse. 
O