Apostila Fundamentos de Biotecnologia - UENF

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APOSTILA: FUNDAMENTOS EM BIOTECNOLOGIA 
 
 Editores: 
 Dra. Claudete Santa-Catarina 
 Professora Associada – LBCT/CBB/UENF 
 Dr. Álvaro Fabrício Lopes Rios 
 Professor Associado LBT/CBB/UENF 
 Dra. Marília Amorim Berbert de Molina 
 Professora Associada LBT/CBB/UENF 
 Dr. Vanildo Silveira 
 Professor Associado LBT/CBB/UENF 
 Aline Martins de Vita 
 Biológa – CBB/UENF 
 Vanessa de Souza Rodrigues 
 Graduanda Ciências Biológicas – CBB/UENF 
 
 Equipe do projeto Extensão: 
 M.Sc. Tatiana Barroso Chiquieri 
 Doutoranda em Biociências e Biotecnologia – CBB/UENF 
 
 Nayara Justo Nogueira 
 Graduanda Licenciatura em Ciências Biológicas – CEDERJ/UENF 
 
 Telma Ferreira Costa Aguiar 
 Técnica em Química - LBT/CBB/UENF 
 
 Apoio: 
 UENF – Universidade Estadual do Norte Fluminense 
 PROEX - Pró-Reitoria de Exensão - UENF 
 FAPERJ - (Auxílio ao Projeto Extensão - Processo E-26/111.109/2010) 
 
 Arte: 
 ASCOM - UENF 
 
 Primeira Edição: Setembro/2011 
 
Campos dos Goytacazes – RJ 
2011 
iii 
 
SUMÁRIO 
 
 
INTRODUÇÃO ...............................................................................................................................................1 
CAPÍTULO 1 - BIOTECNOLOGIA ANIMAL.................. ..........................................................9 
1. ESTRUTURA DOS GENES ..................................................................................................................................9 
2. AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DA ENGENHARIA GENÉTICA... .................................................................... 11 
2.1. Clonagem do gene...................................................................................................................................11 
2.2. Sequenciamento do DNA.........................................................................................................................12 
2.3. Amplificação gênica in vitro....................................................................................................................................12 
2.4. Construção gênica ..................................................................................................................................................12 
2.5. Transferência do gene ...........................................................................................................................................13 
3. TÉCNICAS PARA TRANSFERÊNCIA NUCLEAR (CLONAGEM) E TRANSGÊNESE .................................14 
3.1. Clonagem .................................................................................................................................................................14 
3.1.1. As principais etapas da diferenciação .................................................................................................................14 
3.1.2. Clonagem por transferência nuclear ...................................................................................................................14 
3.2. Transgênese ............................................................................................................................................................17 
3.2.1. Os objetivos e o conceito de transgênese animal ...............................................................................................17 
3.2.2. Transferência do gene nos gametas ...................................................................................................................18 
3.2.2.1. Transferência do gene no esperma ..............................................................................................................18 
4. APLICAÇÕES DA TRANSGÊNESE ..................................................................................................................19 
4.1. Estudos básicos ......................................................................................................................................................19 
4.2. Estudo de doenças humanas ................................................................................................................................19 
4.3. Produção farmacêutica ..........................................................................................................................................20 
5. GENES CANDIDATOS QUE PODEM MELHORAR A PRODUÇÃO A NIMAL ...............................................21 
6. APLICAÇÕES DA CLONAGEM .........................................................................................................................22 
6.1. Estudos básicos ......................................................................................................................................................22 
6.2. Reprodução animal .................................................................................................................................................23 
6.3. Reprodução humana ..............................................................................................................................................24 
6.4. Clonagem terapêutica ............................................................................................................................................24 
6.5. Transplante ..............................................................................................................................................................25 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................................................26 
CAPÍTULO 2 - BIOTECNOLOGIA VEGETAL................. ......................................................27 
1. CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS ................................................................................................................29 
2. PARÂMETROS ESSENCIAIS PARA A MANIPULAÇÃO DAS CUL TURAS DE TECIDOS VEGETAIS......32 
2.1. Explantes ..................................................................................................................................................................32 
2.2. Assepsia ...................................................................................................................................................................33 
iv 
 
2.3. Condições de incubação ........................................................................................................................................34 
2.4. Meio de cultura ........................................................................................................................................................34 
2.4.1. Meio de cultura semi-sólido................................................................................................................................35 
2.4.2. Meio de cultura líquido .......................................................................................................................................36 
3. FATORES QUE INFLUENCIAM NO ESTABELECIMENTO DA CU LTURA ..................................................37 
3.1. Oxidação fenólica ...................................................................................................................................................37 
3.2. Densidade mínima de inoculação ........................................................................................................................37 
4. MICROPROPAGAÇÃO ......................................................................................................................................38 
4.1. Estágios da micropropagação ..............................................................................................................................38 
4.2. Vantagens da micropropagação ..........................................................................................................................40 
4.3. Desvantagens da micropropagação ....................................................................................................................405. PRINCIPAIS METODOLOGIAS DA MICROPROPAGAÇÃO .........................................................................40 
5.1. Organogênese direta .............................................................................................................................................40 
5.1.1 Estágios da organogênese direta .........................................................................................................................41 
5.2. Organogênese indireta ..........................................................................................................................................41 
5.2.1. Estágios da organogênese indireta .....................................................................................................................42 
6. EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA ..........................................................................................................................42 
6.1. Estágios da embriogênese somática ..................................................................................................................43 
6.2. Vantagens da embriogênese somática ..............................................................................................................46 
6.3. Limitações/Desvantagens da embriogênese somática ....................................................................................46 
7. APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE MICROPROPAGAÇÃO .........................................................................47 
7.1. Produção de sementes sintéticas ........................................................................................................................47 
7.2. Conservação de germoplasma................................................................................................................47 
7.3. Produção de metabólitos secundários ................................................................................................................48 
7.4. Micropropagação de espécies de interesse............................................................................................49 
8. TRANSGÊNESE EM PLANTAS ........................................................................................................................50 
8.1. Princípios da Transformação Gênica ..................................................................................................................52 
8.2. Transformação por Agrobacterium tumefaciens ................................................................................................54 
8.3. Eletroporação de protoplastos.................................................................................................................54 
8.4. Biobalística ..............................................................................................................................................................55 
8.5. Dificuldades na Transformação Gênica em Plantas .........................................................................................55 
8.6. Potencial da transformação gênica.........................................................................................................56 
8.6.1. Adição de novas ou diferentes funções...............................................................................................................56 
8.6.2. Adição de novas características...........................................................................................................................57 
8.6.3. Biorremediação ...................................................................................................................................................57 
8.6.4. Fármacos .............................................................................................................................................................57 
8.6.5. Alteração no desenvolvimento ou morfologia do indivíduo ...............................................................................57 
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................................................57 
CAPÍTULO 3 - BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL .............................................................................59 
1. INTRODUÇÃO .....................................................................................................................................................59 
2. PROCESSOS FERMENTATIVOS..................................................................................................................61 
v 
 
3. PRODUTOS DA BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL: APLICAÇÕES E BENEFÍCIOS ....................................63 
3.1. Metabólitos primários e secundários e suas aplicações ...................................................................................64 
3.1.1. Metabólitos primários .........................................................................................................................................64 
3.1.2. Metabólitos secundários .....................................................................................................................................67 
3.1.3. Produtos alimentícios e bebidas .........................................................................................................................69 
3.1.4. Produtos voltados para o Meio Ambiente ..........................................................................................................70 
3.1.5. Produtos obtidos por bioconversões microbianas ..............................................................................................72 
3.1.6. Produtos da Biotecnologia Industrial Moderna ..................................................................................................72 
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................................................76 
GLOSSÁRIO DE BIOTECNOLOGIA ....................................................................................................77 
 
 
 
Introdução 
 
1 
 
INTRODUÇÃO 
 
O homem utiliza a biotecnologia há muito tempo, desde que fez o primeiro pão, produziu a 
primeira taça de vinho e selecionou os melhores grãos de milho para o replantio da nova safra. Na 
atualidade, o pão e cerveja são os componentes mais abundantes na dieta, tanto social e em rituais. 
No século da biotecnologia, convive-se com biotecnologias tradicionais (as antigas 
biotécnicas) e modernas (engenharia genética, genômica, proteômica e clonagem – manipulação 
biológica do DNA). É correto afirmar que incluindo a manipulação genética, a biotecnologia é tão 
antiga quanto a história da humanidade, no entanto a manipulação possibilitada por técnicas de 
engenharia genética data de 1971, com a manipulação do DNA/engenharia genética – técnicas que 
permitem manipular o gene (pedaço ou unidade funcional do gene). 
O anúncio, em 2001, da finalização de uma primeira versão de todo o genoma humano foi 
saudado pela mídia com uma série de especulações sobre o significado desta informação, que iam 
desde a vitória sobre o câncer até bebês fabricados geneticamente sob eliminação da obesidade e 
juventude eterna. É claro que, para alcançar essas metas, é necessário muito mais do que apenas o 
conhecimento do genoma humano. 
Ao longo das últimas décadas houve uma intensa expansão da biotecnologia, em ambos, 
aquisição de conhecimentos e desenvolvimento de processos tecnológicos e na sua aplicação nas 
diferentes áreas (Tabela 1). Atualmente, destacam-se várias áreas dentro da biotecnologia, as quais 
são frequentemente complementares: 
- A biotecnologia voltada para a agropecuária e de produção de alimentos com estudos de 
novos produtos alimentares, de aplicação de microrganismos geneticamente modificados, animais e 
plantas transgênicos, bem como melhoria da qualidade de vegetais e animais relevantes para a 
indústria.Essa área liga-se também à biotecnologia da preservação e melhoria ambiental e o estudo 
da biodegradação de poluentes gasosos, líquidos e sólidos do solo. A biotecnologia que utiliza 
biologia molecular, como a química combinatorial de biomoléculas, os processos de 
biotransformação e aplicação de biocatalisadores, a tecnologia de ácidos nucléicos, a engenharia de 
proteínas, a aplicação de moléculas menores em controles de metabolismo e em farmacologia. Suas 
aplicações são essencialmente dirigidas para a área de obtenção de produtos industriais de alto valor 
agregado. Na área de saúde, incluem-se nessa vertente a construção e produção de moléculas 
recombinantes de ácidos nucléicos e de proteínas, usadas em vacinação humana e animal e em 
terapia molecular na medicina, e de moléculas estruturais usadas em engenharia tecidual. 
- A biotecnologia voltada para a biologia celular aplicada à medicina e saúde refere-se à 
genômica, com extensão para a terapia gênica, o diagnóstico, o prognóstico, o tratamento e a 
prevenção de doenças e de modulação de defeitos metabólicos. Uma área emergente da 
biotecnologia médica é a engenharia de tecidos e órgãos, associada com a biologia estrutural e a 
Introdução 
 
2 
 
biomimética. Essa área é profundamente ancorada em conhecimentos da biologia dos sistemas 
supramoleculares, da biologia celular e tecidual, da biologia do desenvolvimento e da forma, bem 
como dos sistemas integradores dos organismos superiores. 
No século XXI, o DNA, que até algumas décadas atrás só poderia ser visualizado com uma 
mente imaginativa, agora não só pode ser visto e fotografado, mas também manipulado de forma 
precisa e planejada. Muitas questões que existiam na mente dos biólogos até algumas décadas atrás 
deram espaço para questões mais aplicadas, e a biotecnologia deixou de ser apenas uma ciência 
básica e passou a ser um empreendimento altamente promissor. Em 2000, a biotecnologia 
movimentou mais de US$ 200 bilhões, apenas nos EUA. Oportunidades de emprego e de 
investimento estão se materializando à medida que a biotecnologia coloca no mercado novos 
produtos: medicamentos, variedades etc. e serviços: terapias, testes genéticos etc. 
No Brasil, a biotecnologia representa hoje a base produtiva de diversos setores da economia, 
os quais representam parte considerável do PIB e das exportações. O processo de ajuste estrutural 
da economia brasileira tem influenciado na demanda por inovações tecnológicas nos principais 
setores usuários de biotecnologias do país. 
 O termo Biotecnologia foi primeiramente definido por Karl Ereky no final da Segunda Guerra 
Mundial, referindo-se a métodos intensivos de agricultura. Desde então, várias definições foram 
sugeridas, associando a Biotecnologia, principalmente, ao uso de microrganismos na fabricação de 
produtos de valor comercial. A Biotecnologia é formada por vocábulos de origem grega: "bio" 
significa vida; "logos" significa conhecimento e "tecnos" designa a utilização prática da Ciência. 
Trazendo para os dias atuais, a "bio" refere-se ao uso de processos biológicos e "tecnologia" 
refere-se à fabricação de produtos e processos úteis e ao desenvolvimento de técnicas que levam à 
solução de problemas, baseando-se em conhecimento científico. 
 A BIOTECNOLOGIA teve várias definições ao longo dos anos. Estas definições podem ser 
simples às mais complexas. Dentre as definições mais simplificadas, podemos citar: 
- "A utilização dos organismos vivos ou de seus constituintes nos processos industriais", definida por 
OTA (Office of Technology Assessment – EUA, 1981); 
- “A utilização dos sistemas celulares para obtenção de produtos ou desenvolvimento de processos 
industriais", pelo CNPq (Programa Nacional de Biotecnologia – Brasil, 1981); 
- “A aplicação de princípios científicos e técnicos à transformação de certas matérias por agentes 
biológicos para produzir bens e serviços” (Organização para Cooperação e Desenvolvimento 
Econômico, 1994); 
- “O emprego de organismos vivos na geração de produtos benéficos para a espécie humana. É a 
aplicação de seres biológicos em processos técnicos e industriais” (U.S. Environmental Protection 
Agency, 1995); 
- ”Um conjunto de técnicas biológicas, desenvolvidos a partir de pesquisas básicas, aplicadas à 
pesquisa e ao desenvolvimento de produtos” (National Cancer Institute, NIH, USA, 2007). 
Introdução 
 
3 
 
 Dentre as definições mais completas, citamos: 
- "A Biotecnologia trata da utilização das atividades biológicas no âmbito dos processos técnicos e da 
produção industrial. Ela consiste em colocar em prática a Microbiologia e a Bioquímica em ligação 
com a Química Industrial e a Engenharia de Processos" (Biotecnologie, Dechema, RFA, 1976); 
- "A Biotecnologia compreende um vasto conjunto de técnicas que usam seres vivos, ou parte deles, 
para produzir ou modificar produtos, aumentar o crescimento de plantas e animais ou, ainda, 
desenvolver microrganismos para usos específicos" (Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia da 
UFSC (1995); 
- “A Biotecnologia é a aplicação controlada e intencional de agentes biológicos simples - células vivas 
ou mortas ou componentes celulares - em operações tecnicamente úteis, tanto em processos 
produtivos quanto em serviços” (Bu'Lock & Christiansen, 1987); 
- "A Biotecnologia, de uma forma abrangente, inclui qualquer técnica que utiliza organismos vivos (ou 
parte deles) para obter ou modificar produtos, melhorar plantas ou animais, ou desenvolver 
microrganismos para usos específicos" (OTA, Office of Technology Assessment, EUA, 1984); 
- “É o estudo ou a manipulação de um ou mais componentes básicos de organismos vivos: tecidos, 
células, proteínas, genes ou DNA. Pode incluir a identificação e caracterização de genes, a 
engenharia genética e o cultivo de células” (PCE – Parliamentary Commissioner for the Environment, 
New Zeland, 2008); 
- “É a ciência que usa organismos vivos ou seus componentes para produzir bens e serviços. 
Envolve a manipulação e modificação de organismos, freqüentemente em nível molecular, para criar 
novas e práticas aplicações para a agricultura, medicina e indústria” 
(www.smartstate.qld.gov.au/strategy/strategy05_15/glossary.shtm, 2008); 
- “É a aplicação da ciência e da engenharia para o uso direto ou indireto de organismos vivos, ou 
parte deles ou seus produtos, na sua forma natural ou modificada” (www.cambridge.gov.uk/ccm/cms-
service/download/asset/, 2008); 
 Nestas definições, que englobam textos da década de 70 até os dias atuais, vemos que o 
significado do termo Biotecnologia, feito de maneira mais ampla, envolve diferentes aspectos desta 
ciência, podendo ser destacados os seguintes fatores: 
• O “sistema biológico” inclui não somente seres vivos e integrais, mas também parte deles ou 
seus produtos; 
• O “sistema biológico” compreende tanto organismos naturais quanto modificados; 
• A manipulação dos sistemas biológicos é feita de maneira deliberada e controlada; 
• A Biotecnologia inclui o conhecimento de várias disciplinas científicas; 
• A Biotecnologia tem como objetivo final a geração de produtos úteis à espécie humana. 
 
 
Introdução 
 
4 
 
 Ou seja, para qualquer definição de Biotecnologia todos estes aspectos devem ser levados 
em conta. Adicionalmente, a biotecnologia tem um caráter multidisciplinar, a qual tem por base vários 
ramos do conhecimento, que podem ser divididos em 2 grupos: 
 FUNDAMENTAIS: o qual inclui a bioquímica, fisiologia, genética, microbiologia, biologia 
molecular, virologia, botânica, zoologia, ecologia, matemática, física, entre outras. 
 ENGENHARIAS: principalmente a atuação da Engenharia Química. 
 Desta forma, a Biotecnologia apóia-se em várias disciplinas científicas - principalmente a 
biologia molecular e celular, bioquímica, genética, microbiologia, imunologia, química, engenharia 
industrial e informática. Seu campo é tão vasto que seria mais corretofalar em “biotecnologias”, no 
plural. Simples ou sofisticadas, baratas ou caras, elas abrangem processos tão antigos como a 
fermentação a técnicas tão avançadas como a engenharia genética, que permite transferir certos 
caracteres genéticos de um a outro organismo e assim criar vegetais, animais transgênicos e 
microrganismos com as características desejadas. 
De uma forma mais abrangente e na tentativa de englobar diferentes áreas do conhecimento 
sobre o que é a biotecnologia pode-se definir este termo como “conjunto de técnicas e métodos 
industriais que viabilizam a obtenção de BENS E SERVIÇOS de interesse para o ser humano, tendo 
como agentes de transformação, de uma forma integral ou parcial, células animais e vegetais, 
microrganismos e vírus” (OTA, Office of Technology Assessment, 1984; Pós-graduação em 
Biotecnologia - UFSC, 1995). 
Como BENS E SERVIÇOS, podemos citar: 
 a) Produtos – Temos vários produtos no nosso cotidiano que são oriundos tanto da 
Biotecnologia clássica quanto da moderna. Pela Biotecnologia clássica temos vários alimentos, 
bebidas fermentadas e fermento-destiladas, fármacos, enzimas para aplicações diversas, 
combustíveis, ácidos orgânicos e outros químicos, pão, queijos, iogurte, chucrute, cogumelos, 
biomassa microbiana, vinagre, vinho, cerveja, ácidos orgânicos (acético, cítrico, lático, etc), álcool 
etílico, glicerol, n-butanol, aminoácidos (lisina, ácido glutâmico), vitaminas (C, B12, riboflavina), 
antibióticos (penicilina, cefalosporina), metano, polissacarídeos (dextrana, xantana, alginatos), 
vacinas bacterianas e virais (tuberculose, poliomielite, rubéola), enzimas (proteases, lipase, lactase, 
lacase, pectinase, amiloglicosidase, glicose isomerase, inulinases), bioinseticidas, etc. 
Pela Biotecnologia moderna incluem-se as novas tecnologias, geradas a partir de organismos 
geneticamente modificados ou transgênicos. Pode-se citar a insulina e hormônio de crescimento 
humano produzidos pela bactéria Escherichia coli geneticamente modificada; proteínas terapêuticas 
(usadas na produção de fármacos) obtidas a partir do leite de animais (ovinos, bovinos e caprinos) 
modificados geneticamente pela inserção, em seu genoma, de genes humanos que codificam estas 
proteínas; plantas agronomicamente importantes (milho, soja, arroz, etc) alteradas geneticamente 
pela inserção de genes de resistência a herbicidas e insetos, dentre outros. 
 
Introdução 
 
5 
 
b) Processos – Como processos oriundos da biotecnologia destaca-se a biorremediação, 
controle biológico, biolixiviação de metais, tratamento biológico de efluentes, entre outros. 
c) Serviços – Dentre os serviços oriundos da Biotecnologia pode-se citar Kits para 
diagnóstico de doenças, testes de DNA (determinação de paternidade, investigações forenses, 
diagnóstico de doenças genéticas), kits enzimáticos para determinações analíticas (dosagem de 
açúcares em líquidos biológicos, determinação de proteínas, etc), dentre outros. 
Todas estas definições mostram, nitidamente, que a Biotecnologia tem por base vários ramos do 
conhecimento. A biotecnologia animal, por exemplo, envolve as técnicas já estabelecidas para a 
reprodução animal, como a inseminação artificial, incluindo os principais avanços em fisiologia 
reprodutiva, desenvolvidos nas décadas recentes, tais como a fertilização in vitro e a transferência de 
embriões. Além destes, a biotecnologia animal também inclui progressos relativamente recentes que 
empregam a modificação genética, ou seja, a manipulação direta da composição genética de um 
animal (transgênese animal) e a clonagem por transferência nuclear, tecnologia na qual o núcleo 
integral de uma célula e os genes que ele carrega são transferidos para células receptoras 
especialmente preparadas, cujos próprios cromossomos foram previamente removidos. 
A biotecnologia vegetal está associada à vários setores, incluindo a cultura in vitro (ou cultura 
de tecidos) de plantas e transformação genética, com reflexos sobre a agricultura, a indústria 
alimentar, e o meio ambiente. Destaca-se a micropropagação de plantas de interesse econômico-
social e/ou ameaçadas de extinção, e a produção de plantas transgênicas com adaptações para 
diferentes condições de estresse, resistência ao ataque de patógenos, plantas com níveis mais 
reduzidos de compostos alergénicos ou tóxicos, ou com melhores qualidades para armazenamento 
ou processamento, ou ainda melhores qualidades nutricionais, são alguns dos numerosos exemplos 
de aplicações da biotecnologia vegetal. 
 A biotecnologia industrial é o ramo da Biotecnologia voltado para a produção industrial. No 
seu sentido mais amplo, consiste no uso de microrganismos em processos fermentativos visando 
à produção de uma grande variedade de compostos com aplicação em diversos setores da 
economia. Compreende uma alternativa promissora e vantajosa às rotas químicas de obtenção de 
produtos-chave para a saúde humana e animal, agricultura e meio-ambiente, sendo também 
fundamental na produção industrial de diversos tipos de alimentos e bebidas. 
 
Tabela 1. Quadro mostrando a evolução da biotecnologia desde a antiguidade até a presente data. 
Período Descobertas e Avanços 
10.000 – 8.000 a.C. 
Primeiros agricultores no Oriente Médio, Ásia e Américas iniciam o processo de 
domesticação das espécies vegetais. 
4.000 a.C. Indícios mais antigos do uso da fermentação para produção de pão e cerveja. 
1857-65 
Louis Pasteur iniciou os estudos sobre o papel dos microrganismos na fermentação 
e o processo de esterilização, hoje conhecido como “pasteurização”. 
1859 
Charles Darwin publica o livro “Origem das espécies”, no qual dedica um capítulo ao 
estudo dos processos de seleção artificial em animais domésticos. 
1866 
O monge austríaco Gregor Mendel publica seus trabalhos sobre hereditariedade, 
descrevendo como as características são passadas de uma geração a outra. 
Introdução 
 
6 
 
1877 
Moritz Traube propõe que fermentação e outras reações químicas são catalisadas 
por substâncias tipo proteínas, que não são modificadas na reação. 
1900 
A mosca da fruta, Drosofila melanogaster, foi usada nos primeiros estudos de genes 
1906 
1906: surge o termo “genética”. 
1908 
Primeiro híbrido de milho é produzido por George H. Shull, no Instituto Carnegie, 
EUA. 
1914-19 
Necessidade de glicerol para produzir munição (explosivos); óleos vegetais não 
podiam ser importados. Bioquímicos e engenheiros alemães adaptaram processo 
fermentativo com leveduras para converter açúcar em glicerol (> 100 ton/mês) 
1919 O termo Biotecnologia foi cunhado pelo húngaro Karl Ereky. 
1920 Descoberta da Penicilina - Penicillium notatum 
1940 Descoberta das propriedades antibacterianas e produção em escala durante 2ª 
Guerra Mundial, desenvolvimento de biorreatores. 
1944 Descoberto que DNA é a estrutura responsável pela transmissão das informações 
genéticas 
1953 
Watson e Crick descrevem a hélice dupla do DNA, elucidando a estrutura 
tridimensional dessa molécula. Demonstraram mecanismo para a cópia do material 
genético responsável pela perpetuação das espécies. Explosão de pesquisas em 
biologia molecular, com rápido avanço das “técnicas de DNA recombinante” 
(engenharia genética). 
1957 
Francis Crick e George Gamov elaboraram o “dogma central” sobre como funciona o 
DNA para produzir proteínas. Matthew Meselson e Frank Sthal demonstraram 
mecanismo de replicação do DNA. 
1960 
Após décadas de trabalho, Norman E. Borlaug desenvolve o trigo semi-anão 
iniciando a Revolução Verde, que salva milhões de pessoas de morte por fome. 
1961 
Marshall Nieremberg e Gobind Korana decifram o código genético, isto é, convertem 
a informação contida no DNA em uma sequência de aminoácidos da proteína. 
1970 
Howard Temin e David Baltimore isolaram as enzimas de restrição - cortam a 
molécula de DNA em regiões específicas. Abriu caminho para a clonagem molecular 
dos genes com a criação de clones de bactérias.1972 
Paul Berg isolou e empregou uma enzima de restrição para cortar o DNA e a DNA 
ligase para unir duas fitas de DNA e formar uma molécula circular híbrida. Esta foi a 
primeira molécula de DNA. 
1973 
Cohen e Boyer fazem a primeira experiência de engenharia genética unindo dois 
genes de dois organismos diferentes produzindo o primeiro Plasmídeo com DNA 
recombinante, usando enzimas de restrição, o que dá início à biotecnologia 
moderna. 
1977 
Walter Gilbert e Allan Maxam, na Universidade de Harvard e Frederick Sanger, na 
Inglaterra, desenvolveram o método de sequenciamento de DNA. Genentech Inc. 
mostrou a produção da primeira proteína humana (somatostatina) sintetizada em 
uma bactéria. 
1978 Boyer sintetiza a primeira versão recombinante do gene humano da insulina. 
Gentech Inc. anunciou a produção do primeiro biofármaco produzido por bactérias – 
a insulina humana - usando a tecnologia do DNA recombinante em laboratório. 
1982 Produção da primeira planta transgênica, tabaco resistente a antibiótico. 
A Gentech Inc. recebeu aprovação da FDA (Food and Drug Administration) para 
comercializar insulina humana modificada geneticamente. 
1983 Kary B. Mullis desenvolveu a técnica de reação de polimerização em cadeia (PCR) - 
permite amplificar o material genético (genes) em tubos de ensaio. Aprovação de 
patentes de plantas geneticamente modificadas. 
1984 Foi clonado o vírus HIV e seu genoma foi totalmente sequenciado. 
1985 
Primeiros experimentos de campo como plantas transgênicas resistentes a insetos, 
vírus e bactérias são realizados nos EUA. 
1986 
O EPA (United States Environmental Protection Agency) aprovou a liberação da 
primeira planta de tabaco geneticamente modificada. 
Foi produzida a primeira vacina recombinante para humanos contra hepatite B e a 
primeira droga anticâncer produzida por meio da biotecnologia. 
1987 
Calgene Inc. obteve a patente da sequência de DNA da poligalacturonase de tomate 
- usada para desenvolver técnica que aumenta o tempo de vida dos frutos. 
Introdução 
 
7 
 
1990 
Foi lançado o Projeto Genoma Humano. 
1994 
O Primeiro alimento geneticamente modificado (o tomate Flavr Savr) foi liberado 
para comercialização/consumo humano no EUA pelo FDA (Food and Drug 
Administration), tornando-se o primeiro alimento geneticamente modificado a chegar 
às prateleiras dos supermercados americanos. 
1995 O primeiro genoma, o de uma bactéria (Hemophilus influenzae), é completamente 
seqüenciado. 
1995-1996 Variedades transgênicas de soja e milho são aprovadas para liberação comercial 
nos EUA, dando início à rápida adoção desta tecnologia por agricultores em 
diferentes países. 
1996 
Conjuntamente, seis países plantam o primeiro milhão de hectares com 
transgênicos. 
Nasce o primeiro clone de mamífero, a ovelha Dolly, gerada a partir de células 
somáticas adulta de uma ovelha adulta doadora. 
1998 
Descoberta das células-tronco embrionárias humanas. 
Foi sequenciado o primeiro genoma completo de um organismo multicelular, o 
nematoide Caenorhabditis elegans. As pesquisas sobre a biologia molecular e do 
desenvolvimento de C. elegans começaram em 1974 (Sydney Brenner) e o 
organismo tem sido extensivamente usado como modelo animal. 
Quarenta milhões de hectares de culturas geneticamente modificadas são plantadas 
no mundo - predominantemente soja, algodão, canola e milho. Liberação comercial 
da soja transgênica tolerante a herbicida é concedida no Brasil. 
1999 
Cientistas suíços e alemães desenvolvem o arroz dourado, rico em beta-caroteno. 
Precursor da vitamina A, importante na prevenção de alguns tipos de cegueira. 
2000 
Foi sequenciado o genoma da primeira espécie vegetal, Arabidopsis thaliana, 
tornando-se um dos organismos modelo para o estudo de genética, em botânica. O 
conhecimento do papel de cada gene na fisiologia da espécie leva ao conhecimento 
da genética vegetal no seu todo. 
Conjuntamente, 13 países atingem a marca de 25 milhões de hectares plantados 
com variedades transgênicas, um aumento de 25 vezes a área cultivada em 1996. 
2001 
Sequenciamento completo do genoma de bactéria fitopatogênica (Xyllela fastidiosa) 
por consórcio de pesquisadores brasileiros (192 cientistas). Esta bactéria é 
causadora de doenças como a praga do amarelinho (Clorose Variegada de Citros - 
CVC) que afeta laranjeiras. 
Consórcio do Genoma Humano e o grupo Celera publicaram o genoma humano. 
2003 A conclusão do seqüenciamento do genoma humano é anunciada. 
A ovelha Dolly foi submetida a eutanásia após desenvolver um câncer de pulmão. 
2004 Clonado primeiro animal de estimação: um gato. 
Sequenciado o genoma do rato utilizado para pesquisas em laboratório. 
2005 Foi publicado o genoma do cachorro da raça boxer, sequenciado pelo Whitehead 
Institute/MIT Center for Genome Research (WICGR) – atualmente: Broad Institute. 
A identificação de genes levou a compreensão das bases genéticas de doenças 
comuns aos caninos. 
2006 Arroz GM para consumo humano é liberado nos Estados Unidos. 
Uvas geneticamente modificadas são testadas na África do Sul. 
2007 
Cientistas dos EUA anunciam a geração de células-tronco embrionárias a partir de 
células da pele de macacos, o que deverá permitir o desenvolvimento da clonagem 
terapêutica. 
Liberação experimental de cana transgênica com alto teor de açúcar no Brasil pela 
empresa Allelyx/Monsanto. 
Liberação comercial de milho geneticamente modificado resistente a inseto e 
tolerante a herbicida no Brasil. 
2008 
Pesquisadores australianos desenvolvem plantas com altos níveis de um ácido 
graxo para produzir plásticos, tintas e cosméticos. 
Pesquisadores japoneses desenvolvem a primeira rosa azul geneticamente 
modificada. 
Liberação comercial de algodão geneticamente modificado tolerante a herbicida no 
Brasil. 
2009 
Liberação comercial da soja geneticamente modificada tolerante a herbicida e 
algodão resistente a inseto no Brasil. 
Introdução 
 
8 
 
2010 
Craig Venter cria a “célula sintética” a partir de um genoma sintetizado em 
laboratório. Em 20 de Maio de 2010, pesquisadores do J. Craig Venter Institute 
(JCVI), uma organização de pesquisa genômica sem fins lucrativos, publicaram os 
resultados descrevendo a construção bem-sucedida da primeira célula sintética 
bacteriana auto-replicante. A equipe sintetizou o cromossomo do genoma 
modificado de Mycoplasma mycoides. A célula sintética é chamada Mycoplasma 
mycoides JCVI-syn1.0 e é a prova do princípio de que o genoma pode ser projetado 
no computador, quimicamente feito em laboratório e transplantado para uma célula 
receptora para produzir uma célula auto-replicante nova controlada apenas pelo 
genoma sintético. 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 
Almeida, M.R., Borém, A. (2004) Biotecnologia e Saúde. In: Biotecnologia e Saúde. Almeida, M.R., Borém, A., 
Franco, G.R. (Eds). UFV. Cap. 1, p. 9-30. 
Borém, A., Santos, F.R. (2007) Entendendo a Biotecnologia. UFV. 342 p. 
Ferreira, C., Aguiar, J.; Pessanha, L.; Rangel, P.; Berbert-Molina, M.; Flores, V. M. Q. (2009). 
Valverde, S.R., Neiva, S.A., Soares, N.S. (2007) Biotecnologia e Competitividade das Plantações Florestais. 
In: Biotecnologia Florestal. Borém, A. (Ed). UFV. Cap. 17, p. 363-374. 
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/Arabidopsis.html, acesso em 29/08/2011. 
http://www.jcvi.org, acesso em 29/08/2011. 
http://www.jcvi.org. 
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/Arabidopsis.html 
Sasson, A., da Silva, E.J. (1994) Revista O Correio da Unesco, n.8. 
Ferreira, C., Aguiar, J., Pessanha, L., Rangel, P., Berbert-Molina, M., Flores, V. M. Q. (2009). 
Tópicos em Biotecnologia – Material de Consulta. CEDERJ-UENF. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Biotecnologia Animal 
 
 
1
Bolsista UAB. Pós-graduanda em Biociências e Biotecnologia. 
2
Bolsista de extensão. Graduanda em Ciências Biológicas. 
3
Biólogo, Doutor, Professor Associado da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. 
CAPÍTULO 1 - BIOTECNOLOGIA ANIMALAline Martins de Vita1 
Vanessa de Souza Rodrigues2 
Álvaro Fabrício Lopes Rios3 
 
O desenvolvimento de protocolos de biotecnologia utilizando células animais proporcionou a 
obtenção de uma grande quantidade de conhecimento científico a respeito da biologia das mesmas. 
Dois exemplos que devem ser citados são a produção de células iPS (do inglês, induced pluripotent 
stem cells) e a clonagem interespecífica. O conhecimento das redes gênicas que governam a 
pluripotência embrionária através de técnicas de biologia molecular, entre elas a transgenia, permitiu 
que em 2006, um cientista japonês, Shinya Yamanaka, tratasse células diferenciadas (fibroblastos) 
com genes responsáveis pelo estabelecimento e manutenção da pluripotência celular. Esses 
fibroblastos foram “reprogramados” em um tipo celular próximo às células-tronco embrionárias. 
Essas iPS são capazes de se diferenciar em qualquer tipo celular presente em um organismo adulto. 
Outra pesquisa de grande importância é a clonagem de animais ameaçados de extinção 
utilizando oócitos de espécies relacionadas, mas não em risco de extinção (clonagem 
interespecífica). Em geral, o núcleo celular da espécie ameaçada é colocado no citoplasma de um 
oócito de uma espécie com grande número de indivíduos. Essa espécie serve como receptora do 
embrião clonado (um citoplasma e uma barriga de aluguel). Alguns resultados tem sido promissores 
como a clonagem de lobos ameaçados de extinção em oócitos de cães domésticos. Algumas 
espécies de gado selvagem tem sido submetidas a esse tipo de biotecnologia. Recentemente, um 
grupo de pesquisadores de diversos países utilizou material congelado de uma espécie de cabra 
selvagem extinta (Capra pyrenaica pyrenaica) e clonaram em uma receptora doméstica. O animal 
nasceu, mas morreu em seguida. 
 
1. ESTRUTURA DOS GENES 
 
 Os códigos genéticos variam em seu tamanho de acordo com a espécie. Em eucariotos, a 
maioria dos genes são intercalados por sequências não codificadoras denominadas íntrons que são 
eliminados dos RNAs mensageiros (mRNA) recém sintetizados, processo denominado splicing, para 
gerar o mRNA pronto para ser traduzido, que então migra do núcleo para o citoplasma onde ocorre a 
tradução das proteínas. mRNAs maduros são então formados apenas por éxons que se associam 
após os íntrons serem eliminados. 
 Os íntrons podem participar no controle de qualidade de mRNAs no núcleo. Portanto, se sabe 
que a processamento do mRNA maduro ocorre no núcleo para checar a sua funcionalidade. 
Biotecnologia Animal 
 
10 
 
Um códon de terminação seguido por um íntron menor que 50 nucleotídeos é considerado não-
funcional, porém alguns íntrons são tão longos que contem genes funcionais, um exemplo pode 
ser atribuído aos primeiros íntrons localizados na porção 5’ que servem de sítios de ligação para 
fatores de transcrição. Sua presença parece importante por manter um local da cromatina aberta e 
favorecer a transcrição. 
 E ainda, alguns mRNAs não possuem introns. Esse é o caso das histonas e numerosos 
mRNAs virais. Esses RNAs contem sinais que permitem que o mRNA seja transportado do núcleo 
para o citoplasma. 
 A transcrição é controlada por mecanismos complexos que envolvem a ação de proteínas que 
são chamadas de fatores de transcrição, as quais reconhecem sequências curtas específicas de 
DNA (cerca de 12 nucleotídeos). Alguns dos fatores de transcrição se ligam ao DNA e controlam a 
síntese de RNA apenas após ter sido ativado por outros mecanismos celulares como fatores de 
crescimento, hormônios, estresse celular etc. Um determinado fator de transcrição pode participar no 
controle de diversos genes uma vez que ele pode se associar a uma série de fatores específicos 
para cada tipo celular 
Regiões promotoras ou “promotores” estão localizados no sítio de iniciação da transcrição. A 
combinação de fatores de transcrição que se ligam ao promotor determina sua potência e 
especificidade celular. O complexo de transcrição responsável pela síntese de mRNA é formado na 
região promotora. 
Os primeiros promotores encontrados em genomas virais e na maioria dos genes mais 
expressos contem sequências (consensus sequences). Uma região rica em AT (A = adenina; T = 
timina) denominada TATA Box está presente em muitos genes a cerca de -30 bp (pares de base) à 
montante do sítio de iniciação da transcrição. Fatores específicos se ligam ao TATA Box e fazem 
parte do complexo de iniciação da transcrição. 
À montante (upstream) dos promotores e em distâncias variáveis, elementos acentuadores 
(do inglês, enhancers) da transcrição são encontrados na maioria se não todos os genes animais. O 
nome enhancer foi dado a essas regiões regulatórias dos genes uma vez que eles são capazes de 
aumentar a taxa de transcrição global. Estudos recentes mostram que acentuadores não aumentam 
a taxa de transcrição por si só, mas a probabilidade de ocorrer a transcrição. Acentuadores atuam 
aumentando a freqüência do complexo de transcrição estar ativo na célula. Eles geralmente contem 
múltiplos sítios de ligação para fatores de transcrição. O complexo fator de transcrição-DNA interage 
com o complexo de transcrição a uma determinada distância pela formação de um loop que carrega 
o acentuador e o promotor muito próximos. 
Os mRNAs maduros no citoplasma contem regiões diferentes com funções distintas e 
específicas. A região que precede o códon de iniciação denominada região não traduzida 5’ (5’UTR) 
está geralmente envolvida no controle da tradução. 5’UTR ricas em GC não favorecem ou até 
mesmo inibem a tradução enquanto 5’UTR ricas em AU favorecem ou pelo menos não prejudicam a 
Biotecnologia Animal 
 
11 
 
tradução do RNA. Algumas 5’UTR contem regiões regulatórias especiais permitem que um mRNA 
seja traduzido ou não de acordo com o estado fisiológico da célula. 
A região downstream do códon de terminação chamada de região não-traduzida 3’ (3’UTR) é 
relativamente longa em muitos genes, enquanto 5’UTR são geralmente curtas. Algumas 3’UTRs 
contem sequências às quais proteínas se ligam. As 3’UTRs de alguns mRNAs contem sequências 
que formam um complexo com proteínas do citoplasma, direcionando os mRNAs a compartimentos 
celulares específicos. 
Um dos pontos chave da transgênese consiste na construção de genes que sejam expressos 
de forma apropriada quando transferidos aos animais. Os mecanismos que controlam a expressão 
gênica não são totalmente conhecidos e a construção de um gene pode eliminar alguns sinais 
essenciais ou combinar sinais incompatíveis que levarão ao insucesso da transgênese. 
 
2. AS PRINCIPAIS TÉCNICAS DA ENGENHARIA GENÉTICA 
 
 A maioria das mensagens contidas no DNA são lineares. Esse é o caso das mensagens 
genéticas baseadas na sucessão de códons, que definem a ordem dos aminoácidos nas proteínas 
correspondentes. O mesmo pode ser definido em certo grau para as regiões regulatórias. Os sítios 
que ligam fatores de transcrição são compostos de cerca de 12 nucleotídeos adjacentes. Os outros 
sinais também contam com sequências de DNA, tendo cada categoria de sinal seu tipo de linguagem 
específica, sempre baseado no alfabeto de quatro letras ATGC, correspondente às quatro bases do 
DNA. 
2.1. Clonagem do gene 
O primeiro passo consiste na clivagem do DNA em fragmentos que podem variar de poucas a 
muitas centenas de quilobases (kb). Esses fragmentos são introduzidos em vetores bacterianos para 
clonagem. Os diferentes vetores disponíveis foram desenhados para abrigarem diferentes 
comprimentos de DNA. Plasmídeos, cosmídeos, fago P1, BACs (cromossomos bacterianos 
artificiais) e YACs (cromossomos artificiais de leveduras) pode abrigar até 20 kb, 40 kb, 90 kb, 200 kb 
e 1000 kb de DNA, respectivamente. Cada vetor contendo apenas um fragmento de DNA é 
introduzido em uma bactéria, sendo amplificado, formando um clone. 
 A clonagem direta de um fragmento de DNA contendo um determinado gene geralmente nãoé possível. A clonagem do cDNA (DNA complementar) correspondente geralmente é um passo 
intermediário. Para esse propósito, os mRNAs de um tipo celular são re-transcritos em DNA por uma 
transcriptase reversa viral. O DNA fita única obtido dessa forma é então convertido em DNA fita-
dupla por uma DNA polimerase. Os fragmentos de DNA resultante são clonados em plasmídeos para 
gerar um banco de cDNA. Por fim, o clone contendo o cDNA em questão pode ser identificado e 
isolado para o uso na transgênese. 
Biotecnologia Animal 
 
12 
 
2.2. Sequenciamento do DNA 
 O seqüenciamento do DNA consiste em determinar a ordem das bases em um fragmento do 
DNA. Por anos, o seqüenciamento foi realizado por técnicas lentas. Nos dias de hoje, o 
seqüenciamento foi automatizado e ocorre em uma escala industrial. Agora, é possível seqüenciar 
vários milhares de quilobases diariamente, o que é absolutamente necessário para o 
seqüenciamento sistemático dos genomas. Pesquisadores também necessitam de computadores 
poderosos para determinar a estrutura dos fragmentos de DNA que foram isolados, mutados ou 
agrupados. 
2.3. Amplificação gênica in vitro 
 A técnica conhecida como PCR (reação em cadeia da polimerase) para amplificação 
específica de uma região do DNA está entre as mais utilizadas pelos biólogos moleculares. Esta 
técnica consiste da síntese da fita complementar de uma região do DNA iniciada a partir de um 
iniciador primer. O primer é um oligonucleotídeo composto de aproximadamente 15-20 nucleotídeos, 
os quais são quimicamente sintetizados e reconhecem especificamente a região do DNA escolhida. 
O oligonucleotídeo é alongado por uma DNA polimerase bacteriana, gerando uma fita de DNA 
complementar, a qual o primer é ligado. Na maioria dos casos, dois primers que reconhecem 
seqüências diferentes de ambas as fitas do DNA são usadas simultaneamente. Assim, dá-se início a 
síntese de um DNA dupla fita correspondendo a região localizada entre os dois primers. Regiões de 
DNA de 1 kb são comumente usadas. Fragmentos de até 20-40 kb podem ser sintetizados 
especificamente sobre condições otimizadas. Após cerca de 30 ciclos de amplificação, milhares de 
cópias da sequência de DNA estão presentes no tubo iniciadas a partir de uma única cópia. Isso 
permite a identificação de uma região específica do DNA genômico. Essa técnica é então utilizada 
para tipagem genômica, mas também para identificar indivíduos. Ela tem se tornado comum na 
prática de determinação de paternidade e identificação de assassino. PCR também é uma técnica 
essencial para mutação de fragmentos de DNA in vitro e para construção de genes funcionais a partir 
de vários fragmentos de DNA. 
2.4. Construção gênica 
 O estudo de genes requer a construção de genes funcionais a partir de vários elementos. 
Esses elementos podem ser regiões regulatórias, mas também regiões transcritas. Eles podem estar 
em sua estrutura nativa ou mutados experimentalmente. Isto pode ajudar a identificar as regiões 
regulatórias que controlam a expressão gênica. As regiões codificantes podem ter sua estrutura 
nativa. A construção pode então ser usada para estudar o efeito do gene nas células ou organismos 
inteiros. As regiões transcritas podem conter um gene repórter que codifica uma proteína que pode 
ser facilmente visualizada ou quantificada por sua atividade enzimática específica. Isto revela em 
quais células e em que proporção o gene repórter é expresso. 
Biotecnologia Animal 
 
13 
 
 A engenharia genética também pode ser usada numa escala industrial para reprogramar 
células ou organismos inteiros para produzir DNAs recombinantes de interesse farmacêutico e para 
prevenir a rejeição imunológica de órgãos transplantados. 
 Em todos os casos, os genes devem ser construídos experimentalmente. A construção gênica 
contem pelo menos uma região promotora, uma região transcrita e um terminador da transcrição. O 
gene construído é, então inserido um vetor de expressão. 
 A construção de um gene implica no uso de enzimas de restrição, as quais clivam o DNA em 
sítios específicos, a síntese química de oligonucleotídeos, a amplificação in vitro de fragmentos de 
DNA por PCR e a associação covalente dos diferentes fragmentos de DNA por uma ligase. Na 
maioria das vezes, esses fragmentos são adicionados em plasmídeos, que são transferidos para o 
interior de bactérias. Os clones bacterianos são selecionados e amplificados. 
 A escolha dos elementos a serem adicionados na construção gênica depende do objetivo do 
experimento e particularmente do tipo celular no qual o gene em questão deve ser expresso. O 
código genético é universal mesmo se alguns códons são mais utilizados em um determinado tipo 
celular que outros. O código que define a atividade das seqüências regulatórias é específico a cada 
tipo de organismo. O promotor de um gene bacteriano não está ativo em uma célula vegetal ou 
animal, assim como o contrário. 
2.5. Transferência do gene 
 Um gene isolado pode ser transcrito in vitro e seu mRNA pode também ser traduzido em um 
sistema sem célula. Isto permite aos pesquisadores que possuem uma quantidade muito pequena de 
proteínas, tornar essa quantidade suficiente para estudos bioquímicos. Essa técnica é insuficiente 
para um número de estudos, tal como determinar a atividade biológica da proteína in vivo ou 
determinar sua estrutura por cristalização. 
Para ser decodificado e traduzido em uma proteína, um gene deve ser transferido para dentro 
da célula, a qual, por natureza, contem todos os fatores para transcrição e tradução. A membrana 
plasmática de diferentes tipos celulares possui uma barreira que permite um carregamento seletivo 
de compostos. Em alguns casos, as moléculas entram nas células através de poros que são abertos 
ou fechados de uma forma controlada. 
Carreadores específicos podem também transportar determinadas moléculas a serem 
transferidas para dentro da célula. Em outros casos, a molécula reconhece receptores específicos do 
lado de fora da membrana plasmática e o complexo formado modifica a membrana localmente, 
levando a uma internalização do complexo e da membrana ao redor. Esse processo é chamado de 
endocitose. 
O DNA é uma molécula grande e carregada negativamente e, portanto, não pode atravessar 
espontaneamente a membrana plasmática. Essa é uma forma das células de se protegerem do DNA 
estranho que pode estar na vizinhança. Oligonucleotídeos adicionados ao meio de cultura ou 
Biotecnologia Animal 
 
14 
 
injetados em animais podem entrar nas células em condições em que eles estão presentes em 
concentração relativamente alta. 
Várias técnicas foram desenhadas para forçar o DNA a entrar nas células e atingir seu 
núcleo. Essas diferentes formas de transferir o gene para dentro das células foram agrupadas e 
denominadas transfecção. 
 
3. TÉCNICAS PARA TRANSFERÊNCIA NUCLEAR (CLONAGEM) E TRANSGÊNESE 
3.1. Clonagem 
3.1.1. As principais etapas da diferenciação 
A clonagem é, por definição, a reprodução de uma célula e, de forma mais geral, de um 
organismo inteiro sem qualquer modificação de seu genótipo. Esse fenômeno ocorre amplamente na 
natureza uma vez que bactérias e fungos se reproduzem de acordo com esse processo. A mesma 
situação é encontrada em células somáticas de organismos pluricelulares, com exceção daquelas do 
sistema imune que sintetizam anticorpos e receptores T. Um número de plantas pode se multiplicar 
independentemente da reprodução sexuada. Estacas são estratégias utilizadas pelos jardineiros para 
a reprodução de muitas plantas e os organismos resultantes são clones. 
Nenhum fenômeno desse tipo foi observado em vertebrados. Os mecanismos de 
desenvolvimento em plantas e animais são bem diferentes. Isso explica por que a clonagem em 
plantas pode ser obtida a partir do simples prolongamento do estado diferenciado, enquanto para 
animais isso não ocorre. Em animais superiores, sabe-se que a célulainicial do zigoto formada logo 
após a fertilização é totipotente. Isso significa que a célula pode gerar todas as células daquele 
organismo. O mesmo acontece para duas ou quatro células do início do embrião em 
desenvolvimento. Essas células podem se desenvolver em um organismo vivo se introduzidas na 
zona pelúcida de um oócito. Essas células, portanto, ainda são totipotentes. Após esse estágio, as 
células embrionárias começam a perder a totipotência e se tornam pluripotentes. Essas células, 
conhecidas como blastômeros, não são diferenciadas. Essas células perdem a capacidade de gerar 
um organismo vivo após serem transferidas para a zona pelúcida. 
Após alguns dias, dependendo da espécie, o embrião, conhecido como blastocisto, pode ser 
dividido em duas categorias de células: a) as células que formam uma camada unicelular ao longo da 
zona pelúcida, que dará origem à placenta e; b) as células que formam um bloco compacto, 
conhecido como massa de células internas, que é precursor do próprio embrião. 
 
3.1.2. Clonagem por transferência nuclear 
Cerca de 40 anos atrás, a clonagem de uma rã (Rana pipiens) e de um sapo de laboratório, 
(Xenopus laevis), foi realizada por uma técnica que foi essencialmente a mesma usada para gerar a 
ovelha Dolly. 
Biotecnologia Animal 
 
15 
 
A técnica é baseada em uma simples ideia. O citoplasma do oócito deve ser capaz de 
favorecer ou induzir totipotência na célula. Na verdade, o núcleo espermático é inativado em nível 
transcricional. O DNA espermático é coberto por proteínas básicas, as protaminas, e a cromatina é 
amplamente condensada. Logo após a fertilização, o núcleo espermático é descondensado. 
Protaminas são substituídas por histonas, levando a ativação progressiva do genoma alguns dias 
depois, dependendo da espécie. O citoplasma do oócito assim tem uma capacidade forte de 
reprogramar o genoma para o desenvolvimento do embrião. Muitos genes são requeridos para o 
desenvolvimento do embrião e a expressão massiva de genes é observada em células totipotentes e 
pluripotentes. Não se conhece até que ponto a expressão de todos esses genes é requerida no início 
do embrião. Sabe-se que a diferenciação é acompanhada e provavelmente causada por uma 
extinção seletiva de genes específicos e pela ativação de outros. Isso leva a um padrão de 
expressão que caracteriza cada célula diferenciada. 
Núcleos isolados de células embrionárias de Xenopus foram transferidos por 
micromanipulação em citoplasmas de oócitos enucleados. A enucleação é indispensável para 
eliminar o genótipo do oócito e prevenir que embrião se torne triplóide após a transferência de um 
núcleo diplóide. A enucleação ocorreu por aspiração usando uma micropipeta. Esses experimentos 
pioneiros não tiveram sucesso. Foi postulado que isso se deve a utilização de um núcleo isolado, que 
pode ter perdido componentes essenciais durante o processo de micromanipulação. 
Uma outra estratégia foi utilizada. Ela consistia na injeção de uma célula embrionária diplóide 
entre a zona pelúcida e a membrana plasmática do oócito enucleado. Esse primeiro passo foi 
seguido pela fusão das membranas plasmáticas da célula e do oócito. Isso foi alcançado por 
submeter o material a um campo elétrico alternativo. Esse tratamento desestabiliza as membranas 
celulares, as quais espontaneamente se fundem sob essas condições. O núcleo da célula é então 
transferido para o citoplasma do oócito sem qualquer micromanipulação. O campo elétrico tem outra 
função que é essencial. A fertilização não é só a transferência do genoma do esperma no oócito. O 
esperma também contem fatores que induzem o transporte de cálcio pelo oócito. Este é um sinal 
essencial para levar ao desenvolvimento do embrião. O campo elétrico cria poros na membrana do 
oócito, tornando possível que o cálcio no meio entre na célula. Isso mimetiza a ativação do oócito 
pelo esperma. O embrião reconstituído pode assim iniciar seu desenvolvimento (Figura 1). Xenopus 
foi clonado dessa forma há 40 anos atrás. 
 
 
 
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16 
 
 
Figura 1: Princípios da clonagem animal por transferência nuclear (Modificada de Houdebine, 2003). 
 
Cerca de 15 anos atrás, parecia importante estender a técnica de clonagem para animais de 
fazenda para acelerar a seleção genética como era o caso das plantas. O protocolo definido para 
Xenopus também foi utilizado em ovelha e os cordeiros clonados foram obtidos dessa forma. 
A taxa de sucesso desses experimentos foi e ainda é baixa, e foi levemente melhorada ao 
longo dos últimos 15 anos. Cerca de 1 % dos embriões reconstituídos por transferência nuclear deu 
origem a animais normais. Esse número é insuficiente para acelerar a seleção genética. Na verdade, 
o genótipo do embrião do qual as células doadoras foram isoladas não é conhecido. Apenas o 
genótipo e o fenótipo de seus progenitores são conhecidos. 
Para melhorar os resultados da clonagem, protocolos modificados foram adotados, mas com 
sucesso moderado. Uma das razões pela qual a clonagem falha tão frequentemente pode resultar da 
discordância entre os estágios do ciclo de divisão das células doadoras e os oócitos recipientes. Na 
verdade, é fácil imaginar que uma célula doadora na fase mitótica não entregue seus cromossomos 
ao oócito recipiente de uma forma apropriada. A fase da célula doadora é desconhecida na maioria 
dos casos e a transferência nuclear gera provavelmente embriões não viáveis. 
Um número crescente de estudos está progredindo para descrever os fenômenos que são 
regularmente observados após a clonagem. Uma das descobertas mais marcantes é a discrepância 
entre o número de blastocistos obtidos após a transferência nuclear seguido pelo desenvolvimento in 
vitro e o número de recém-nascidos que sobrevivem. Outra descoberta surpreendente é o grande 
Biotecnologia Animal 
 
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número de abortos tardios que ocorrem após a transferência nuclear e a morte de cerca de 40 % dos 
fetos e recém-nascidos. Diversas anormalidades são comumente observadas, tais como grande 
embrião com uma placenta pouco desenvolvida. Outras observações têm sido constatadas como: 
aplasia tímica, atrofia do rim, flutuações da temperatura corporal, hipertrofia do fígado ou do coração, 
concentração alta de leptina, imunossupressão parcial etc. 
3.2. Transgênese 
 
3.2.1. Os objetivos e o conceito de transgênese ani mal 
A transgênese consiste da introdução de uma sequência exógena de DNA no genoma de um 
organismo pluricelular que então se torna presente na maioria das células e é transferida para a 
progênie. A palavra transgênese é, portanto, restrita a plantas e animais. Leveduras, bactérias e 
células cultivadas carregando um fragmento de DNA externo são conhecidas como células 
recombinantes ou transformadas. 
A transgênese é, portanto, diferente da terapia gênica. Na verdade, no último caso, as células 
germinativas não abrigam o DNA externo. A expressão terapia gênica germinativa é também 
utilizada. Ela designa uma terapia que ainda não foi tentada em humanos e que implica que o gene 
externo esteja contido nas células germinativas e transmitido para a progênie. 
Os fragmentos de DNA usados para gerar organismos transgênicos são, na prática, quase 
sempre os genes contem uma sequência precedida por um promotor que direciona sua expressão 
em um RNA e geralmente em uma proteína. No entanto, é fácil imaginar que o DNA externo é 
desprovido da capacidade de ser transcrito e que sua presença é desejável, mas não a de seu 
transcrito. 
O transcrito do gene pode ser um RNA não traduzido em uma proteína. Esse é o caso do 
RNA antisentido, das ribozimas e dos genes transcritos pela RNA polimerase I e III. 
O objetivo da transgênese é adicionar informação genética exógena a um genoma ou 
também suprimir um gene endógeno. Em alguns casos, a substituição de gene funcional por outro 
gene funcional é desejada. O gene exógeno pode ser um mutante do geneendógeno ou um 
completamente diferente. 
A adição de um gene pode ser realizada para fornecer ao organismo uma proteína. Isso pode 
resultar na extinção de um gene endógeno. A adição de um gene pode ser usada para estudar o 
mecanismo de ação de um promotor no organismo inteiro. A associação de genes repórter com 
promotores é geralmente a regra para esse método. 
A substituição do gene é principalmente utilizada para inativar um determinado gene. Na 
prática, ela consiste da substituição do gene endógeno por um mutante inativado. Espera-se que 
essa técnica dê informação sobre a função biológica do gene, como no caso da adição do gene. Na 
verdade, tanto a adição gênica quanto a inativação podem induzir modificações em animais 
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transgênicos, as quais podem ser observadas ou medidas. Mutantes do gene substituído podem 
fornecer informação de uma forma mais sutil. 
O DNA exógeno deve atingir o núcleo da célula para se tornar integrada ao seu genoma. O 
destino do DNA exógeno não é o mesmo dependendo se ele foi introduzido no citoplasma ou 
diretamente no núcleo. 
O DNA transferido em células cultivadas está geralmente na forma de um plasmídeo circular. 
O plasmídeo é clivado pela DNAse citoplasmática em sítios aleatórios. A principal parte do DNA é 
destruída no citoplasma. Uma pequena parte migra para o núcleo, onde ele pode ser transcrito. 
Dessa forma, o DNA exógeno é instável e é eliminado assim que as células se dividem. Uma 
pequena proporção do DNA exógeno se torna integrado no genoma. Durante a transferência do 
citoplasma para o núcleo, os fragmentos de DNA exógeno se associam para formar polímeros 
chamados concatâmeros. No citoplasma, as associações covalentes dos fragmentos do DNA 
ocorrem aleatoriamente, gerando algumas vezes genes rearranjados em sequência ou posição 
cabeça-cauda. 
 
3.2.2. Transferência do gene nos gametas 
Parece lógico transferir genes em gametas para gerar animais transgênicos. A fertilização 
então traz o DNA exógeno para todas as células do embrião e do adulto. Assim, os primeiros animais 
transgênicos foram obtidos por transferência do DNA em embriões no estágio de primeira célula. 
 
3.2.2.1. Transferência do gene no esperma 
 O esperma maduro tem um genoma inativo que não se replica. Seu DNA é coberto por 
protaminas deixando pouco acesso para o DNA exógeno no genoma do esperma. O DNA exógeno 
não tem chance de se integrar ao DNA do esperma. 
 Experimentos realizados há uma década, o qual provou ser fracamente reproduzível, mostrou 
que o esperma incubado na presença de DNA poderia carregá-lo para o oócito durante a fertilização, 
levando a geração de camundongos transgênicos. Estudos bioquímicos mostraram que o DNA se 
liga prontamente ao esperma, mas ainda não foi provado se isso foi seguido pela sua integração. O 
esperma então desempenha a função de um veículo para o DNA exógeno. 
Após vários anos esse método foi estendido para vacas, porcos, ovelhas e ao peixe-arroz (Oryzias 
latipes). Em todos esses casos e por razões desconhecidas os experimentos pareceram ser 
fracamente reproduzíveis. Além disso, na maioria dos casos, o DNA exógeno integrado no genoma 
do hospedeiro foi amplamente rearranjado. Um estudo revelou que até mesmo após uma lavagem 
cuidadosa, o esperma contem DNAse, que degrada o DNA exógeno. A DNAse é abundante no 
plasma seminal e quantidades variáveis da enzima permanece ligada ao esperma, explicando por 
que o experimento não foi reproduzível e por que o DNA exógeno foi fragmentado. Também é 
interessante observar que o DNA exógeno parece induzir a atividade da DNAse no esperma isolado. 
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Uma possível interpretação para esse fenômeno é que a DNAse é um meio de proteger o esperma 
da contaminação por DNA exógeno do epidídimo ao oócito. 
 
4. APLICAÇÕES DA TRANSGÊNESE 
 
A transgênese é mais utilizada por pesquisadores, mas também pela indústria para diferentes 
propósitos. Por uma questão de conveniência, é possível dividir as aplicações da transgênese animal 
em três categorias. A primeira, e a principal, razão para utilizar animais transgênicos é para obter 
informação fundamental sobre os organismos vivos e as doenças humanas. A segunda razão é usar 
animais como uma fonte de proteínas farmacêuticas, células e órgãos. A terceira é melhorar a 
produção animal. 
4.1. Estudos básicos 
 A grande maioria dos animais transgênicos é gerada para ser usada como modelos para o 
estudo da função gênica e mecanismos de ação. A tendência neste campo é usar animais de uma 
forma integrada e crescentemente sistemática. Laboratórios especiais pertencentes às universidades 
ou a companhias privadas geram animais transgênicos experimentais (camundongos, C. elegans, 
Drosophila) pela adição ou substituição de um gene. Nesses casos, os genes usados são 
conhecidos e os pesquisadores precisam de animais transgênicos para avaliar uma hipótese sobre a 
função ou mecanismo de controle de seus genes. 
 Um método mais recente consiste do “knocking out” (bloqueio) de genes de animais em 
laboratório sem qualquer hipótese particular sobre sua função. Bancos de animais com um gene 
bloqueado por recombinação homóloga ou “gene trapping” estão disponíveis para pesquisadores e 
companhias. Esse método sistemático e o completo seqüenciamento dos genomas dos animais 
podem fornecer a melhor chance de obter o máximo de informação de forma rápida sobre a função 
do gene. 
4.2. Estudo de doenças humanas 
 Os métodos descritos acima para estudar a função do gene são também amplamente usados 
para estudar doenças humanas. Na verdade, um gene envolvido em uma doença humana pode ser 
adicionado ou especificamente inativado em camundongos. Os modelos obtidos dessa forma podem 
auxiliar os pesquisadores com animais experimentais sem valor científico a descrever doenças 
humanas e avaliar os efeitos terapêuticos de compostos químicos, proteínas recombinantes ou 
genes transferidos a tecidos de pacientes. 
O camundongo é a espécie mais comumente usada para esse propósito. Embora satisfatório 
em muitos casos, o camundongo não mimetiza algumas das doenças humanas. Isso ocorre devido 
ao fato de o camundongo ser um roedor e não um primata e algumas funções biológicas serem 
diferentes em camundongos e humanos. Um exemplo marcante é a fibrose cística. Essa doença 
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humana é essencialmente causada por mutações do gene CFTR. Camundongos cujo gene CFTR foi 
bloqueado não desenvolve a doença. Sabe-se que a ação do canal de cloro CFTR não mais 
funcional é compensada pelo efeito de outro gene que não possui o mesmo padrão de expressão em 
humanos. 
Muitos camundongos transgênicos são modelos candidatos para o estudo de doenças 
humanas, sejam elas genéticas ou infecciosas. Na prática, apenas um número limitado de 
camundongos parece relevante. Isso ocorre devido o fato de o transgene ou gene bloqueado nem 
sempre gere uma doença que se assemelha a patologia humana. O background genético do 
camundongo é também muito importante. Isso, às vezes, implica que a modificação genética obtida 
em uma linhagem de camundongo tem que ser transferida para outra linhagem por cruzamento. 
4.3. Produção farmacêutica 
 Todas as comunidades humanas estão em busca de substâncias que combatam doenças. 
Originalmente, extratos de plantas naturais desempenhavam esse papel. Esse método ainda é muito 
popular. A emergência da química tornou possível determinar a estruturas das moléculas ativas nos 
extratos vegetais e, em alguns casos, obter essas moléculas ou análogos através da síntese 
química. O caso da aspirina é ilustrativo. Extrato de folhas de salgueiro foi amplamente utilizado até 
que se descobriu que seu composto ativo é o ácido salicílico. A síntese química de um análogo, o 
ácido acetilsalicílico, conhecido como aspirina, foi alcançada no início do século XX. Esse protocolo 
ainda é utilizadopara preparar drogas muito eficientes. 
A engenharia genética tem contribuído muito nesse aspecto. Um gene que codifica uma 
proteína de interesse farmacêutico pode ser isolado, inserido em um vetor de expressão e transferido 
para células ou organismos que se tornam produtores da proteína em escala industrial. 
Isso foi conseguido pela primeira vez com a insulina humana, que foi preparada a partir de 
uma bactéria geneticamente modificada há 15 anos. A maioria dos diabéticos é agora tratada com 
insulina recombinante e não mais com insulina extraída do porco. O hormônio recombinante tem 
maior grau de pureza e é estruturalmente idêntico à insulina nativa humana. 
Algumas observações levaram ao uso de células animais geneticamente modificadas como a 
fonte de proteínas recombinantes. Essa técnica é usada com sucesso para preparar proteínas em 
escala industrial. Anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de linfócitos B imortalizados 
cultivados in vitro conhecidos como hibridomas. Sua produção continua limitada e muitos hibridomas 
são geneticamente instáveis e perdem os genes que codificam os anticorpos. 
A produção de proteínas recombinantes a partir de células é uma realidade, mas esse 
processo tem sua limitação. Quantidades de proteínas que não excedem alguns quilogramas por ano 
podem ser preparadas a partir de células com um custo moderado. Outra técnica possível é usar 
células animais em organismos vivos. As vantagens são que as células são tão numerosas quanto 
requeridas e mantidas em condições metabólicas ideais. Essa possibilidade foi levantada pela 
primeira vez em 1982, quando o primeiro camundongo expressando seu transgene em um nível 
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elevado foi obtido. Esses animais carregando o gene do hormônio de crescimento de rato ou humano 
exibiram crescimento acelerado e alguns deles tiveram uma concentração alta de hormônio de 
crescimento no seu sangue (acima de 50 µg/mL). Esse fato originou a ideia de que o sangue de 
animais transgênicos poderia ser uma fonte de proteínas recombinantes. 
 4.4. Melhoramento genético 
 A seleção genética é um dos métodos principais usados para melhorar a produção animal. 
Essa técnica tem se tornado mais poderosa desde a descoberta das leis da hereditariedade e ainda 
vem sendo melhorada pelo uso de marcadores genéticos. Com a transgênese, se espera gerar 
mutantes de interesse que não poderiam ser obtidos pela seleção clássica, pelo menos dentro de um 
intervalo de tempo considerável. 
A transgênese em plantas, que é baseada somente na adição do gene por razões técnicas e, 
em hipótese alguma, na substituição do gene, tem gerado algumas novas variedades amplamente 
apreciadas por agricultores. O mesmo é teoricamente possível para animais. Na prática, isso é 
parcialmente verdadeiro. Na verdade, a transgênese é ainda mais complexa e custosa em animais 
do que em plantas. Além disso, a introgressão das características genéticas introduzidas pelos 
transgenes pode não ser um processo rápido, até mesmo se a clonagem dos fundadores é 
implementada. O número de repetições possíveis em animais é e continuará sendo menor em 
animais do que em plantas. Os genes candidatos para melhorar a produção animal por transgênese 
deve, portanto, ser cuidadosamente selecionados. 
 
5. GENES CANDIDATOS QUE PODEM MELHORAR A PRODUÇÃO A NIMAL 
 
Resistência a doenças: Na agricultura, mais de 40 por cento do que é colhido pode ser 
perdido com resultado de diferentes doenças. No melhoramento, a perda pode atingir 20 por cento. 
Os genes capazes de prevenir doenças em animais são teroricamente muito diversos. Esses genes 
podem inibir a infecção ou replicação. Alguns alelos naturais são conhecidos por proteger os 
indivíduos contra doenças. Esses genes são raramente identificados. O estudo sistemático do 
genoma de animais de fazenda contribuirá progressivamente para identificar esses genes, que 
podem ser transferidos para animais da mesma espécie e, possivelmente de outra espécie para 
protegê-los contra determinada doença. 
Digestão e metabolismo: Otimizar a digestão em animais de fazenda pode ter diversas 
vantagens. Ela pode diminuir o risco de rejeição e poluição, reduzir o consumo de alimento e 
acentuar a produção. Modificações metabólicas podem gerar animais melhores adaptados à 
alimentação disponível ou de baixo-custo. 
Composição do leite: O leite é fonte de cerca de 30 por cento das proteínas consumidas por 
humanos em países desenvolvidos. A produção de leite tem sido melhorada pela seleção e 
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alimentação otimizada. A composição do leite foi levemente modificada. A concentração lipídica foi 
essencialmente acentuada. 
 
6. APLICAÇÕES DA CLONAGEM 
 
A clonagem oferece a oportunidade única de obter células totipotentes a partir de células 
totalmente diferenciadas. A clonagem é, portanto, um novo e atraente modelo experimental para 
estudar os mecanismos responsáveis pela desdiferenciação e diferenciação celular. A clonagem 
também é um novo método de reprodução animal e potencialmente de reprodução humana, 
produzindo indivíduos geneticamente idênticos a um adulto. Aplicações potenciais foram 
desenvolvidas para melhor controlar a reprodução animal e humana. Hoje, se sabe que a 
transgênese é em alguns casos, facilitada pela clonagem. Um número de doenças poderia ser 
curado pela terapia celular. Isso implica que células meristemáticas estão disponíveis para regenerar 
tecidos lesionados. Células meristemáticas embrionárias podem ser obtidas por clonagem e células 
meristemáticas de órgãos podem ser derivadas de células meristemáticas embrionárias. Portanto, 
teoricamente, a clonagem poderia contribuir para a terapia celular por autografting. Na prática, essas 
aplicações ainda são iniciais e algumas delas podem não se tornar realidade devido a problemas 
técnicos ou éticos. 
6.1. Estudos básicos 
 O nascimento da ovelha Dolly demonstrou que a composição genética de células 
diferenciadas é essencialmente a mesma de um embrião. A evidência de que o genoma de uma 
célula adulta pode gerar um embrião foi confirmada. 
 Uma das principais questões levantadas pela clonagem é conhecer como os numerosos 
genes que são silenciados em células diferenciadas podem ser reativados para participar do 
desenvolvimento do embrião. Esse processo raramente ocorre devido à constante baixa eficiência da 
clonagem. As razões para numerosas falhas são desconhecidas. É convincente que um determinado 
número de genes em células diferenciadas seja mutado e inativado. O desenvolvimento do embrião 
pode ser prejudicado se genes essenciais não requeridos para sobrevivência da célula adulta não 
funcionem mais. 
 Um fator é marcante. A maioria dos animais clonados incapazes de sobreviver após o 
nascimento apresenta síndromes repetidas, algumas delas são similares a determinadas doenças do 
desenvolvimento humano. Isso sugere que o mesmo grupo de genes não é funcional nos clones. 
Esse fato é consistente com mutações genéticas aleatórias em células adultas usadas como 
doadoras nucleares. 
 Estudos recentes sustentam fortemente a ideia de que animais clonados são modificados 
epigeneticamente. Na verdade, o DNA é metilado anormalmente em embriões gerados pela 
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clonagem e não por fertilização normal. Subsequentemente, muitos genes não são reativados pela 
desmetilação do DNA e indisponibilizados para o desenvolvimento do embrião. Uma identificação 
sistemática dos genes metilados em clones que se desenvolvem normalmente ou não poderia 
explicar porque tantos clones são anormais. Esse estudo poderia revelar a função de alguns genes 
na organogênese. Isso não implica necessariamente que a metilação do gene nos clones poderia ser 
controlada e que isso acentuaria os resultados da clonagem. A metilação do DNA parece ser um 
processo sutil, que pode não ser facilmente modificado em alguns