Relátorio - Coloração de Gram

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Universidade do Estado do Pará 
 Núcleo Universitário de Cametá-Campus XVIII 
 Centro de Ciências Sociais e Educação 
 Departamento de Ciências Naturais 
 Licenciatura Plena em Biologia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Vanielson de Jesus Ramos dos Prazeres 
 
 
 
 
 
 
VISUALIZAÇÃO DE BACTÉRIAS CORADAS ATRAVÉS DO MÉTODO DE 
COLORAÇÃO DE GRAM 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cametá 
2018 
 
Vanielson de Jesus Ramos dos Prazeres 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VISUALIZAÇÃO DE BACTÉRIAS CORADAS ATRAVÉS DO MÉTODO DE 
COLORAÇÃO DE GRAM 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório apresentado como requisito parcial para 
obtenção de nota da 2ª avaliação da disciplina de 
Agentes Infecciosos e Parasitários do curso de 
Licenciatura Plena em Ciências Naturais da 
Universidade do Estado do Pará, sob orientação 
da Prof.ª. Dra Jéssica Herzog Viana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cametá 
2018 
INTRODUÇÃO 
A coloração em técnicas tintoriais é empregada para facilitar os estudos microbianos, 
bem como a visualização destes ao microscópio. Ela é de importância fundamental na 
microbiologia, pois os microorganismos não tratados têm pouca diferenciação óptica. Os 
corantes utilizados atuam fixando-se eletiva ou seletivamente em determinadas estruturas 
celulares, conferindo a elas diferentes graus de absorção da luz incidente, e possibilitando a 
identificação e o estudo de suas alterações por nosso sentido de visão, auxiliado pelo 
microscópio (MATIAS & MARTINS, 2006). 
A maioria das técnicas de colorações usadas em estudos bacteriológicos têm o intuito 
de diagnosticar previamente determinado processo infeccioso, além de uma antecipada 
avaliação da qualidade amostral (OPLUSTIL et al. 2000). 
A coloração de Gram é o procedimento bacterioscópico mais importante e mais 
utilizado na atualidade para visualização de bactérias. Esse método de coloração foi 
desenvolvido, em 1884, pelo médico patologista dinamarquês Hans Christian Joachim Gram 
(1853-1938) e possibilita a classificar as bactérias em dois grandes grupos, as gram-positivas 
e as gram-negativas, com base na cor que estas adquirem após serem tratadas com substâncias 
químicas específicas (TORTORA et al. 2003; TORTORA, 2005). 
A técnica baseia-se em fixar, através do calor, um esfregaço bacteriano e tratá-lo com 
um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol, além de 
etanol e fucsina básica. As bactérias que adquirem a coloração vermelha são chamadas de 
Gram-negativas e aquelas que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-
positivas (TORTORA et al. 2003). 
 
MATERIAL 
Para o desenvolvimento da atividade, utilizou-se os seguintes materiais e 
equipamentos: 
▪ Hastes flexíveis com ponta de algodão hidrófilo (cotonetes); 
▪ Lâminas de vidro para microscopia; 
▪ Caneta para escrever em vidro; 
▪ Solução de cristal violeta constituída por 1g de cristal violeta, 10mL de álcool a 95º GL, 2g 
de fenol e 100mL de água destilada; 
▪ Solução de iodo, conhecida como solução de Lugol. É constituída por 1g de iodo metálico, 
2g de iodeto de potássio e 300mL de água destilada; 
▪ Álcool a 95º GL; 
▪ Solução de fucsina constituída por 30mg de fucsina básica, 10mL de álcool a 95º GL, 
500mg de fenol e 90mL de água destilada; 
▪ Pia com torneira; 
▪ Recipiente ou suporte descartável para recolher os resíduos de corante (lata de leite em pó 
ou equivalente); 
▪ Frasco com água; 
▪ Bico de Bunsen ou lamparina a álcool; 
▪ Papel-toalha; 
▪ Microscópio óptico com lente objetiva com capacidade de aumento de 100 vezes; 
▪ Óleo para imersão ou óleo mineral. 
 
MÉTODOS 
Esta aula foi ministrada pela Prof. Dra. Jéssica Viana no dia 10 de agosto de 2018, 
referente à disciplina: Agentes Infecciosos e Parasitários, ofertada no oitavo semestre do curso 
de Ciências Naturais - Biologia, da Universidade Estadual do Pará. Para que os discentes 
pudessem obter melhores resultados a turma foi dividida em dois grupos e horários diferentes, 
sendo que a primeira foi das 18:00 até 20:00 h, e a segunda das 20:00 às 22:00 h. Esta prática 
em laboratório teve como objetivos confeccionar esfregaços e fixá-los a partir de uma amostra 
bacteriana e visualizar, com o auxílio do microscópio, os micróbios corados de modo a 
classificar as bactérias de acordo com a técnica de coloração Gram. 
Os procedimentos metodológicos se deram das seguintes formas: 
Etapa 1: Coleta do material para observação e preparo do esfregaço na lâmina de vidro. 
Esfregou-se firmemente a ponta de algodão de uma haste flexível na gengiva e, com 
este material, fez-se um esfregaço no centro de uma lâmina de vidro, previamente 
desengordurada e marcada na face contrária àquela onde o esfregaço seria feito, conforme as 
Figuras 1; A e B. Em seguida eixou-se exposta ao ar, até o esfregaço secar. 
 
 
 
Figura 1: Coleta do material para observação e preparo do esfregaço na lâmina de vidro. 
 
(a) Passando a haste algodonosa na gengiva; (b) fazendo o esfregaço na lâmina, no lado 
contrário à marcação. 
 
Etapa 2: Fixação, à lâmina, do material a ser examinado. 
Passou-se a lâmina pela face oposta ao esfregaço sobre uma chama, tendo o cuidado 
de não torrar o esfregaço. Incidiu-se a lâmina três vezes pela ponta da chama, rapidamente, 
para que a lâmina ficasse levemente aquecida. 
Etapa 3: Coloração primária do material. 
Inicialmente colocou-se a lâmina nivelada sobre um suporte que permitia recolher o 
líquido que nela era depositado, com o material fixado voltado para cima. Com isso, gotejou-
se a solução de cristal violeta de maneira a cobrir todo o esfregaço e, em seguida, deixou-se 
corar por um minuto. Depois disso, escorreu-se o corante para dentro do suporte e voltou-se a 
lâmina para a mesma posição. Posteriormente, gotejou-se sobre o esfregaço a solução de lugol 
e deixou-se reagir durante um minuto, depois de completar o tempo, escorreu-se o lugol no 
suporte. Deixando a lâmina inclinada, gotejou-se o álcool de forma a lavar o resíduo de 
corante, escorrendo-o para o suporte. Em seguida, lavou-se a lâmina com água destilada. 
Etapa 4: Coloração secundária ou de contraste. 
Gotejou-se sobre a lâmina nivelada a solução de fucsina básica que após 30 segundos 
foi escorrida. Posteriormente, o esfregaço foi lavado com água e deixou-se secar ao ar. Em 
seguida, a lâmina foi levada ao microscópio no qual pôde-se observar as estruturas coradas. 
Etapa 5: Observação dos resultados da coloração. 
Antes de posicionar a lâmina no microscópio, colocou-se uma gota de óleo de 
imersão sobre o esfregaço. A função do óleo, neste caso, seria de anular o fenômeno de 
difração da luz entre meios diferentes (existentes no vidro da lâmina e no espaço entre a 
lâmina e a lente da objetiva). Sem o óleo, parte da luz, depois de atravessar o vidro da lâmina, 
se desviaria antes de chegar à objetiva. Depois disso, ligou-se o microscópio, acoplou-se a 
lâmina à mesa (platina) do microscópio e utilizou-se a lente de maior aumento (100x). 
Focalizou-se utilizando o parafuso macrométrico e ajustou-se o foco com o parafuso 
micrométrico. 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
A prática no laboratório de Microbiologia foi de muita importância para nossos 
estudos, sendo que teve seus objetivos alcançados. Conseguiu-se preparar as lâminas com 
esfregaço bacteriano e visualizar ao microscópio os microorganismos corados. 
Sabe-se que os organismos observados pertencem ao reino Monera, que são seres 
unicelulares procariontes, ou seja, são constituídos por uma única célula e que esta não possui 
envoltório nuclear delimitando o material genético, porém não se sabe ao certo quais espécies 
de bactérias foram visualizadas. 
Ao observar a lâmina, foi possível notar que a amostra obteve material corado em 
duas cores distintas. Os microorganismos que apresentaram coloração violeta-azulado, eram 
gram-positivos, enquanto os de cor avermelhada eram gram-negativos. 
A diferença decoloração apresentada aconteceu porque as bactérias gram-positivas 
retêm o cristal violeta devido à presença de uma espessa camada de peptideoglicano em suas 
paredes celulares, enquanto que as bactérias gram-negativas apresentam uma membrana 
externa, formada por lipídeos e uma fina camada de peptideoglicano que não absorvem o 
cristal violeta durante o processo de descoloração. 
Ao corar as bactérias com cristal violeta e lugol, tanto bactérias gram-positivas 
quanto as gram-negativas absorvem igualmente esse corante primário e fixador, adquirindo 
uma coloração violeta-azulada em virtude da formação de um complexo cristal violeta-iodo 
(CV-I), insolúvel, em seus citoplasmas. Porém, ao serem tratadas com álcool, as espessas 
paredes celulares das bactérias gram-positivas são desidratadas, tornando-as impermeáveis ao 
complexo CV-I. Por outro lado, o etanol dissolve a porção lipídica das membranas externas 
das bactérias gram-negativas, deixando o complexo cristal violeta-iodo ser removido, 
descorando as células. Dessa forma, ao tratar a amostra com a fucsina básica, as gram-
positivas não retêm esse contra corante por já estarem coradas, ao contrário das gram-
negativas que o absorvem por estarem incolores. 
Uma outra explicação que pode ser dada, está baseada na diferença entre a 
permeabilidade dos dois grupos de bactérias. Na parede celular das gram-positivas, o 
complexo CV-I é absorvido depois de ser tratado com álcool, o que pode causar uma 
diminuição do diâmetro dos poros da camada de peptideoglicano. Já as bactérias gram-
negativas permanecem com porosidade suficientemente grande em suas paredes celulares, 
mesmo após o tratamento com etanol, o que possibilita a retirada do complexo cristal violeta-
iodo. 
Portanto, a retenção ou não do corante primário, dependente das propriedades físico-
químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, porosidade, integridade e 
densidade. 
As duas etapas de coloração, inicialmente com o corante primário cristal violeta, 
seguido do tratamento com o fixador lugol e posteriormente, o tratamento com um corante 
secundário fucsina básica, são de fundamental importância na coloração de Gram, uma vez 
que são essas etapas que permitem a visualização, diferenciação e a classificação das bactérias 
em gram-positivas e gram-negativas. 
Vale ressaltar que as bactérias gram-positivas foram coradas igualmente às células 
eucariontes, isso ocorreu devido as células eucariontes apresentarem em suas estruturas uma 
espessa camada de peptideoglicano, similar às das bactérias gram-positivas. 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
JUNIOR, M, J, P. Microbiologia Conceitos e Aplicações. Makron Books 2ª Ed. São Paulo, 
1996. 
 
MATIAS, O., & MARTINS, P. Biologia 10. Biologia e Geologia 10º ano Ensino Secundário 
(1ª ed.). Porto: Areal Editores, 2006. 
 
OPLUSTIL, C. P.; ZOCCOLI, C.M.; TOBOUTI, N.R.; SINTO, S.I. Procedimentos Básicos 
em Microbiologia Clínica. São Paulo: Sarvier, 2000. 
 
TORTORA, J, G. Microbiologia. ARTEMED, 8ª Ed. Porto Alegre, 2005. 
 
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 
2003.