MÉTODOS LABORATORIAIS NO DIAGNÓSTICO, SEGUIMENTO E COMPLICAÇÕES DE UMA DOENÇA INFECCIOSA

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MÉTODOS LABORATORIAIS NO DIAGNÓSTICO, SEGUIMENTO E
COMPLICAÇÕES DE UMA DOENÇA INFECCIOSA
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
(HIV) _____________________
MARCADORES DA INFECÇÃO POR
HIV
- p24= antígeno viral
IMUNOENSAIOS _____________
- são métodos bioanalíticos que
medem a presença ou concentração
de analitos (amostra do paciente)
através do uso de um anticorpo ou
antígeno como agente de detecção
- as interações específicas que
ocorrem durante a resposta imune
possibilitaram o desenvolvimento dos
imunoensaios
- imunodiagnóstico: diagnóstico
laboratorial feito por meio de
técnicas imunobiológicas
ANTICORPOS
- são as imunoglobulinas que se
ligam de forma específica a
antígenos naturais e sintéticos
(proteínas, carboidratos, ácidos
nucleicos, lipídios, outras moléculas)
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TESTE DE ELIZA
(IMUNOENZIMÁTICO) ________
- permite a detecção de anticorpo
(Ac) e antígenos (Ag) específicos no
soro/plasma sanguíneo
- aplicações:
- doenças infecciosas
- detectar alergias
- doenças autoimunes
- tipo I e II (indireto IgG)
- tipo I: 6-8 semanas
- tipo II: 28-30 dias
1. placa sensibilizada com
antígeno de interesse
2. amostra do paciente é
incubada na placa contendo o
antígeno selecionado
3. caso o paciente possua
anticorpo para aquele
antígeno, ocorrerá uma reação
de antígeno/anticorpo, o
anticorpo se ligará na fase
sólida e, após a lavagem, ele
permanecerá ligado. Caso não
tenha anticorpo para o
antígeno selecionado, durante
a lavagem toda a amostra é
retirada da placa
4. na sequência, será adicionado
o Anti-IgG ligado a uma
enzima, esse Anti-IgG se
ligará no complexo
antígeno-anticorpo formado na
etapa 3
5. ocorre uma cascata de ligação
antígeno-anticorpo-antígeno
ligado a enzima
6. será adicionado um substrato,
alvo da enzima acoplada ao
Anti-IgG. Se toda a reação
anterior aconteceu, essa
enzima irá degradar o
substrato, gerando uma
reação colorimétrica,
indicando a presença do
anticorpo. Dessa forma,
quanto maior a intensidade da
cor, maior a quantidade de
anticorpo presente na amostra
utilizada
- se for negativo, toda reação
que ocorre a partir da etapa 3
não acontece e não haverá
enzima para degradar o
substrato, mantendo a solução
incolor
- fase de incubação: permite que
ocorra a ligação antígeno-anticorpo
- lavagem: permite a retirada de
excesso de anticorpo, e na ausência
de ligação antígeno-anticorpo,
mantém a reação limpa
- tipo III (indireto IgG/IgM)
- 22-25 dias
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1. placa sensibilizada com o
antígeno de interesse
2. amostra do paciente é
incubada na placa contendo o
antígeno selecionado
3. caso o paciente possua
anticorpo para aquele
antígeno, ocorrerá uma reação
de antígeno-anticorpo, o
anticorpo se ligará à fase
sólida e, após a lavagem,
permanecerá ligado. Caso não
tenha anticorpo para o
antígeno selecionado, durante
a fase de lavagem toda a
amostra é retirada da placa
4. na sequência, será adicionado
um conjunto de peptídeos
sintéticos específicos para HIV
ligado a uma enzima, que se
ligará no complexo
antígeno-anticorpo formado na
etapa 3
5. ocorre uma cascata de ligação
que recebe o nome de
sanduíche de
antígeno-anticorpo-antígeno
ligado à enzima
6. será adicionado um substrato,
alvo da enzima acoplada ao
antígeno. Se toda a reação
anterior, aconteceu, essa
enzima irá degradar o
substrato gerando uma reação
colorimétrica indicando a
presença do anticorpo. Dessa
forma, quanto maior a
intensidade de cor, maior a
quantidade de anticorpo
presente na amostra utilizada
- tipo IV (indireto IgG/IgM, direto
p24)
1. placa sensibilizada com o
antígeno de interesse e o
anticorpo p24
2. amostra do paciente é
incubada na placa contendo o
antígeno e o anticorpo
selecionado
3. caso o paciente possua o
anticorpo para aquele antígeno
e a proteína para o anticorpo,
ocorrerá uma reação,
ocorrendo a ligação do
anticorpo e/ou proteína a fase
sólida, e após a lavagem ele
permanecerá ligado. Caso não
tenha anticorpo-proteína para
antígeno-anticorpo
selecionado, durante a fase da
lavagem toda a amostra é
retirada da placa
4. será adicionado um conjunto
de peptídeos sintéticos
específicos par HIV ligado a
uma enzima e um anticorpo
p24 acoplado a uma enzima,
que se ligará formando um
complexo
5. ocorre uma cascata de ligação
que recebe o nome de
sanduíche de
antígeno-anticorpo-antígeno
ligado a enzima
anticorpo-proteína-anticorpo
6. será adicionado um substrato,
alvo da enzima acoplada ao
antígeno-anticorpo. Se toda a
reação anterior aconteceu,
essa enzima irá degradas o
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substrato, gerando uma
reação colorimétrica,
indicando a presença do
anticorpo-proteína. Dessa
forma, quanto maior a
intensidade da cor, maior a
quantidade de anticorpo
presente na amostra utilizada
TESTE RÁPIDO
(IMUNOCROMATOGRAFIA) _____
- resultado em 30 minutos
- presencial
- saliva, sangue, soro/plasma
- S> 99,5% e E>99%
- uso restrito: situações em que o
diagnóstico é essencial para a
conduta imediata (parturientes,
acidentes ocupacional, mutirões)
TESTE DE AGLUTINAÇÃO ______
- técnica que permite identificar e
quantificar precipitados resultantes
da interação antígeno-anticorpo,
absorvidos a micropartículas
insolúveis ou células
- imunoensaio não-marcado
- soro: detecção de anticorpos IgM e
IgG
- S e E semelhantes ao ELISA
- fácil (sem equipamentos)
- triagem
AGLUTINAÇÃO DIRETA
- o antígeno está presente
naturalmente na célula (pesquisa de
antígeno)
- ex.: bactérias, protozoários,
hemácias (tipagem sanguínea)
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AGLUTINAÇÃO INDIRETA
- o antígeno é adsorvido a uma
partícula que servirá de fase sólida
da reação (pesquisa de anticorpo)
- ex. de partícula: látex,
sepharose, hemácias de
ave/carneiro no formol
(hemaglutinação)
- diagnóstico de malária
(hemácia de carneiro) e
diagnóstico de HIV
WESTERN BLOT
(IMUNOENZIMÁTICO) ________
- técnica que permite a detecção de
proteínas a partir de uma marcação
com anticorpos e enzima
- separação das proteínas por peso
molecular (eletroforese)
- quanto menor o peso
molecular, mais a frente estará
1. separação das proteínas
2. Transferir a proteína do gel para a
membrana
- aplicação: confirmação de testes
positivos pela alta especificidade
(ex.: HIV)
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DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE
- sintomático respiratório : pessoa
que, durante a estratégia
programática de busca ativa,
apresenta tosse por 3 semanas ou
mais. Essa pessoa deve ser
investigada para tuberculose através
de semanas bacteriológicas
- transmissão por aerossóis
- Mycobacterium tuberculosis (bacilo
de Koch)
AMOSTRA- Escarro
- 2 amostras (no atendimento e na
manhã do dia seguinte) → colher na
UBS, preferencialmente
- microscopia direta (diagnósticos e
acompanhamentos do tratamento)
- cultura (diagnóstico)
- qPCR (primers específico)
- não substitui o diagnóstico
convencional da TB
- não utilizado para
acompanhamento do
tratamento
- automatizado- Xpert MTB/RIF
(resistência a rifampicina)
MICROSCOPIA DIRETA
- coloração de gram em BAAR
sempre terá um falso positivo
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TESTE TUBERCULÍNICO (TT) OU
PROVA TUBERCULÍNICA (PT) OU
REAÇÃO DE MANTOUX
Diagnóstico de:
- infecção tuberculosa
- TB latente
- não necessariamente a
presença da doença
- inoculação intradérmica do
antígeno tuberculínico (PPD-Rt23,
derivado protéico do Mycobacterium
tuberculosis)
- nos indivíduos já sensibilizados
ocorre uma reação
inflamatória
- leitura: 72-96 h após injeção
- falso-positivo: vacina BCG,
micobactérias não TB
- falso-negativo: imunodeprimidos,
gestação
- a Prova Tuberculínica se tornará
positiva aproximadamente 3-12
semanas após a infecção tuberculosa
Está extinta a classificação:
- 0-4mm: não reativo (não
infectado)
- 5-9mm: reativo fraco (infectado ou
BGC, TB ativa em HIV)
- ≥ 10 mm: reativo forte (TV ativa
ou BCG recente)
IGRA (INTERFERON GAMMA
RELEASE ASSAY)
- mede a reatividade imunológica de
uma pessoa ao Mycobacterium
tuberculosis. As células branca do
sangue da maioria das pessoas que
foram infectadas com M. tuberculosis
liberam interferon gama (IFN-g)
quando misturados com antígenos
(substâncias que podem produzir
uma resposta imune) derivadosde
M. tuberculosis
- amostras de sangue fresco são
misturadas com antígenos e
controles
- requer uma única visita do
paciente para realizar o teste
- os resultados podem estar
disponíveis em 24h
- não aumenta as respostas
medidas por testes
subsequentes
- a vacinação prévia de BCG não
causa um resultado falso
positivo do teste
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