L4_Enzimas_G11 (2)

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Universidad Nacional de Ingeniería 
Facultad de Ingeniería Química y Textil 
Departamento Académico de Ingeniería Química 
 
Laboratorio de Bioquímica y Microbiología (PI721 A) 
Informe N°4 
 Enzimas 
Integrantes: 
Alumno 1: Effio Castillo, Melissa Alicia 
Alumno 2: Oliva Peña, Héctor Piero 
Alumno 3: Sandoval Mariños, Miguel Antenor 
 
Profesores: 
- Dra. Jessica Ivana Nieto Juárez 
- Ing. Janet Rojas Orosco (responsable de la práctica) 
 
Fecha de realización de la práctica: 12/05/2021 
Fecha de presentación del informe:19/05/2021 
 
2021-1 
 
2 
 
ÍNDICE 
Introducción .......................................................................................................................................... 3 
Las enzimas ......................................................................................................................................... 3 
Especificidad de acción enzimática .................................................................................................... 3 
Acción catalítica de las enzimas ......................................................................................................... 4 
Mecanismo de catálisis ................................................................................................................... 4 
Enzimas oxidorreductasas ................................................................................................................... 5 
Catalasa .......................................................................................................................................... 6 
Enzimas Hidrolasas ............................................................................................................................. 6 
α-amilasa ........................................................................................................................................ 7 
Inhibición enzimática .......................................................................................................................... 7 
Efecto temperatura .......................................................................................................................... 7 
Efecto de pH .................................................................................................................................... 7 
Objetivo .................................................................................................................................................. 8 
Objetivo general .................................................................................................................................. 8 
Objetivos específicos .......................................................................................................................... 8 
Diagrama de flujo ................................................................................................................................. 9 
Parte experimental .............................................................................................................................. 10 
Materiales ................................................................................................................................... 10 
Reactivos ........................................................................................................................................... 13 
Seguridad en el laboratorio ............................................................................................................... 15 
Resultados esperados .......................................................................................................................... 17 
A. Reconocimiento de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales ................................... 17 
B. Efecto de la temperatura sobre la enzima catalasa .................................................................... 18 
C. Actividad de la enzima α-amilasa y efecto del pH .................................................................... 19 
Discusión de Resultados ..................................................................................................................... 19 
A. Reconocimiento de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales ................................... 19 
B. Efecto de la temperatura sobre la enzima catalasa .................................................................... 20 
C. Actividad de la enzima α-amilasa y efecto del pH .................................................................... 23 
Cuestionario......................................................................................................................................... 25 
Pregunta 1. ........................................................................................................................................ 25 
Pregunta 2. ........................................................................................................................................ 29 
Pregunta 3. ........................................................................................................................................ 30 
Conclusiones ........................................................................................................................................ 31 
Anexo .................................................................................................................................................... 31 
Referencias bibliográficas .................................................................................................................. 33 
3 
 
 
Introducción 
 
Las enzimas 
Las enzimas son estructuras celulares, generalmente proteicas, catalizadoras 
específicas que permiten el desarrollo en simultáneo de un gran número de reacciones 
químicas al interior de la célula. Las enzimas se pueden encontrar de forma intracelular, 
solubilizadas o en las membranas y también se hallan en forma extracelular como es el caso 
de las enzimas digestivas. 
Una enzima tiene entre 100 y 2500 aminoácidos, en su composición pueden integrar 
iones inorgánicos o moléculas orgánicas para ayudar a ampliar su espectro de acción. Las 
altas velocidades que alcanzan las reacciones químicas producidas por las enzimas quedan 
determinadas por el pH y temperatura en la célula. 
Las enzimas no son capaces de llevar a cabo reacciones imposibles, solo facilitan la 
reacción incrementando su velocidad. Se les puede clasificar según el tipo de reacción 
catalizada en 6 grupos generales, como se observa en la siguiente tabla: 
 
Tabla 1. Clases de enzimas según el tipo de reacción catalizada. (Fundamentos de la bioquímica. 
Bañó et al., 2007) 
 
 
Especificidad de acción enzimática 
 
Las enzimas son catalizadores altamente efectivos (acelera reacciones muy lentas) 
pero debe tomarse en cuenta que una determinada enzima acelera una reacción determinada 
pues, para cualquier otra reacción, se convierte en un mal catalizador o no la cataliza en lo 
absoluto. A esto le llamamos especificidad de acción catalítica y gracias a ella, las reacciones 
que permiten la vida ocurren de forma ordenada y equilibrada. 
4 
 
La especificidad por sustrato de las enzimas radica en una región ubicada en su 
superficie, llamada centro activo o centro de fijación del sustrato. Alrededor de este centro 
activo se encuentran acomodados grupos químicos que determinan la fijación (o no) de un 
sustrato específico. 
Algunas enzimas tienen una especificidad absoluta para cierto sustrato, pero no 
siempre. Generalmente las enzimas tienen una especificidad ligeramente amplia que les 
permite aceptar análogos estructurales de un sustrato específico, aunque la velocidad de la 
catálisis también se ve modificada. 
 
Acción catalítica de las enzimas 
 
El poder catalítico de las enzimas permite incrementar notablemente la velocidad de 
una reacción en específico,además de darles la facultad de elegir sustratos alternativos. La 
eficacia enzimática se debe a la complementariedad de las enzimas con el estado de 
transición (estructura inestable y transitoria para llegar de sustrato a producto) de la reacción 
que catalizan. 
Investigaciones han permitido conocer que las enzimas tienen un “sitio activo” que es 
una superficie donde ocurre la catálisis. En este espacio, encaja la molécula de sustrato y es 
retenida fuertemente. Cerca al sitio activo se encuentran grupos funcionales que contribuyen 
a la catálisis. Algunas enzimas tienen más de 1 sitio activo por molécula. 
 
Mecanismo de catálisis 
Las enzimas catalizan diversas reacciones en donde transforman moléculas del 
sustrato en productos. El sustrato requiere una cantidad de energía para ser activado y 
que la reacción se lleve a cabo, a esta energía se le llama energía de activación Ea. 
Usualmente esta energía se aporta como calor; pero, por ejemplo, en condiciones 
ambientales de 37 °C (cuerpo humano) incrementar la temperatura para alcanzar la 
activación perjudica y daña células. Para evitar ello, las enzimas reducen la cantidad 
necesaria de energía de activación, estabilizando el estado de transición de la 
reacción, permitiendo que las reacciones químicas se den a temperatura corporal 
regular, pero a la velocidad que requiere el desarrollo de las funciones vitales. 
Principalmente las enzimas realizan catálisis covalente que involucra ataques 
nucleofílicos para la formación de un enlace covalente transitorio. Las enzimas se 
acercan a los sustratos, formando un complejo enzima-sustrato enlazados por el centro 
5 
 
de fijación, y los fuerzan a tomar una orientación correcta reactiva. Después de la 
formación del complejo, este enlace por el centro activo modifica las propiedades 
químicas originales del sustrato, debilitando los enlaces iniciales y permitiendo 
nuevos enlaces que originen los productos de reacción. 
Terminada la catálisis, la enzima queda libre para continuar catalizando otras 
reacciones y no se ha visto modificada. La reacción general de catálisis enzimática es 
la siguiente: 
 
Enzima+Sustrato→Complejo Enzima-Sustrato→Producto+Enzima 
 
 
Figura 1. Función de las enzimas. (Bioquímica de los procesos metabólicos. Cuatmazi, O., 
Melo, V., 2006) 
 
Enzimas oxidorreductasas 
Estas enzimas catalizan reacción de oxidorreducción o transferencia de átomos de H o 
electrones de un sustrato a otro. Dentro de esta clasificación destacan las deshidrogenasas y 
las oxidasas. 
 
6 
 
Figura 2. Oxidorreductasas. (Fundamentos de bioquímica estructural. Garrido, A., Teijón, J., 
2006) 
Dentro de esta clasificación encontramos a la catalasa, que aumenta la velocidad de la 
descomposición del peróxido de hidrógeno aproximadamente 1000 millones de veces. La 
proteína hemoglobina, que contiene hierro, también incrementa eficazmente la velocidad de 
descomposición del peróxido de hidrógeno, aproximadamente en 1 millón de veces. 
 
Catalasa 
La catalasa es una enzima intracelular, actúa sobre el peróxido de hidrógeno 
H2O2 el cual es un compuesto muy tóxico que resulta del metabolismo celular en 
muchas especies, por lo que es necesario convertirlo rápidamente en compuestos 
menos peligrosos. Esta enzima convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno 
molecular. 
 
Esta enzima se inactiva por acción de la temperatura, por desnaturalización. El 
reconocimiento de la actividad enzimática de la catalasa se evalúa mediante el 
desprendimiento de oxígeno en el tubo tras reacción catalítica. 
 
Enzimas Hidrolasas 
Estas enzimas se consideran una clase especial de transferasas donde el sustrato se rompe y 
sus fragmentos se transfieren a los componentes del agua, iones OH y H. Las reacciones 
catalizadas por hidrolasas involucran la ruptura hidrolítica de enlaces C-O, C-N, O-P y C-S. 
 
 
Figura 3. Hidrolasas. (Fundamentos de bioquímica estructural. Garrido, A., Teijón, J., 2006) 
 
 
 
7 
 
α-amilasa 
Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de los enlaces 1-4 en la 
glucosa que contienen polisacáridos como amilopectina, amilosa, amilopectina, 
glucógeno y otros. La α-amilasa se encuentra en nuestro organismo en la saliva, se 
encuentra también en la malta y diversos hongos, levaduras, tejidos animales y 
vegetales. 
La α-amilasa es un tipo de enzima hidrolasa que cataliza la hidrólisis de los 
enlaces C1-C4 de la cadena lineal y la cadena ramificada del almidón. Tras esto, la 
estructura helicoidal del almidón originada por la amilosa desaparece. El 
reconocimiento se evalúa comprobando la presencia de glucosa mediante reactivo de 
Fehling. 
 
Inhibición enzimática 
La actividad catalítica de las enzimas puede verse afectada por la concentración del sustrato, 
concentración de la enzima, pH del medio o por la temperatura. 
 
Efecto temperatura 
A bajas temperaturas muchas enzimas no logran su funcionamiento, para que 
este se desarrolle correctamente debe trabajarse a su punto óptimo de temperatura 
donde la actividad catalítica es máxima. 
Al incrementar la temperatura, la velocidad de las reacciones catalíticas 
aumenta también, pero solo hasta cierto valor. Si se sobrepasa el rango crítico o 
“temperatura de transición” la actividad de la enzima decrece rápidamente pues el 
aumento de la velocidad de reacción es contrarrestado por la desnaturalización 
térmica de la enzima, decreciendo su actividad catalítica hasta anularse. El aumento 
de temperatura, si bien aumenta la energía cinética de las moléculas. También 
desorganiza su estructura y destruye las interacciones débiles, desnaturalizando la 
enzima. 
 
Efecto de pH 
Una enzima tiene típicamente un pH óptimo en el cual la conformación es la 
ideal para la actividad catalítica y se realiza la reacción de un modo mucho más 
efectivo; pero, al contener aminoácidos, son sensibles a cambios de pH debido a que 
8 
 
algunos aminoácidos reaccionan con radicales libres alterando así la conformación 
funcional de la enzima, un pH extremo puede desnaturalizar a la enzima. 
La conformación total de la molécula de enzima depende en ocasiones de la 
existencia de cargas electrostáticas, por ejemplo, una atracción entre un grupo amonio 
y un grupo carboxilato no existirá a concentración de H+ muy bajas o altas porque eso 
significa que uno u otro grupo perdería su carga. Se debe considerar también que la 
creación de enlaces de hidrógeno puede no ocurrir a concentración de H+ extremas. 
La carga que tengan los grupos ionizables de las cadenas laterales de los 
aminoácidos podrá ser positivas, negativas o neutras dependiendo del pH del medio. 
Un cambio en condiciones de pH óptimo afecta considerablemente la actividad de la 
enzima pues, si esta se desnaturaliza, cambia sus propiedades fisicoquímicas: 
incrementa su viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión, disminuye su 
solubilidad y la hace perder sus propiedades biológicas. 
 
 
Objetivo 
 
Objetivo general 
Evidenciar la naturaleza catalítica y actividad de las enzimas tanto animales como vegetales y 
estudiar los efectos que generan sobre estas la variación de distintos parámetros. 
Objetivos específicos 
● Estudiar la acción catalítica de la enzima catalasa en tejido de animales y vegetales. 
● Determinar la relación entre el cambio de temperatura y la velocidad de reacción de 
descomposición del peróxido de hidrógeno producida por el enzima catalasa. 
● Estudiar la reacción catalítica de descomposición del almidón por la enzima α-
amilasa, así como el efecto que causa la variación del pH en esta reacción. 
 
 
 
 
9 
 
Diagrama de flujo 
 
 
 
 
 
10 
 
 
 
Parte experimental 
 
Materiales 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 tubos de ensayo con tapa 2 vasos de precipitado 50, 150 y 600 ml 
11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pipeta graduada de 5, 10ml PropipetaGradilla para tubos de ensayo 2 Fiolas de 100 mL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pinza para tubos Gotero o pipeta Pasteur 
12 
 
 
 
 Bagueta Jeringa 
 
Termómetro Cronómetro 
 
 
 
Hígado de pollo Carne molida de res 
13 
 
 
Zanahorias Tomates 
 
 
 
 Papa Espinaca 
 
Reactivos 
peróxido de hidrogeno 30% (controlado) Solución de glucosa 0.5%
 
14 
 
Solución de almidón 0.5% Solución de saliva 2 % 
 
 HCl 0.1N (controlado) NaOH 0.1N (controlado) 
 
 Reactivo de Fehling A y B Reactivo de Lugol 
15 
 
Seguridad en el laboratorio 
 
REACTIVO RIEGOS PREVENCIÓN PRIMEROS AUXILIOS 
Peróxido de 
hidrógeno 30 
% 
 
En caso de ingestión: 
provoca náuseas, 
vómitos, diarrea, dolor 
abdominal. 
En caso de contacto con 
los ojos. Provoca 
lesiones oculares graves, 
peligro de ceguera. Al 
inhalar: tos, dificultades 
respiratorias. 
Poco irritante al contacto 
con la piel, pero no es 
relevante para clasificar 
 
Utilizar el equipo de 
protección individual 
obligatorio. Evitar el 
contacto con la piel, los 
ojos y la ropa. 
No respirar los vapores. 
Mantener el producto 
alejado de los desagües y 
de las aguas superficiales 
y subterráneas. 
Consérvese únicamente en 
el recipiente de origen. 
Proteger de la luz del sol. 
Durante mucho tiempo a 
la luz puede causar 
descomposición 
 
 
En caso de contacto con la 
piel: Lavar con abundante 
agua. En caso de contacto 
con los ojos: Enjuagar con 
agua cuidadosamente 
durante varios minutos. 
Quitar las lentes de 
contacto cuando estén 
presentes y pueda hacerse 
con facilidad. Proseguir 
con el lavado. En caso de 
ingestión: Enjuáguese la 
boca con agua (solamente 
si la persona está 
consciente). 
HCl 0.1 N 
 
Produce humos tóxicos 
más pesados que el aire. 
Al ser calentada la 
solución libera vapores 
tóxicos de cloruro de 
hidrógeno. Provoca 
quemaduras graves en la 
piel y lesiones oculares 
graves Puede irritar las 
vías respiratorias. 
Usar siempre protección 
personal así sea corta la 
exposición o la actividad 
que realice con el 
producto. Mantener 
estrictas normas de 
higiene, no fumar, ni 
comer en el sitio de 
trabajo. Usar las menores 
cantidades posibles 
Lavar la boca con agua. Si 
está consciente, 
suministrar abundante 
agua. No inducir el 
vómito. Si esto se produce 
de manera natural, inclinar 
la persona hacia el frente 
para evitar la 
broncoaspiración. Después 
de proporcionar los 
primeros auxilios, 
16 
 
contactar con un médico 
especialista en toxicología. 
NaOH 0.1 N 
 
Causa quemaduras a piel 
y ojos. Puedes ocasionar 
irritación severa de tracto 
respiratorio digestivo con 
posibles quemaduras En 
casos crónicos puede 
producir cáncer en el 
esófago y dermatitis en 
la piel 
Uso de lentes de 
seguridad, bata y guantes 
de neopreno, nitrilo o 
vinilo. Manejarse en una 
campana. En el caso de 
trasvasar pequeñas 
cantidades de disoluciones 
de sosa con pipeta, utilizar 
una propipeta, nunca 
aspirar con la boca. 
Quitar toda la ropa 
contaminada. Enjuagar la 
piel con agua durante 
varios minutos. Quitar las 
lentes de contacto cuando 
estén presentes y pueda 
hacerse con facilidad. 
Proseguir con el lavado. 
 
Reactivo de 
Fehling 
 
Provoca lesiones 
oculares graves. 
 Muy tóxico para los 
organismos acuáticos, 
con efectos nocivos 
duraderos. 
En caso de ingestión 
causa náuseas 
En caso de contacto con 
los ojos provoca lesiones 
oculares graves, peligro 
de ceguera 
En caso de inhalación 
causa irritación ligera a 
moderada 
En caso de contacto con 
la piel causa eritema 
localizado 
 
Úsense guantes 
adecuados, guante de 
protección química 
probado. 
Protección respiratoria es 
necesaria para: Formación 
de aerosol y niebla. 
Utilizar gafas de 
protección con protección 
a los costados. 
El material es estable bajo 
condiciones ambientales 
normales y en condiciones 
previsibles de temperatura 
y presión durante su 
almacenamiento y 
manipulación. 
En caso de contacto con 
los ojos: Enjuagar con 
agua cuidadosamente 
durante varios minutos. 
Quitar proseguir con el 
lavado. 
En caso de inhalación: 
Proporcionar aire fresco. 
En caso de contacto con la 
piel: aclarar la piel con 
agua/ducharse. 
En caso de ingestión 
Enjuagarse la boca. 
Llamar a un médico si la 
persona se encuentra mal 
 
 
 
 
17 
 
Reactivo de 
Lugol 
Puede provocar daños en 
los órganos (tiroides) tras 
exposiciones 
prolongadas o repetidas 
(en caso de ingestión) 
 
Lavar las manos antes de 
las pausas y al fin del 
trabajo. Manténgase lejos 
de alimentos, bebidas. 
Mantener el recipiente 
herméticamente cerrado. 
Temperatura recomendada 
de almacenamiento: 15 –
 25 °C. 
Úsense guantes 
adecuados. Adecuado es 
un guante de protección 
química y también gafas 
protectoras. 
 
En caso de inhalación: 
Proporcionar aire fresco 
En caso de contacto con la 
piel: aclarar la piel con 
agua/ducharse. Si aparece 
malestar o en caso de duda 
consultar a un médico. 
En caso de contacto con 
los ojos: aclarar 
cuidadosamente con agua 
durante varios minutos. 
consultar a un médico. 
En caso de ingestión: 
enjuagarse la boca. 
 
 
 
Resultados esperados 
 
A. Reconocimiento de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales 
 
Tabla 2. Observaciones, tiempo y altura de burbujeo alcanzada por cada muestra. 
 
Muestra Observaciones Tiempo(s) Altura (cm) 
Papa Burbujeo lento 8 1.5 
Piña Burbujeo muy lento 14 1 
Zanahoria Burbujeo moderado 42 4.1 
Melocotón Burbujeo muy lento 30 2 
Hígado Burbujeo muy rápido 4 11.7 
Apio Burbujeo muy lento 10.6 2.3 
18 
 
Cebolla Burbujeo muy lento 19 1.2 
Plátano Burbujeo Muy lento 5 1 
 
Tabla 3. Velocidad de burbujeo 
 
Muestra Velocidad (mm/s) 
Papa 1.875 
Piña 0.714 
Zanahoria 0.976 
Melocotón 0.666 
Hígado 29.25 
Apio 2.169 
Cebolla 0.631 
Plátano 1.937 
 
 
B. Efecto de la temperatura sobre la enzima catalasa 
 
Tabla 4. Datos experimentales de la acción de la catalasa en la reacción de oxidación de 
peróxido de hidrógeno 
Temperatura °C Distancia recorrida cm Tiempo de reacción s Rapidez de reacción cm/s 
4 12 6.2 1.935 
23 12 6.1 1.967 
34 12 1.81 6.63 
39 12 3.5 3.43 
48 12 5.51 2.178 
58 12 7.5 1.6 
 
19 
 
Graficando los valores se obtiene, 
 
 
C. Actividad de la enzima α-amilasa y efecto del pH 
 
Tabla 5. Resultados prueba de Fehling 
N° tubo Muestra pH Observación 
3 Almidón + α-amilasa 7 Ppdo rojo 
5 Almidón + α-amilasa + HCl 2 Solución 
verde azulado 
7 Almidón + α-amilasa + 
NaOH 
11 Ppdo rojo 
 
Discusión de Resultados 
 
A. Reconocimiento de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales 
 
¿Qué tejido presenta mayor o menor desprendimiento de oxígeno? ¿Cuáles de los tejidos 
presentan mayor o menor actividad enzimática? 
 
La acción de la catalasa sobre el peróxido de hidrógeno es añadir un electro en 
presencia de hidrógeno al agua y el oxígeno diatómico. El oxígeno se reduce de nuevo a 
superóxido y después a peróxido de hidrógeno y otra vez comience la reacción. Una molécula 
de catalasa puede convertir millones de moléculas de peróxido de hidrógeno en oxígeno y 
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60
V
el
o
ci
d
ad
 d
e 
re
ac
ci
ó
n
 m
/s
Temperatura °C
Temperatura Vs velocidad de reacción
20 
 
agua en cuestión de segundos y es la primera línea de defensa del cuerpo contra la formación 
de radicales libres de hidroxilo. (Altman, 1995) 
La actividad enzimática se expresa habitualmente en micro moles (µmol) de sustrato 
convertido en producto por minuto, Una unidad estándar de actividad enzimática (U) es 
aquella actividad que cataliza la transformación de 1 µmol min- de sustrato. (Devlin, 2004) 
 
Tabla 6.Actividad enzimática (decreciente) 
Muestra Velocidad (mm/s) 
Hígado 29.25 
Apio 2.169 
Plátano 1.937 
Papa 1.875 
Zanahoria 0.976 
Piña 0.714 
Melocotón 0.666 
Cebolla 0.631 
 
B. Efecto de la temperatura sobre la enzima catalasa 
¿Cómo afecta la actividad de la enzima? ¿A qué temperatura es la máxima y mínima 
actividad? ¿Por qué la actividad disminuye o es negativa a altas temperaturas? 
En las reacciones enzimáticas el sustrato se va a unir al sitio activo y se puede 
mantener ahí por medio de interacciones débiles como enlaces iónicos y puentes de 
hidrógeno. Las cadenas de los aminoácidos presentes en el sitio activo catalizan la conversión 
de sustrato en producto y el producto sale del sitio activo. 
21 
 
 
Figura 4. Estructura de la enzima y complejo enzima sustrato. (Neil A. Campbell, 
2005) 
En la figura izquierda el sitio activo de esta enzima forma un surco en su superficie. 
Su sustrato es glucosa(rojo) y en la derecha el sustrato entra al sitio activo e induce el cambio 
en la forma de la proteína, se forman interacciones débiles que provocan que el sitio activo 
abrace al sustrato y lo mantenga en su lugar. (Neil A. Campbell, 2005) 
Cada enzima opera mejor en algunas condiciones que en otras. Hasta cierto punto la 
velocidad de reacción enzimática aumenta con el aumento de la temperatura debido a que los 
sustratos (el sustrato es el reactivo sobre el cual actúa la enzima) colisionan con los sitios 
activos con mayor frecuencia cuando las moléculas se mueven con una mayor rapidez. 
Pero por encima de cierta temperatura la velocidad de reacción va a caer de manera 
abrupta. Se van a romper los enlaces mencionados anteriormente (iónicos y puentes de 
hidrógeno que mantiene) debido a la agitación térmica de la molécula desestabilizando la 
estructura activa desnaturalizando la molécula proteica. Cuando la enzima está sin 
desnaturalizar la temperatura óptima va a permitir un mayor número de colisiones y la 
conversión más rápida de reactivos en productos. 
Todo aumento más allá de la temperatura óptima va a reducir significativamente la 
velocidad de reacción, esta disminución de la velocidad es debido a la desnaturalización de la 
enzima que implica la ruptura de enlaces hidrógenos y otros enlaces no covalentes, esto 
modifica el sitio activo, modifica su forma y se da la pérdida de su actividad catalítica. 
22 
 
La actividad enzimática aumenta con el aumento de la temperatura hasta que la enzima 
comienza a desnaturalizarse por el calor. A partir de acá la velocidad de la reacción cae. 
(Gerard J. Tortora, 2007) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Desnaturalización de las proteínas (Arias) 
 
Primero con el aumento de la temperatura, aumenta la actividad enzimática, si la 
temperatura se aumenta por encima de su temperatura óptimo las colisiones se tornan más 
violentas y se inicia el rompimiento de enlaces, más allá de esta temperatura la actividad 
enzimática comienza a disminuir hasta cerca del punto donde la proteína se desnaturaliza y su 
actividad llega a 0. (Jaime Fornaguera, 2004) 
23 
 
 
 La temperatura óptima experimental según el gráfico se alcanza a los 32°C y la 
temperatura de menor actividad se da a la temperatura de desnaturalización de la catalasa. 
 
C. Actividad de la enzima α-amilasa y efecto del pH 
 
En la discusión de resultados, explicar: ¿En qué tubo se demuestra la actividad de la enzima 
α-amilasa y por qué?, ¿En qué tubo se ha inactivado la enzima y por qué no ha actuado? 
La enzima -amilasa es hidrolasa, la cual lleva a cabo la hidrólisis de los enlaces 
internos α-1,4-glicosídicos del almidón, para posteriormente obtener productos como glucosa 
o maltosa (Steyn & Pretorius, 1991). 
 
Figura 6. Hidrólisis del almidón con la amilasa. (Cremosi, P., 2002) 
 
Para identificar la presencia de glucosa/almidón en las muestras se usan 2 pruebas 
cualitativas: 
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60
V
el
o
ci
d
ad
 d
e 
re
ac
ci
ó
n
 m
/s
Temperatura °C
Temperatura Vs velocidad de reacción
24 
 
• Test con Lugol para identificar polisacáridos (almidón). 
• Test con reactivo de Fehling para identificar azúcares reductores (glucosa) procedentes de la 
acción de la amilasa. 
 
¿En qué tubos se demuestra la actividad de la enzima α-amilasa y por qué? 
 
Tras el baño maría, el tubo 3 que contenía la solución de almidón y saliva al 2%, dio 
positivo a la prueba de Fehling con la aparición de un precipitado color rojo ladrillo que 
confirma la presencia de glucosa. La enzima α-amilasa presente en la saliva hidrolizó al 
polisacárido almidón tras alcanzar la temperatura fisiológica de 37°C, degradándolo en 
moléculas de glucosa detectables por la prueba de Fehling. Por este motivo, el tubo 4 que 
tiene la misma composición que el tubo 3, dio negativo a la prueba de Lugol pues el almidón 
fue degradado a glucosa, desapareciendo la estructura espiralada del polisacárido, no 
quedando huecos para que entre el yodo. 
 
Tras el baño maría, el tubo 7 que contenía la solución de almidón, NaOH y saliva al 
2%, dio positivo a la prueba de Fehling con la aparición de un precipitado color rojo ladrillo 
que confirma la presencia de glucosa. El hidróxido de sodio NaOH llevó a la solución a un 
pH de 11 que no impidió la degradación del almidón en glucosa detectable por Fehling. Por 
este motivo, el tubo 8, que tiene la misma composición que el tubo 7, dio negativo a la prueba 
de Lugol pues ya no se encuentra almidón en el tubo al haber sido degradado en glucosa por 
la amilasa salival. 
 
¿En qué tubos se ha inactivado la enzima y por qué? 
 
Tras el baño maría, el tubo 5 que contenía la solución de almidón con HCl y saliva al 
2%, dio negativo a la prueba de Fehling exhibiendo un color azul-verdoso indicando la 
ausencia de glucosa. Lo anterior se debe a que la amilasa salival no degradó al almidón, por 
lo que no existen moléculas libres de glucosa en la solución que el reactivo de Fehling 
pudiera detectar. El HCl añadido llevó a la solución a tener un pH de 2, este pH desnaturalizó 
a la enzima α-amilasa salival inhibiendo su actividad, pues su rango óptimo para que la α-
amilasa realice su actividad enzimática se encuentra entre 5-8. 
 
25 
 
Tras el baño maría, el tubo 6 que contenía la solución de almidón con HCl y saliva al 
2%, dio positivo a la prueba de Lugol lo que verifica la presencia del polisacárido almidón. 
Esto debido a que el ácido clorhídrico perjudicó la actividad enzimática de la enzima α-
amilasa salival, impidiendo que se hidrolice el almidón y lo degrade en glucosa. El almidón 
aún presente en el tubo 6 reacciona químicamente con yodo del reactivo de Lugol para 
producir un color azul oscuro cuando las moléculas de yodo se insertan en los hoyos de la 
molécula espiralada del almidón (amilosa). 
 
 
Cuestionario 
 
Pregunta 1. 
En la superficie de algunas frutas y vegetales cuando se cortan, se forman una coloración 
café oscuro denominado pardeamiento enzimático, ¿qué enzima produce este efecto? 
Fundamente su respuesta y esquematice las reacciones químicas involucradas. 
 
El pardeamiento enzimático es una alteración química, aunque enzimática en sus 
primeras etapas, que tiene como sustratos a los compuestos fenólicos que transforman en 
estructuras poliméricas poco aclaradas, por lo general con coloraciones pardas. 
 
Las enzimas implicadas en este pardeamiento se conocen con el nombre de polifenol 
oxidasas, también denominadas polifenolasas o simplemente fenolasas. Generalmente se 
admite que todos estos términos incluyen las enzimas que tienen la capacidad de oxidar los 
compuestos fenólicos a orto-quinonas. Su nombre sistemático corresponde al de orto-difenol 
oxígeno oxidorreductasa. Se trata de metaloenzimas que contienen un 0,2 % de cobre como 
grupo prostético. El sistema presenta una doble actividad capaz de catalizar dos tipos de 
reacciones: 
 
● El paso de monofenoles aorto-difenoles mediante una actividad cresolasa, que 
implica una hidroxilación. 
● La conversión de orto-difenoles a orto-quinonas, a través de una actividad catalasa, 
que implica una oxidación. 
 
 Mecanismo de reacción 
26 
 
El pardeamiento enzimático transcurre a través de un proceso muy complejo, se 
pueden distinguir cinco etapas, cada una de ellas con mecanismo de actuación propio, 
de naturaleza enzimática los dos primeros: 
 
Hidroxilación inicial mediante actividad cresolasa 
Tiene como sustrato a los monofenoles(incoloros) que para ser 
convertidos en difenoles (incoloros) necesitan de una hidroxilación 
enzimática, con la ayuda de una actividad cresolasa con intervención de la 
molécula de O2, de la cual un átomo se usa para formar el difenol y el otro es 
reducido a agua, como se expresa en la reacción: 
 
 
Oxidación a quinonas por actividad catecolasa. 
No se conoce con claridad el mecanismo de oxidación de los difenoles, 
aunque puede ser esquematizado como se expresa en la reacción: 
 
 
 
También interviene el oxígeno del aire como aceptor de hidrógenos y 
la actividad enzimática conocida con el nombre de catecolasa. la implicación 
27 
 
del catión cobre que se encuentra en todos los sistemas polifenolasas resulta 
esencial. Tanto para la actividad cresolasa como para la catecolasa, la 
intervención catalítica del cobre comprende un mecanismo que se desarrolla 
en varias etapas. Aunque la enzima se encuentra en los productos vegetales a 
concentraciones reducidas, suele ser la cantidad de sustrato el que limite la 
velocidad de la alteración Los autores han explicado el mecanismo de reacción 
como una oxidación no enzimática en la que deben intervenir a la vez tanto los 
monofenoles como las quinonas ya presentes en el alimento, según el esquema 
de la reacción: 
 
 
 
Hidroxilación química secundaria de las quinonas 
La formación de quinonas es un proceso que depende de la presencia 
de oxígeno y enzima, pero una vez que han sido formadas se producen de 
modo espontáneo una serie de reacciones de muy diversa naturaleza. Entre 
otras posibilidades, las quinonas pueden ser hidroxiladas de modo secundario 
mediante reacción con moléculas de agua para dar lugar a trihidroxibenceno, 
según: 
 
 
Cambios intramoleculares entre quinonas y fenoles 
28 
 
La gran capacidad de reacción de estos compuestos trifenólicos 
los lleva a cambios intramoleculares entre quinonas y fenoles para dar 
lugar a la formación de hidroxiquinonas, según: 
 
 
Condensaciones de quinonas para dar lugar a polímeros. 
Las hidroxiquinonas son la base de condensaciones oxidativas que 
conducen a la formación de polímeros denominados melaninas, que tras pasar 
por una gran variedad de colores rosa, rojo, azulado intermedios, alcanzan su 
coloración final parda o negra. Estas melaninas responden a las estructuras 
complejas no bien aclaradas, cuyo esquema general corresponde lo siguiente: 
Las proteínas y los aminoácidos también pueden reaccionar, a través de sus 
grupos libres aminos (-NH2) y tioles (-SH), con las quinonas para dar 
compuesto de coloración intensa, según la siguiente reacción: 
29 
 
 
 
Algunas estructuras específicas de ciertos aminoácidos también pueden 
experimentar una serie de transformaciones químicas, que llevan a la 
formación de polímeros con coloraciones que varían desde el rosa al pardo 
después de pasos sucesivos. (Bello Gutiérrez, 2000) 
 
 
Figura 7. Etapas de la reacción de pardeamiento enzimático (Hernández 
Rodríguez, 2008) 
 
 
Pregunta 2. 
¿Qué métodos o técnicas se podría recomendar para evitar el pardeamiento de las frutas y 
vegetales? 
El oscurecimiento de las frutas y vegetales se da cuando hay una disrupción a nivel 
celular y una exposición de los sustratos del tipo fenólico al oxígeno del aire siendo 
convertidos por vía enzimática en melaninas que son compuestos oscuros de calor marrón. 
Las fenolasas son las enzimas que catalizan estas reacciones, dicha reacción se dará 
en presencia de oxígeno molecular y cobre como un grupo prostético en un medio 
30 
 
ligeramente ácido. El oscurecimiento se da en frutas y vegetales donde no se ha desactivado 
las enzimas previamente 
Este oscurecimiento enzimático en las frutas y verduras se puede controlar empleando 
diversas técnicas que desactivan las enzimas o reducen su actividad como las siguientes: 
● Tratamiento térmico o escaldado para inactivar las enzimas antes de la conservación 
por bajas temperaturas. (José A. Barriero M.) 
● Aplicación de compuestos azufrados como SO2 gaseoso o soluciones de sulfito, 
bisulfito para inactivar las enzimas antes de la congelación. (José A. Barriero M.) 
● Reducción de la temperatura para retardar el oscurecimiento enzimático, debido a que 
la actividad enzimática a bajas temperaturas se reduce. (José A. Barriero M.) 
● Uso de aditivos como boratos y ácido bórico. Según estudios soluciones de 1.5% de 
tetraborato de sodio pueden inhibir el oscurecimiento enzimático y especialmente si 
se utiliza junto a otros compuestos como ácido ascórbico y compuestos de azufre. 
(José A. Barriero M.) 
● Aplicación de ácidos y reducción del pH. Las fenolasas tienen un pH óptimo entre 6 y 
7, si se reduce el pH la actividad se reduce, por debajo de pH =3 la actividad es 
prácticamente nula. Los ácidos más utilizados son el ácido cítrico, málico, fumárico, 
fosfórico y ascórbico. Las frutas y verduras se sumergen en soluciones ácidas antes de 
la congelación con este fin. (José A. Barriero M.) 
● Remoción de oxígeno como empacado al vacío o atmósferas inertes (N2) o 
protegiendo al producto del oxígeno del aire durante el proceso con procesos como la 
inmersión en agua. En las frutas congeladas, el tratamiento del alimento por inmersión 
en almíbares reduce la solubilidad del oxígeno en el tejido y retrasa la difusión de este 
y como consecuencia retrasa el oscurecimiento. (José A. Barriero M.) 
Pregunta 3. 
¿En qué rango de pH trabaja mejor la enzima amilasa? 
 
La amilasa salival o ptialina se obtiene de la saliva. Según Lesli Smit (2004), la saliva 
posee una variedad de amilasas que actúa sobre el almidón y algodón. 
 
Las α-amilasas son generalmente estables a pH 5.0-8.0, la actividad óptima de las α-
amilasas normalmente ocurre entre pH 4.8 a 6.5 (Maning y Campbell, 1961), pero el valor 
31 
 
apropiado dependerá de las diferentes enzimas de α-amilasas con la que se esté trabajando. 
Existen pocos reportes de α-amilasas con un pH óptimo por debajo de 5.0. 
 
La enzima amilasa salival es también conocida como ptialina. En el estómago, el HCl 
del jugo gástrico le da un carácter ácido con pH cercano a 2. El pH óptimo de la amilasa se 
encuentra alrededor de 7, por lo que llegado al estómago se inhibe la acción de la encima. 
(Arroyo A. et al., 2004) 
 
Conclusiones 
● La enzima catalasa está presente en todas las muestras dadas, papa, piña, zanahoria, 
melocotones, hígado, apio, cebolla, plátano, va a generar la descomposición del 
peróxido H2O2 la velocidad de esta reacción de descomposición aumenta hasta llegar 
a su punto óptimo el cual es a una temperatura de 32°C según los resultados 
experimentales y una actividad mínima cuando esta enzima se desnaturaliza, en otras 
pruebas como la realizada por Departamento de Química, Facultad de Ciencias, 
Universidad Nacional de Colombia se encontró una temperatura óptima de 37°C. Esta 
enzima se encuentra con una mayor actividad en el tejido del hígado, seguido en 
menor medida de la zanahoria, y menor actividad en los otros vegetales. 
● El almidón es descompuesto por las enzimas en la saliva α-AMILASA en sus 
monómeros más simples encontrándose glucosa en las muestras 2 y 4 luego de la 
reacción de hidrólisis. 
 
Anexo 
 
La utilización de enzimas inmovilizadas como aceleradores de reacciones químicas de 
interés industrial 
Las enzimas son proteínas, a menudo combinadas con otrasmoléculas tales como 
azúcares, que están presentes en todos y cada uno de los organismos vivos. Su función básica 
es la aceleración y en parte, también la regulación de las reacciones químicas necesarias para 
la vida. También los llamamos biocatalizadores. 
 
32 
 
En una parte importante de la llamada biotecnología blanca o industrial, las enzimas 
son producidas en grandes cantidades y utilizadas para acelerar reacciones con un interés 
comercial. Ante la química tradicional, las enzimas aportan las ventajas de ser selectivas para 
un tipo de reacción, específicas para un sustrato (molécula a convertir) concreto y de trabajar 
en condiciones mucho más suaves de temperatura y presión o utilizar y / o generar muchos 
menos productos contaminantes. En cuanto a su producción, bacterias, hongos o células 
animales son los huéspedes que, modificados genéticamente, nos sintetizan la enzima 
deseada. Una vez ya ha sido probada la eficiencia de estas "fábricas biológicas de enzimas", 
estas se emplean en la aceleración de reacciones para producir todo tipo de productos 
químicos: fármacos, suplementos nutricionales, aditivos alimentarios, fragancias, etc. 
 
Las enzimas se pueden utilizar mientras todavía están dentro del organismo que les ha 
producido, pero el sustrato tiene la tarea añadida de tener que entrar y salir de la célula, lo que 
no siempre es fácil. Por otro lado, también se pueden utilizar libres en solución acuosa, pero a 
menudo la enzima es desactivada por las nuevas condiciones en las que se encuentra. Existe 
una tercera opción. La unión de las enzimas libres a partículas sólidas, las enzimas 
inmovilizadas, confiere una mayor rigidez y estabilidad a la estructura tridimensional 
(esencial para ser activa) de la proteína y también permite separarlas fácilmente del resto de 
contenido. Ambos atributos combinados, hacen que sea posible la reutilización del 
biocatalizador en varios ciclos de reacción. De este modo, la cantidad de producto obtenido 
con una cierta cantidad de enzima, el llamado rendimiento del biocatalizador se ve 
incrementada significativamente y los costes del proceso disminuyen. 
 
En el Grupo de Ingeniería de Bioprocesos y Biocatálisis Aplicada, dentro del marco 
del proyecto europeo Roboxer, nos hemos encargado de la inmovilización y aplicación de 
enzimas que actúan en reacciones de intercambio de electrones, es decir, de oxidorreductasas. 
En colaboración con la Universidad de Maastricht, de entre estas oxidorreductasas, se 
pudieron inmovilizar y aplicar en reacción, dos de destacadas: la Ciclohexanona 
Monooxigenasa (EC 1.14.13.22) y la Glucosa Deshidrogenasa (EC 1.1.1.47). Ambas, clave 
para la producción de la trimetil-ε-caprolactona, un precursor del novedoso polímero que 
lleva el mismo nombre, poli-trimetil-ε-caprolactona. Este polímero se puede utilizar, entre 
otros, como aditivo en tintas de impresora mejorando la dispersión en la superficie aplicada. 
En nuestro caso, el hecho de utilizar la enzima inmovilizada ha implicado que se pueda 
producir 50 veces más de producto con la misma cantidad de enzima dada. 
33 
 
 
Figura 8. Bio-reactor y equipamiento utilizado en las transformaciones biocatalizadas. En la imagen 
izquierda, vista superior del reactor, se puede ver: el agitador, la sonda de pH, el condensador y las 
entradas de sustrato, NaOH (control pH) y aire. En la imagen central, vista frontal de todo el 
equipamiento, se puede ver: el bio-reactor encamisado (parte superior derecha de la imagen), el 
dosificador de sustrato (inferior de la imagen) y el controlador de pH (aparato central de la imagen). 
La imagen de la derecha es la vista frontal del bio-reactor con los mismos componentes descritos. 
(Solé, 2019) 
 
 
 
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1345680342040.html?noticiaid=1345788498856