Practica 9

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Universidad Autónoma De Baja California 
Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería 
Laboratorio de Microbiología General 
 
Practica 9: 
Pruebas Metabólicas para 
 la identificación de Género y 
Especie de un Microorganismo. 
Alumna: 
Flores Zapotl Gladiz Berenisse 
Grupo: 
452 
Fecha de entrega: 
17 de Mayo de 2022 
 
Docente: 
Dra. Bertha Landeros Sánchez 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
COMPETENCIA 
Identificación de género y especie de un microorganismo, a partir de la demostración de sus 
propiedades metabólicas y sus productos, para el apoyo del diagnóstico, con ética, y bioseguridad. 
FUNDAMENTO TEÓRICO 
La caracterización detallada de cualquier microorganismo general depende de la determinación de 
las características fisiológicas y bioquímicas específicas. La mayoría de las pruebas utilizadas para 
evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las bacterias, se llevan a cabo usualmente sub-
cultivando el aislamiento primario por transferencia a una serie de medios para pruebas 
diferenciales, las cuales pueden ser interpretadas luego de uno o más días de incubación adicional. 
Con estas pruebas de la actividad bioquímica de los microorganismos se puede realizar la 
identificación final de especies. La base de todas estas pruebas puede ser la presencia o ausencia 
en el microorganismo de una enzima, de un grupo de enzimas, o una vía metabólica completa. 
Pasos para la identificación de microorganismos de prueba 
Los siguientes pasos proporcionan un marco de referencia para realizar la identificación de los 
cultivos. 
1. Obtener un cultivo puro. 
2. Determinar sus necesidades de energía: Si es fototrófico, litotrófico o heterotrófico. Por medio 
de aislamiento y cultivo. 
3. Examen microscópico: Gram y morfología colonial. 
4. Buscar otras características microscópicas como: esporas, por medio de tinciones, o por 
siembra en medio que propicien la esporulación. 
5. Comprobar movilidad: En medio húmedos, e intentar deducir si es flagelado polar peritrico, y 
tinción de flagelos. 
6. Examinar colonias o masas de crecimiento de pigmentos u otras características especiales. 
7. Probar los requerimientos de oxígeno: aeróbico, anaeróbico, anaeróbico obligado o 
facultativo, o microaerofílico. 
8. Si es un organismo heterotrófilico, probar el catabolismo de la glucosa u otro azúcar simple. 
Oxidativa o fermentativa (O/F). 
9. Si es fototrófico, ver si también crece en la obscuridad aeróbica (característica de la bacteria 
púrpura no sulfurosa, Rhodospirillaceae). 
10. Si es litrotrófico, por lo general sa ha aislado en un donador de electrones inorgánico (Ej. 
Azufre, amonio, hierro). 
11. Después de todo lo anterior, intentar una identificación preliminar. A partir del grupo de 
géneros seleccionados completar las pruebas adicionales, si es necesario, para mejorar la 
identificación. 
En la tabla siguiente se encuentran las pruebas bioquímicas más importantes que se deben 
practicar para la identificación de un microorganismo. 
Pruebas diagnósticas importantes para bacterias 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PARTE EXPERIMENTAL. 
MATERIAL. 
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con caldo rojo de fenol con: Sacarosa. 
Manitol. 
Glucosa. 
Lactosa. 
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con medio KIA Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con 
medio LIA. 
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con medio de Citrato de Simmons. Tubos de ensaye 13 X 100 
con rosca con medio de Fenilalanina. 
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con medio MR-VP. 
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con caldo de urea. 
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con medio MIO. 
Cajas de Petri con Agar Almidón. 
Cajas de Petri con Gelatina. 
Cajas de Petri con Agar Sangre. 
Mecheros Meker. 
Mechero Bunsen. 
Alambre de picadura. 
Asa de nicromo. 
Pipeta Mohr de 1 ml. 
Solución de cloruro de mercurio al 12.5% Reactivo de Kovac. 
Papel tornasol rosa. Solución de lugol. Solución de rojo de metilo. Solución de -naftol. 
Solución de KOH creatina. 
TÉCNICA. 
Fermentación de los hidratos de Carbono. 
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada uno de los cuatro tubos de 
caldo Rojo de fenol que contienen glucosa, lactosa, sacarosa y manitol. 
B). Incubación a 37oC por 18 a 24 horas. 
C). Interpretación: 1. Positivo. 
1.1. Acido (A) pH: 6.8 
1.2. Color amarillo. 
1.3. Producción de gas. (G). Presencia de burbujas en el tubo de Durham (positivo) No presencia 
de burbujas y el medio de cultivo amarillo dentro 
del tubo de Durham (negativo). 
1.4. Registrar producción de ácido y gas. (AG). 
2. Retardada. Color anaranjado. Volver a inocular. 
3. Negativa. 
3.1 Alcalina. 
3.2. Color rosa-rojizo. 
 
Prueba del Citrato. Utilización del Citrato como única fuente de carbono. 
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo inclinado de Citrato de 
Simmons solo en el pico de flauta. 
B). Incubación a 37oC por 24 a 48 horas. En ocasiones hasta 4 días. 
C). Interpretación: 
1. Positivo Crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta. 
2. Negativo. No se observa crecimiento ni cambio de color (verde). 
 
Prueba con agar hierro de Kligler. 
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo inclinado de KIA . 
Primero con el alambre de picadura picar en el centro del tubo y proseguir en estría sobre el 
pico de flauta. 
B). Incubación a 37oC por 18 a 24 horas. 
C). Interpretación: 
1. Fermentación de la glucosa solamente. 
1.1. Pico de flauta alcalino (rojo). 
1.2. Capa profunda ácida (amarillo). 
1.3. Producción de gas SH2 (negro). 
 2. Fermentación de la glucosa y la lactosa. 
 2.1 Pico de flauta acido (Amarillo). 
 2.2 Capa profunda acida (amarillo). 
 3. No fermentación de ningún azúcar. 
3.2 Pico de flauta alcalino (rojo) 
 3.2. Capa profunda (rojo). 
 
4.Producción de gas rompimiento del medio o burbujas en el medio se considera positivo y 
si no hay producción de gas es negativo (anaerógenico). 
 
Prooducción de acetoína. Reacción de Voges-Proskauer. 
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de caldo de VP. 
B). Incubación a 37oC por 24 a 48 horas En ocasiones e necesitan hasta 10 días de incubación. 
C). Agregar 1.2 ml. de la solución de α-naftol al 5%. 
D). Agregar 0.4 ml. de sol. de KOH al 40%. 
E). Agitar y dejar reposar 10-15 min. 
F). Interpretación. 
1. Positiva. Color rojo rosado en la superficie del medio. 
2. Negativa. Color amarillo en la superficie del medio. 
 
Prueba cuantitativa de la producción de ácido. Prueba del rojo de metilo. 
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de caldo de Rojo de metilo 
B). Incubación a 37oC por 3 a 5 días. 
C). Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo. 
D). Interpretación: 
1. Positivo. Color rojo brillante. 
2. Negativo. Color amarillo definido. 
 
Prueba de la decarboxilasa, desaminación y producción de H2S. 
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de agar LIA, con 
alambre de picadura, primero por picadura en la capa interna y proseguir con estría cruzada 
en el pico de flauta. 
B). Incubación a 37oC por 24 a 48 horas. 
Interpretación: 
1. Decarboxilación positiva por reacción alcalina en el fondo (púrpura) 
Desaminación positiva, por coloración roja en la superficie. 
Producción de H2S por precipitado negro. 
Fermentación de la glucosa únicamente. Es una reacción negativa (púrpura la superficie y amarillo 
el fondo). 
Prueba de la movilidad, producción de Indol y decarboxilación de ornitina. 
A). Inocular una asada con alambre de picadura de la cepa bacteriana proporcionada a cada 
tubo de medio MIO, cuidando de picar solo por el centro con mucha precaución. 
B). Incubación a 37oC por 24 a 48 horas. 
C). Agregar reactivo de Kovacs o de Ehrlich para interpretar la prueba del Indol. 
D). Interpretación: 
1.Indol. 
1.1. Positivo. Anillo color rojo en la superficie del medio en la capa alcohólica. 
1.2. Negativo. No se produce color, toma el color del reactivo (amarillo). 
1.3. Variable. Color anaranjado en la superficie del medio, debido a la 
presencia de escatol, compuesto precursor del Indol. 
2. Ornitina 
2.1. Positivo. Un color púrpura en la superficie del medio (alcalino). 
2.2. Negativo. Color púrpura en la superficie, con una banda amarilla a lo largo del tubo (ácido). 
3. Movilidad. 
3.1. Positivo. Crecimiento extendido de la línea de inoculación. 
3.2. Negativo. Crecimiento solo sobre la línea de inoculación. 
 
Prueba de la fenilalanina-desaminasa. 
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de agar de Fenilalanina. 
B). Incubación a 37oC por 4, 18 o 24 horas. 
C). Agregar 5 gotas del indicador de cloruro férrico. 
D). Interpretación: 
1. Positivo. Color verde. 
2. Negativo. Color amarillo. 
 
Licuefacción de la gelatina. 
A). Inocular una caja de Gelatina o un tubo con la cepa bacteriana proporcionada B). Incubación a 
22-25 o 35oC por 24horas a 14 días. 
C). Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo. 
D). Interpretación: 
1. Positivo. Medio licuado. 
2. Negativo. Medio sólido. 
 
Prueba de la Ureasa. 
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de caldo de urea. 
B). Incubación a 37oC por 8, 12, 24 y 48horas. 
C). Interpretación: 
1. Positivo. Color rojo rosado intenso en todo el caldo. 
2. Negativo. No se produce cambio de color. (Color amarillo anaranjado)
 
 
PRUEBA 
MICROORGANISMO 
Resultado Foto 
Fermentación de glucosa 
Negativo se observa 
un viraje rosa-rojizo 
levemente. 
 
Fermentación de Dextrosa Negativo no hay 
cambio de color. 
 
 
 
 
Fermentación de Manitol Negativo no hay 
cambio de color. 
 
 
 
 
 
 
Fermentación de lactosa Negativo no hay 
cambio de color. 
 
RESULTADOS. 
PRUEBAS CON CARBOHIDRATOS. 
 
Utilización de citrato Negativo no se observa 
crecimiento, ni cambio 
de color persiste el 
verde. 
 
Rojo de Metilo (MR) Negativo existe un 
viraje amarillo definido 
en la prueba. 
 
 
Voges-Proskauer (VP) Negativa debido a que 
manifiesta un viraje 
amarillo en el medio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PRUEBA CON PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS 
 
Prueba con agar hierro de Kligler 
(KIA) 
*En fermentación de la 
glucosa existe una 
capa profunda acidas 
virando un color 
amarillo. 
*En fermentación de 
glucosa y lactosa, el 
pico de flauta es acido 
(amarillo) y de igual 
forma la capa profunda 
es acida (amarilla). 
*Es positivo en 
producción de gas 
debido a que presenta 
un rompimiento del 
medio. 
 
 
PRUEBA 
MICROORGANISMO 
Resultados Foto 
Decarboxilasa desaminación y 
producción de H2S. 
 
 
 Descarboxilación positiva 
manifiesta una reacción 
alcalina en el fondo virando 
púrpura. 
 
Producción de Indol, Movilidad y 
descarboxilación de ornitina 
 Indol: Positivo manifiesta un 
anillo color rojo en la 
superficie del medio de la 
capa. 
Ornitina: Negativo 
Movilidad: Positivo hay 
crecimiento extendido de la 
línea de inoculación. 
 
Licuefacción de gelatina Positivo para medio licuado 
 
Fenilalanina desamilasa Negativo manifiesta un color 
amarillo en el medio. 
 
 
PRESENCIA DE ENZIMAS 
 
 
 
OBSERVACIONES 
Se utilizo un agar selectivo MacConkey para inocular la Bacteria 
Salmonella es un Bacilo Gram Negativo de la familia 
Enterobacteriaceae; realizaron pruebas bioquímicas y se obtuvo los 
siguientes resultados. 
Para las pruebas de fermentación de hidratos de carbono, mediante 
Glucosa, Dextrosa, Manitol, Lactosa se obtuvieron resultados 
negativos. En el caso para el citrato de Simmons se obtuvo un 
resultado negativo no se observó crecimiento, ni cambio de color 
persiste el verde. Para las pruebas de Rojo de Metilo y Voges-
Proskauer se obtuvo un resultado negativo manifestando un viraje 
amarillo en el medio. 
La prueba de con agar hierro de Kligler (KIA); hay fermentación de glucosa manifestados una capa 
profunda acida de color amarillo; en la fermentación de la glucosa y lactosa en el pico de flauta es 
existe un color amarillo indicando ácido de igual forma la capa profunda es ácida (amarilla). Es 
positivo en producción de gas debido a que presenta un rompimiento en el medio. 
En la prueba de la decarboxilasa, desaminación y producción de H2S el resultado es positiva 
manifiesta una reacción alcalina en el fondo virando púrpura. Para la prueba Producción de Indol, 
Movilidad y descarboxilación de ornitina para Indol manifiesta un resultado Positivo existe un anillo 
color rojo en la superficie del medio de la capa; para Ornitina es negativo y para Movilidad se obtiene 
un resultado positivo existe crecimiento extendido en la línea de inoculación. 
 
PRUEBA 
MICROORGANISMOS 
Resultado Foto 
Prueba de la ureasa Positivo manifiesta un 
viraje rosado intenso 
uniforme en todo el caldo. 
 
Para la prueba de Licuefacción de Gelatina tenemos un resultado positivo para medio licuado. En 
Fenilalanina Desamilasa es negativo manifiesta un color amarillo en el medio. Y para la prueba de 
la Ureasa existe un viraje rosado intenso uniforme en todo el caldo obtenido como resultado positivo. 
 
CONCLUSIÓN 
Las pruebas bioquímicas nos permiten identificar de forma más certera la bacteria ya que nos 
permite identificar las características metabólicas de acuerdo con estas características concluimos 
que es salmonella. 
ANEXO 
Fermentación de los hidratos de carbono: Las bacterias anaerobias o anaerobias facultativas a 
menudo fermentan carbohidratos a ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2). Estos pueden detectarse 
incluyendo en el medio un indicador de pH. 
Ureasa: Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de 
amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las 
especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que 
dan negativo o positivo retardado. La prueba también se utiliza para diferenciar Physobacter 
phenylpyruvicus de Moraxella spp. Helicobacter pylori y Brucella spp. también hidrolizan la urea. 
Esta prueba puede ayudar en la identificación de Cryptococcus spp. que produce un resultado 
positivo después de una incubación prolongada. 
Rojo de metilo: El rojo de metilo es un indicador de pH. Actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde 
rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Mediante esta prueba se comprueba la capacidad de un 
microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación 
de la glucosa por la vía de la fermentación acido-mixta. Se utiliza como parte de la identificación a 
nivel de especie de los bacilos entéricos gramnegativos. 
Voges-Proskauer: Permite observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía 
butanodiolica. Si es asÌ, se forma un producto intermedio (acetoÌna) que forma un complejo de color 
rojizo con el α-naftol. Se usa en la identificaciÛn a nivel de especie de bacilos entÈricos 
gramnegativos, Aeromonas spp., y Vibrio spp. 
Prueba de citrato: Determina si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de 
carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando 
una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes 
géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin 
embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer 
con esos nutrientes. 
Prueba de la Fenilalanina Desaminasa: Determina la capacidad de un organismo para desaminar 
el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por la actividad de la enzima fenilalanina 
desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática escaracterística de 
todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos 
géneros de otras enterobacterias. El ácido fenilpirúvico puede detectarse por la adición de un 
reactivo (cloruro férrico al 10%). 
Prueba con agar hierro de kligler (KIA): Mediante esta prueba se puede determinar: 
a. La capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono específico (en este 
caso glucosa, lactosa o ambas) incorporado en un medio de crecimiento básico. 
b. Producción o no de gases: CO2 e H2 como productos finales del metabolismo de los hidratos 
de carbono. 
c. Producción de ácido sulfhídrico (SH2). 
El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa. Existe otro medio, el 
triple sugar iron (TSI) que posee un tercer hidrato de carbono, la sacarosa. 
 
Prueba de la decarboxilasa, desaminación y producción de H2S: La descarboxilación es un 
proceso en el cual las descarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando 
la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en la identificación de 
enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La descarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina 
y putrescina (diaminas), mientras que la descarboxilación de arginina da citrulina por acción de una 
dehidrolasa. Esta prueba se debe realizar con un tubo control que contiene el medio base sin 
aminoácido. Como la descarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una 
capa de aceite mineral estéril. El proceso se produce en dos etapas: por fermentación de la glucosa 
se produce una acidificación del medio (pH < 6,0), apareciendo color amarillo. La acidificación es 
necesaria para que ocurra la descarboxilación. Este último proceso da lugar a la formación de las 
aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador a color violeta. Esta prueba se 
utiliza tanto en la identificación de bacilos gramnegativos como de bacilos y cocos grampositivos. 
 
Licuefacción de la gelatina: Esta prueba muestra la capacidad de ciertos microorganismos para 
hidrolizar la gelatina a péptidos y aminoácidos, mediante la acción de enzimas específicas 
denominadas gelatinasas. 
Prueba de la movilidad, producción de Indol y decarboxilación de ornitina: Mediante esta 
prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la 
degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa. 
 
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
[1] Cercenado. E, Cantón. R. Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de 
microbiología.Seimc.org. Recuperado el 9 de mayo de 2022, de 
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-
procedimientomicrobiologia37.pdf 
 
[2] Ulpgc.es. Recuperado el 9 de mayo de 2022, de 
https://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/35/35729/pruebas_bioquimicas_de_identificacion_
de_bacterias.pdf 
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf