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T UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
“DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO 
PARA CUANTIFICAR PARACETAMOL EN PLASMA POR 
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN” 
 
 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 
 
 
PRESENTA 
JESÚS ALBERTO MOJICA YAÑEZ 
 
 
 MÉXICO, CD. MX. AÑO 2017 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: HELGI JUNG COOK 
VOCAL: Profesor: JUAN MANUEL RODRIGUEZ 
SECRETARIO: Profesor: MARÍA ISABEL RUIZ OLMEDO 
1er. SUPLENTE: Profesor: SILVIA CITLALLI GAMA GONZALEZ 
2° SUPLENTE: Profesor: KENNETH RUBIO CARRASCO 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
INVESTIGACIÓN FARMACOLÓGICA Y BIOFARMACÉUTICA S.A.P.I. de C.V. (IFaB) 
 
ASESOR DEL TEMA: DRA. EN C. MARÍA ISABEL RUIZ OLMEDO 
 
SUPERVISOR TÉCNICO: M. EN A. OMAR EMMANUEL HERNÁNDEZ PIÑA 
 
SUSTENTANTE: JESÚS ALBERTO MOJICA YAÑEZ 
 
 
 
 
 
 
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ÍNDICE GENERAL 
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................... 7 
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................. 9 
ABREVIATURAS ....................................................................................................................... 10 
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 12 
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 14 
3. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................. 14 
3.1 Generalidades del principio activo ............................................................................... 14 
3.1.1 Propiedades fisicoquímicas .................................................................................. 14 
3.1.2 Indicaciones terapéuticas y régimen de dosificación ............................................ 14 
3.1.3 Clasificación ATC y biofarmacéutica .................................................................... 15 
3.1.4 Propiedades farmacodinámicas ........................................................................... 15 
3.1.5 Propiedades farmacocinéticas ............................................................................. 15 
3.1.6 Contraindicaciones ............................................................................................... 17 
3.1.7 Reacciones adversas ........................................................................................... 18 
3.2 Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) ........................................................ 18 
3.2.1 Definición y clasificación ...................................................................................... 18 
3.2.2 Instrumentación general para CLAR .................................................................... 19 
3.3 Métodos analíticos para cuantificar paracetamol en fluido biológico ............................ 20 
3.4 Validación de métodos bioanalíticos ........................................................................... 22 
4. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................... 27 
4.1 Reactivos, sustancias de referencia, material, equipos e instrumentos y matriz 
biológica ................................................................................................................................ 27 
4.1.1 Reactivos ............................................................................................................. 27 
4.1.2 Sustancias de referencia ...................................................................................... 27 
4.1.3 Material ................................................................................................................ 27 
4.1.4 Equipos e instrumentos ........................................................................................ 28 
4.1.5 Matriz biológica .................................................................................................... 28 
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4.2 Preparación de soluciones utilizadas para la etapa de validación. .............................. 28 
4.3 Desarrollo del método analítico ................................................................................... 30 
4.3.1 Elección del estándar interno ............................................................................... 30 
4.3.2 Condiciones cromatográficas ............................................................................... 30 
4.3.3 Método de extracción ........................................................................................... 31 
4.4 Validación del método bioanalítico .............................................................................. 31 
4.4.1 Preparación de curva de calibración y controles de calidad en plasma. ............... 32 
4.4.2 Adecuabilidad del sistema cromatográfico ........................................................... 33 
4.4.3 Selectividad .......................................................................................................... 34 
4.4.3.1 Selectividad de la corrida analítica .................................................................... 34 
4.4.3.2 Selectividad a la matriz biológica ...................................................................... 34 
4.4.3.3 Selectividad a fármacos de uso común............................................................. 35 
4.4.4 Acarreo (efecto residual) ...................................................................................... 35 
4.4.5 Curva de calibración ............................................................................................ 35 
4.4.6 Precisión .............................................................................................................. 36 
4.4.6.1 Repetibilidad ..................................................................................................... 36 
4.4.6.2 Reproducibilidad ............................................................................................... 37 
4.4.7 Exactitud .............................................................................................................. 37 
4.4.8 Estabilidad ........................................................................................................... 38 
4.4.8.1 Estabilidad de la muestra a corto plazo ............................................................ 38 
4.4.8.2 Estabilidad de la muestra a largo plazo ............................................................ 38 
4.4.8.3 Estabilidad de la muestra procesada ................................................................ 38 
4.4.8.4 Estabilidad a ciclos de congelación/descongelación ......................................... 39 
4.4.9 Estabilidad en solución .........................................................................................39 
4.4.10 Reproducibilidad de la reinyección ....................................................................... 40 
4.5 Aplicación del método al análisis de muestras plasmáticas de un estudio de 
bioequivalencia ...................................................................................................................... 41 
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................................ 43 
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5.1 Desarrollo del método analítico ................................................................................... 43 
5.1.1 Elección del estándar interno ............................................................................... 43 
5.1.2 Condiciones cromatográficas ............................................................................... 44 
5.1.3 Método de extracción ........................................................................................... 45 
5.2 Validación del método analítico ................................................................................... 47 
5.2.1 Adecuabilidad del sistema cromatográfico ........................................................... 47 
5.2.2 Selectividad .......................................................................................................... 47 
5.2.2.1 Selectividad de la corrida .................................................................................. 47 
5.2.2.2 Selectividad a la matriz biológica ...................................................................... 48 
5.2.2.3 Selectividad a fármacos de uso común............................................................. 49 
5.2.3 Acarreo ................................................................................................................ 50 
5.2.4 Curva de calibración ............................................................................................ 52 
5.2.5 Precisión y Exactitud ............................................................................................ 54 
5.2.5.1 Repetibilidad ..................................................................................................... 54 
5.2.5.2 Reproducibilidad y Exactitud ............................................................................. 55 
5.2.6 Estabilidad ........................................................................................................... 57 
5.2.6.1 Estabilidad de la muestra a corto plazo ............................................................ 57 
5.2.6.2 Estabilidad de la muestra a largo plazo ............................................................ 58 
5.2.6.3 Estabilidad de la muestra procesada ................................................................ 59 
5.2.6.4 Estabilidad a ciclos de congelación/descongelación ......................................... 60 
5.2.7 Estabilidad en solución ......................................................................................... 61 
5.2.8 Reproducibilidad de la reinyección ....................................................................... 63 
5.3 Aplicación del método al análisis de muestras plasmáticas de un estudio de 
bioequivalencia ...................................................................................................................... 65 
6. CONCLUSIONES............................................................................................................... 71 
7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 72 
 
 
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ÍNDICE DE TABLAS 
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas del paracetamol. .............................................................. 14 
Tabla 2. Clasificación ATC del paracetamol. ............................................................................. 15 
Tabla 3. Instrumentación para CLAR. ....................................................................................... 20 
Tabla 4. Métodos analíticos para cuantificar paracetamol en tabletas y plasma humano por 
CLAR. ....................................................................................................................................... 21 
Tabla 5. Comparativo de la NOM-177-SSA1-2013 y la RESOLUÇÃO RDC N. º 27. ................. 23 
Tabla 6. Preparación de curva de calibración y controles de calidad en sistema y en plasma. . 33 
Tabla 7. Condiciones cromatográficas para el análisis de paracetamol. ................................... 44 
Tabla 8. Resultados de adecuabilidad del sistema cromatográfico de las corridas analíticas de 
la validación del método para paracetamol y diprofilina (E.I.) .................................................... 47 
Tabla 9. Resultados de las curvas de calibración del método analítico para cuantificar 
paracetamol en plasma (Concentración recuperada). ............................................................... 52 
Tabla 10. Parámetros de linealidad del método analítico para cuantificar paracetamol en 
plasma. ..................................................................................................................................... 52 
Tabla 11. Resultados de repetibilidad del método analítico para cuantificar paracetamol en 
plasma. ..................................................................................................................................... 54 
Tabla 12. Resultados de reproducibilidad y exactitud método analítico para cuantificar 
paracetamol en plasma. ............................................................................................................ 56 
Tabla 13. Resultados de estabilidad de paracetamol en plasma a temperatura ambiente (15-30 
oC) 3.3 horas. ............................................................................................................................ 57 
Tabla 14. Resultados de estabilidad de paracetamol en plasma a temperatura ambiente (15-30 
oC) 66.1 horas. .......................................................................................................................... 57 
Tabla 15. Resultados de estabilidad de paracetamol en plasma en refrigeración (2-8 oC) 66.1 
horas. ........................................................................................................................................ 58 
Tabla 16. Resultados de estabilidad de paracetamol en plasma en congelación (no mayor a -20 
oC) 66.1 horas. .......................................................................................................................... 58 
Tabla 17. Resultados de estabilidad de paracetamol en plasma en congelación (-70 ± 10 oC) 
117 días. ................................................................................................................................... 58 
Tabla 18. Resultados de estabilidad de paracetamol en muestra procesada en automuestreador 
(20 oC) 24 horas. ....................................................................................................................... 59 
Tabla 19. Resultados de estabilidad de paracetamol en muestra procesada en automuestreador 
(20 oC) 48 horas. ....................................................................................................................... 59 
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Tabla 20. Resultados de estabilidad de paracetamol en muestra procesada en refrigeración (2-8 
oC) 24 horas. ............................................................................................................................. 60 
Tabla 21. Resultados de estabilidad de paracetamol en muestra procesada extracto seco (2-8 
oC) 24 horas. ............................................................................................................................. 60 
Tabla 22. Resultados de estabilidad de paracetamol a cuatro ciclos de 
congelación/descongelación (-70 ± 10 oC). ...............................................................................61 
Tabla 23. Resultados de estabilidad en solución principal de paracetamol A (2000 µg/mL) 
almacenada a temperatura ambiente, en refrigeración y congelación. ...................................... 61 
Tabla 24. Resultados de estabilidad en solución de trabajo de paracetamol B (100 µg/mL) 
almacenada a temperatura ambiente, en refrigeración y congelación. ...................................... 62 
Tabla 25. Resultados de estabilidad en solución principal de diprofilina (E.I.) (200 µg/mL) 
almacenada a temperatura ambiente, en refrigeración y congelación. ...................................... 63 
Tabla 26. Resultados de reproducibilidad de la reinyección. ..................................................... 64 
Tabla 27. Parámetros farmacocinéticos para paracetamol ........................................................ 70 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura 1. Metabolismo de paracetamol. ................................................................................... 17 
Figura 2. Instrumentación general de un cromatógrafo de líquidos. ......................................... 19 
Figura 3. Estrategia de selección para el E.I. ........................................................................... 30 
Figura 4. Condiciones cromatográficas evaluadas. .................................................................. 30 
Figura 5. Técnicas de extracción evaluadas. ........................................................................... 31 
Figura 6. Cromatogramas de muestra blanco (B) y estándar de calibración (CP7). ................. 44 
Figura 7. Cromatograma de estándar de calibración (CP7). .................................................... 45 
Figura 8. Técnica líquido- líquido con evaporación para la extracción de paracetamol y 
diprofilina (E.I.). ......................................................................................................................... 46 
Figura 9. Cromatogramas de LIC (límite inferior de cuantificación), muestra doble blanco (DB) y 
muestra blanco (B). ................................................................................................................... 48 
Figura 10. Cromatogramas de LIC (límite inferior de cuantificación), fuente de plasma individual 
(F_1851), hemolizada (M_335) y lipémica (L_1670). ................................................................. 49 
Figura 11. Cromatogramas de fármacos de uso común LIC (límite inferior de cuantificación), 
AS (ácido salicílico), NAP (naproxeno), CAF (cafeína) y NIC (nicotina). .................................... 50 
Figura 12. Cromatogramas acarreo; LIC (límite inferior de cuantificación), LSC (límite superior 
de cuantificación) y DB_1 y 2 (doble blanco). ............................................................................ 51 
Figura 13. Cromatogramas de estándares de calibración (CP1, CP5 y CP10). ....................... 53 
Figura 14. Curvas de calibración para cuantificar paracetamol en plasma. .............................. 53 
Figura 15. Cromatogramas de los controles de calidad (CCB, CCBB, CCM, CCA y CCD) y 
límite inferior de cuantificación (LIC). ......................................................................................... 55 
Figura 16. Cromatogramas selectividad de la corrida; BR (Blanco de reactivos), DB (Doble 
blanco) y B (Blanco). ................................................................................................................. 66 
Figura 17. Curva de calibración de una corrida analítica. ........................................................ 67 
Figura 18. Cromatogramas de controles de calidad (CCB, CCBB, CCM, CCA). ...................... 68 
Figura 19. Cromatogramas de acarreo; LIC (límite inferior de cuantificación), LSC (límite 
superior de cuantificación) y DB_1 y 2 (doble blanco). .............................................................. 69 
 
 
 
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ABREVIATURAS 
± Más menos 
oC Grados celsius 
µg Microgramo 
µL Microlitro 
µm Micrómetro 
ACN Acetonitrilo 
AINEs 
 
 
Antinflamatorios no esteroideos 
 
 
ANVISA 
 
 
Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria (en portugués Agência 
Nacional de Vigilância Sanitária) 
ATC 
 
Anatómica, Terapéutica, Química (ATC: Anatomical, Therapeutic, 
Chemical classification system) 
 BCS 
Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (BCS: Biopharmaceutics 
Classification System) 
CCA Control de calidad nivel alto 
CCB Control de calidad nivel bajo 
CCBB Control de calidad nivel bajo B 
CCD Control de calidad nivel diluido 
CCM Control de calidad nivel medio 
CLAR Cromatografía líquida de alta resolución 
Cmáx Concentración plasmática máxima 
cm Centímetro 
cm2 Centímetro cuadrado 
COFEPRIS Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios 
CONBIOÉTICA Comisión Nacional de Bioética 
Conc. Concentración 
COSUFAR Comité Mexicano de Sustancias Farmacéuticas de Referencia 
COX Ciclooxigenasa 
CP Estándar de calibración 
CPDA Anticoagulante de citrato fosfato dextrosa adenina (CPDA: Citrate 
Phosphate Dextrose Adenine) 
C.V.% Porciento del coeficiente de variación 
DAD Detector de arreglo de diodos 
DB Doble blanco 
D.E. Desviación estándar 
Desv. Abs. % Desviación absoluta 
EDQM European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare 
E.I. 
 
 
Estándar interno 
EMEA/CHMP European Medicines Agency/ Committee for Medicinal Products for 
Human Use 
FDA Food and Drug Administration 
g Gramos 
h Horas 
IFaB Investigación Farmacológica y Biofarmacéutica S.A.P.I. de C.V 
IUPAC Unión Internacional de Química Pura y Aplicada 
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Ke Constante de eliminación 
Kg Kilogramo 
L Litro 
LIC Límite inferior de cuantificación 
LSC Límite superior de cuantificación 
M Molar 
MeOH Metanol 
mg Miligramo 
min Minuto 
mL Mililitro 
mm Milímetro 
mM Milimolar 
MS-MS Espectrometría de masas /masas 
MTBE Metilterbutiléter 
NAPQI N-acetil-p-benzoquinona-imina 
NOM Norma Oficial Mexicana 
n Número de inyecciones 
nm Nanómetro 
pH Potencial de hidrógeno 
PRC Paracetamol 
rpm Revoluciones por minuto 
SNC Sistema nervioso central 
TSRL Laboratorios de Investigación de Sistemas Terapéuticos (TSRL: 
Therapeutic Systems Research Laboratories) 
 
UV Detector de espectrofotometría ultravioleta 
UV/Vis Detector de espectrofotometría ultravioleta/visible 
v/v Relación volumen/volumen 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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1. INTRODUCCIÓN 
Los medicamentos genéricos intercambiables son productos desarrollados, fabricados y 
comercializados después de que la patente para un ingrediente activo ha expirado y que 
poseen la misma composición cuali-cuantitativa y forma farmacéutica que un medicamento de 
referencia. La equivalencia farmacéutica se evalúa mediante estudios o pruebas de 
intercambiabilidad que determinan si la velocidad de absorción y la cantidad absorbida del 
principio activo es igual a la del medicamento de referencia a través de pruebas in vivo, o bien 
estudios in vitro. 
En 2013 la Norma Oficial 177 la cual rige la evaluación de la intercambiabilidad en México, 
sufrió cambios importantes debido al avance de la tecnología, la actualización de sistemas de 
gestión de calidad y la armonización con entidades regulatorias internacionales. Esto propició la 
modificación para la evaluación de los parámetros de desempeño en la validación de 
metodologías, promoviendo con ello la revalidación de los métodos analíticos ya existentes en 
los Terceros Autorizados y en algunos casos, fue necesario desarrollar y validar las 
metodologías analíticas por completo. 
En México, los Terceros Autorizados apoyan a la Autoridad Sanitaria en el control y vigilancia 
sanitarios. Mediante la realización de pruebas analíticas, de verificación o estudios de 
bioequivalencia y/o biocomparabilidad. Las unidades de intercambiabilidad, son instancias 
analíticasy clínicas que realizan los estudios para demostrar intercambiabilidad de 
medicamentos; asegurando la validez y confiabilidad de los resultados obtenidos con base a un 
sistema de gestión de calidad de acuerdo con la regulación vigente nacional e internacional 
según sea el caso y en apego a lo descrito en las normas y guías correspondientes.1 
Por otro lado, la Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria (ANVISA) autorizó a Unidades de 
Bioequivalencia Mexicanas para realizar estudios de bioequivalencia en territorio nacional lo 
cual permitió que con un solo estudio los laboratorios patrocinadores pudieran obtener el 
registro del medicamento genérico en México y en Brasil al mismo tiempo realizando estudios 
en territorio nacional. 
El paracetamol es uno de los fármacos más utilizados y vendidos a nivel mundial, es un 
componente importante en numerosos medicamentos antigripales y analgésicos de prescripción 
común. Tan sólo en México, en 2015 se consumieron 600 millones de cajas de medicamentos 
que contienen este principio activo (libre venta y/o con receta médica), y en el mercado existen 
más de 400 medicamentos con este principio activo según datos de la COFEPRIS. 
Prácticamente se consumieron 5 cajas de paracetamol en el país, considerando el número de 
habitantes registrados en 2015.2 
Debido a que se existen diversas presentaciones y dosis de este principio activo los laboratorios 
farmacéuticos nacionales e internacionales aún ven un nicho de comercialización de 
medicamentos genéricos de dicho fármaco en nuestro país. 
La validación de un método bioanalítico implica un proceso experimental que se documenta y 
donde se establece que un método analítico tiene la capacidad para determinar uno o más 
analitos en matrices biológicas de manera fiable. 
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Si bien es cierto que existen diversas metodologías analíticas validadas aplicadas a estudios de 
bioequivalencia para paracetamol con base a la NOM-177-SSA1-1998. El presente trabajo tiene 
como objetivo el desarrollo y validación de un método analítico para la cuantificación de 
paracetamol en plasma humano, empleando cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) 
acoplada a un detector UV, que cumple con lo descrito por dos entidades regulatorias, en 
primera instancia para la regulación nacional la cual se apega a la Norma Oficial Mexicana 
NOM-177-SSA1-2013 y en segundo lugar a la regulación brasileña mediante el apego a la 
RESOLUÇÃO RDC N. º 27, emitida por ANVISA. 
Por otro lado, método una vez validado fue aplicado a muestras plasmáticas provenientes de un 
estudio de bioequivalencia para la evaluación de la intercambiailidad de un producto genérico 
en México y en Brasil (tabletas de paracetamol de 500 mg). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2. OBJETIVOS 
 Desarrollar un método analítico para la cuantificación de paracetamol en plasma 
humano por cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR) acoplada a un sistema 
de detección UV. 
 Validar el método analítico de acuerdo a los parámetros de desempeño descritos en la 
NOM-177-SSA1-2013 y a la RESOLUÇÃO RDC N. º 27. 
 Retar el método analítico validado aplicándolo a muestras plasmáticas provenientes de 
un estudio de bioequivalencia después de la administración oral de paracetamol a una 
dosis única de 500 mg. 
3. MARCO TEÓRICO 
3.1 Generalidades del principio activo 
3.1.1 Propiedades fisicoquímicas 
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas del paracetamol. 
Nombre Paracetamol (acetaminofén) 
Nombre IUPAC N-(4-hidroxifenil) acetamida 
Fórmula molecular C8H9NO2 
Estructura 
molecular 
 
Peso molecular 151.16 g/mol 
pKa 9.38 
Solubilidad 
Una parte de paracetamol es soluble en 70 partes de agua a 
temperatura ambiente y soluble 1 en 20 partes de agua 
hirviendo. En agua 14.0 mg/mL a 25 oC. 
Soluble en metanol, etanol, dimetilformamida, dicloruro de 
etileno, acetona, acetato de etilo. 
Punto de fusión 168 -171 oC 
Apariencia Polvo finamente cristalizado de color blanco.3, 4 y 5. 
 
3.1.2 Indicaciones terapéuticas y régimen de dosificación 
El paracetamol (también conocido como acetaminofén) tiene propiedades 
analgésicas, antipiréticas y poca actividad antiinflamatoria. Se utiliza para el 
tratamiento en el alivio temporal de dolor leve a moderado en dolor de cabeza, 
dental, muscular, de espalda baja, para el dolor relacionado con artritis, dolor 
premenstrual y menstrual y especialmente para aliviar estados febriles.3 y 6 
 
Cuando se emplea a las dosis recomendadas tiene un excelente perfil de 
seguridad.3 Actualmente para formulaciones orales (tabletas con 500 mg de 
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paracetamol), en población adulta mexicana la dosis para analgesia y control de 
la fiebre es de 250 a 500 mg cada cuatro o seis horas.7 
 
3.1.3 Clasificación ATC y biofarmacéutica 
La clasificación anatómica, terapéutica, química (ATC) del paracetamol es 
N02BE01. Cuyo significado se presenta en la tabla 2. 3 y 5 
Tabla 2. Clasificación ATC del paracetamol. 
N N02 N02B N02BE N02BE01 
Sistema nervioso Analgésicos Otros analgésicos y antipiréticos Anilidas Paracetamol 
 
De acuerdo con la base de datos de Therapeutic Systems Research Laboratories 
(TSRL), Inc. El paracetamol se clasifica como CLASE IV (baja permeabilidad, 
baja solubilidad) en el Sistema de Clasificación Biofarmacéutica (BCS). 8 
3.1.4 Propiedades farmacodinámicas 
El paracetamol actúa a nivel del sistema nervioso central (SNC), incrementando 
el umbral al dolor inhibiendo las isoenzimas ciclooxigenasa (COX-1, COX-2 y 
COX-3) implicadas en la síntesis de prostaglandinas, de ahí su efecto analgésico 
central. Las propiedades antipiréticas probablemente se deben a la acción sobre 
el centro termorregulador del hipotálamo, lo que deriva en vasodilatación 
periférica, sudoración y la disipación de calor.3 y 6 
 
El acetaminofén no inhibe las ciclooxigenasas presentes en tejido periférico y, por 
ende, no tiene efecto antiinflamatorio a nivel de periferia. La inhibición indirecta 
de la COX es aminorada en presencia de peróxidos, esto puede explicar porque 
el fármaco es efectivo en SNC y células endoteliales, pero no en plaquetas y 
células inmunes que tienen altos niveles de peróxidos, presentes en los sitios de 
inflamación.3, 6 y 9 
 
Se ha informado que el paracetamol activa vías serotoninérgicas promoviendo un 
efecto antinociceptivo.10 
3.1.5 Propiedades farmacocinéticas 
Absorción 4, 6 y 11 
 
El paracetamol se absorbe rápida y casi totalmente en tracto gastrointestinal 
principalmente en intestino delgado, la absorción se produce por transporte 
pasivo. Los alimentos reducen la absorción del fármaco debido al retraso en el 
vaciado gástrico, aumentando el Tmáx y disminuyendo los valores de Cmáx. Palma-
Aguirre JA11 reportan un Cmáx de 6.76 ±1.75 µg/mL y un Tmáx de 0.63 ± 0.35 h 
para una tableta con 300 mg de paracetamol, en población mexicana. 
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Biodisponibilidad 4 y 6 
 
La biodisponibilidad relativa de paracetamol es 85 a 98%. Se sabe que en estado 
de ayuno la biodisponibilidad absoluta del fármaco es de 62 a 89%. 
 
La biodisponibilidad absoluta por vía oral no varía con la dosis en el rango de 
entre 5 y 20 mg/Kg. 
 
Distribución 4, 6 y 12 
 
Se distribuye ampliamente en casi todos los líquidos corporales. El volumen 
aparente de distribución de paracetamol es de 0.69 a 1.36 L/Kg. La unión a 
proteínas plasmáticas es del 10 a 25% a concentraciones terapéuticas 
habituales. Alcanza concentraciones plasmáticas máximas en 30 a 60 min. 
 
Cuando existe sobredosis, un 20 a 50% del fármaco puede estar unido a 
proteínas. La unión a las células rojas es de 10 a 20%. 
 
Metabolismo 4, 6 y 13 
 
El paracetamol se metaboliza principalmente en el hígado (85 a 90%), con una 
cinética de primer orden e involucra tres vías principales: 
 Glucuronidación: Mediante la enzima UDP-glucuronosiltransferasa para 
formarel conjugado (acetaminofén-glucurónido), metabolito no tóxico que 
se excreta en orina. 
 Sulfatación: Mediante la enzima sulfotransferasa para formar el conjugado 
inactivo (acetaminofén-sulfato), metabolito no tóxico que se excreta en 
orina. 
 Oxidación vía citocromo P450: Que forma un metabolito electrofílico 
reactivo N-acetil-p-benzoquinona-imina (NAPQI) que se conjuga con 
glutatión para formar el metabolito (acetaminofén-glutatión). A dosis 
terapéuticas, sólo una pequeña porción (5-15%) de acetaminofén es 
bioactivado para producir NAPQI. El conjugado (acetaminofén-glutatión) 
se hidroliza por las enzimas gamma-glutamil transpeptidasa y 
dipeptidasas para formar (acetaminofén-cisteína), que posteriormente se 
acetila por N-acetiltransferasa, produciendo así (acetaminofén-N-
acetilcisteína). También el metabolito (acetaminofén-glutatión) se conjuga 
con ácido mercaptúrico para dar otro conjugado. La principal isoenzima 
del citocromo P450 involucrada en esta oxidación es la CYP2E1, con la 
CYP1A2 y la CYP3A4 como vías adicionales. 
 
Las dosis elevadas de paracetamol, pueden saturar la vía metabólica por 
glutatión lo que genera acumulación de NAPQI. El exceso de este derivado 
metabólico agota las reservas de glutatión y comienza a formar aductos 
uniéndose a grupos cisteína en proteínas celulares. El NAPQI reacciona 
Página 17 
 
principalmente con proteínas mitocondriales, macromoléculas y canales iónicos, 
induciendo a la pérdida de producción de energía, desequilibrio de iones y 
muerte celular. 
 
 
Figura 1. Metabolismo de paracetamol. 
Eliminación 4 
 
La recuperación urinaria total de paracetamol en 24 horas es de 71.5 a 95% 
conjugado y menos del 5% se elimina en forma inalterada. La depuración del 
paracetamol es de 11.8 a 22.3 L/h y presenta una vida media de eliminación (t1/2 
de eliminación) es de 1.9 a 4.3 horas. 
 
3.1.6 Contraindicaciones 6 
El paracetamol está contraindicado cuando existe: 
 Hipersensibilidad al fármaco o cualquier otro componente de la forma 
farmacéutica. 
 Enfermedades hepática o renal grave 
 Úlcera péptica activa 
Página 18 
 
 Consumo de anticoagulantes 
 Trastornos de coagulación 
 
3.1.7 Reacciones adversas14 
Las reacciones adversas que se informan durante su consumo son: 
 Dermatológicos: Rash. 
 Endocrinos y metabólicos: Incremento de cloro, ácido úrico y glucosa, 
disminución de sodio, bicarbonato y calcio. 
 Hematológicos: Anemia, discrasias sanguíneas (neutropenia, leucopenia 
y pancitopenia). 
 Hepáticos: Incremento de bilirrubina y fosfatasa alcalina. 
 Renales: Incremento de amonio, nefrotoxicidad por sobredosis crónica. 
 Otros: Reacciones de hipersensibilidad (raras). 
 
3.2 Cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) 
3.2.1 Definición y clasificación 
Se clasifica a la cromatografía como un método físico de separación con base a 
la afinidad de los componentes de una muestra al distribuirse entre dos fases 
inmiscibles entre sí (fase estacionaria y fase móvil). La fase estacionaria puede 
ser un sólido o un líquido adsorbido o enlazado covalentemente sobre un soporte 
poroso de gran área superficial. Por su parte, la fase móvil es un fluido (gas, 
líquido o fluido supercrítico) que transporta la mezcla de analitos a separar y pasa 
a través o a lo largo de la fase estacionaria.15 y 16 
La separación cromatográfica en CLAR, se debe a las interacciones específicas 
entre los analitos a separar y ambas fases. La CLAR ofrece una mayor variedad 
de fases estacionarias (tales como las fases químicamente unidas o enlazadas), 
permitiendo diversas interacciones selectivas y específicas lo que se traduce en 
más posibilidades de separación.15 
La fase normal implica que la polaridad de la fase estacionaria es alta y la de la 
fase móvil tiende a ser baja. Mientras que en fase reversa, la polaridad de la fase 
estacionaria es baja y la de la fase móvil es alta (como en el caso de fases 
enlazadas tipo hidrocarburo y fases móviles polares). En ambos casos, los 
solutos eluyen por orden de polaridad, en fase reversa primero los más polares y 
en fase normal los menos polares, y pueden cambiar los tiempos de retención 
modificando la polaridad de la fase estacionaria. Para solutos ionizables el pH de 
la fase móvil es un factor importante en el tiempo de retención y selectividad.15 y 16 
 
 
 
Página 19 
 
3.2.2 Instrumentación general para CLAR 
Un cromatógrafo de líquidos consta de los siguientes componentes: 
 
Figura 2. Instrumentación general de un cromatógrafo de líquidos. 
 
 
 
Página 20 
 
Tabla 3. Instrumentación para CLAR. 
Inciso Componente Características 
A 
Fuente o 
suministro de 
fase móvil 
Son recipientes de vidrio o acero inoxidable que contienen disolventes 
orgánicos e inorgánicos. El empleo de fases móviles en composición 
constante se conoce como elución isocrática, mientras que la elución por 
gradiente involucra el cambio de la composición en forma escalonada de flujo 
y/o de proroción.16 y 17 
B 
Sistema de 
bombeo 
Una bomba para CLAR debe generar presiones mayores a 6000 psi, flujos sin 
pulsaciones, controlados, reproducibles en intervalos de 0.1 a 10 mL/min. Se 
usan dos tipos de bombas principales: tipo jeringa y tipo émbolo. Las bombas 
de tipo oscilante se utilizan en casi todos los instrumentos comerciales.16 
C 
Sistema de 
inyección de 
muestra 
Son dispositivos que introducen la muestra líquida, un sistema de inyección 
debe introducir volúmenes pequeños y reproducibles, generar poca dispersión 
física del volumen mezclado, insertar la muestra como pulso fino y no tener 
volumen muerto. Los sistemas de inyección son: válvulas o loops y por flujo 
suspendido. Siendo las válvulas las más empleadas, son intercambiables y 
permiten elegir volúmenes de muestra de 0.5 a 500 µL.15, 16 y 17 
D Columna 
Es el componente más importante, aquí se da la separación entre los analitos. 
La clave de la eficiencia está en la reducción del tamaño de partícula de la 
fase estacionaria.15La columna para CLAR es un tubo de acero inoxidable, su 
interior es liso con diámetro uniforme con una longitud de 5 a 30 cm, un 
diámetro interno de generalmente de 2.1 a 10 mm y tamaño de partícula de 3, 
5 y 10 µm. Los rellenos o empaques son peliculares y porosos; las partículas 
peliculares son esferas de vidrio cubiertas con fase estacionaria. Y las 
partículas porosas son micropartículas porosas de forma esférica. En ambos 
casos pueden tener un polímero enlazado a la superficie.16 y 17 
E 
Sistema de 
detección 
El detector monitorea la fase móvil que sale de la columna, la salida del 
detector es una señal eléctrica proporcional a alguna propiedad de la fase 
móvil y/o analitos. Los detectores más empleados se basan en la absorción 
UV/Vis, los cuales únicamente detectan solutos que absorben la radiación 
UV/Vis como son compuestos aromáticos y con enlaces múltiples entre C y O, 
N o S.15 y 16 
 
3.3 Métodos analíticos para cuantificar paracetamol en fluido biológico 
La técnica analítica de elección para cuantificar concentraciones de paracetamol en 
plasma es por CLAR acoplado a un detector UV o de espectrometría de masas-masas. 
Se han reportado varios ensayos que utilizan CLAR para analizar paracetamol tanto en 
preparaciones farmacéuticas, como en fluidos biológicos (plasma) a concentraciones 
terapéuticas y/o tóxicas.18 
Para fines del presente trabajo, se empleó un cromatógrafo de líquidos de alta 
resolución acoplado a un sistema de detección UV ya que los niveles esperados de 
concentraciones plasmáticas de las muestras de voluntarios después de la 
administración de 500 mg de paracetamol no son inferiores al orden de microgramos, y 
aunado a lo anterior es benéfico para el patrocinador el costo del estudio a 
comparación con un costeo por espectrometría de masas-masas. 
Página 21 
 
En la tabla 4, se encuentran descritos ensayos empleadospara cuantificar paracetamol 
tanto en formulaciones orales (tabletas a diferentes dosis), como en plasma humano 
empleando CLAR que dieron pie al desarrollo de la metodología en cuestión. 
Tabla 4. Métodos analíticos para cuantificar paracetamol en tabletas y plasma humano por CLAR. 
Título Condiciones 
Glavanovic et al.19 
Detector (λ): 244 nm 
Columna: Zorbax SB (C18) (50 X 2.1 mm, 1.8 µm) 
Fase móvil: (ACN:NaH2PO4 0.025 M a pH 2.5, con 3.5 mL de trimetilamina) 
(15:85) v/v 
Flujo: 0.4 mL/min 
Volumen de inyección: 3 µL 
Temperatura de columna (oC): 35 oC 
Muestra: Tabletas 
Ali et al.20 
Detector (λ): 210 nm 
Columna: Phenomenex (C18) (25 cm X 4.6 mm, 5 µm) 
Fase móvil: (H2O: MeOH pH 3.9 con ácido CF3COOH) (50:50) v/v 
Flujo: 1.0 mL/min 
Muestra: Tabletas 
Dewani et al.21 
Detector (λ): 230 nm 
Columna: Kinetex-C18 (150 X 4.6 mm, 5 µm) 
Fase móvil: (Solución amortiguadora de fosfatos 10 mM pH 3.3: ACN), en 
gradiente: 
0-2 min: Solución amortiguadora de fosfatos 10 mM pH 3.3: ACN (98:2 ) v/v 
2-12 min: Solución amortiguadora de fosfatos 10 mM pH 3.3: ACN (20:80) v/v 
12-20 min: Solución amortiguadora de fosfatos 10 mM pH 3.3: ACN (98:2) v/v 
Flujo: 1 mL/min 
Muestra: Tabletas 
Investigación Farmacológica y 
Biofarmacéutica (IFaB) 
Método: Precipitación de proteínas con ACN 
Detector (λ): 243 nm 
Columna: Polaris C18 A (15 cm X 4.6 mm, 5μm) 
Fase móvil: Acetato de sodio trihidratado 10 mM pH 5.0: ACN (85:15) v/v 
Flujo: 0.6 mL/min 
Volumen de inyección: 10 µL 
Temperatura de columna (ºC): 45 ºC 
Temperatura de automuestreador (ºC): 20 ºC 
Matriz biológica: Plasma 
Palma et al.11 
Método: Precipitación de proteínas con ZnSO4 0.014 M. 
Detector(λ): 242 nm 
Columna: Zorbax SB-C18 (15 cm X 4.6 mm, 5μm) 
Fase móvil: Fosfato de amonio 5 mM pH 6.0 ± 0.2 : ACN (79.5:20.5) v/v 
Flujo: 1.0 mL/min 
Temperatura de columna (oC): 25 oC 
Estándar interno: Sulfametoxazol 
Matriz biológica: Plasma 
 
Portolés et al.22 
 
Método: Extracción líquido-líquido con acetato de etilo. 
Detector (λ): 237 nm 
Columna: Ultasphere- ODS (Octadecilsilano 25 cm X 4.6 mm, 5μm) 
Fase móvil: ACN:H2O (12:88) v/v 
Flujo: 1.0 mL/min 
Estándar interno: Teobromina 
Matriz biológica: Plasma 
Nagaralli et al.23 Método: Extracción líquido-líquido con éter. 
Detector (λ): 230 nm 
Página 22 
 
Título Condiciones 
Columna: CLC C18 (25 cm X 4.6 mm, 5μm) 
Fase móvil: ACN:H2O (55:45) v/v 
Flujo: 0.8 mL/min 
Volumen de inyección: 20 µL 
Estándar interno: Nimesulida 
Matriz biológica: Plasma 
 
Se ha seleccionado para esta propuesta analítica, el método de calibración por 
estándar interno. El cual se utiliza para compensar errores aleatorios o sistemáticos 
como interferencias por componentes de la matriz, variaciones debidas al método y 
errores instrumentales. Se selecciona como estándar interno, una sustancia diferente 
al analito pero con propiedades semejantes, tal que ambos sean afectados 
similarmente durante el análisis. La aplicación de este método consiste en realizar 
medidas simultáneas de la respuesta del instrumento (área) del analito y del estándar 
interno. El estándar interno, se añade en una cantidad conocida y constante a la 
muestra. La matriz debe estar libre de estándar interno. El paso más importante en 
este método, es la selección adecuada del estándar interno.27 
Las características que debe cumplir un estándar interno son: 
 Debe estar resuelto de los otros picos. 
 Debe eluir cercano al (los) pico (os) de interés. 
 Debe usarse una concentración similar al pico del analito de interés. 
 Debe ser químicamente similar al o los analito (os) de interés y no debe 
reaccionar con este (os). 
 Alto grado de pureza.28 
 
3.4 Validación de métodos bioanalíticos 
El objetivo principal de la validación del método bioanalítico es demostrar la fiabilidad 
del método en cuestión para determinar la concentración de un analito (os) en una 
matriz biológica específica, tales como sangre, suero, plasma, orina o saliva. Además, 
si se utiliza un anticoagulante, la validación debe realizarse utilizando el mismo 
anticoagulante empleado para las muestras del estudio. En general, debe realizarse 
una validación completa para cada especie y matriz en cuestión.24 
 
Tanto la Norma Oficial Mexicana NOM-177-SSA1-2013 como la RESOLUÇÃO RDC N. 
º 27, establecen y especifican que previo al inicio de la validación se debe elaborar un 
protocolo que describa de manera detallada el método analítico, los parámetros de 
desempeño mínimos para la validación y los criterios de aceptación. Por otro lado, 
también estipulan los criterios y requisitos para el análisis de muestras biológicas de un 
estudio de biodisponibilidad o bioequivalencia. 25 y 26 
Página 23 
 
 
Para ambas normatividades, la validación del método analítico debe incluir como 
mínimo, los parámetros de desempeño que se indican en la columna de evaluación de 
la tabla 5, aunado a ello, esta tabla presenta las similitudes y diferencias entre normas 
en las cuales se basó esta propuesta de validación (mexicana y brasileña) y así 
clarificar las exigencias en ambas normas. 
 
Tabla 5. Comparativo de la NOM-177-SSA1-2013 y la RESOLUÇÃO RDC N. º 27. 
EVALUACIÓN 
CONDICIONES DE EVALUACIÓN 
Similitudes Diferencias 
Selectividad 
Evaluar al menos 6 unidades individuales de 
matriz biológica normal, la lipémica y la 
hemolizada. Considerar posibles interferencias 
de fármacos de uso común, metabolitos, 
anticoagulantes, compuestos endógenos de la 
matriz biológica u otras sustancias que puedan 
estar presentes en la matriz biológica. 
La NOM 177 no especifica en caso del 
incumplimiento de una unidad. En el caso 
de la RESOLUCIÓN No 27, indica 
claramente que en caso de un 
incumplimiento, se deben analizar, al 
menos otras seis fuentes de matriz 
biológica. 
 
Se solicita por parte de ANVISA realizar la 
selectividad a todo aquel fármaco 
administrado durante el estudio, que no se 
encuentre en la nota técnica 13, la cual 
contiene principalmente fármacos de baja 
absorción. 
Acarreo/ Efecto 
residual 
Realizar un mínimo de 3 inyecciones de la 
misma muestra blanco siendo una antes y dos 
después de una inyección del límite superior de 
cuantificación (LSC). 
En el caso de la RESOLUCIÓN No 27, 
indica la posibilidad de adoptar estrategias 
analíticas en caso de que el acarreo sea 
inevitable. 
Curva de 
calibración 
Establecer el intervalo de la curva de calibración 
en función a las concentraciones esperadas del 
(os) analito(s) a cuantificar durante el análisis de 
las muestras. 
Caracterizar por lo menos 6 concentraciones 
distintas sin incluir muestras blanco. 
Definir un modelo matemático que describa 
adecuadamente la relación entre la 
concentración y la respuesta, la cual debe ser 
continua y reproducible en el intervalo de trabajo 
de la curva de calibración. 
Cada curva de calibración debe incluir una 
muestra de blanco de matriz y muestra cero. 
Deben ser evaluadas un mínimo de 3 curvas de 
calibración e incluir los resultados de la 
concentración recuperada y el porciento de 
desviación. 
En el caso de la RESOLUCIÓN No 27, se 
sugiere que se adopte el modelo 
matemático más simple para la descripción 
adecuada de la relación entre las 
concentraciones conocidas del analito y la 
respuesta del instrumento, utilizando 
preferentemente el modelo lineal. Sin 
embargo workshops de esta entidad 
regulatoria indican que se pueden adoptar 
modelos matemáticos cuadráticos, ante ello 
la autoridad sanitaria recomienda no usar 
estos modelos. 
Página 24 
 
EVALUACIÓN 
CONDICIONES DE EVALUACIÓN 
Similitudes Diferencias 
Precisión 
Se evalúa como repetibilidad y reproducibilidad: 
Repetibilidad: Analizar en un mismo día al 
menos por quintuplicado las siguientes muestras 
control LIC, CCB, CCM, CCA y CCD. Calcular la 
concentración obtenida para cada nivel 
interpolando su respuesta analíticaen la curva 
de calibración. (Precisión intra-corrida para la 
RESOLUCIÓN No 27). 
Reproducibilidad: Analizar al menos por 
quintuplicado en tres corridas analíticas 
diferentes, las muestras control LIC, CCB, CCM 
y CCA. (Precisión inter-corridas para la 
RESOLUCIÓN No 27). Calcular la concentración 
obtenida para cada nivel interpolando su 
respuesta analítica en la curva de calibración. La 
adición de otro analista o el uso de otro equipo, 
debe cumplir con los criterios de 
reproducibilidad. 
En el caso de la NOM-177-SSA1-2013, 
indica que la evaluación interdía, se puede 
realizar en al menos dos días naturales. 
Mientras que la RESOLUCIÓN No 27 
obliga a hacerlo en días naturales distintos. 
Se deberá realizar la evaluación de la 
precisión intra-día ante la presencia de 
medicación concomitante o co-administrada 
en caso de que el método presente un 
estándar análogo. 
Exactitud 
 
Calcular a partir de los datos de repetibilidad y 
reproducibilidad la desviación de la 
concentración obtenida respecto al valor nominal 
(% de desviación). 
En el caso de la NOM-177-SSA1-2013, 
indica que la evaluación interdía, se puede 
realizar en al menos dos días naturales. 
Mientras que la RESOLUCIÓN No 27 
obliga a hacerlo en días naturales distintos. 
Se deberá realizar la evaluación de la 
exactitud intradía ante la presencia de 
medicación concomitante o co-administrada 
en caso de que el método presente un 
estándar análogo. 
Estabilidad de la 
muestra 
Evaluar por triplicado concentraciones de CCB y 
CCA. 
Determinar las condiciones de temperatura y 
tiempo entre otros, en las que el fármaco 
permanezca estable en la matriz biológica, 
durante su manejo, toma de muestra, 
almacenamiento y procesamiento analítico. 
Las los controles se interpolan en una curva de 
calibración recién preparada y las 
concentraciones obtenidas se comparan con su 
respectiva concentración nominal. 
Estabilidad a corto plazo: Evaluar la 
estabilidad del (os) analito(s) en la matriz 
biológica a la temperatura y tiempo de 
procesamiento de la muestra. 
Estabilidad a largo plazo: Evaluar la 
estabilidad del (os) analito(s) en la matriz 
biológica, bajo las condiciones de 
almacenamiento en las que se mantendrán las 
muestras, por un tiempo al menos equivalente 
desde la obtención de la muestra hasta su 
análisis. 
Estabilidad de la muestra procesada: Evaluar 
la estabilidad del (os) analito(s) en la muestra 
procesada a temperatura ambiente o bajo las 
No hay diferencias 
Página 25 
 
EVALUACIÓN 
CONDICIONES DE EVALUACIÓN 
Similitudes Diferencias 
condiciones de almacenamiento a ser usadas 
durante el estudio. (Estabilidad post-
procesamiento para la RESOLUCIÓN No 27). 
Estabilidad en automuestreador: Evaluar la 
estabilidad del (os) analito(s) en la muestra 
procesada a la temperatura del inyector o 
automuestreador. 
Estabilidad ciclos de congelación 
descongelación: Evaluar la estabilidad del(os) 
analito(s) en la matriz biológica, almacenadas en 
congelación al menos 12 h, descongelarlas por 
completo a temperatura ambiente y volver a 
congelar al menos 12 h bajo las mismas 
condiciones. El número de ciclos debe ser al 
menos de 3. 
Estabilidad en 
solución 
En caso de no utilizar una solución de referencia 
de manera inmediata, demostrar la estabilidad 
del (os) analito(s) y EI (si aplica), en al menos 
una muestra inyectada por triplicado de una 
solución de referencia principal (de mayor 
concentración) y de una solución de trabajo (de 
menor concentración) por triplicado por un 
tiempo igual o mayor al periodo de uso o 
almacenamiento que será utilizado durante el 
análisis de las muestras. 
Las estabilidades de la solución de referencia 
principal y de trabajo deben evaluarse con la 
dilución apropiada, considerando la linealidad y 
detector de medición utilizado. 
El valor promedio de la respuesta analítica de 
las soluciones en estudio debe ser comparado 
con respecto al valor promedio obtenido por el 
análisis por triplicado de una solución de 
reciente preparación. 
No hay diferencias 
Efecto matriz 
Analizar individualmente, al menos 6 unidades 
de matriz blanco, adicionalmente considerar al 
menos matriz biológica lipémica y hemolizada. 
Para cada unidad de matriz biológica obtener el 
FMN. 
El CV% del FMN calculado de las 6 unidades de 
la matriz no debe ser mayor que el 15%. Esta 
determinación debe ser realizada con la CCB y 
CCA 
En el caso de la NOM-177-SSA1-2013, 
solicita la evaluación de al menos 6 fuentes 
normales de fluido biológico y una fuente de 
matriz lipémica y hemolizada, mientras que 
la RESOLUCIÓN No 27 obliga a analizar al 
menos 4 fuentes normales, dos lipémicas y 
dos hemolizadas. 
Se deberá realizar la evaluación del efecto 
matriz ante la presencia de un estándar 
análogo y en caso de que se hayan 
administrado una comedicación o fármacos 
concomitantes. 
 
Adicionalmente, la presente validación incluye la evaluación de otros parámetros de 
desempeño no contemplados en las normas antes mencionadas. Los parámetros de 
desempeño adicionales fueron: Estabilidad de la muestra procesada (como extracto 
Página 26 
 
seco) y reproducibilidad de la reinyección, mismos que se describen en sus 
respectivas secciones (4.4.8.3 y 4.4.10). 
 
Por otro lado, en cuanto al análisis de muestras biológicas, este se llevó a cabo en 
función de los criterios y requisitos establecidos en la NOM-177-SSA1-2013 
(numerales 9.3 y 9.4), en la Resolución RDC No 27 (capítulos IV y V).26 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Página 27 
 
4. PARTE EXPERIMENTAL 
4.1 Reactivos, sustancias de referencia, material, equipos e instrumentos y matriz 
biológica 
4.1.1 Reactivos 
 Agua grado cromatográfico (CLAR), (H2O), Honeywell o J.T. Baker. 
 Acetato de sodio trihidratado grado reactivo (CH3COONa-3H2O), J.T. Baker. 
 Acetona grado reactivo (C2H6CO), Tecsiquim. 
 Acetonitrilo grado cromatográfico (CLAR), (ACN), (CH3CN), Honeywell o J.T. 
Baker. 
 Ácido acético glacial grado reactivo, (CH3COOH), J.T. Baker. 
 Hielo seco (CO2) 
 Metanol grado cromatográfico (CLAR), (MeOH), (CH3OH), Honeywell o 
J.T.Baker. 
 Metilterbutil-éter grado reactivo, (MTBE), (C5H12O), J.T. Baker. 
 
4.1.2 Sustancias de referencia 
 Paracetamol (acetaminofén) (PRC) sustancia de referencia primaria, COSUFAR, 
lote 70A1, pureza 100.0%. 
 Paracetamol (PRC) sustancia de referencia primaria, USP, lote KOI244, pureza. 
 Diprofilina (E.I.) sustancia de referencia primaria, EDQM, lote 1, pureza 100.0%. 
 Cefalexina sustancia de referencia primaria, USP, lote K0J198, pureza 99.8% 
 Diclofenaco sustancia de referencia primaria, USP, lote F0F269, pureza 100% 
 
4.1.3 Material 
 Espátulas de cromo-níquel. 
 Frascos reservorios de vidrio con tapa de rosca de 500, 1000 y 2000 mL. 
 Guantes de nitrilo. 
 Gradillas para tubos de vidrio. 
 Insertos de polipropileno. 
 Matraces volumétricos calibrados de clase A de 10, 20, 25, 50, 500, 1000 y 2000 
mL. 
 Membranas de filtración de nylon 0.45 µm y 47 mm de diámetro. 
 Microtubos de 2 mL. 
 Naves de pesado. 
 Pipetas Pasteur. 
 Pipetas volumétricas de 1 mL. 
 Puntas de volumen variable para pipeta repetidora (Combitip ®). 
 Puntas para micropipeta de 100-1000 µL. 
 Puntas para micropipeta de 200 µL. 
 Probeta graduada de polipropileno de 10, 500 y 1000 mL. 
 Probeta graduada de vidrio de 10 y 100 mL. 
 Recipiente resistente a bajas temperaturas. 
Página 28 
 
 Tubos lisos de vidrio de 16 X 100 mm. 
 Tubos de vidrio de 16 X 100 mm con tapón de rosca. 
 Tubos de polipropileno Falcon de 50 mL. 
 Unidad de filtración Millipore. 
 Vasos de precipitados de vidrio de 50, 100 y 250 mL. 
 Vasos de precipitados de polipropileno de 50, 500, 1000 y 2000 mL. 
 Viales para automuestreador de 2 mL. 
 
4.1.4 Equipose instrumentos 
 Cromatógrafo de líquidos de alta resolución marca Waters, modelo 486. 
 Balanza analítica marca Ohaus modelo EP214C. 
 Balanza granataria marca Ohaus modelo Adventurer PRO. 
 Agitador vórtex marca Scientific Industries, modelo G560. 
 Agitador vórtex multi-tubo, marca VWR, modelo 945063. 
 Agitador vórtex multi-tubo, marca VWR, modelo DVX-2500. 
 Ultracongelador marca REVCO modelo ULT2186-5-A40. 
 Pipeta repetidora electrónica marca Eppendorf, modelo Research Plus. 
 Pipeta repetidora electrónica marca Eppendorf, modelo Multipette Plus. 
 Micropipeta volumen variable 100-1000 µL marca Eppendorf, modelo Research 
Plus. 
 Micropipeta volumen variable 10-100 µL marca Eppendorf, modelo Research. 
 Micropipeta volumen fijo 200 µL marca Hirschmann Laborgeräte, modelo 
9475507. 
 Refrigerador marca Torrey modelo R-16. 
 Centrífuga marca Hettich modelo Rotanta 460. 
 Potenciómetro marca Thermo Scientific, modelo ORION STAR A211. 
 Baño ultrasónico marca Crest ultrasonics, modelo 1875TA. 
 Parrilla con agitación magnética. 
 
4.1.5 Matriz biológica 
La matriz biológica empleada durante el desarrollo, validación y para la preparación 
de muestras plasmáticas (dobles blancos, blancos, curvas de calibración y puntos 
control de calidad) fue plasma humano con CPDA (citrato fosfato dextrosa adenina) 
como anticoagulante, provenientes de voluntarios sanos del Instituto Nacional de 
Cardiología. 
4.2 Preparación de soluciones utilizadas para la etapa de validación. 
a) Solución amortiguadora de acetato de sodio trihidratado 10 mM pH 5.0 en agua 
grado CLAR (componente acuoso de la fase móvil): Pesar aproximadamente 
1.36 g de acetato de sodio trihidratado y transferir a un matraz volumétrico de 1L, 
disolver y llevar a volumen de aforo con agua grado CLAR. Ajustar a pH a 5.0 con 
ácido acético glacial concentrado, filtrar y desgasificar en baño de ultrasonido 
durante 15 minutos. 
Página 29 
 
b) Disolvente acetonitrilo grado CLAR (componente orgánico de la fase móvil): 
Transferir 1L de acetonitrilo grado CLAR a un frasco reservorio de 1L, filtrar y 
desgasificar en baño de ultrasonido durante 15 minutos. 
c) Solución de lavado: Agua grado CLAR: ACN grado CLAR 50:50 v/v: Medir en 
una probeta graduada 500 mL de agua grado cromatográfico y 500 mL de 
acetonitrilo grado cromatográfico, transferir a un frasco de 1L y mezclar 
homogéneamente, desgasificar en baño de ultrasonido durante 15 minutos. 
d) Solución reactivo: Agua grado CLAR: Metanol grado CLAR 50:50 v/v: Medir en 
una probeta graduada 50 mL de agua grado cromatográfico y 50 mL de metanol 
grado cromatográfico, transferir a un frasco de 100 mL y mezclar homogéneamente. 
e) Solución de reconstitución: Solución amortiguadora de acetato de sodio 
trihidratado 10 mM pH 5.0: Acetonitrilo grado CLAR 91:9 v/v: Transferir 
cuantitativamente 45.5 mL de solución amortiguadora de acetato de sodio 
trihidratado 10 mM pH 5.0 a un tubo de 50 mL, adicionar 4.5 mL de acetonitrilo grado 
cromatográfico y mezclar homogéneamente. 
f) Solución principal de paracetamol (2000 µg/mL) Solución A: Pesar con exactitud 
el equivalente a 40 mg de sustancia de referencia de paracetamol y transferir a un 
matraz volumétrico de 20 mL, disolver y llevar a volumen con metanol grado 
cromatográfico. Realizar el correspondiente ajuste de peso, con base a la pureza de 
la sustancia de referencia. 
g) Solución de trabajo de paracetamol (100 µg/mL) Solución B: Transferir 
cuantitativamente 1 mL de la solución A (2000 µg/mL) de paracetamol a un matraz 
volumétrico de 20 mL y llevar a volumen con metanol grado cromatográfico. 
h) Solución principal de diprofilina (200 µg/mL) Solución E.I: Pesar con exactitud el 
equivalente a 5 mg de sustancia de referencia de diprofilina (E.I.) y transferir a un 
matraz volumétrico de 25 mL, disolver y llevar a volumen con agua grado 
cromatográfico: metanol grado cromatográfico 50:50 v/v. Realizar el correspondiente 
ajuste de peso, de acuerdo a la pureza de la sustancia de referencia. 
i) Solución para adecuabilidad del sistema (paracetamol 10 µg/mL, diprofilina 
(E.I.) 60 µg/mL. Solución AD1. Transferir cuantitativamente 50 µL de la solución A 
(2000 µg/mL) de paracetamol y 3000 µL de la solución I (200 µg/mL) de diprofilina 
(E.I.) a un matraz volumétrico de 10 mL y llevar a volumen con solución de 
reconstitución: solución amortiguadora de acetato de sodio trihidratado 10 mM pH 
5.0: acetonitrilo grado CLAR 91:9 v/v. Dividir la solución en alícuotas de 1 mL en 
microtubos de 2 mL y almacenarlas a -70 ± 10 oC. Descongelar un tubo cada día de 
trabajo a temperatura ambiente. 
 
 
 
Página 30 
 
4.3 Desarrollo del método analítico 
El desarrollo de la presente metodología fue basado en un método analítico previamente 
desarrollado y validado en IFaB (ver tabla 4), el cual no contaba con estándar interno. 
Para ello se tomó en cuenta la información bibliográfica referente a propiedades 
fisicoquímicas del paracetamol y los posibles estándares internos, condiciones de 
detección, condiciones cromatográficas y método de extracción en plasma. 
Cabe mencionar que este método analítico se sujetó a verificación por ANVISA, dicha 
instancia en su Resolución RDC No 27 (Capítulo II, artículo 4) determina el uso 
justificado de estándar interno. 
 
Como parte de la estrategia de desarrollo del método analítico, se contemplaron los 
siguientes rubros: 
4.3.1 Elección del estándar interno 
La secuencia para elegir el estándar interno fue: 
 
Figura 3. Estrategia de selección para el E.I. 
Para seleccionar el estándar interno (E.I.) se consideraron fármacos con 
absorción de radiación UV/Vis a las longitudes de onda estudiadas (λ= 243 y 260 
nm) y que los candidatos a E.I. pudieran extraerse de la matriz biológica con 
alguna de las técnicas de extracción evaluadas (técnicas 1 y/o 2). 
 
4.3.2 Condiciones cromatográficas 
Se realizaron las determinaciones pertinentes modificando los siguientes 
parámetros: 
 
 
Figura 4. Condiciones cromatográficas evaluadas. 
FÁRMACOS 
Al menos 30 
sustancias de 
referencia fueron 
evaluadas
PREPARACIÓN 
Soluciones a 
concentración de 
10 µg/mL
DETECCIÓN 
UV/Vis a λ= 243 y 
260 nm
EXTRACCIÓN
Técnica 1:
Precipitación de 
proteinas. 
Técnica 2: 
Líquido-Líquido 
con evaporación.
•243 nm y 260 nmLongitud de onda (λ):
•Polaris C18-A (4.6 X 150 mm 5.0 µm)
•XTerra C18 (4.6 X 150 mm 5.0 µm)
•Gemini C18 110 Å (4.6 X 250 mm 5.0 µm)
Columna cromatográfica:
• (25:75 a 98:2) (fase acuosa: fase orgánica)Proporción de fase 
móvil (v/v):
• (0.6 a 1.0) mL/min
Velocidad de 
flujo 
(mL/min):
Página 31 
 
Para determinar las condiciones cromatográficas que permitieran una mayor 
resolución con las interferencias propias del plasma se tomaron en cuenta los 
siguientes parámetros: 
 Tiempo de retención de los analitos en estudio para considerar un 
tiempo de corrida breve: Menos de 10 minutos. 
 Simetría de los picos cromatográficos: Menor o igual a 2. 
 Eficiencia de la columna cromatográfica para separar los analitos en 
estudio: Platos teóricos mayor o igual a 2000. 
 Resolución entre picos cromatográficos: Mayor o igual a 1.5. 
 Selectividad en los tiempos de retención de los analitos de interés: 
No interferencia de compuestos cercanos a los tiempos de retención. 
 
 
4.3.3 Método de extracción 
Se evaluaron dos técnicas de extracción: 
 
 
Figura 5. Técnicas de extracción evaluadas. 
Inicialmente se consideró una técnica de extracción por precipitación de 
proteínas con solventes orgánicos, no obstante, conforme se fue desarrollando el 
método analítico y de acuerdo con la bibliografía reportada (ver tabla 4), se 
evaluó también una técnica de extracción líquido-líquido con solventes orgánicos 
y con evaporación. La selección de la técnica de extracción se fundamentó en la 
respuesta analítica de paracetamol y diprofilina(E.I.) y en la selectividad frente a 
componentes endógenos de la matriz biológica. 
 
4.4 Validación del método bioanalítico 
La presente propuesta de validación del método analítico, se llevó a cabo para dar 
cumplimiento con dos normatividades de dos instancias regulatorias. Considerando 
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS con:
ACN (100 %)
MeOH (100%)
(ACN:MeOH) (75:25) v/v
LÍQUIDO- LÍQUIDO CON 
EVAPORACIÓN:
Éter (100 %)
Éter- hexano (80:20) v/v
Éter- cloroformo (90:10) v/v
Éter- diclorometano (80:20) v/v
Éter- alcohol isoamílico (90:10) 
v/v
Metil-terbutil-eter (100 %)
Página 32 
 
entonces; los lineamientos establecidos en la Norma Oficial Mexicana NOM-177-SSA1-
2013, en lo referente a validación de métodos analíticos (características de desempeño) 
y los criterios y requisitos para el análisis de muestras biológicas de un estudio de 
biodisponibilidad o bioequivalencia, en su numeral 9.1. Asimismo, considerando los 
criterios definidos en RESOLUÇÃO RDC N. º 27, Dispõe sobre os requisitos mínimos 
para a validação de métodos bioanalíticos empregados em estudos com fins de registro 
e pós-registro de medicamentos, emitida por ANVISA el 17 de mayo del 2012, en sus 
capítulos II y III. 
Para ello se realizó la evaluación de la exigencia de cada parámetro de desempeño y 
una vez determinado la evaluación más exigente junto con sus criterios de aceptación se 
realizó la experimentación y por ende cada parámetro da cumplimiento con ambas 
normatividades. 
 
4.4.1 Preparación de curva de calibración y controles de calidad en plasma. 
La curva de calibración fue conformada con base al Cmax reportado en estudios 
previos del analito de interés y se conformó con 10 estándares de calibración. Se 
prepararon cada uno de los estándares de calibración y controles de calidad en 
sistema (solución) y posteriormente en plasma, de acuerdo con la tabla 6. 
La preparación de cada estándar de la curva de calibración y las muestras control 
de calidad en sistema (solución), se realizó colocando alícuotas de paracetamol y 
metanol grado CLAR, en microtubos de 2 mL que se agitaron a 2500 rpm por 1 
minuto. 
Se tomó una alícuota de 50 µL de cada muestra preparada en solución y se 
depositaron en microtubos de 2 mL, a los que se les adicionó 950 µL de plasma 
fresco con CPDA y se agitaron a 2500 rpm por 1 minuto. 
Para la muestra control de calidad diluido (CCD) se transfirieron 100 µL de 
muestra preparada en plasma a un microtubo de 2 mL, luego se agregaron 100 
µL de plasma fresco y libre de fármaco y se agitó a 2500 rpm por 1 minuto. De 
esta forma se considera un factor de dilución 1:2, para evaluar el efecto de la 
dilución. Sólo se estudió el factor 1:2 en caso de que se presentaran muestras de 
voluntarios con concentraciones de paracetamol por encima del límite superior de 
cuantificación. 
La metodología fue desarrollada y validada utilizando cuatro controles de calidad, 
el cuarto control calidad se conoce como control de calidad nivel bajo B (CCBB) 
cuyo propósito es prevenir que las concentraciones cuantificadas no se 
encuentren dentro de intervalos de los controles de calidad entre el CCB y CCM 
o cuando se diseñan curvas de calibración para evaluar diferentes dosis de un 
analito (como en el caso de paracetamol). Con ello se espera que las 
concentraciones en las muestras de voluntarios se ubiquen entre dos controles 
de calidad a lo largo del intervalo de trabajo. 
Página 33 
 
Tabla 6. Preparación de curva de calibración y controles de calidad en sistema y en plasma. 
Estándar de calibración (CP), Control de calidad nivel bajo (CCB), Control de calidad nivel bajo B (CCBB), Control de 
calidad nivel medio (CCM), Control de calidad nivel alto (CCA), Control de calidad nivel diluido (CCD factor 1:2), 
Límite inferior de cuantificación (LIC), Límite superior de cuantificación (LSC), Concentración (Conc.). 
4.4.2 Adecuabilidad del sistema cromatográfico 
Con la finalidad de verificar que el sistema cromatográfico está en condiciones 
adecuadas y de llevar un monitoreo del desempeño de la columna cromatográfica, 
se preparó la solución AD1 (paracetamol 10 µg/mL, diprofilina (E.I.) 60 µg/mL) 
según se describe en el apartado de “Preparación de soluciones”. Y antes de cada 
corrida analítica de validación, se realizaron por lo menos 6 inyecciones 
consecutivas de 10 µL de esta solución y se analizaron con las condiciones 
cromatográficas establecidas. 
Se consideró un sistema cromatográfico adecuado al darse cumplimiento los 
siguientes criterios o parámetros: 
 Porciento del coeficiente de variación de la respuesta analítica (relación de 
áreas) menor a 2%. 
 Porciento del coeficiente de variación del tiempo de retención (min) menor 
a 2% 
 Resolución mayor o igual a 1.5. 
 Simetría de pico menor o igual a 2. 
 Promedio de platos teóricos mayor o igual a 2000. 
Volumen de 
Solución B 
(100 µg/mL) 
(µL) 
Volumen de 
Solución A 
(2000 
µg/mL) (µL) 
Volumen 
de 
Metanol 
(µL) 
Conc. en 
sistema de 
paracetamol 
(µg/mL) 
Alícuota de 
muestra en 
sistema 
(µL) 
Volumen 
de 
plasma 
(µL) 
Conc. 
en 
plasma 
(µg/mL) 
Nivel 
20 - 980 2 50 950 0.100 CP1 (LIC) 
40 - 960 4 50 950 0.200 CP2 
60 - 940 6 50 950 0.300 CCB 
200 - 800 20 50 950 1.000 CP3 
400 - 600 40 50 950 2.000 CP4 
600 - 400 60 50 950 3.000 CCBB 
- 50 950 100 50 950 5.000 CP5 
- 100 900 200 50 950 10.000 CP6 
- 150 850 300 50 950 15.000 CP7 
- 200 800 400 50 950 20.000 CCM 
- 250 750 500 50 950 25.000 CP8 
- 300 700 600 50 950 30.000 CCA 
- 350 650 700 50 950 35.000 CP9 
- 400 600 800 50 950 40.000 CP10 (LSC) 
- 700 300 1400 50 950 70.000 CCD 
Página 34 
 
4.4.3 Selectividad 
 
Para demostrar la ausencia de interferencias debidas a componentes endógenos 
de la matriz biológica, a fármacos de uso común u otras sustancias que pueden 
estar presentes en el fluido biológico, se llevaron a cabo las siguientes pruebas. 
 
4.4.3.1 Selectividad de la corrida analítica 
Previo a cada corrida analítica de validación se evaluó la selectividad, 
inyectándose en el siguiente orden: un blanco de reactivos, un doble blanco 
(muestra de matriz biológica sin la adición del analito de interés y sin el 
estándar interno), y un blanco (muestra de matriz biológica sólo con la 
adición del estándar interno); estas últimas dos muestras fueron 
procesadas como indica el método de extracción definido (ver Figura 8); 
todas las muestras se analizaron con las condiciones cromatográficas 
establecidas. 
Para dar cumplimiento a la evaluación de selectividad de la corrida analítica 
se consideraron los siguientes criterios de aceptación: 
Sin presencia de interferencias por componentes endógenos de la matriz 
biológica en los tiempos de retención de paracetamol y diprofilina (estándar 
interno E.I.), o bien, la respuesta analítica (área) de las interferencias 
próximas al tiempo de retención debe ser menor al 20% para paracetamol y 
del 5% para el estándar interno, con respecto a la respuesta analítica (área) 
del LIC (valor promedio de cinco réplicas). 
 
4.4.3.2 Selectividad a la matriz biológica 
La selectividad a la matriz biológica, se determinó analizando seis fuentes 
individuales de plasma con CPDA como anticoagulante, una fuente de 
plasma lipémica y una fuente de plasma hemolizada, todas provenientes de 
voluntarios sanos. Cada fuente de plasma se procesó de acuerdo con el 
método de extracción definido (ver Figura 8). 
El método analítico se consideró selectivo a la matriz biológica, si las 
fuentes individuales, lipémica y hemolizada no presentaban interferencias 
por componentes endógenos de la matriz biológica para los tiempos de 
retención de paracetamol y diprofilina (E.I.), o bien, la respuesta analítica 
de las interferencias próximas al tiempo de retención debe ser menor al 
20% para el paracetamol y del 5% para el estándar interno, con respecto a 
la respuesta analítica de muestras LIC (valor promedio delárea de las 
cinco réplicas). 
 
Página 35 
 
4.4.3.3 Selectividad a fármacos de uso común 
La selectividad a fármacos de uso común se realizó analizando muestras 
dobles blanco que contenían concentraciones reportadas de los siguientes 
analitos: naproxeno (50 µg/mL), ácido salicílico (300 µg/mL), cafeína (4 
µg/mL) y nicotina (50 µg/mL). 
Las muestras se procesaron como indica el método de extracción definido 
(ver Figura 8). 
El método analítico se consideró selectivo a los fármacos de uso común 
antes mencionados, al no presentar interferencias por dichos fármacos 
para los tiempos de retención de paracetamol y diprofilina (E.I.), o bien, la 
respuesta analítica de las interferencias próximas al tiempo de retención 
debe ser menor al 20% para el analito de interés y del 5% para el estándar 
interno, con respecto a la respuesta analítica (área) de muestras LIC (valor 
promedio de cinco réplicas). 
4.4.4 Acarreo (efecto residual) 
La evaluación de acarreo o efecto residual por parte de los analitos de interés, se 
ejecutó preparando y procesando cinco muestras LIC, una muestra LSC (ver tabla 
6) y una muestra doble blanco, de acuerdo con el método de extracción (ver Figura 
8). Se realizaron tres inyecciones de la misma muestra doble blanco siendo una 
antes y dos después de la inyección de la muestra LSC. Las respuestas analíticas 
(áreas) de dichas inyecciones, se compararon con la respuesta analítica promedio 
de las cinco inyecciones de LIC. 
Se considera que el sistema cromatográfico no muestra acarreo al no presentar 
interferencias en los tiempos de retención de paracetamol y diprofilina (E.I.), o 
bien, la respuesta analítica de las interferencias próximas al tiempo de retención 
debe ser menor al 20% para paracetamol y del 5% para diprofilina (estándar 
interno E.I.), con respecto a la respuesta analítica del LIC (valor promedio del área 
de las cinco réplicas). 
4.4.5 Curva de calibración 
El objetivo de esta prueba es establecer el intervalo de trabajo para la curva de 
calibración y definir el modelo matemático que mejor describa la relación entre 
respuesta analítica y concentración nominal en forma continua y reproducible en el 
intervalo de trabajo. 
Se prepararon tres curvas de calibración en forma independiente, empleando las 
concentraciones nominales de 0.1, 0.2, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 35.0 y 40.0 
µg/mL de paracetamol según se describe en la tabla 6. Las muestras plasmáticas 
se procesaron de acuerdo al método de extracción (ver Figura 8). Adicionalmente 
para cada curva de calibración se incluyeron una muestra doble blanco y una 
muestra blanco. (La muestra doble blanco es aquella que no contiene paracetamol 
Página 36 
 
ni estándar interno, mientras que la muestra blanco sólo contiene estándar 
interno). 
Se graficó la respuesta analítica (relación de áreas) con respecto a la 
concentración nominal, así mismo se hizo la regresión lineal simple ajustando los 
datos a la ecuación y = mx + b, donde la variable “y” corresponde a la respuesta 
analítica (relación de áreas paracetamol/diprofilina (E.I.)) obtenida para su 
respectiva concentración nominal “x” de paracetamol. 
Se determinó la concentración experimental (recuperada) interpolando la 
respuesta analítica obtenida en la ecuación de la línea recta obtenida para cada 
una de las tres curvas analizadas. 
Por otro lado, mediante el software para cromatografía Empower, se calcularon los 
errores relativos (ER%) de tres ponderaciones (1/x, 1/x2, 1/y), además del arreglo 
matemático más simple (sin ponderación), en cada ponderación se sumaron los 
ER% de las tres curvas de calibración analizadas para finalmente determinar un 
error relativo global (ΣER%), se consideró que el modelo matemático que mejor 
describe la relación entre respuesta analítica (relación de áreas 
paracetamol/diprofilina (E.I.)) obtenida y concentración nominal de paracetamol, es 
aquel que presente el ΣER% más bajo. 
La evaluación de curva de calibración se acepta si el modelo matemático (y = mx + 
b) con la ponderación de menor ΣER% seleccionado, demuestra que para cada 
una de las tres curvas se obtiene un coeficiente de correlación (r) mayor o igual a 
0.99 y la desviación absoluta (Desv. Abs. %) de la concentración recuperada 
(interpolada) con respecto a la nominal (adicionada) sea menor o igual a 15% en 
todos los niveles que constituyen la curva de calibración, a excepción del límite 
inferior de cuantificación (LIC) cuya desviación no debe ser mayor al 20%. 
Para que el modelo matemático pueda ser evaluado se debe considerar que por lo 
menos el 75% de los estándares de calibración deben cumplir con el criterio de 
aceptación antes mencionado, en caso de que un estándar de calibración no 
cumpla con dicho criterio, debe rechazarse el estándar y la curva de calibración 
debe recalcularse sin cambiar el modelo matemático. 
 
4.4.6 Precisión 
La precisión fue determinada como repetibilidad y reproducibilidad. 
4.4.6.1 Repetibilidad 
Partiendo de una solución de referencia; se prepararon y procesaron cinco 
réplicas de muestras plasmáticas (LIC, CCB, CCBB, CCM, CCA y CCD) en 
un mismo día de trabajo, de acuerdo con la tabla 6 y el método de 
extracción (ver Figura 8). 
Página 37 
 
Para determinar la concentración de cada nivel, se interpolaron las 
respuestas analíticas en una curva de calibración de reciente preparación. 
Con los resultados obtenidos de concentración recuperada de las cinco 
réplicas se calcula promedio, desviación estándar y coeficiente de variación 
para cada nivel. 
Se considera que el método analítico es repetible si el porciento del 
coeficiente de variación (C.V. %) de la concentración promedio de cada 
control de calidad es menor a 15% y que el porciento del coeficiente de 
variación de la concentración promedio del LIC sea menor a 20%. 
4.4.6.2 Reproducibilidad 
La evaluación de reproducibilidad entre días se realizó preparando y 
procesando en plasma una curva de calibración y cinco réplicas de 
muestras LIC, CCB, CCBB, CCM, CCA y CCD, como indica la tabla 6 y el 
método de extracción (ver Figura 8) durante tres días, empleando 
soluciones estándar principales y de trabajo de reciente preparación. 
Se determinó la concentración recuperada para cada nivel interpolando la 
respuesta analítica en la curva de calibración de reciente preparación por 
cada día de trabajo. Considerando los resultados de concentración 
recuperada para cada nivel de los tres días de trabajo se calcularon 
promedio, desviación estándar y coeficiente de variación. 
Se considera que el método analítico es reproducible entre días si el 
porciento del coeficiente de variación (C.V. %) de la concentración 
promedio (de los tres días) en cada control de calidad es menor a 15% y 
que el porciento del coeficiente de variación de la concentración promedio 
(de los tres días) del LIC sea menor a 20%. 
 
4.4.7 Exactitud 
La exactitud se determinó a partir de los datos de repetibilidad y reproducibilidad, 
calculando la desviación absoluta (Desv. Abs. %) del valor promedio de las 
concentraciones obtenidas en las muestras LIC, CCB, CCBB, CCM, CCA y CCD, 
con respecto a las concentraciones nominales de dichas muestras. 
Se considera que el método analítico es exacto si el la desviación absoluta (Desv. 
Abs. %) del valor promedio en cada nivel de concentración (LIC y controles de 
calidad) no es mayor a 15% de su valor nominal correspondiente, excepto para el 
límite de cuantificación que debe ser menor a 20%, haciendo uso de la siguiente 
ecuación: 
Desv. Abs. % = |
Concentración nominal - Concentración recuperada
Concentración nominal
|*100 
 
Página 38 
 
4.4.8 Estabilidad 
La evaluación de estabilidad se llevó a cabo con la finalidad de establecer las 
condiciones de temperatura y tiempo, en las cuales el paracetamol permanece 
estable en la matriz biológica, durante su manejo, toma de muestra, 
almacenamiento