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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN 
 
 
DETECCIÓN DE Campylobacter spp. EN ESPECÍMENES FECALES DE 
PACIENTES DEL INCMNSZ POR CULTIVO BACTERIANO, ENSAYO 
INMUNOENZIMÁTICO Y PCR EN TIEMPO REAL 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
LICENCIADA EN BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA 
 
P R E S E N T A: 
ADRIANA VARGAS CHÁVEZ 
 
ASESOR EXTERNO: Q.F.B. FERNANDO TUZ DZIB 
CO-ASESORA INTERNA: M. EN C. ANDREA BECERRIL OSNAYA 
CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO 2015 
 
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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN 
UNIDAD DE ADMINISTRACIÓN ESCOLAR 
DEPARTAMENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES 
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\,.'u ;JT!"" 
AVl>WM.A DE 
M.rltlc,o ASUNTO: VOTO ","P-ROIlATORIO 
M. en C. JORGE ALFREDO CUÉLLAR ORDAZ 
J)IRECTOR DE LA FES CUAUTITLAN 
PRESENTE -;.,. ..... 
ATN : M. EN A. ISMAEL HERNÁNÓEZ MA URICIO ,., 11 
Jefe del Dcp:1rta mcnto dc' Exlínlc~~cs·Pr.Qfcsiomllcs 
, de 1<\ FES Cuautithín. 
Con base en el Reglamento General de Exámenes, y la Dirección de la Facultad, nos permitimos 
comunicar a usted que revisamos el: Trabajo de Tesis 
Detección de Campylobacter spp. en especimenes fecales de pacientes dellNCMNSZ por cultivo bacteriano, 
ensayo inmunoenzimático y PCR en tiempo real. 
Que presenta la pasante: Adriana Vargas Chávez 
Con número de cuenta: 307294339 para obtener el Título de la carrera: Licenciatura en Bioguimica Diagnóstica 
Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL 
correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO. 
ATENTAMENTE 
"POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU" 
Cuautillán Izcalli, Méx. a 13 de Agosto de 2015. 
PROFESORES QUE INTEGRAN EL ,JURADO 
NOMBRE 
P RES[J)ENTE M. en C. Andrea Angela Becerril Osnaya 
VOCAL • Dra. Alma Lucila N uiiez del Arco 
SECRETARIO Q. Araceli Gaspar Mcdina 
le ... SUPLENTE M. en C. Ma. Guadalupe Avilés Robles 
2do. SUPLENTE M. en C. Mari tcre DOll1íngul.'z Rojas 
NOTA: los sinodales suple ntes están obligados a presentarse el día V hora del Examen Profesional (art. 127). 
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FIRMA 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN 
UNIDAD DE ADMIN LSTRACIÓN ESCOLAR 
DEPARTAMENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES 
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DIRECTOR DE LA FES CUAUTITLAN 
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.Jefe del J)cp:trta mcn to d e Kx:'Ílilcncs Profcsioll lllcs 
• de la' FES CuautitJún. 
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Detección de Campylobacter spp. en espeeimenes fecales de pacientes dellNCMNSZ por cultivo bacteriano, 
ensayo inmunoenzimático y PCR en tiempo real . 
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FIRMA 
Este trabajo fue realizado en el laboratorio de bacteriología intestinal 
del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán 
AGRADECIMIENTOS 
A mis padres a quienes amo incondicionalmente y que con su confianza, apoyo, 
sacrificios y valiosos consejos hicieron posible la culminación de mis estudios 
universitarios. 
A la Universidad Nacional Autónoma de México, especialmente a la Facultad de 
Estudios Superiores Cuautitlán por ser mi casa de estudios y permitir formarme 
académicamente. 
Al departamento de Infectología e Investigación del Instituto Nacional de Ciencias 
Médicas y Nutrición Salvador Zubirán por brindar los recursos, infraestructura y a 
quienes me brindaron las asesoría necesaria para la realización de este proyecto. 
Al Q.F.B. Fernando Tuz Dzib por aceptarme como parte de su equipo de trabajo y 
darme su confianza para la elaboración de este trabajo. 
A la Q.F.B. Leticia Reyes González por otorgarme parte de su tiempo y paciencia 
para enseñarme todo sobre la detección microbiológica de Campylobacter. 
A mis amigas Ali, Denise, Heidi, Irais, Karina, Lupe y Marta con las que aprendí 
demasiado, e hicieron muy ameno todo este trayecto. 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
ABREVIATURAS i 
LISTA DE FIGURAS ii 
LISTA DE TABLAS iii 
RESUMEN 1 
1 INTRODUCCIÓN 2 
1.1 Historia 3 
1.2 Características generales de Campylobacter spp. 4 
1.3 Patogénesis 5 
1.3.1 Respuesta al estrés. 6 
1.3.2 Motilidad y quimiotaxis 6 
1.3.3 Adhesión e invasión. 7 
1.3.4 Toxigenicidad. 8 
1.4 Reservorios y fuentes de infección. 9 
1.5 Manifestaciones clínicas 10 
1.5.1 Complicaciones de la infección por Campylobacter spp. 11 
1.6 Epidemiología 12 
1.6.1 Incidencia 12 
1.6.2 Datos demográficos 13 
1.7 Tratamiento y susceptibilidad a antibióticos. 14 
1.8 Detección en el laboratorio. 15 
1.8.1 Recolección, transporte y almacenamiento de muestras. 15 
1.8.2 Aislamiento. 16 
1.8.3 Confirmación 18 
1.8.4 Identificación a nivel de especie 19 
1.8.5 Ensayos inmunoenzimáticos 21 
1.8.6 Reacción en cadena de la polimerasa 24 
2 JUSTIFICACIÓN 31 
3 HIPÓTESIS 31 
4 OBJETIVOS 32 
5 METODOLOGÍA 33
5.1 Recepción de especímenes fecales. 34 
5.2 Cultivo y condiciones de crecimiento. 34 
5.2.1 Medios selectivos 34 
5.2.2 Preparación de la muestra 34 
5.2.3 Método de filtración pasiva. 34 
5.3 Identificación. 35 
5.4 Ensayo Inmunoenzimático 35 
5.5 Método de PCR en tiempo real 36 
5.6 Controles de crecimiento y amplificación 37 
6 RESULTADOS 38 
6.1 Técnicas de cultivo bacteriano 39 
6.2 Ensayo inmunoenzimático 40 
6.3 Método de PCR en tiempo real 40 
7 DISCUSIÓN 42 
8 conclusiones 48 
9 Perspectivas 49 
10 REFERENCIAS 50 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 i 
 
ABREVIATURAS 
ADN Acido desoxirribonucleico 
Ac Anticuerpo 
Ag Antígeno 
C. Campylobacter 
CadF Factor de adhesión de Campylobacter a fibronectina 
CapA Proteína de adhesión A de Campylobacter 
CB Medio de transporte Cary-Blair 
CCDA Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar (Agar desoxicolato cefoperazona carbón) 
CDC Centers for Disease Control and Prevention (Centros para el control y la prevención 
de enfermedades) 
Cdt Cytolethal Distending Toxin (Toxina distensora citoletal) 
CM Agar sangre de carnero con membrana 
CO2 Dióxido de carbono 
CSM Charcoal Selective Medium (Medio selectivo base de carbón) 
Ct Threshold Cycle (Ciclo umbral) 
EIA Enzyme Immunoassay (Ensayo inmunoenzimático) 
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) 
glyAGen de la serina hidroximetiltranferasa 
hipO Gen de la hipuricasa 
INCMNSZ Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán 
JlpA Liproproteína A de C. jejuni 
Kb kilobases 
LOS Lipoolisacáridos 
mCC Medio de carbón para Campylobacter 
NO2 Dióxido de nitrógeno 
NTC Non-Template Control (Control negativo de templado) 
Peb1 Proteína Pei, Ellison y Blaser 1 
PCR Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa) 
PSC Polisacárido capsular 
SGB Síndrome de Guillain-Barré 
UFC Unidad formadora de colonias 
VNC Viable no cultivable 
 
 
 
 ii 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1. Imagen de microscopio electrónico de barrido de C. jejuni, se observa su apariencia de 
sacacorchos y flagelo bipolar (Altekruse, Stern, Fields, & Swerdlow, 1999) 4 
Figura 2. Modelo de patogénesis de C. jejuni. La manifestación clínica de la infección por C. jejuni 
es resultado de la actividad bacteriana (lado derecho) y la respuesta inmune del hospedero 
(lado izquierdo). (Larson, Christensen, Pacheco, Minnich, & Konkel, 2008) 8 
Figura 3. Rutas más importantes para la infección humana por Campylobacter (Young, Davis, & 
Dirita, 2007) 9 
Figura 4. EIA tipo sándwich. Cuando los antígenos (Ag) de Campylobacter están presentes en la 
muestra la reacción positiva en el EIA PREMIERTM CAMPY se observa con una coloración 
amarilla bien definida. 21 
Figura 5. El ImmunoCard STAT! CAMPY es uno de los métodos inmunocromatográficos 
comercialmente disponible. Se observa los posibles resultados obtenidos con este método.
 22 
Figura 6. Reacción en cadena de la polimerasa. Los pasos de la reacción incluyen 
desnaturalización, hibridación y extensión debido a la acción de la DNA polimerasa. (Winn 
et al., 2006.) 25 
Figura 7. Química de la sonda de hidrólisis. La proximidad de la molécula extintora (quencher, Q) a 
la molécula fluorescente (R) deriva en una fluorescencia de fondo mínima. La hidrólisis de 
esta sonda por la actividad de exonucleasa de la DNA polimerasa provoca la difusión del 
fluoróforo desde la molécula extintora, de modo que la fluorescencia puede suceder 
cuando el fluoróforo de excita de modo apropiado. (Tille, 2013) 28 
Figura 8. Gráfico de amplificación lineal de PCR en tiempo real 29 
Figura 9. Morfología colonial de los aislados de Campylobacter jejuni en mCC y agar sangre de 
carnero en heces 39 
Figura 10. Curvas de amplificación por PCR en tiempo real del gen hipO para la detección de C. 
jejuni en las muestras fecales 41 
Figura 11. Curvas de amplificación por PCR en tiempo real del gen glyA para la detección de C. coli 
en las muestras fecales 41 
 
 
 
 iii 
 
LISTA DE TABLAS 
Tabla 1. Características para diferenciar Arcobacter y Campylobacter 19 
Tabla 2. Características diferenciales de campilobacterias de importancia clínica 20 
Tabla 3. Cebadores y sondas usadas en el método de PCR en tiempo real 37 
Tabla 4. Muestras fecales positivas de Campylobacter en cultivo, EIA y PCR en tiempo real de las 
250 muestras recibidas de Mayo a Junio del 2014. 38 
Tabla 5. Comparación de las técnicas de cultivo en medio selectivo y en agar sangre de carnero 
con membrana para la detección de Campylobacter en heces. 39 
Tabla 6. Resultados de las diluciones de cepas control en el ensayo inmunoenzimático 40 
1 
 
RESUMEN 
El género Campylobacter es reconocido como uno de los causantes más 
importantes de la gastroenteritis aguda bacteriana en humanos a nivel mundial, 
aislándose con mayor frecuencia C. jejuni y C. coli. La identificación de estas 
bacterias usando cultivos convencionales y ensayos bioquímicos es tardada y 
laboriosa, requiriéndose más de 4 días. Actualmente existen métodos como los 
ensayos inmunoenzimáticos y PCR en tiempo real que permiten una rápida 
identificación sin necesidad de un aislamiento primario, pero son poco usados por 
los costos que estos ensayos implican. 
Con el objetivo de identificar Campylobacter en muestras fecales se emplearon 
métodos convencionales de cultivo, un ensayo inmunoenzimático y PCR en 
tiempo real, para tomar en consideración sus ventajas en el diagnóstico de rutina 
en laboratorio. 
Se procesaron en total 250 muestras de pacientes con síntomas de gastroenteritis. 
Todas las muestras se examinaron mediante cuatro métodos: aislamiento en 
medios selectivos a base de carbón, aislamiento por el método de filtración pasiva, 
el uso del EIA PREMIERTM CAMPY y PCR en tiempo real. 
De las muestras analizadas el 4.4% fueron positivas para Campylobacter en al 
menos una prueba; 2% de los cultivos en mCC y 2.4% en CM fueron positivos de 
C. jejuni, con el EIA 2.4% de las muestras resultaron positivas de las cuales dos 
no se recuperaron en cultivo y dieron negativo en PCR; finalmente con PCR en 
tiempo real 2.8% resultaron positivas para C. jejuni y 0.8% positivas para C. coli. 
Los resultados de este trabajó demuestran que el EIA y PCR en tiempo real 
proporcionan resultados muy rápidos si se busca una alternativa al cultivo, siendo 
así la PCR la mejor opción debido a su sensibilidad, rapidez, a que puede 
emplearse de manera cuantitativa y es capaz de detectar Campylobacter a nivel 
de especie. 
 
2 
 
1 INTRODUCCIÓN 
Las diarreas infecciosas suelen ser uno de los problemas de salud más 
importantes a nivel mundial con una incidencia de 2 millones de casos anuales, y 
es considerada la segunda causa de muerte en niños menores de 5 años. Algunos 
de los agentes etiológicos identificados son bacterias pertenecientes a los géneros 
Shigella spp., Salmonella spp., Escherichia coli, Vibrio cholerae y Campylobacter 
spp., siendo este último la causa más común de la gastroenteritis humana (Platts-
Mills & Kosek, 2014) 
Las bacterias que pertenecen al género Campylobacter se encuentran 
ampliamente distribuidas y, desde el año 2005, representa la zoonosis más 
importante a nivel mundial causante de diarrea tanto en países desarrollados 
como en países en desarrollo (Platts-Mills & Kosek, 2014; WHO, 2011) 
En humanos la infección por Campylobacter se presenta como una gastroenteritis 
aguda con diarrea y/o vómito (Debruyne, Gevers, & Vandamme, 2008), 
principalmente como consecuencia de la ingesta de alimentos de origen animal 
contaminados como pollo mal cocinado o productos lácteos. 
Cuando el diagnóstico de la infección está basado exclusivamente en el cultivo en 
medio selectivo se ha encontrado que más del 90% de las campilobacteriosis son 
causadas por Campylobacter jejuni, y el resto por Campylobacter coli. Sin 
embargo, el avance en las técnicas de aislamiento e identificación ha permitido 
que especies como C. upsaliensis, C. lari, C. fetus subsp. fetus, C. jejuni subsp. 
doylei, C. concisus, Arcobacter butzleri y A. skirrowii hayan sido detectadas en 
muestras de pacientes con sospecha de campilobacteriosis (Man, 2011). 
El trabajo en el laboratorio para la detección, identificación y diferenciación de 
especies de Campylobacter incluyen métodos de microscopia, filtración y cultivo 
en medios selectivos que siguen dando resultados confiables (Nachamkin, 2003). 
Sin embargo, debido a que estas bacterias son nutricionalmente fastidiosas 
(requieren ambientes nutricionales complejos) y presentan una tasa de 
crecimiento lento, su aislamiento resulta ser más costoso y laborioso en 
3 
 
comparación a otras especies de importancia como Salmonella o Shigella y por lo 
tanto los laboratorios no suelen incluirlo en la búsqueda de rutina (Ajene, Fischer 
Walker, & Black, 2013; Nachamkin, 2003; Nyati & Nyati, 2013). 
1.1 Historia 
Las primeras observaciones al microscopio de bacterias semejantes a 
Campylobacter fueron hechas por Theodore Escherich en 1886, quien observó 
bacterias espirales a partir de muestras diarreicas de niños. En 1906 Mcfadyean y 
Stockman, y posteriormente Smith, identificaron bacterias microaerófilas 
semejantes a Vibrio refiriéndose a ellas como Vibrio fetus por ocasionar abortos en 
ganadobovino y ovino. Más tarde otras bacterias semejantes a Vibrio fueron 
observadas en muestras del yeyuno de becerros con diarrea y las llamaron Vibrio 
jejuni. Doyle en 1944 llamó Vibrio coli a un organismo similar obtenido de puercos 
con disentería porcina. Fue en 1963 cuando Sebald y Veron demostraron que 
estas bacterias poseían características genotípicas y fenotípicas diferentes al 
género Vibrio e introducen un nuevo género al que llamaron Campylobacter 
(Percival & Williams, 2013). 
Después de 1970 se realizaron los primeros aislamientos a partir de deposiciones 
de humanos por Cooper y Slee en Australia, y Dekeyser y colaboradores en 
Europa gracias al método de filtración implementado por Butzler, reconociéndose 
hasta estas fechas como patógeno humano causante de síndromes diarreicos 
(Winn, Allen, Janda, Koneman, & Procop, 2006). 
Un avance importante en el cultivo de estos organismos fue hecho por Skirrow, 
Bolton, Robertson y Blazer, quienes desarrollaron medios selectivos con 
antibióticos para facilitar el aislamiento de especies de Campylobacter con mayor 
frecuencia a partir de muestras de heces humanas sin necesidad de implementar 
la técnica de filtración. Para 1980 Penner, Hennessy, Lior y colaboradores 
describieron técnicas de serotipificación, que junto con técnicas de biotipificación, 
fagotipificación y genotipado, se han utilizado como base de la caracterización de 
las cepas de Campylobacter (Lawson, 2011). 
4 
 
1.2 Características generales de Campylobacter spp. 
El género Campylobacter pertenece a la familia Campylobacteraceae junto con los 
géneros Arcobacter y Sulfurospirillum, e incluye 25 especies y 8 subespecies, 
muchas de las cuales son de importancia clínica y económica (Debruyne, Gevers, 
et al., 2008; Fitzgerald & Nachamkin, 2011). 
Este género se caracteriza por tratarse de bacilos Gram-negativos con morfología 
en espiral, de S o curva con un tamaño entre los 0.2 a 0.8 μm de ancho y 0.5 a 5 
μm de largo (Figura 1). Son bacterias altamente móviles gracias a la presencia de 
un flagelo polar en uno o ambos extremos que le proporciona un movimiento 
circular o de sacacorchos (Nachamkin, 2003; Tille, 2013). 
 
Figura 1. Imagen de microscopio electrónico de barrido de C. jejuni, se observa su apariencia de sacacorchos y flagelo 
bipolar (Altekruse, Stern, Fields, & Swerdlow, 1999) 
La mayoría de estos microorganismos son microaerófilos, oxidasa positivos, no 
fermentadores ni oxidativos y obtienen su energía del uso de aminoácidos y de 
intermediarios del ciclo de Krebs (Winn et al., 2006). C. jejuni es la única especie 
que hidroliza hipurato de sodio y que pertenece, junto con C. coli, C. lari y C. 
upsaliensis, al grupo de las especies de Campylobacter conocidas como 
termotolerantes por crecer preferentemente entre 37° C y 42° C y no por debajo de 
los 30° C (Hofreuter, 2014) 
5 
 
Los integrantes de este género tienen un genoma de aproximadamente 1600 a 
2000 kb, siendo un genoma pequeño comparado con otras especies 
enteropatógenas como Escherichia coli, la cual tiene un genoma de 
aproximadamente 4000 kb (Fouts et al., 2005; Parkhill et al., 2000; Poly et al., 
2007) 
Además de la forma en espiral característica de este género, se ha descrito una 
forma cocoide observada a menudo en cultivos viejos o que han tenido una 
prolongada exposición al aire. Algunos factores que pueden influir la forma 
cocoide es el tipo de cepa, la temperatura, el pH, la osmolaridad y el medio de 
cultivo empleado (Winn et al., 2006), por lo que se ha sugerido que esta forma es 
la presentación del estado latente necesario para la supervivencia bajo 
condiciones que implican variaciones de temperatura, oxigeno, pH, ambientes 
osmóticos y es conocida como la forma VNC (Murphy, Carroll, & Jordan, 2006). 
1.3 Patogénesis 
La primera secuenciación del genoma de C. jejuni cepa NCTC 11168 (Parkhill et 
al., 2000), y posteriormente de cepas de C. coli, C. lari, C. upsaliensis han 
proporcionado las bases para el estudio de las moléculas y proteínas implicadas 
en los mecanismos de patogenicidad con los que cuentan estas bacterias, sin 
embargo, en comparación con otras bacterias enteropatógenas, los mecanismos 
de especies de Campylobacter son poco conocidos. La relativa escasez en el 
conocimiento de su patogénesis se debe a las dificultades en la manipulación 
genética molecular, la variabilidad de la virulencia de las cepas y la falta de un 
modelo animal eficaz de infección entérica humana. (Fouts et al., 2005). 
Los mecanismos de patogenicidad de Campylobacter que se han ido estudiando 
desde la primera secuenciación de su genoma son los implicados en la respuesta 
al estrés, la motilidad, quimiotaxis, adhesión, invasión y la toxigenicidad. 
6 
 
1.3.1 Respuesta al estrés. 
C. jejuni, especie estudiada con mayor frecuencia, es inusualmente sensible a 
diferentes condiciones de estrés ambiental porque carece de respuestas 
adaptativas como el regulador global RpoS, que a diversas bacterias Gram-
negativas les permite sobrevivir en condiciones severas de estrés, y a pesar de 
ello se ha visto que Campylobacter muestra respuestas adaptativas a condiciones 
ácidas y aeróbicas, promoviendo la forma VNC (Murphy et al., 2006). Otro sistema 
que no se ha identificado es el mecanismo osmoregulador, que les permite a las 
bacterias lidiar con el estrés osmótico. En cuanto al shock térmico, Campylobacter 
sintetiza 24 proteínas en respuesta a la exposición a temperaturas por encima del 
rango óptimo para el crecimiento (37-42 °C); además es capaz de llevar a cabo 
respiración y producción de ATP pero sin replicación a temperaturas de 4 °C, lo 
que ha permitido aislarla de alimentos refrigerados (Dasti, Tareen, Lugert, Zautner, 
& Gross, 2010) 
1.3.2 Motilidad y quimiotaxis 
El género Campylobacter se caracteriza por poseer un flagelo polar que facilita la 
motilidad de las bacterias y tiene una importancia primordial en el comportamiento 
quimiotáctico. Este flagelo polar está compuesto de flagelina O-glicosilada crucial 
para acercarse a los sitios de unión en las células epiteliales intestinales. Además, 
se han identificado dos proteínas implicadas en la regulación del flagelo, el sensor 
FlgS y el regulador de respuesta FlgR, y las proteínas FlgP y FlgQ esenciales en 
el movimiento del flagelo. 
En la secuencia del genoma de C. jejuni se han identificado los genes de 
quimiotaxis cheA, cheW, cheV, cheY, cheR, y cheB (Dasti et al., 2010; Young et 
al., 2007). En conjunto, el flagelo y sus componentes son importantes en la 
interacción de la bacteria con su hospedero, lo que facilita la colonización del 
intestino. 
7 
 
1.3.3 Adhesión e invasión. 
En la colonización del hospedero generalmente los microorganismos requieren 
factores de adherencia, los cuales en la mayoría de las bacterias Gram positivas y 
Gram negativas incluyen a los pilis. A pesar de que este tipo de estructuras no se 
han identificado en las especies de Campylobacter se han descrito proteínas como 
las CadF, la JlpA, CapA y Peb1 que contribuyen en la adhesión a las células 
eucariotas. CadF es una adhesina que se requiere para la adhesión e invasión 
máxima ya que se adhiere específicamente a la fibronectina de la matriz celular y 
se encuentra tanto en cepas de C. jejuni y C. coli. JlpA es una lipoproteína de 
superficie que influye en la respuesta proinflamatoria, observada en infecciones 
por C. jejuni. Otra lipoproteína involucrada en la colonización y persistencia de la 
infección es la homologa de adhesina autotrasnportadora CapA. La adhesina 
periplásmica Peb1 es crucial en la adherencia y comparte homología con las 
proteínas periplásmicas de unión acopladas a un sistema ABC (ATP-binding 
cassette) uniéndose con gran afinidad a aspartato y glutamato (Dasti et al., 2010; 
Young et al., 2007). 
Otros factores que en su ausencia en modelos animales afectan la adherencia, 
invasióny virulencia de Campylobacter son: el PSC que le proporciona a la 
bacteria resistencia al suero; los lipooligosacaridos que tiene actividad endotóxica 
típica y que presentan ácido siálico en la estructura del antígeno O de LOS 
semejante al de los gangliosidos neuronales, lo que sugiere que puede ser la 
causa que conduce a trastornos autoinmunes, como el caso del SGB (Nyati & 
Nyati, 2013; Young et al., 2007); los antígenos de invasión de Campylobacter (Cia, 
por sus siglas en inglés) y las proteínas flagelares FlaC, FlaA y FlaB, de los cuales 
su mecanismo de secreción y el papel que tienen en la invasión no son del todo 
claras. 
 
8 
 
1.3.4 Toxigenicidad. 
La única toxina identificada, secretada por varias especies de Campylobacter, 
incluidas C. jejuni, C. lari, C. coli, C. fetus y C. upsaliensis, es llamada toxina 
distensora citoletal, que consta de tres subunidades CdtA, CdtB, CdtC. En 
diferentes líneas celulares se ha visto que Cdt induce distención celular 
caracterizada por la elongación, hinchamiento y muerte celular (Dasti et al., 2010). 
El conjunto de estos mecanismos y el estado inmunológico del hospedero son 
factores que influyen en que Campylobacter sea capaz de invadir las células 
epiteliales del intestino y replicarse, manifestándose como inflamación y diarrea 
(Figura 2). 
 
Figura 2. Modelo de patogénesis de C. jejuni. La manifestación clínica de la infección por C. jejuni es resultado de la 
actividad bacteriana (lado derecho) y la respuesta inmune del hospedero (lado izquierdo). (Larson, Christensen, 
Pacheco, Minnich, & Konkel, 2008) 
 
9 
 
1.4 Reservorios y fuentes de infección. 
Las especies de Campylobacter generalmente son ubicuas en el medio ambiente 
y se pueden encontrar como comensales del tracto gastrointestinal de una gran 
variedad de mamíferos entre los que destacan las vacas, ovejas, cerdos, cabras, 
roedores silvestres y en toda variedad de aves de corral (Whiley, van den Akker, 
Giglio, & Bentham, 2013). Los perros, gatos u otros animales de compañía son 
considerados como posible fuente de infección de C. jejuni para los humanos, 
aunque también C. upsaliensis y C. helveticus han sido identificados en estos 
animales (Gölz et al., 2014). 
 
Figura 3. Rutas más importantes para la infección humana por Campylobacter (Young, Davis, & Dirita, 2007) 
 
La transmisión de .estas bacterias puede ser por consumo de agua o alimentos 
contaminados (Figura 3). Se ha visto que en países industrializados es común que 
ocurra la transmisión por el consumo de alimentos de origen animal como carne 
de aves de corral mal cocida o cruda y en países en vías de desarrollo 
Campylobacter también puede estar presente en los suministros de agua debido a 
10 
 
las condiciones sanitarias inadecuadas, pudiendo infectar a los humanos 
directamente a través de su consumo (Lawson, 2011). 
Ya que la infección suele ser por vía fecal-oral, el contacto de manera ocupacional 
con animales portadores o enfermos supone otra fuente importante de transmisión 
como en el caso de granjeros, veterinarios o personas encargadas del manejo de 
alimentos (Bouwman & van Putten, 2012). 
1.5 Manifestaciones clínicas 
Las infecciones en humanos por Campylobacter, en su mayoría, son causadas por 
C. jejuni y C. coli con una dosis infectiva de 500 células y un periodo de incubación 
que puede ir de los 2 a 10 días (Blaser & Engberg, 2008; Winn et al., 2006). 
Cuando Campylobacter infecta el intestino delgado y el colon la infección se 
presenta como una enfermedad gastrointestinal aguda autolimitante caracterizada 
por diarrea, fiebre y dolores abdominales. En general, los signos y síntomas por la 
infección de Campylobacter pueden presentarse de forma variable, desde una 
forma de corta duración que suele resolverse en una semana, o a un cuadro más 
severo y prolongado dependiendo del tamaño de inoculo y estado inmunológico 
del paciente (Blaser & Engberg, 2008; Tille, 2013). La diarrea puede continuar por 
2-3 días, pero el dolor abdominal y las molestias pueden persistir aun después de 
que la diarrea se haya detenido (Kirkpatrick & Tribble, 2011). 
Los estudios epidemiológicos han sugerido que existen dos tipos de 
manifestaciones de la enfermedad que dependen del nivel socioeconómico. En los 
países industrializados comúnmente se manifiesta como un periodo febril (fiebre 
de 40 °C) con diarrea inflamatoria sanguinolenta o con moco; y en los países en 
desarrollo la diarrea acuosa no inflamatoria es la presentación común de la 
enfermedad principalmente en niños mientras que en los adultos se habla de una 
posible forma de inmunización contra la enfermedad (van Vliet & Ketley, 2001; 
Young et al., 2007). 
11 
 
1.5.1 Complicaciones de la infección por Campylobacter spp. 
La campylobacterisosis se caracteriza por causar infecciones agudas con diarrea, 
pero se ha establecido que también contribuye en la patogénesis de condiciones 
gastrointestinales crónicas. Las complicaciones locales de las infecciones por 
Campylobacter como colecistitis, pancreatitis, peritonitis o hemorragia 
gastrointestinal masiva se presentan de manera poco frecuente como 
consecuencia de la difusión directa desde el tracto gastrointestinal, principalmente 
en adolescentes y adultos jóvenes. Así mismo, las secuelas gastrointestinales 
crónicas que se han relacionado a la infección de Campylobacter son el síndrome 
del intestino irritable, la enfermedad inflamatoria intestinal y la enfermedad celíaca 
(Allos, Lovine, & Blaser, 2014; Riddle, Gutierrez, Verdu, & Porter, 2012). 
Las infecciones por campylobacterias pueden llegar a ser prolongadas, severas y 
recurrentes, originando bacteriemia y manifestaciones extraintestinales, 
principalmente por C. fetus en aquellos pacientes con sistemas inmunes 
severamente comprometidos. Las infecciones extraintestinales como meningitis, 
osteomielitis y sepsis neonatal son muy raras, pero se han llegado a presentar. 
También, en una baja proporción, se han llegado a desarrollar secuelas post-
infección como eritema nodoso o artritis reactiva. (Ajene et al., 2013; Allos et al., 
2014; Nachamkin, 2003). 
El SGB, una neuropatía progresiva aguda caracterizada por parálisis, dolor, 
debilidad muscular y perdida de sensibilidad distal debido a la desmielinización de 
las neuronas, es reconocido como la complicación más severa de la infección por 
Campylobacter con una incidencia de 1 de cada 1000 individuos infectados. En 
general, uno de cada tres pacientes con SGB han tenido una infección con C. 
jejuni. Los síntomas de SGB suelen aparecer de 1-3 semanas después del inicio 
de enteritis por Campylobacter (Nachamkin, 2003; Nyati & Nyati, 2013). 
12 
 
1.6 Epidemiología 
1.6.1 Incidencia 
La campilobacteriosis es una zoonosis de distribución mundial y es la principal 
enfermedad gastrointestinal bacteriana, responsable de aproximadamente 400-
500 millones de casos al año, superando en ocasiones a la salmonelosis y 
shigellosis (Bessède, Delcamp, Sifré, Buissonnière, & Mégraud, 2011; Bouwman & 
van Putten, 2012). La verdadera incidencia de gastroenteritis causada por 
Campylobacter spp. es poco conocida debido a que son escasos los estudios 
referentes a esta bacteria y frecuentemente no todos los casos son reportados a 
órganos nacionales de vigilancia. 
Existen estudios realizados en diferentes partes del mundo en los que se ha 
estimado la incidencia basado solo en casos confirmados, por ejemplo, entre 2008 
y 2009 en Reino Unido se estimó la incidencia anual de campilobacteriosis en 9.3 
casos por cada 1000 habitantes (Tam et al., 2012); en los Países Bajos en el 2009 
la incidencia estimada fue de 52 casos por cada 1000000 habitantes (Havelaar et 
al., 2012). En el 2010 en 27 países europeos la incidencia era de 48.6 casos por 
cada 100000 habitantes (WHO, FAO, & OIE, 2013). En los EE.UU la red de 
vigilancia activa de enfermedades transmitidas por alimentos(FoodNet) reportó 
una incidencia de 14.3 casos por cada 100000 habitantes anualmente (National 
Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, 2012). 
En los países en que se realizan programas de vigilancia las tasas de incidencia 
informadas varían aproximadamente entre 25 a 250 por cada 100000 personas, 
reflejando las diferencias regionales en la incidencia de la campilobacteriosis, las 
dificultades en su estimación debido a las diferencias en los sistemas de vigilancia, 
las técnicas de identificación que se hayan empleado y las fuentes de datos 
consultadas. En cuanto a los países donde no existen programas de nacionales de 
vigilancia los datos epidemiológicos son escasos y se cree que la incidencia es 
mayor debido a que existe un alto nivel de infecciones asintomáticas asociadas 
13 
 
principalmente a C. coli, que no hacen posible la relación de la detección y la 
enfermedad (Fitzgerald & Nachamkin, 2011, Platts-Mills & Kosek, 2014). 
De los pocos estudios que existen en países de América Latina y África, se ha 
establecido una incidencia de 40000 casos por cada 100000 habitantes; y en el 
caso de los viajes a estas zonas se ha podido establecer una incidencia de 27000 
a 38000 casos por cada 100000 personas al año (Maurtua-Neumann & A 
Oberhelman, 2013). 
1.6.2 Datos demográficos 
Cualquier individuo es susceptible de ser infectado por Campylobacter pero 
particularmente afecta a niños menores de 5 Años y jóvenes adultos de 15 a 44 
años (Bouwman & van Putten, 2012; WHO et al., 2013). Esto se debe a los 
factores de riesgo que se presentan en las diferentes edades, como las mucosas y 
el sistema inmune inmaduros en niños pequeños o la exposición más frecuente en 
edad adulta a alimentos contaminados durante su preparación o falta de higiene 
en los mismos. Además, los hombres son los que se ven afectados con mayor 
frecuencia que las mujeres debido a los distintos hábitos nutricionales, el tipo de 
exposición y duración, así como las diferencias fisiológicas e inmunológicas (Gölz 
et al., 2014). 
Las infecciones por Campylobacter presentan una marcada estacionalidad, sobre 
todo en climas templados, ya que la incidencia comienza a aumentar en Marzo 
con un pico en verano que comienza a disminuir a principios de otoño (Fitzgerald 
& Nachamkin, 2011; Tille, 2013). 
En países tropicales en vías de desarrollo las infecciones asintomáticas ocurren 
comúnmente en niños y adultos, además son infectados con menor frecuencia 
debido a la inmunidad adquirida que va aumentando con la edad; en los países 
industrializados estos casos son inusuales (Maurtua-Neumann & A Oberhelman, 
2013; van Vliet & Ketley, 2001). 
14 
 
1.7 Tratamiento y susceptibilidad a antibióticos. 
Las infecciones sintomáticas por Campylobacter spp. comúnmente son 
autolimitantes y no requieren terapia antimicrobiana por lo que es tratada 
principalmente mediante reposición de líquidos y electrolitos dejando la terapia con 
antibióticos solamente en infecciones severas en niños, en pacientes 
inmunocomprometidos, en casos severos con disenterías graves y/o en 
infecciones con duración superior a los 7 días, (Kirkpatrick & Tribble, 2011; Perez-
Perez & Kienesberger, 2013). 
Estudios in vitro demuestran que C. jejuni es susceptible a una gran variedad de 
antibióticos incluyendo la eritromicina, las tetraciclinas, los aminoglucósidos, 
cloranfenicol, las quinolonas, los nitrofuranos, y a la clindamicina (Allos et al., 
2014; Tille, 2013). 
 Anteriormente, en países industrializados las fluoroquinolonas eran considerados 
los antibióticos de elección para tratar infecciones sospechosas de Campylobacter 
sin necesidad de esperar los resultados de laboratorio debido a su amplio espectro 
de acción pero, después de observar un aumento considerable de cepas 
resistentes a estos antimicrobianos, la eritromicina se volvió el antibiótico más 
óptimo para tratar las infecciones por Campylobacter debido a su bajo costo, ser 
seguro, a su fácil administración y a su espectro de acción que no afecta la 
microbiota de los pacientes (Allos et al., 2014), dejando como terapia alternativa la 
ciprofloxacina, la tetraciclina y la clindamicina. 
En el caso de las cepas adquiridas en países en desarrollo es más probable que 
sean resistentes a la eritromicina y tetraciclina, en estos casos la elección de la 
terapia alternativa se debe establecer hasta tener los resultados de las pruebas de 
susceptibilidad, al igual que en los casos de bacteremias (Fitzgerald, Whichard, & 
Nachamkin, 2008; Maurtua-Neumann & A Oberhelman, 2013). 
Debido a que el uso de antimicrobianos en etapas tempranas de la enfermedad 
reduce los síntomas intestinales aproximadamente 1.3 días, el diagnóstico rápido 
15 
 
presuntivo obtenido mediante la detección de Campylobacter directamente de las 
heces es clínicamente relevante (Allos et al., 2014) 
1.8 Detección en el laboratorio. 
La identificación rápida y correcta del agente infeccioso de las gastroenteritis, 
principalmente en los casos severos, ayuda a la elección correcta del tratamiento 
así como a proporcionar datos epidemiológicos certeros. 
Las especies de Campylobacter son difíciles de aislar de muestras fecales en 
presencia de la flora normal y a sus requerimientos nutricionales, pero el 
desarrollo de métodos selectivos ha facilitado esta tarea. 
Los métodos convencionales disponibles y empleados en algunos laboratorios 
clínicos para el diagnóstico de Campylobacter incluyen la microscopia, filtración y 
el cultivo en medios selectivos, pero en las últimas décadas se han desarrollado 
técnicas que no dependen del cultivo entre las que se incluyen los ensayos 
inmunoenzimáticos y técnicas moleculares como PCR en sus diferentes 
modalidades, que han permitido la detección a nivel de especie de Campylobacter 
directamente de las heces. 
1.8.1 Recolección, transporte y almacenamiento de muestras. 
La identificación de Campylobacter en humanos se realiza a partir de muestras 
diarreicas o heces de pacientes con gastroenteritis recolectadas en contendores 
convencionales para ser aisladas inmediatamente después de su llegada al 
laboratorio debido a que estas bacterias son sensibles a las condiciones 
ambientales como a la deshidratación, el oxígeno atmosférico, luz solar y 
temperaturas elevadas (Maurtua-Neumann & A Oberhelman, 2013). 
Cuando las muestras son procesadas después de 2 h de su recolección deben ser 
colectadas en medios de transporte como agua peptonada alcalina con tioglicolato 
y cistina, medio modificado de Stuart o medio Cary Blair que le proporcionan un 
bajo contenido de nutrientes y las bacterias no se replican pero se mantienen 
16 
 
viables por su bajo potencial oxidoreducción y su alto pH que minimiza la 
destrucción bacteriana por acidificación. El almacenamiento de las muestras 
puede ser a 4° C hasta por 3 días, para evitar su desecación, pero lo más 
recomendable es procesarlas lo más pronto posible a su momento de llegada 
(Fitzgerald & Nachamkin, 2011; Tille, 2013). 
1.8.2 Aislamiento. 
Para el aislamiento de Campylobacter a partir de muestras fecales se usan medios 
selectivos o el método de filtración pasiva en medio no selectivo. El empleo de 
mínimo dos medios selectivos diferentes o dos técnicas de aislamiento está 
asociado con una mayor sensibilidad en el aislamiento (Fitzgerald et al., 2008; 
Tille, 2013). 
1.8.2.1 Medios selectivos 
El aislamiento exitoso de Campylobacter spp. a partir de especímenes fecales 
depende del medio selectivo elegido y de las condiciones de incubación. Los 
medios selectivos pueden contener antibióticos como la cefoperazona en 
combinación con vancomicina o bacitracina para inhibir bacterias Gram positivas; 
rifampicina para inhibir tanto bacterias Gram positivas como Gram negativas; la 
polimixina B o E (colistina) es usada para inhibir la mayoría de bacterias Gram 
negativas a excepción de Proteus spp.para la cual se adiciona timetoprima o 
deoxicolato; además incluyen cicloheximida, anfotericina B o nistatina para inhibir 
competidores fúngicos (Corry, 2014). 
Los medios selectivos se dividen en dos grandes grupos: medios a base de agar 
sangre con antibióticos como el medio de Blaser (Campy BAP), el medio de 
Skirrow, el medio Butzler, y medios a base de carbón que no contienen sangre 
como agar desoxicolato cefoperazona carbón modificado y el CSM, siendo estos 
últimos más sensibles que el método de filtración o el uso del medio de Skirrow. 
(Nachamkin, 2003) 
17 
 
1.8.2.2 Técnica de filtración pasiva 
La técnica de filtración pasiva es un método de aislamiento desarrollado por Steele 
y McDermott, usada como complemento para el aislamiento primario de 
Campylobacter en medios no selectivos como el agar sangre, permitiendo el 
aislamiento de especies de Campylobacter sensibles a los agentes de los medios 
selectivos, especialmente de especies poco comunes (Corry, 2014; Winn et al., 
2006). Esta técnica se fundamenta en el pequeño tamaño y alta motilidad de 
Campylobacter que le facilita el paso a través de filtros de membrana de acetato 
de celulosa con poros de 0.45 a 0.65 µm, que no permiten que bacterias más 
grandes pasen. Las desventajas que presenta esta técnica es que no todas las 
bacterias del inoculo penetran el filtro y no puede ser usado como método 
cuantitativo, además el tiempo de incubación mínimo debe ser 5 días (Nachamkin, 
2003; Steele & McDermott, 1984). 
1.8.2.3 Incubación 
La mayoría de las especies de Campylobacter requieren para su incubación una 
atmosfera microaeróbica que contenga aproximadamente 5% de O2, 10% de CO2 
y 85% NO2. Las especies termotolerantes son capaces de crecer a una 
temperatura superior a los 30° C con mayor desarrollo en un rango 42-45°C en el 
cual se inhibe el crecimiento de otras especies bacterianas por lo que es la 
temperatura ideal en los laboratorios de diagnóstico clínico; el periodo de 
incubación es de hasta por 72 h para un crecimiento óptimo (Fitzgerald & 
Nachamkin, 2011; On, 2013). Por el contrario, las especies no termotolerantes, 
como C. fetus, C. hyointestinalis, C. curvus, C. rectus, se inhiben por los agentes 
selectivos convencionales, las mezclas de gases comúnmente empleados y/o la 
incubación a 42° C y por lo tanto su aislamiento se puede realizar más fácilmente 
mediante filtración pasiva en medios no selectivos con incubación en una 
atmósfera microaeróbica enriquecida con hidrógeno y dióxido de carbono 
incubándolos 5 días a 37° C (Lastovica, 2006; Man, 2011). 
18 
 
1.8.3 Confirmación 
Las pruebas para confirmar la presencia de Campylobacter requieren cultivos 
puros, pero se puede realizar un diagnóstico rápido presuntivo mediante el 
examen directo de muestras fecales diarreicas en microscopio de campo oscuro o 
de contraste de fases al observar la característica morfología y el típico 
movimiento de sacacorchos de dicha bacteria, aunque requiere demasiada 
experiencia por parte del microbiólogo (Debruyne, Gevers, et al., 2008; Fitzgerald 
& Nachamkin, 2011). 
1.8.3.1 Morfología colonial 
En medios que contienen sangre, las colonias características de Campylobacter 
son ligeramente rosadas, redondas, convexas, lisas y brillantes, con un borde 
regular. En los medios a base de carbón las colonias son grisáceas, planas, de 
forma irregular de apariencia seca o húmeda, con tendencia a extenderse, y 
debido a la incubación prolongada pueden llegar a verse colonias redondas, 
convexas y con brillo metálico. Cuando el medio es fresco es posible observar un 
velo sobre la superficie del agar debido al movimiento de las bacterias (OIE, 2008; 
Winn et al., 2006) 
1.8.3.2 Microscopía 
El uso de la tinción Gram, a partir del frotis del aislado de heces, permite observar 
en un microscopio óptico la morfología de bacilos curvos y/o en espiral distintivo 
de este género bacteriano. Las especies de Campylobacter tienden a presentar 
una tinción débil haciendo necesario el uso de carbolfucsina como colorante de 
contraste o puede extenderse el tiempo con el colorante de contraste de safranina 
por lo menos 10 minutos para una mayor intensidad de tinción (Fitzgerald & 
Nachamkin, 2011; Winn et al., 2006) 
19 
 
1.8.3.3 Otras pruebas 
Las pruebas de oxidasa y catalasa positivas, junto con la variación en las 
temperaturas de incubación, forman parte del esquema para la confirmación del 
género Campylobacter (Tabla 1), por ejemplo C. jejuni y C. coli no se desarrollan 
en microaerofilia a 25° C y en aerobiosis a 42° C; las especies no termotolerantes 
pueden crecer a 37 °C en microaerofilia pero no a mayor temperatura. Además, 
las especies de Arcobacter spp. presentan morfología colonial y celular semejante 
a Campylobacter y la variación en la temperatura de incubación permite diferenciar 
estos géneros, debido a que Arcobacter spp. es capaz de crecer en microaerofilia 
a 42° C y aeróbicamente a temperatura ambiente mientras que Campylobacter 
spp. solo en microaerofilia por arriba de los 30° C (Corry, 2014; Fitzgerald & 
Nachamkin, 2011; Tille, 2013). 
Tabla 1. Características para diferenciar Arcobacter y Campylobacter 
Género 
Reducción 
de nitratos 
Crecimiento en 
glicina al 0.5% 
Hidrólisis 
de urea 
Crecimiento a 
Morfología 
celular 
Vainas 
flagelares 15° C 30° C 42° C 
Arcobacter + ND V + + - 
Bacilos curvos 
y espiralados 
Ausentes 
Campylobacter + V - - + V 
Bacilos curvos 
y espiralados 
Ausentes 
+: 90% o más de las cepas son positivas; -: 90% o más de las cepas son negativas; V: variable 11%-89% de las cepas son 
positivas; ND: no disponible. (Winn et al., 2006) 
 
1.8.4 Identificación a nivel de especie 
El esquema convencional para identificar Campylobacter y microorganismos 
relacionados está basado en las características fenotípicas como la morfología 
celular y colonial, reacciones bioquímicas, pruebas de temperatura de crecimiento 
y tolerancia. En la mayoría de los laboratorios clínicos la identificación solo se 
realiza a nivel de género, ya que debido a la compleja y rápida evolución 
taxonómica, los requerimientos de crecimiento exigentes y a que son 
20 
 
relativamente inertes bioquímicamente vuelve problemática la caracterización 
fenotípica de otras especies diferentes a C. jejuni. Las pruebas que comúnmente 
se utilizan por su rapidez son hidrólisis de hipurato e hidrólisis de indoxil acetato 
que permiten la identificación de C. jejuni por ser la única capaz de hidrolizar 
hipurato, pero debido a que se han encontrado cepas con hidrólisis de hipurato 
negativo, junto con la prueba de hidrólisis de indoxil acetato positivo es posible 
reportarla como C. jeuni/ C. coli hipurato negativo, confirmándose solo por 
amplificación del gen hipO (Corry, 2014; On, 2013; Tille, 2013). En la Tabla 2 se 
pueden observar otras de las pruebas complementarias para la identificación de 
algunas de las especies de Campylobacter de mayor importancia clínica. 
 
Tabla 2. Características diferenciales de campilobacterias de importancia clínica 
Especie Catalasa Nitrato 
Sulfuro de 
hidrógeno 
Acetato de 
indoxilo Hipurato 
Crecimiento 
25° C 37° C 42°C 
Mac-
Conkey 
C. coli + + - + - - + + + 
C. concisus - + + - - - + C + 
C. curvus - + + V - - + V V 
C. fetus subsp. 
fetus 
+ + - - - + + - + 
C. hyointestinalis + + + - - V + + + 
C. jejuni subsp. 
jejuni 
+ + - + + - + + - 
C. jejuni subsp. 
doylei 
v - - + + - + D - 
C. lari + + - - - - + + + 
C. rectus - + + + - - + D - 
C. upsaliensis - (d) + - + - - + + - 
+: 90% o más de las cepas son positivas; -: 90% o más de las cepas son negativas; V: variable 11%-89% de las cepas son 
positivas; D: reacción débil; ND: no disponible; resultados contradictorios en la literatura. (Winn et al., 2006) 
 
21 
 
1.8.5 Ensayos inmunoenzimáticos 
Los métodos convencionales de detección de Campylobacter requieren el 
aislamiento previoen medios selectivos los cuales son laboriosos y consumen 
mucho tiempo. En la actualidad se han desarrollado métodos inmunológicos de 
diagnóstico rápido, independientes de los cultivos bacterianos, donde se 
identifican antígenos directo en las muestras de heces diluidas sin previo 
aislamiento. 
Los métodos más utilizados para detección directa de patógenos entéricos en 
heces son los ELISA o EIA. Los ELISA/EIA, son enzimoinmunoanálisis, 
generalmente diseñados de tipo “sándwich”, que involucran un Ac inmovilizado a 
una matriz sólida que captura los Ags específicos, ya sea células o toxinas 
bacterianas presentes en la muestra, y un segundo Ac conjugado a una enzima 
que se une al Ag, la aparición de color en la mezcla de reacción al adicionar un 
sustrato cromógeno indica una prueba positiva (Figura 4). La validación de estos 
ensayos incluye pruebas de inclusión para asegurar que detectan diferentes cepas 
de C. jejuni y C. coli, y de exclusividad para asegurar que no haya reacciones 
cruzadas con bacterias estrechamente relacionadas (Law, Ab Mutalib, Chan, & 
Lee, 2015; Oyarzabal & Battie, 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. EIA tipo sándwich. Cuando los antígenos (Ag) de Campylobacter están presentes en la muestra la reacción 
positiva en el EIA PREMIERTM CAMPY se observa con una coloración amarilla bien definida. 
A
g 
Ag 
22 
 
El método inmunocromatográfico de flujo lateral es un EIA modificado disponible 
comercialmente en un dispositivo simple, generalmente recubierto de plástico, 
utilizada para detecciones rápidas sin necesidad de más de 15 min para obtener 
un resultado. La prueba se realiza en una tira de nitrocelulosa en una zona se 
encuentran los anticuerpos marcados específicos contra el antígeno de interés y 
es donde se coloca la muestra de donde migran por capilaridad a la mitad de la 
tira que tiene inmovilizados anticuerpos específicos contra el antígeno que 
permiten la formación del complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo y por lo tanto 
visible por la aparición de una banda de color. Existe una tercera zona conocida 
como zona de control a donde la muestra sigue migrando y el exceso de 
conjugado se une dando una segunda banda de color. Dos bandas claras de color 
en la membrana es un resultado positivo, una solo banda indica resultado negativo 
(Figura 5). La principal desventaja de esta técnica es que puede tener un umbral 
más alto de detección en comparación con la EIA, lo que aumenta los falsos 
positivos (Oyarzabal & Battie, 2012). 
 
 
Figura 5. El ImmunoCard STAT! CAMPY es uno de los métodos inmunocromatográficos comercialmente disponible. Se 
observa los posibles resultados obtenidos con este método. 
 
 
23 
 
Algunos de los EIA disponibles para la detección de Campylobacter 
comercialmente disponibles son PremierTM CAMPY EIA, ProSpecTTM 
Campylobacter EIA, Ridascreen® Campylobacter, ImmunoCard STAT! ® CAMPY y 
Xpect Campylobacter, que son capaces solo de detectar C. jejuni o C. coli 
directamente de las heces, pero no de diferenciarlos. 
El ensayo ProSpectTM Campylobacter (Remel Inc.), es un EIA en sándwich que se 
lleva a cabo en una microplaca y usa anticuerpos policlonales conjugados con 
peroxidasa de rábano. Este ensayo presenta una sensibilidad analítica de 105-6 
UFC/ml y los resultados se pueden leer visualmente o espectrofotométricamente. 
Diferentes estudios han demostrado que tiene una sensibilidad de 89% y una 
especificidad del 98% (Dediste et al., 2003; Granato et al., 2010; Platts-Mills et al., 
2014) 
El EIA PREMIERTM CAMPY (Meridian Bioscience Inc.) emplea un anticuerpo 
monoclonal que se une a un antígeno en común de C. jejuni y C. coli. Presenta un 
límite de detección de 106-7 UFC/ml, y el fabricante reporta una sensibilidad de 
97% y una especificidad de 96% en un estudio de 2073 muestras, que junto con 
los trabajo de Granato (2010), Bessède y colaboradores (2011) demuestran una 
alta especificidad y sensibilidad de este EIA, pero siguen siendo pocos los datos 
sobre su desempeño. 
Otro EIA en microplaca, Ridascreen Campylobacter (R-Biopharn AG), también 
emplea anticuerpos monoclonales pero no ha tenido un buen desempeño como 
menciona el fabricante (Bessède et al., 2011). 
El ensayo inmunocromatográfico ImmunoCard STAT! CAMPY (Meridian 
Bioscience, Inc.) detecta la bacteria mediante un complejo coloidal/anticuerpo y 
presenta una especificidad semejante a los EIA con una sensibilidad analítica de 
107 UFC/ml (Bessède et al., 2011; Granato et al., 2010). Otro ensayo 
inmunocromatográfico, disponible comercialmente, es el Xpect Campylobacter 
(Remel Inc.) que permite obtener resultados rápidos pero con muy baja 
sensibilidad (Tissari & Rautelin, 2007). 
24 
 
De acuerdo a la comparación entre los cultivos bacterianos y la detección de 
antígenos, los inmunoensayos presentan una mayor sensibilidad que los cultivos 
(Bessède et al., 2011; Granato et al., 2010), por lo tanto estos métodos pueden ser 
una alternativa para el diagnóstico de infecciones gastrointestinales por 
Campylobacter, y tienen como ventajas la rapidez, sencillez y la fácil 
interpretación. Sin embargo, recientemente el CDC ha publicado datos que 
sugieren que los EIAs no deben ser utilizados como único método para detección 
de Campylobacter en muestras fecales y los casos “positivos” deben ser 
confirmados con el cultivo (Fitzgerald & Nachamkin, 2011; Oyarzabal & Battie, 
2012) 
Aún no está establecido si el pobre desempeño de estos ensayos es inherente de 
ellos o se debe a la falta de optimización, ya que no existen suficientes estudios 
que lo corroboren, debido a los altos costos prohibitivos que implica la adopción de 
estos métodos en combinación con los cultivos de rutina. 
1.8.6 Reacción en cadena de la polimerasa 
Gracias a los avances en biología molecular, los métodos basados en el análisis 
de ácidos nucleicos ha revolucionado el diagnóstico microbiológico. Los ácidos 
nucleicos presentan una estructura estable que puede ser heredada de 
generación en generación con gran fidelidad, lo que los hace excelentes blancos 
moleculares para la detección de microorganismos mediante la búsqueda de 
genes específicos a través de herramientas rápidas, sensibles y cuantitativas. 
La técnica de amplificación por PCR, en la que se aísla y reproducen secciones 
específicas del ADN bacteriano, es la de mayor utilidad para la detección e 
identificación de microorganismos. Esta técnica se fundamenta en la amplificación 
in vitro de una secuencia conocida de ADN mediante una ADN polimerasa 
termoestable y un par de oligonucleótidos (cebadores) que delimitan el fragmento 
a amplificar, permitiendo aumentar de forma exponencial las copias de un 
fragmento concreto de su genoma. 
25 
 
Los pasos de la PCR (Figura 6) incluyen la desnaturalización, donde la doble 
hélice de ADN es separada en dos hebras, que servirán de molde, mediante la 
incubación de las muestra a una temperatura entre 90-95° C. El segundo paso de 
la reacción es el alineamiento, donde los cebadores se unen a los extremos 3’ 
complementarios que flanquean el fragmento de interés, siendo necesario la 
disminución de la temperatura entre 45-65°C, la cual dependerá de la composición 
nucleotídica y del tamaño de los cebadores. En el paso final de extensión o 
elongación, a una temperatura normalmente de 72°C, se produce la síntesis de 
una cadena sencilla en dirección 5’→3’ mediante la ADN polimerasa, la cual 
incorpora los desoxinucleotidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena 
molde y produciendo así un fragmento de doble cadena por complementariedad. 
Dicho ciclo se puede repetir normalmente unas 25 a 45 veces para permitir la 
amplificación de suficientes amplicones (fragmentos amplificados por PCR) para 
poder detectarlo mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro 
de etidio, o mediante hibridación con sondas específicas (Mackay, 2004).Figura 6. Reacción en cadena de la polimerasa. Los pasos de la reacción incluyen desnaturalización, hibridación y 
extensión debido a la acción de la DNA polimerasa. (Winn et al., 2006.) 
26 
 
La PCR se ha empleado en gran cantidad de estudios para detectar e identificar 
diferentes especies de Campylobacter, principalmente C. jejuni y C. coli, en 
diferentes tipos de muestras (Debruyne, Samyn, et al., 2008; Fernández-Cruz et 
al., 2010; Maher et al., 2003; Singh, Rathore, Singh, & Cheema, 2011). También 
se han empleado técnicas de PCR modificadas que pretenden aumentar el 
potencial de la técnica, tal es el caso de la PCR múltiple que permite detectar 
varias especies o varios genes en una misma muestra y reacción (Buchan et al., 
2013; Kabir et al., 2011; Yamazaki-Matsune et al., 2007), resultando en ahorro de 
tiempo, de reactivos y de volumen de la muestra. No obstante, la especificidad de 
la reacción puede disminuir por la competencia entre cebadores cuando se usa 
más de un par, disminuyendo así la disponibilidad de los reactivos y por ende la 
sensibilidad de la amplificación. 
Las principales ventajas que tiene el uso de la PCR son su sensibilidad, su 
especificidad, su capacidad de procesamiento de grandes cantidades de muestra 
y la detección de los microorganismos directamente de la muestra sin previo 
aislamiento, lo que es muy útil en el caso de microorganismos que son difíciles de 
recuperar en cultivo (de Boer et al., 2013; On, 2013). Sin embargo, la aplicación de 
PCR para la detección de patógenos directamente de las muestras biológicas, 
principalmente en muestras fecales, se vuelve más complicado por la presencia de 
varios inhibidores de la PCR, como hemoglobina, polisacáridos, grasas, proteínas, 
iones y sales, que pueden conducir a falsos negativos (Claassen et al., 2013; 
Wilson, 1997). Debido a ello, la elección del método de extracción del ADN deberá 
estar basada en la naturaleza de la muestra y el tipo de célula de la que se 
obtendrá el ADN. Actualmente existen diferentes métodos de extracción de ADN 
bacteriano de muestras fecales automatizados y no automatizados que han dado 
buenos resultados eliminado la mayoría de los inhibidores (Claassen et al., 2013; 
Mirsepasi et al., 2014; Nelson, Palombo, & Knowles, 2010). 
 
27 
 
1.8.6.1 PCR en tiempo real 
El proceso para la detección de microorganismos por PCR, en general, implica la 
extracción del ADN, la amplificación por PCR y la detección mediante 
electroforesis, todo este proceso puede durar hasta 24 h y aumenta la probabilidad 
de contaminaciones y/o de degradación del ADN, lo que ha llevado a la 
implementación de modalidades más rápidas y específicas como la PCR en 
tiempo real, que es capaz de realizar la amplificación y detección al mismo tiempo. 
La PCR en tiempo real se basa en el mismo principio que la PCR punto final pero, 
en lugar de utilizar la electroforesis en geles de agarosa para detectar la secuencia 
amplificada, utiliza la fluorescencia como indicador de la amplificación. Durante la 
amplificación, el termociclador, que tiene incorporado un lector de fluorescencia, 
detecta la señal emitida tras la excitación del o los fluoróforos utilizados, con la 
correspondiente longitud de onda, siendo esta señal proporcional a la cantidad de 
ADN formado en cada ciclo (Higuchi, Fockler, Dollinger, & Watson, 1993).Esta 
técnica puede ser cualitativa o cuantitativa. 
Los sistemas de detección por fluorescencia pueden ser inespecíficos mediante 
agentes intercalantes, que son fluorocromos que aumentan notablemente la 
emisión de la fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice y el más 
empleado por su facilidad de utilización y disponibilidad es SYBR® Green I. Los 
sistemas específicos de secuencia se tratan de sondas marcadas con fluoróforos, 
cuya diana se encuentra en el producto de amplificación. Las sondas de 
hibridación más utilizadas, y las utilizadas en este trabajo, son las sondas de 
hidrólisis, denominadas también sondas TaqMan (Costa, 2004). 
Las sondas de hidrólisis son oligonucleótidos marcados con un fluorocromo 
donador en el extremo 5’, que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor 
(quencher) en el extremo 3’ que absorbe la fluorescencia liberada por el donador 
cuando están espacialmente próximas. Sin embargo, durante la amplificación de 
ADN, la sonda se hibrida con su cadena complementaria pero la ADN polimerasa, 
que tiene actividad 5’ exonucleasa, hidroliza el extremo libre 5’ de la sonda 
28 
 
durante su desplazamiento en la amplificación, produciendo la liberación del 
fluorocromo donador (Figura 7). Como donador y aceptor están espacialmente 
alejados, la fluorescencia emitida por el primero es captada por el lector (Costa, 
2004), la cual es proporcional al incremento de ADN de cada ciclo. El empleo de 
sondas garantiza la especificidad de la detección y pueden ser empleadas en 
análisis multiplex pero su costo es más elevado que el SYBR® Green I y las 
optimizaciones de las condiciones de reacción resulta más difícil. 
 
Figura 6. Química de la sonda de hidrólisis. La proximidad de la molécula extintora (quencher, Q) a la molécula 
fluorescente (R) deriva en una fluorescencia de fondo mínima. La hidrólisis de esta sonda por la actividad de exonucleasa 
de la DNA polimerasa provoca la difusión del fluoróforo desde la molécula extintora, de modo que la fluorescencia 
puede suceder cuando el fluoróforo de excita de modo apropiado. (Tille, 2013) 
 
Entre los fluorocromos más empleado como aceptor en las sondas son el 6-FAM™ 
(6-carbo fluoresceína) que es excitado eficientemente a 488 nm y es fácilmente 
conjugado a los oligonucleótidos emitiendo una señal fuerte. Otro de los 
fluorocromos empleados es VIC® que se excita eficientemente cerca de los 538 
29 
 
nm. Los quencher son moléculas fluorescentes o capaces de absorber energía 
luminosa dentro del rango apropiado de longitud de onda y entre los más usados 
esta TAMRA™ (6-carboxil-tetrametil-rodamina). Además de los fluorocromos 
aceptor y donador presentes en las sondas, la PCR en tiempo real incluye un 
tercero conocido como de referencia, el más empleado es ROX™ (6-carboxy-X-
rodamina), el cual no interactúa con los componentes de la reacción pero es útil 
para normalizar la señal en el software del equipo (Dorak, 2006). 
El resultado de una PCR en tiempo real se visualiza en un gráfico de 
amplificación. En él se lee la fluorescencia leída por el termociclador en el eje de 
las ordenadas y el número de ciclos de la PCR en el eje de las abscisas. De esta 
forma, la curva de amplificación consta de una fase inicial donde la producción de 
fluorescencia está por debajo del nivel de detección del termociclador, una 
segunda fase en la que se da un incremento de la fluorescencia, el cual es en 
forma exponencial en su inicio, y una tercera fase (Plateau) donde finaliza la 
reacción y se estabiliza la fluorescencia. En este gráfico es posible establecer un 
valor de fluorescencia umbral (Threshold) que señala la zona de aumento 
exponencial (Figura 9). 
 
Figura 7. Gráfico de amplificación lineal de PCR en tiempo real 
30 
 
La PCR en tiempo real tiene grandes ventajas respecto a la PCR punto final ya 
que la amplificación y detección se dan al mismo tiempo sin necesidad de 
metodologías posteriores para la visualización de los amplicones mediante 
electroforesis lo que la hace ideal para análisis cuantitativos; el uso de sondas 
permite el monitoreo constante de la reacción además aumenta la especificidad de 
la misma; el tiempo y las cantidades requeridas por corrida son menores; así 
mismo existe un menor riesgo de contaminación debido al sellado de las 
reacciones (Costa, 2004; Mackay, 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
2 JUSTIFICACIÓN 
En México la búsqueda de especies de Campylobacter en los laboratorios clínicos 
se realiza con poca frecuencia debido a que el aislamientollega a ser costoso, 
laborioso y tardado por ser microorganismos con requerimientos especiales para 
su crecimiento. Esta es una de las principales razones por la que no hay 
suficientes datos epidemiológicos que corroboren la importancia clínica de 
Campylobacter spp. en México; requiriendo la evaluación de métodos más 
eficientes como los inmunoensayos enzimáticos y la técnica de PCR en tiempo 
real que permitan la identificación directa en los especímenes fecales, reduciendo 
el tiempo de detección y puedan ser empleados de manera rutinaria, al menos en 
algún hospital de tercer nivel. 
En el laboratorio de bacteriología intestinal del INCMNSZ, de acuerdo a datos 
previos del laboratorio, se ha aislado Campylobacter spp. en medios selectivos a 
base de carbón en 1.4% de las muestras recibidas anualmente, por lo que se 
decidió realizar la búsqueda de este género mediante cultivo, inmunoensayo y 
PCR en tiempo real para determinar si el cultivo sigue siendo un buen método 
para su identificación o si es necesario implementar otra técnica más específica. 
 
3 HIPÓTESIS 
Mediante los métodos PCR en tiempo real y ensayo inmunoenzimático la 
identificación del género Campylobacter puede realizarse en menor tiempo y con 
mejor sensibilidad que con los métodos convencionales de cultivo. 
 
 
 
32 
 
4 OBJETIVOS 
 
Objetivo general 
Identificar el género Campylobacter en muestras fecales de pacientes del INCMSZ 
por métodos de cultivo bacteriano, inmunoensayo y la técnica de PCR en tiempo 
real. 
Objetivos particulares 
 Aislar e identificar Campylobacter spp. en los especímenes fecales de 
pacientes del INCMSZ por cultivo en medio selectivo a base carbón 
suplementado con antibióticos. 
 Identificar especies de Campylobacter no comunes en heces mediante el 
método de filtración pasiva. 
 Detectar antígenos de Campylobacter en muestras fecales por el ensayo 
comercial Premier™ CAMPY. 
 Determinar la presencia de C. jejuni y C. coli en las muestras mediante la 
identificación de los genes hipO y glyA por PCR en tiempo real. 
 
 
 
 
 
 
33 
 
5 METODOLOGÍA 
 
 
 
 
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34 
 
5.1 Recepción de especímenes fecales. 
Las muestras que se emplearon fueron los especímenes fecales de pacientes con 
signos y síntomas de gastroenteritis recibidos en el Laboratorio de Bacteriología 
Intestinal del departamento de Infectología INCMNSZ de Mayo a Junio del 2014, 
recolectados y transportados en medio de transporte Cary-Blair. 
5.2 Cultivo y condiciones de crecimiento. 
5.2.1 Medios selectivos 
Las muestras recolectadas se sembraron en medios selectivos y diferenciales 
para bacterias enteropatógenas, incluyendo el mCC. 
El mCC que contiene agar carbón, cefoperazona y desoxicolato (CCDA-Preston, 
Oxoid CM0739) esta adicionado con Cefoperazona (32 mg/l), Vancomicina (10 
mg/l), y Anfotericina B (2.5 mg/l). Las cajas se incubaron en una jarra con vela 
para generar el ambiente microaerofílico a 42° C por 48 h. Después del periodo de 
incubación las placas fueron revisadas, seleccionando colonias planas pequeñas 
y/o medianas de color grisáceo, y principalmente las que presentaban brillo 
metálico. 
5.2.2 Preparación de la muestra 
Los hisopos del CB se colocaron en 500 µL de caldo Brucella y se separan 100 µL 
para el método de filtración, 200 µl para el EIA y 200 µl se mantuvieron a -70° C 
hasta la extracción del ADN para la técnica de PCR en tiempo real. 
5.2.3 Método de filtración pasiva. 
El método de filtración pasiva en CM se realizó colocando 100 µl de la suspensión 
fecal sobre la membrana de acetato de celulosa estéril con poro de 0.65 µm de 
diámetro (Millipore) previamente colocada sobre la placas con agar sangre de 
carnero. Para promover el paso de Campylobacter spp. a través de la membrana 
se incubaron a 37° C por 30 min. Posteriormente, cuando la suspensión fecal se 
35 
 
filtró completamente, la membrana se retiró cuidadosamente y las placas se 
incubaron en jarras BBL GasPak con sobres generadores de dióxido de carbono e 
hidrógeno sin catalizador a 37° C por 72 h. 
5.3 Identificación. 
Las colonias con morfología sospechosa de Campylobacter se resembraron en 
agar sangre de carnero e incubaron por 24 h bajo las condiciones a las que 
crecieron originalmente, dejando una placa extra a temperatura ambiente para 
descartar la presencia de Arcobacter spp. 
Las colonias sospechosas con tinción de Gram negativa, con morfología en espiral 
o sacacorchos y la prueba de oxidasa positiva se reportaron como Campylobacter 
spp. Para la identificación a nivel de especie se realizó la prueba de hidrólisis de 
hipurato para confirmar la presencia de C. jejuni y la prueba de hidrólisis de 
indoxil-acetato (C. jejuni, C. coli y Arcobacter spp. son positivas; C. fetus y C. lari 
son negativos) 
5.4 Ensayo Inmunoenzimático 
Para la determinación con el EIA Premier CAMPY, se transfirieron los 200 µl de 
suspensión fecal a un tubo con 200 µl de diluyente de muestra/control negativo 
(solución proteica tamponada, ProClin® 0.1% y gentamicina 0.03%) y se 
homogenizó en un agitador tipo vórtice por 15 segundos. Posteriormente, se 
realizó la determinación de acuerdo a las instrucciones del manual. 
El Premier CAMPY es un ensayo inmunoenzimático que permite la detección de 
antígenos de Campylobacter en heces de humanos. Se añadió la muestra fecal 
diluida a los micropocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales específicos 
contra C. jejuni y C. coli, se incubó por 1 h a temperatura ambiente. Al completarse 
la incubación se realizó el lavado con el buffer de lavado, incluido en el kit, para 
remover el material no ligado y se agregó el conjugado de peroxidasa de rabano 
(HRP)-Anti-Campylobacter para formar el complejo anticuerpo-enzima y se dejó 
en incubación por 30 min. Se realizó un segundo paso de lavado para eliminar 
36 
 
nuevamente el material no ligado y se adicionó el sustrato cromógeno que permitió 
el desarrollo de una coloración azul solo en presencia de los antígenos específicos 
de C. jejuni o C. coli en la muestra (cambió a amarillo con la adición de la solución 
de parada). 
La interpretación de las resultados se realizó espectrofotométricamente a 450/630 
nm, reportándose como positivas aquellas con DO mayores a 0.100, que es el 
punto de corte reportado por el fabricante. Este método tiene una sensibilidad 
analítica de 1.2 x 106 UFC/ml para C. jejuni y 8.0 x 106 UFC/ml para C. coli. 
Previamente, para determinar si el caldo Brucella no interfería con el ensayo, se 
realizaron suspensiones de colonias de cultivos recientes de las cepas control de 
C. jejuni, C. coli y de C. fetus y Arcobacter spp. en solución salina fisiológica estérilajustadas al tubo 0.5 del Nefelómetro de McFarland con ayuda del Densichek™ 
plus (bioMerieux Inc.) (aproximadamente 1.5 x 108 UFC/ml). Una vez ajustadas las 
suspensiones bacterianas se realizaron diluciones decimales seriadas en solución 
salina fisiológica estéril hasta una concentración de 104 UFC/ml, de cada dilución 
se colocó 1 ml en diferentes CB y fueron tratadas como las muestras. 
5.5 Método de PCR en tiempo real 
La extracción de ADN se realizó a partir de 200 µl de suspensión fecal, que se 
diluyeron en 2 ml de buffer de lisis y se mezclaron con 100 µl de silica. 
Posteriormente se usó el sistema de extracción semi-automatizado NucliSens 
easyMAG (bioMerieux Inc) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN se 
eluyó en 25 µl de buffer de elusión y se almacenó a -20° C hasta su uso. 
La PCR en tiempo real, para identificar C. jejuni y C. coli, se realizó con una 
reaccion de amplificación en un volumen final de 25 µl compuesta por 12.5 µl de 
Platinum® qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen Life Technologies), 1 µl de cada 
cebador 10 µM, 0.5 µl de la sonda de hidrolisis 10 µM (Tabla 3), 0.5 µl de ROX, 
4.5 µl de UltraPure™ DNase/Rnase-Free Distilled Water (Life Technologies) y 5 µl 
de ADN. El protocolo de amplificación se llevó a cabo en el sistema 7500 Real-
Time PCR (Applied Biosystems) con las siguientes condiciones: 95° C por 3 min, 
37 
 
seguida de 40 ciclos de 95° por 20 s y 60° por 1 min (Vondrakova, Pazlarova, & 
Demnerova, 2014). En cada placa se adicionó NTC y control positivo para C. jejuni 
y C. coli. 
Tabla 3. Cebadores y sondas usadas en el método de PCR en tiempo real 
Patógeno 
Gen 
blanco 
Secuencia (5’→3’) 
Amplicon 
(pb) 
 Referencia 
C. jejuni hipo 
F TGCACCAGTGACTATGAATAACGA 
124 
Vondrakova 
et al., 2014 
R TCCAAAATCCTCACTTGCCATT 
S VIC- TTGCAACCTCACTAGCAAAATCCACAGCT-TAMRA 
C. coli glyA 
F CATATTGTAAAACCAAAGCTTATCGTG 
133 R AGTCCAGCAATGTGTGCAATG 
S FAM-TAAGCTCCAACTTCATCCGCAATCTCTCTAAATTT-TAMRA 
F: Forward primer (cebador hacia adelante) R: Reverse primer (cebador reverso) S: sonda pb: pares de bases 
 
Para el análisis de la amplificación se empleó el Applied Biosystems 7500 Real-
Time PCR System SDS Software. Todas las muestras con Ct < 40 fueron 
consideradas como positivas. 
5.6 Controles de crecimiento y amplificación 
Las cepas bacterianas usadas en este trabajo como controles positivos de 
crecimiento y amplificación fueron Campylobacter jejuni subsp. jejuni (ATCC® 
33560™) y Campylobacter coli (Doyle) Veron and Chatelain (ATCC® 33559™). 
Como controles negativos se ocuparon cepas silvestres de Campylobacter fetus 
aislado de sangre y Arcobacter spp. aislado de heces. 
 
 
38 
 
6 RESULTADOS 
Durante Mayo y Junio del 2014, se procesaron un total de 250 muestras de 
pacientes con síntomas de gastroenteritis para identificar Campylobacter spp. 
utilizando los métodos de cultivo, EIA, y PCR en tiempo real. 
De las 250 muestras 11 dieron positivo (4.4%) para Campylobacter en al menos 
una prueba, pero debido a que las muestras C115 y C161 no pudieron ser 
confirmadas en cultivo o PCR solo se reportaron 9 muestras (3.6%) como 
positivas. Solo 4 muestras (1.6%) fueron positivas para C. jejuni por los cuatro 
métodos (Tabla 4). 
Tabla 4. Resultados positivos para Campylobacter por las técnicas de cultivo, EIA y PCR en 
tiempo real de 250 muestras recibidas de Mayo a Junio del 2014. 
Muestra Tipo de consulta mCC CM EIA PCR 
C2 H + + + C. jejuni 
C3 CE + + + C. jejuni 
C11 H + + + C. jejuni 
C33 H - - - C. coli 
C39 H - - - C. coli 
C94 H + + - C. jejuni 
C96 H + + + C. jejuni 
C115 H - - + - 
C151 H - + - C. jejuni 
C161 H - - + - 
C186 CE - - - C. jejuni 
H: paciente hospitalizado, CE: paciente de consulta externa 
mCC (Medio a base de carbón), CM (agar sangre de carnero con membrana), EIA (Ensayo inmunoenzimático Meridian 
Biosciences Premier® Campy) 
 
 
 
 
 
39 
 
Figura 8. Morfología colonial de aislados de C. jejuni en mCC y agar sangre de carnero. 
6.1 Técnicas de cultivo bacteriano 
De las 250 muestras analizadas solo se logró el aislamiento de Campylobacter en 
6 de ellas (2.4%), de las cuales 5 fueron positivas en medio selectivo y en método 
de filtración, mientras que de 1 muestra solo se logró aislar Campylobacter en CM 
y no en mCC (Tabla 5); en 244 muestras (97.6%) no se recuperaron colonias de 
Campylobacter. 
 
Tabla 5. Comparación de las técnicas de cultivo en medio selectivo y en agar sangre de 
carnero con membrana para la detección de Campylobacter en heces. 
Muestras procesadas 
(250) 
Aislamiento de Campylobacter (%) 
mCC CM 
Muestras positivas 5 (2%) 6 (2.4%) 
Muestras negativas 245 244 
mCC: medio selectivo CM: agar sangre de carnero con membrana 
 
Las colonias sospechosas de Campylobacter spp. se caracterizan por ser 
grisáceas, planas de forma irregular con ligero brillo metálico en mCC, y se 
observan redondas, lisas y brillantes, con un borde regular sin hemolisis en CM 
(Figura 9). Todos estos aislados fueron fenotípicamente identificados como C. 
jejuni por la reacción positiva de hidrolisis de hipurato. 
40 
 
6.2 Ensayo inmunoenzimático 
De las muestras de los pacientes se identificaron 6 muestras positivas (2.4%), de 
las cuales solo 4 fueron recuperadas por cultivo en mCC y CM. Las dos que no se 
identificaron en cultivo, también fueron negativas en PCR. 
Al procesar las cepas control en el EIA, la mínima dilución detectada fue 106 de C. 
jejuni y C. coli (Tabla 6); C. fetus y Arcobacter spp. no presentaron reacción 
cruzada. 
 
Tabla 6. Resultados de las diluciones de cepas control en el ensayo inmunoenzimático 
Cepa control 
Diluciones 
104 105 106 107 108 
C. jejuni ATCC 33560 - - + + + 
C. coli ATCC 33559 - - + + + 
C. fetus - - - - - 
Arcobacter spp - - - - - 
 
6.3 Método de PCR en tiempo real 
Por PCR en tiempo real se identificaron 7 muestras positivas de C. jejuni (3.6%) y 
2 muestras fueron positivas para C. coli (0.8%). En las Figuras 10 y 11 se 
observan las amplificaciones positivas del gen hipO de C. jejuni y el gen glyA de 
C. coli. 
41 
 
 
Figura 9. Curvas de amplificación por PCR en tiempo real del gen hipO para la detección de C. jejuni en las 
muestras fecales 
 
 
Figura 10. Curvas de amplificación por PCR en tiempo real del gen glyA para la detección de C. coli en las 
muestras fecales 
D
e
lt
a 
R
n
 
D
e
lt
a 
R
n
 
C. coli 
42 
 
7 DISCUSIÓN 
Considerando que las especies C. jejuni y C. coli han sido reportadas como las 
principales causas de campilobacteriosis humana a nivel mundial y en el 
laboratorio de bacteriología intestinal del INCMNSZ es la segunda bacteria 
enteropatógena más aislada, se decidió realizar la búsqueda de este género en 
250 muestras fecales de pacientes con síntomas de gastroenteritis por tres 
métodos de identificación basados en cultivo, inmunoensayo y PCR. 
El método de identificación de Campylobacter en muestras fecales que se utiliza 
rutinariamente en el laboratorio es el cultivo en medios selectivos a base de 
carbón que permite el aislamiento de las especies termotolerantes, y normalmente 
la técnica de filtración pasiva no es usado debido a que, en comparación con el 
medio selectivo, implica mayor tiempo de procesamiento. 
Se utilizó la técnica de filtración pasiva porque, además de ser una técnica útil 
cuando no se cuenta con los componentes adecuados para la preparación del 
medio selectivo, resulta apropiado para detectar especies que pueden ser 
inhibidas por los componentes presentes en los medios selectivos, especialmente 
C. fetus y otras especies poco comunes como C. lari, C. concisus, C. 
hyointestinalis, C. upsaliensis, entre otras (Jokinen et al., 2012; Salim, Mandal, & 
Parija, 2014). 
En esta ocasión en ambas técnicas se identificó C. jejuni pero no con el mismo 
número de aislamientos, ya que 2% de las muestras fueron positivas en medio 
selectivo