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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN DETERMINACIÓN DE DL50 Y EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD MEDIANTE LA PRUEBA DE MICRONÚCLEOS DE LOS COMPUESTOS MONOTIOMORFOLÍNICOS LQM318, 339 Y LOS COMPUESTOS MONOPIPERIDÍNICOS LQM336, 334. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA PRESENTA: ANAI WENDOLIN GÓMEZ AGUILAR ASESORA: DRA. SANDRA DÍAZ BARRIGA ARCEO CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO. 2012 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. F'A CU X-TAD ts E E S'[' Utr} Tü S S {-iI}E,RIORES CIJA UT'ITLAN UNH)AT} DE AB]\{INISTRACTÓN ESCOLATT E}E,PART'AMtrF{T& BE, EXÁft4trNE,S PROFESIÜIqALES '.t_','... A SIJ N TO :,VCIlll{},APROBATCI{I G DRA. SUEMI RODRIGT]EZ ROMÜ DIRECTORA DE LA FES CUAUTNTLÁN PRESENTE ATN: L.A. ARACELI HE ANDEZ Jefa del DepÉl#fiÉffitQI$e Exámenes P rofesioriál§§üd{XfFES' Cuautitlán Con base en el Art. 28 del Reglamento de Exámenes Profesic'nales nos permitimos comunicar a usted que revisamos la: TESIS Determinación de DL50 y evaluación de la toxicidad mediante la prueba de micronúcleos de los compuestos monotiomorfolínicos LQM318,339 y los compuestos rnonopiperidínicos LOM336.334 Que presenta la pasante: Anai Wendolin Gómez Aguilar Con número de cuenta 30327504-6 para obtener el Título de: Ouímica Farmacéutica Bióloga Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO. ATENTAMENTE "POR MI RAZA HABLARA EL ESPÍRITU" Cuautitlán fzcalli, Méx. a 01 de Octubre de 2012. PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO NOMBRE Dra. Luisa Martínez Aguilar ,,*.11 iÉ¿-; .fl.$lJ}Ij 'ji;-;r-,." PRESIDENTE VOCAL SECRETARIO ler SUPLENTE 2do SIJPLENTE Dra. SandraDíaz Barriga Arceo QFB. Rosalba Bonilla Sánchez Dra. Patricia Ramírez Noguera QFB. Sara Hemández Matilde NOTA: los sinodales suplentes están obligados a presentarse el día y hora del Exarnen Profesiorral (art. 120) HHA/pm Este trabajo se realizó gracias al apoyo del proyecto PAPIIT IN224310 “Estudios Farmacológicos de los compuestos con clave LQM300s en la hipertensión arterial, arritmias cardiacas e infarto miocárdico”. La investigación teórica y experimental de éste trabajo se realizó en el Laboratorio 9 Toxicología y Genética de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de la FES Cuautitlán Campo 4 y el análisis de las laminillas se realizó en el Laboratorio de Citogenética L- 521 a cargo de la Dra. Sandra Díaz Barriga Arceo. AGRADECIMIENTOS La presente tesis es un esfuerzo en el cual de forma directa o indirecta participaron varias personas leyendo, opinando y dándome sugerencias para que todo quedara de la mejor manera posible; por lo tanto, debo agradecer a mis sinodales: Dra. Luisa Martínez Aguilar, QFB. Rosalba Bonilla Sánchez, Dra. Patricia Ramírez Noguera y por último, pero no menos importante, QFB. Sara Hernández Matilde que tuvieron la paciencia y la confianza para darme su opinión acerca de lo que podía modificar o incluir en éste trabajo de investigación con el fin de mejorarlo. Principalmente, agradezco a mi Asesora: Dra. Sandra Díaz Barriga Arceo por confiar en mí y darme la oportunidad de realizar éste trabajo bajo su dirección y, además, al tratarla me dí cuenta de que es un gran ser humano digna de mi admiración y mi respeto. Agradezco también a mis padres Jose Luis y Patricia, a mis abuelos Joaquín, Felipe y Sara; ustedes fueron el principal motor para concluir mi carrera y titularme, ya que ésta, al ser mi mayor ilusión, la hicieron suya también y me apoyaron sobremanera para hacerla realidad; a mi mejor amiga; prácticamente mi hermana: Maggie, a mis hermanos Sara, Luis y Lili, mis tios, mis primos y demás familiares que me acompañaron y me dieron la mano no sólo mientras realizaba mi tesis, sino durante todo el camino recorrido para poder concluir una licenciatura; porque de una u otra forma me apoyaron moralmente, emocionalmente, económicamente; comprendiendo mis ausencias en momentos especiales; de verdad muchas gracias. Los amo. Tio Carlitos, yo sé que desde el cielo celebras conmigo éste gran logro, te quiero muchísimo y te recuerdo con mucho mucho cariño, y aunque vives en mi corazón siempre, me haces mucha falta, te extraño. Te agradezco a tí Iván, mi amor, por todo tu amor, por toda la paciencia que me tuviste en los momentos en que me encontraba alterada, por acompañarme cuando y donde fuera necesario; por apostar por mí hasta cuando me sentía débil y desesperada, gracias por todo tu apoyo, en todas las formas en que me lo das: moral, emocional, económicamente, etc.; gracias por ser mi apoyo, mi gran apoyo tan incondicional como siempre. Tus brazos siempre son mi abrigo, te amo. Finalmente, a todos mis amigos de la Universidad con los que viví tantas cosas muy bonitas, los quiero mucho y siempre vivirán en mi corazón, son muy importantes en mi vida; Fer, Wera, May, Tony, Naty, Betito, Nava, Cindy, Oliva, Mónica, le agradezco a la vida porque coincidimos en éste mundo y tuve la fortuna de conocerlos. 1 ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS............................................................................................................. ...............................3 RESUMEN..............................................................................................................................................................4 1. Marco teórico............................................................................................................. ................................5 1.1 Compuestos de la serie LQM300.................................................................................................5 1.1.1 Compuestos monotiomorfolínicos LQM318 y LQM339..............................................6 1.1.2 Compuestos monopiperidínicos LQM336 y LQM344.................................................7 1.2 Enfermedades cardiovasculares..................................................................................................8 1.2.1 Hipertensión arterial.......................................................................................................8 1.2.2 Arterioesclerosis...............................................................................................................9 1.2.3 Angina de pecho.............................................................................................................10 1.2.4 Infarto al miocardio.......................................................................................................12 1.2.5 Accidentes vasculares cerebrales..................................................................................12 1.2.6 Arritmias........................................................................................................................13 1.3 Toxicología genética...................................................................................................................15 1.4 Índice terapéutico o márgen de seguridad...............................................................................161.5 Relación Dosis-Respuesta...........................................................................................................17 1.6 Dosis Letal 50 DL50....................................................................................................................18 1.6.1 Transformación Probit.................................................................................................19 1.6.2 Transformación Logit...................................................................................................19 1.6.3 Transformación Anglit ó Angular................................................................................19 1.7 Método de Lorke para calcular DL50......................................................................................20 1.8 Ensayos de toxicidad..................................................................................................................22 1.8.1 Pruebas para la detección de genotoxicidad...............................................................22 1.9 Ensayo de Micronúcleos.............................................................................................................24 2. Justificación.............................................................................................................................................27 3. Hipótesis...................................................................................................................................................27 2 4. Objetivo general......................................................................................................................................28 4.1 Objetivos particulares................................................................................................................28 5. Materiales y Método................................................................................................................................29 5.1 Material biológico.......................................................................................................................29 5.2 Compuestos problema................................................................................................................29 5.3 Reactivos......................................................................................................................................29 5.4 Equipo y otros materiales..........................................................................................................30 6. Metodología............................................................................................................................ .................30 7. Diagrama de flujo....................................................................................................................................32 8. Resultados................................................................................................................... .............................33 8.1 Cálculos realizados para determinar la DL50 de los diferentes compuestos........................33 8.2 Tabla de DL50 con efectos de toxicidad...................................................................................33 8.3 Tablas Eritrocitos policromáticos micronucleados para evaluar genotoxicidad..................34 8.3.1 Tabla de Eritrocitos policromáticos micronucleados en LQM318...........................34 8.3.2 Tabla de Eritrocitos policromáticos micronucleados en LQM336...........................34 8.3.3 Tabla de Eritrocitos policromáticos micronucleados en LQM339...........................35 8.3.4 Tabla de Eritrocitos policromáticos micronucleados en LQM344...........................35 8.4 Tablas Porcentaje de Eritrocitos Policromáticos para evaluar citotoxicidad.......................36 8.4.1 Tabla de porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM318.........36 8.4.2 Tabla de porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM336.........36 8.4.3 Tabla de porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM339.........37 8.4.4 Tabla de porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM344.........37 8.5 Tabla de efectos secundarios de los diferentes compuestos de la serie LQM300.................38 9. Discusión..................................................................................................................................................39 10. Conclusiones............................................................................................................... .............................43 11. Glosario de abreviaturas........................................................................................................................44 12. Referencias..............................................................................................................................................45 3 ÍNDICE DE TABLAS Tabla1. Estructuras de los compuestos de la serie LQM300....................................................................7 Tabla 2. Diferentes dosis para la determinación de la toxicidad aguda (método de Lorke)........................21 Tabla 3. Dosis administradas en la segunda etapa del método de Lorke........................................................30 Tabla 4. DL50 con efectos de toxicidad...............................................................................................................33 Tabla 5. Eritrocitos policromáticos micronucleados en LQM318..................................................................34 Tabla 6. Eritrocitos policromáticos micronucleados en LQM336..................................................................34 Tabla 7. Eritrocitos policromáticos micronucleados en LQM339..................................................................35 Tabla 8. Eritrocitos policromáticos micronucleados en LQM344..................................................................35 Tabla 9. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM318................................................36 Tabla 10. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM336..............................................36 Tabla 11. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM339..............................................37 Tabla 12. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM344..............................................37 Tabla 13. Efectos secundarios de los diferentes compuestos de la serie LQM300.........................................38 4 RESUMEN Las enfermedades cardiovasculares, las cuales se refieren tanto a patologías del corazón como de vasos sanguíneos; son el problema más importante en la sociedad mexicana no solo por su frecuencia sino por la gravedad de muchas de ellas y las complicaciones que traen consigo; aunado a esto, debemos considerar que día con día, los hábitos de la población son menos favorables para la salud y de éste modo, este problema se hace más serio. No obstante que hay muchos fármacos con los que se intenta minimizar este problema, se continúa en busca del fármaco ideal que tenga la capacidad de combatir diferentes patologías cardiovasculares y que además sea seguro para la población, es decir, cause el menor daño posible al organismo; razón por la cual, el Laboratorio de Química Medicinal a cargo del Doctor Enrique Ángeles Anguiano se ha dedicado ya por un largo tiempo al estudio minucioso de compuestos con clave LQM300 que han demostrado, en diferentes estudios llevados a cabo en el Laboratorio de Farmacología del Miocardio a cargo de la Doctora Luisa Martínez Aguilar, que son efectivos para tratar diferentes cardiopatías. Como parte de la caracterización de dichos compuestos, es importante también realizar estudios toxicológicos para poder determinar de éste modo,sí son fármacos seguros, razón por la cual, se llevó a cabo este trabajo de investigación en el cual se determinó la Dosis Letal 50 (DL50) y se estudió la genotoxicidad y citotoxicidad a través del ensayo de Micronúcleos “in vivo” de cuatro compuestos de la serie LQM300 los cuales fueron: dos compuestos monopiperidínicos (LQM336 y LQM344) y dos compuestos monotiomorfolínicos (LQM318 y LQM339). De ésta manera, ahora se tiene el conocimiento de otras características importantes de algunos de estos compuestos. Las DL50 obtenidas fueron: 177. 48 mg/Kg para LQM336, 288.53 mg/Kg para LQM339. Finalmente, 471.16 mg/Kg para los compuestos LQM344 y LQM318. De este modo, se logró determinar, que los compuestos que muestran menor toxicidad son los compuestos LQM344 y LQM318, ya que se necesitó una mayor cantidad de compuesto para producir la muerte del 50% de la población. En cuanto a la evaluación de citotoxicidad, ninguno de los compuestos mostró modificaciones en el número de eritrocitos policromáticos en relación al tiempo o dosis administrada, por lo que se llegó a la conclusión de que no son tóxicos en médula ósea. Tampoco se observó un aumento en el número de eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN), ya que el número de éstos se mantuvo entre 0 y 3 que es el rango normal, por lo que también se consideró que estos compuestos no son genotóxicos porque no inducen a la formación de micronúcleos en eritrocitos de sangre periférica de ratón. 5 1. MARCO TEÓRICO 1.1 COMPUESTOS DE LA SERIE LQM300 Como parte de una estrategia por conseguir nuevos fármacos capaces de ofrecer un mayor número de efectos benéficos con un mínimo de efectos adversos se han desarrollado técnicas basadas en el diseño de nuevos fármacos asistidos por computadora pretendiendo su síntesis y evaluación para la obtención de nuevas moléculas con actividad terapéutica (Díaz y Tlapalmatl, 2008). En 1979, un grupo de investigadores chinos mientras examinaban propiedades antimalariales de derivados de la febrifugina, notaron que un compuesto, la changrolina, era efectivo como agente antiarrítmico (Montes, 2005). Stout y su equipo de investigación introdujeron una nueva serie de compuestos antiarrítmicos realizando algunas variaciones en la estructura de la changrolina, encontraron que ésta puede ser conceptualmente dividida en tres regiones: 1) Región heteroatómica que contiene quinazolina, 2) Región aromática con el bis(pirrolidinilmetil) fenol y 3) Región enlazante entre las dos primeras regiones (Montes, 2005). Posteriormente encontraron las regiones responsables de la actividad biológica, mostrando que la región 2 del bis(pirrolidinilmetil) fenol era importante para mostrar una buena actividad antiarrítmica, además que en la región 1, la quinazolina podía ser reemplazada por una variedad de anillos heteroatómicos sin que disminuya su actividad, y que la región que une las dos primeras regiones tiene una mayor actividad y una menor toxicidad cuando contenía un grupo carbonilo (Montes, 2005). Otro equipo de investigadores, Codding y colaboradores determinaron el análisis conformacional de la serie bis(pirrolidinilmetil) fenol antiarrítmicos de la clase I por métodos de difracción de rayos X . Encontraron que cada estructura tiene un puente de hidrógeno intramolecular entre el grupo OH del fenol y el átomo de N de uno de los anillo de la pirrolidina, sugiriendo también que el anillo libre del puente de hidrógeno intramolecular define la forma activa de las moléculas (Montes, 2005). Años después, se inició el estudio de la relación estructura química-actividad biológica, la cual consistía en cambiar los sustituyentes de la región 2 y 3, encontrando que los anillos pirrolidinicos podían sustituirse por otros anillos heterocíclicos, como la morfolina, tiomorfolina y piperidina (Díaz y Tlapalmatl, 2008). 6 El grupo de investigación del Laboratorio de Química Medicinal de la Unidad de Investigación de Posgrado de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Campo-1 a cargo del Dr. Enrique Ángeles Anguiano, retomó la investigación de éstos compuestos procediendo a sus síntesis mediante la reacción química entre un fenol sustituido formaldehido y una molécula de morfolina o tiomorfolina, obteniendo así una serie de compuestos morfolínicos, tiomorfolínicos, piperidínicos y de cobre, con clave LQM300, a los cuales se estudió su actividad biológica dentro del Laboratorio de Farmacología del Miocardio, a cargo de la Dra. Luisa Martínez Aguilar, de la misma instancia académica, encontrándose que estos compuestos mostraban una actividad antihipertensiva mediante el modelo de rata consciente (Díaz y Tlapalmatl, 2008). La síntesis de estos compuestos tiomorfolínicos, morfolínicos y piperidínicos, se fundamenta en la reacción química entre un fenol sustituido, un formaldehido mas una molécula de morfina, tiomorfina o piperidina, con lo cual se obtiene una serie de compuestos con la clave LQM300. (BRIONES. 2009). Los compuestos de la serie LQM300 son solubles en soluciones ácidas, por lo cual, se encuentran disueltos a pH=2 (Martínez, 2010). Mediante la determinación de área Bajo la Curva, los compuestos LQM318, LQM339, LQM344 y LQM336 presentan efecto antihipertensivo tanto en presión arterial sistólica, presión arterial diastólica y frecuencia cardiaca en comparación con Captopril y Losartán (Pérez, 2012). Los compuestos morfolínicos y tiomorfolínicos son posibles candidatos para el desarrollo de nuevos medicamentos en el tratamiento de la hipertensión arterial, lo que trae consigo la continuación de los estudios farmacodinámicos con los que se podrá determinar su mecanismo de acción, principalmente en músculo liso vascular sobre los sistemas renina-angiotensina-aldosterona y sistema adrenérgico (Díaz y Tlapalmatl, 2008). 1.1.1 Compuestos monotiomorfolínicos LQM318 Y LQM339 El compuesto LQM318 presenta un antagonismo no competitivo al receptor adrenérgico α1 en el modelo de órgano aislado de aorta torácica y abdominal de rata hipertensa espontánea (Mondragón, 2009); en rata hipertensa espontánea en el modelo de rata consciente, mostró efectividad en la disminución de presión sistólica y frecuencia cardiaca (López y Hernández, 2008). Mediante la determinación del Área Bajo la Curva, el LQM318 mostró una mayor eficacia sobre la presión sistólica, presión diastólica y frecuencia cardiaca que el LQM339 (Pérez, 2012). 7 1.1.2 Compuestos monopiperidínicos LQM336 Y LQM344 El LQM344 presenta una piperidina. Mediante un modelo de presión arterial invasiva en ratas Wistar macho muestra un efecto hipotensor significativo en la Presión Arterial Diastólica, Presión Arterial Media, Presión Arterial Sistólica y en Frecuencia Cardiaca (Briones, 2009). El LQM336 presenta un aldehído, un éter y una piperidina. Mediante un modelo de presión arterial invasiva en ratas Wistar macho no muestra efecto hipotensor significativo en Presión Arterial Media, Presión Arterial Diastólica, Presión Arterial Sistólica y Frecuencia Cardiaca (Briones, 2009), muestra tendencia a un antagonismo de tipo no competitivo en modelo de órgano aislado de aorta torácica y abdominal de rata hipertensa espontánea (Mondragón, 2009). Con base al Área Bajo la Curva, en comparación con Captopril y Losartán, muestra mayor eficacia sobre la Presión Arterial Sistólica, Presión Arterial Diastólica y Frecuencia Cardiaca el compuesto LQM344 que el LQM336 (Pérez, 2012). Tabla1. Estructuras de los compuestos de la serie LQM300. Compuestos Monopiperidínicos Compuestos Monotiomorfolínicos LQM336 LQM318 LQM344 LQM339 8 1.2 ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES Las enfermedades cardiovasculares se refieren a patologías del corazón y vasos sanguíneos; son la primera causa de morbimortalidad en los países industrializados, determinando más del 45% de todoslos fallecimientos acaecidos después de los 65 años. Son, además, la segunda causa de deterioro funcional (Sáeza y colaboradores, 1998). En las últimas décadas se ha producido en numerosos países desarrollados una disminución de las tasas de mortalidad cardiovascular para todos los grupos de edad, menos importante en los ancianos y proporcionalmente mayor en las mujeres, que ha contribuido al aumento en la esperanza de vida (Sáeza y colaboradores, 1998). Las tasas de mortalidad son siempre mayores en los grupos de mayor edad. Se sabe que el riesgo relativo asociado a la mayoría de los factores de riesgo cardiovascular disminuye con la edad, pero su riesgo absoluto aumenta (Sáeza y colaboradores, 1998). Se calcula que en 2004 murieron por ésta causa 17,3 millones de personas, lo cual representa un 30% de todas las muertes registradas en el mundo; 7,3 millones de esas muertes se debieron a la cardiopatía coronaria, y 6,2 millones a los accidentes cerebrovasculares (OMS, 2011). Las muertes por enfermedades cardiovasculares afectan por igual a ambos sexos, y más del 80% se producen en países de ingresos bajos y medios (OMS, 2011). Se calcula que en 2030 morirán cerca de 23,6 millones de personas por enfermedades cardiovasculares, sobre todo por cardiopatías y accidentes cerebrovasculares, y se prevé que sigan siendo la principal causa de muerte (OMS, 2011). Las enfermedades cardiovasculares más comunes se presentan a continuación. 1.2.1 Hipertensión arterial La hipertensión se define como un aumento sostenido de la presión arterial ≥140/90 mmHg, criterio que caracteriza a un grupo de pacientes cuyo riesgo de afección cardiovascular relacionada con la hipertensión es lo bastante alto para ameritar atención médica. El riesgo de una enfermedad cardiovascular tanto letal como no letal en adultos es más bajo con presiones arteriales sistólicas menores de 120 mmHg y presión arterial 9 diastólica inferior a 80 mmHg; estos riesgos aumentan de manera progresiva con presiones sistólicas y diastólicas más altas (Goodman y Gilman, 2007). La hipertensión arterial es la enfermedad cardiovascular más común. Su prevalencia aumenta con la edad; alrededor de 50% de las personas entre 60 y 69 años de edad tiene hipertensión, y la prevalencia es mayor después de los 70 años de edad (Goodman y Gilman, 2007).De acuerdo con las estadísticas reportadas por la Secretaría de Salud sobre las diez principales causas de mortalidad en hombres en México durante el año 2007, las Enfermedades Hipertensivas ocupan el décimo lugar, mientras que en el caso de las mujeres este tipo de padecimientos ocupan el quinto lugar (Fauci y Braunwald, 2008). La presión vascular alta genera cambios en la vasculatura e hipertrofia del ventrículo izquierdo. Como consecuencia, la hipertensión constituye la principal causa de apoplejía, conduce a enfermedad coronaria con infarto de miocardio y muerte súbita de origen cardiaco, y es un contribuyente importante de insuficiencias cardiaca y renal, así como aneurisma disecante de la aorta (Goodman y Gilman, 2007). El tratamiento farmacológico de pacientes con hipertensión arterial reduce la morbilidad y mortalidad por afección cardiovascular. La terapéutica antihipertensora eficaz disminuye notablemente el riesgo de apoplejías, insuficiencia cardiaca e insuficiencia renal debidas a hipertensión, además de la disminución del riesgo de infarto al miocardio (Goodman y Gilman, 2007). 1.2.2 Arterioesclerosis Es la pérdida de elasticidad y el estrechamiento de las arterias que se produce como consecuencia de la acumulación de grasa en sus paredes, que empieza a producirse ya desde los primeros años de vida, hasta convertirse en placas de ateroma, que son las lesiones principales de esta enfermedad, dichas placas están compuestas por colesterol y derivados. La distribución de la arteriosclerosis en la red arterial no es homogénea. Afecta sobre todo a la aorta, a las arterias de las piernas, las coronarias y las arterias que conducen la sangre hacia el cerebro. Las placas de ateroma se desarrollan en zonas de gran turbulencia de flujo sanguíneo, sobre todo donde hay bifurcaciones. Estas placas provocan una reducción del diámetro en la zona de arteria donde se sitúan, esto hace que la sangre circule con más dificultad, pudiendo tener como consecuencia la falta de oxigenación en el área que depende de esas arterias (OCU, 2011). Las placas también pueden sufrir un proceso de ulceración y dar lugar a que se formen trombos, los cuales pueden obstruir por completo la zona de la arteria donde se forman, produciendo una trombosis. El trombo puede desprenderse y entrar en la circulación sanguínea. Dependiendo de sus dimensiones podrían provocar la obstrucción de una arteria y una embolia en el organismo. La arteriosclerosis como tal no produce manifestación 10 alguna hasta que tiene lugar, como consecuencia de la misma, la disminución o la interrupción del aporte de sangre a algún tejido. Es entonces cuando tiene lugar, por ejemplo, la angina de pecho, el infarto de miocardio o el accidente vascular cerebral (OCU, 2011). 1.2.3 Angina de pecho Se produce cuando hay un aporte insuficiente de sangre y, por tanto, oxígeno al músculo cardiaco debido a un estrechamiento o a una obstrucción de una arteria coronaria, lo que indica que el músculo cardiaco está afectado, y que precisa un tratamiento (OCU, 2011). Es la forma más común de manifestarse la cardiopatía isquémica y la menos grave. Uno de los aspectos clave del tratamiento de un paciente con Angina de Pecho Estable o Inestable, es conocer el nivel de riesgo y de acuerdo al mismo, indicar los procedimientos terapéuticos más apropiados para mejorar los síntomas, la calidad de vida y sobre todo para evitar sus complicaciones. (Navarro y Fábregas, 2006). ANGINA ESTABLE: Dolor opresivo o malestar, generalmente torácico, atribuible a isquemia miocárdica transitoria, cuyas características no han variado en el último mes. Generalmente causada por estenosis coronaria fija, y se desencadena siempre por el aumento de la demanda de oxígeno al miocardio, ya sea por el ejercicio u otra causa como el estrés. También puede producirse por vasoespasmo coronario (Navarro y Fábregas, 2006). Clasificación de la Canadian Cardiovascular Society (CCS) para la angina estable (Navarro y Fábregas, 2006). • Grado I. La actividad física ordinaria no causa dolor, este aparece debido a esfuerzos extenuantes rápidos o prolongados, durante el trabajo o con actividades recreativas. • Grado II. Hay ligera limitación a la actividad física ordinaria. Hay dolor al caminar, subir escaleras rápidamente, subir pendientes. Puede ser postpandrial o en las primeras horas del día. • Grado III. Hay limitación importante a la actividad física ordinaria, por ejemplo: Subir escaleras rápidamente, caminar dos manzanas. • Grado IV. Incapacidad para llevar a cabo cualquier actividad física sin angina, aparece dolor incluso en el reposo relativo (esfuerzo mínimo). ANGINA INESTABLE. Síndrome coronario agudo que agrupa a pacientes con angina de pecho cuyo comportamiento clínico ha variado en el último mes (frecuencia, duración, intensidad, umbral de aparición y respuesta a la nitroglicerina). También se incluye a la de aparición reciente, la que surge sin causa aparente y la que sigue a un infarto del miocardio. (Navarro y Fábregas, 2006.) 11 Formas clínicas (Navarro y Fábregas, 2006.). Angina de comienzo reciente: tiene menos de 30 días de evolución, puede ser desencadenada por el esfuerzo (sólo la que corresponde con los grados III y IV), en reposo o ambos (mixta). Angina de empeoramiento progresivo: mayor frecuencia, duración o intensidad de las crisis, que generalmente coincide con disminución del umbral del dolor. Angina post infarto: surge después que el paciente con un infarto agudo del miocardio(IAM) lleve 24 horas sin dolor y durante el primer mes de evolución (el dolor no debe estar en relación a extensión del IAM). Angina variante (Prinzmetal): angina espontánea asociada a supradesnivel del ST durante el dolor, en su patogenia prima el vaso espasmo focal sobre coronarias sanas o con lesiones desde mínimas a subtotales. Angina de reposo prolongada: de duración inusual mayor de 20 min. y requiere de un perfil bioquímico minucioso para descartar un IAM. Se diagnostica a partir de los síntomas descritos por el paciente. En principio, se recurre a los medicamentos. Además de los fármacos para reducir los niveles de colesterol, la hipertensión o la diabetes, hay otros específicos contra la angina. Son los nitratos (que actúan dilatando las arterias coronarias y pueden administrarse por vía oral, como comprimidos que se colocan bajo la lengua, con parches en la piel o en inyecciones), los betabloqueantes, que al reducir la frecuencia cardiaca reducen también las necesidades de oxígeno del corazón, o los antagonistas del calcio, que inducen a la dilatación de las arterias coronarias y las venas periféricas, reduciendo así la tensión arterial y la frecuencia cardiaca (OCU, 2011). El ácido acetilsalicílico suele usarse como tratamiento complementario, ya que reduce la posibilidad de que las plaquetas sanguíneas se agrupen formando trombos. Cuando la medicación no basta, es necesario recurrir a un tratamiento quirúrgico. Hay varias alternativas, pero es muy frecuente la angioplastia, que consiste en dilatar mecánicamente los vasos coronarios. Se suele realizar con anestesia local y no requiere hospitalización. Otra alternativa es sustituir la arteria afectada por un injerto de un vaso localizado en otra zona del cuerpo, con la técnica denominada “by-pass”. Otra técnica que se utiliza mucho en la actualidad es introducir un dispositivo, que se llama stent y es parecido a una espiral, dentro del vaso estrechado, para de esta forma mantenerlo "abierto". Estas técnicas tienen diferentes indicaciones: la elección de una u otra se hace de forma individualizada, según el paciente (OCU, 2011). 12 1.2.4 Infarto al miocardio La palabra infarto significa "zona de necrosis", es decir, muerte de los tejidos de un determinado órgano, debido a una importante disminución de la circulación. En el infarto de miocardio, esa necrosis afecta al propio músculo cardiaco o miocardio (OCU, 2011). El infarto de miocardio se divide en infarto transmural, que corresponde a lo que desde el punto de vista clínico se denomina infarto con onda Q, e infarto no transmural, infarto subendocárdico o infarto sin onda Q (Zarco, 2006). El infarto transmural es una necrosis por coagulación del territorio de distribución de una arteria coronaria afectada de aterosclerosis, generalmente con dehiscencia de una placa y trombosis sobreañadida (Zarco, 2006). El subendocardio es la zona del corazón más susceptible al infarto de miocardio. Esta susceptibilidad se puede deber a un mayor requerimiento metabólico, a mayor grado de isquemia tras la oclusión coronaria completa o a una combinación de ambas. En efecto, la reserva coronaria del subendocardio está disminuida en condiciones normales (Zarco, 2006). El infarto de miocardio se manifiesta, la mayoría de las veces, con un dolor, peso u opresión en el pecho, una sensación semejante a la de la angina de pecho, pero más intensa y/o más duradera. La sensación puede extenderse al brazo izquierdo, y también al cuello, costado, estómago, etc. y puede prolongarse durante varias horas. Los medicamentos que se usan en la fase aguda son analgésicos especiales, combinados con nitratos y betabloqueantes y también con fármacos que actúan sobre la coagulación, como los fármacos fibrinolíticos, capaces de disolver los trombos intracoronarios y que son muchos más eficaces si se aplican en las primeras horas siguientes al infarto (OCU, 2011). 1.2.5 Accidentes vasculares cerebrales Hay un conjunto de lesiones en las arterias cerebrales que pueden producir un accidente cerebral, que puede ser: Una embolia cerebral, es una obstrucción brusca de un vaso cerebral por un trombo originado en otro punto de la circulación sanguínea; una trombosis cerebral, es una obstrucción brusca de una arteria cerebral por un trombo que se ha producido en esa misma arteria; una hemorragia cerebral, se debe normalmente a la ruptura de un vaso cerebral dañado. Los síntomas dependen de la zona del cerebro afectada y pueden consistir en alteraciones de la fuerza o de la sensibilidad, dificultad para hablar, dificultad para tragar, inestabilidad al 13 caminar, etc., suelen ocurrir bruscamente y en ocasiones duran solo unos minutos (accidente isquémico transitorio) lo que puede constituir un aviso de que algo más grave puede ocurrir (OCU, 2011). En algunas ocasiones es posible el uso de fármacos fibrinolíticos que contribuyen a disolver un posible trombo. En cualquier caso, la intervención precoz, controlando la oxigenación, la temperatura y los niveles de glucemia (azúcar en sangre) ayuda a minimizar las posibles secuelas (OCU, 2011). 1.2.6 Arritmias. Una arritmia es una alteración del ritmo cardiaco. Las arritmias cardiacas aparecen por alguno de estos tres motivos (Fundación, 2012): a) Uno de los mecanismos eléctricos falla por falta de generación del impulso eléctrico. b) El impulso eléctrico se origina en un sitio erróneo. c) Los caminos para la conducción eléctrica están alterados. Hay diferentes clasificaciones de las arritmias (Fundación, 2012): Por su origen a) Supraventriculares: Se localizan por encima de los ventrículos: en las aurículas o en el nodo aurículo- ventricular. b) Ventriculares: Se originan en los ventrículos Por su frecuencia cardiaca a) Taquicardias: Frecuencia superior a los 100 Impulsos por minuto (lpm). b) Bradicardias: Frecuencia por debajo de los 60 lpm. Por su causa a) Fisiológicas: Originadas por una alteración orgánica o de otro nivel (anemia, taquicardia en el ejercicio, bradicardia sinusal producida en el entrenamiento deportivo, etc.). b) Patológicas: No atribuibles a causa secundaria alguna. 14 Por su repetición a) Crónicas: De carácter permanente. b) Paroxísticas: Se presentan en ocasiones puntuales. Cuando el paciente tiene síntomas, el diagnóstico se hace generalmente por medio de un electrocardiograma. Otro método es el Holter de 24 horas, que consiste en un registro electrocardiográfico ambulatorio que capta los latidos del corazón durante uno o más días. En casos excepcionales, cuando los especialistas sospechan que la arritmia puede ser peligrosa, al paciente se le coloca un Holter implantable que detecta las arritmias durante un año (Fundación, 2012). Si las arritmias tienen relación con el ejercicio físico es necesario realizar una prueba de esfuerzo. Cuando el electrocardiograma no es suficiente, en ocasiones puede ser necesario realizan un estudio electrofisiológico de la conducción intracardiaca mediante catéteres que se introducen por una vena o una arteria (Fundación, 2012). Los fármacos antiarrítmicos sólo se emplean para tratar los síntomas, ya que no tienen efecto beneficioso sobre el pronóstico. La ablación percutánea consiste en la introducción de un catéter para quemar pequeñas zonas del corazón donde se generan arritmias. Los dispositivos implantables son aparatos electrónicos capaces de analizar el ritmo del corazón y tratar las arritmias mediante estímulos eléctricos. Los más usados son los marcapasos y los desfibriladores automáticos implantables (DAI) (Fundación, 2012). 15 1.3 TOXICOLOGÍA GENÉTICA Paracelso, el padre de la Toxicología, dijo: “La diferencia entre lo que cura y lo que mata es la dosis”. Es decir, toda sustancia, sin excepción es un veneno, la cantidad administradahace la diferencia entre un veneno y un remedio (Silva, 2005). La Toxicología es el estudio de los efectos adversos de sustancias químicas sobre los organismos vivos. Los principios de Toxicología son esenciales para el uso apropiado de la ciencia en el proceso que suele denominarse “valoración de riesgo”, por el cual se hacen estimados cuantitativos de los efectos potenciales sobre la salud humana y la importancia ambiental de varios tipos de exposiciones a sustancias químicas (Klaasen y Watkins, 2001). En todas las ramas de la Toxicología, se estudian los mecanismos por los cuales las sustancias químicas producen efectos adversos en sistemas biológicos (Klaasen y Watkins, 2001): Mecanismos de acción y exposición a agentes químicos como una causa de enfermedad aguda y crónica. Fenómenos fisiológicos. Exposición ocupacional a sustancias químicas. Aspectos de salud pública de sustancias químicas que se encuentran en el ambiente, y los fármacos. Descubrimiento y creación de nuevos fármacos y plaguicidas. Creación de estándares y reglamentos. Efectos de sustancias químicas en la flora y la fauna. Mecanismos por los cuales los tóxicos regulan el crecimiento de las células y la diferenciación de las mismas, y las células muestran respuesta a los tóxicos a nivel de gen. Creación de antídotos y regímenes de tratamiento para aliviar intoxicaciones y lesiones de origen xenobiótico. La Toxicología tiene cuatro áreas especializadas (Klaasen y Watkins, 2001): 1. Toxicología forense: Estudia principalmente los aspectos médico-legales de los efectos dañinos de sustancias químicas sobre seres humanos y animales, establece la causa de muerte, y determina sus circunstancias en una investigación post mortem. 16 2. Toxicología clínica: Estudia la enfermedad causada por sustancias tóxicas, o relacionada de manera singular con estas últimas. Los esfuerzos se dirigen a atender pacientes intoxicados con fármacos u otras sustancias químicas y a la creación de nuevas técnicas para tratar esas intoxicaciones. 3. Toxicología ambiental: Se enfoca en el impacto de contaminantes químicos que se encuentran en el ambiente sobre organismos biológicos, con mayor frecuencia en organismos no humanos, como peces, aves y animales terrestres. 4. Ecotoxicología: Es un área especializada dentro de la toxicología ambiental que se enfoca de manera más específica en el impacto de las sustancias tóxicas sobre la dinámica de población en un ecosistema. El espectro de efectos indeseables de las sustancias químicas es amplio. Algunos efectos son nocivos, otros no. En terapéutica, cada fármaco produce diversos efectos, pero por lo general, no sólo un efecto se relaciona con el objetivo primario de la terapéutica; todos los otros efectos se denominan indeseables o secundarios de ese fármaco, para ésta indicación terapéutica. Aún así, algunos de estos efectos secundarios pueden ser deseables para otra indicación terapéutica. Algunos nunca son deseables y siempre son nocivos para el bienestar de seres humanos. Estos se denominan efectos adversos, nocivos o tóxicos del fármaco (Klaasen y Watkins, 2001). 1.4 ÍNDICE TERAPÉUTICO O MÁRGEN DE SEGURIDAD El índice terapéutico es el cociente entre la Concentración Mínima Tóxica (CMT) y la Concentración Mínima Eficaz (CME) (CMT/CME). Cuanto mayor sea ésta relación, mayor es el márgen seguridad ofrece la administración del fármaco y es más fácil conseguir efectos terapéuticos sin producir efectos tóxicos (Velázquez, 2008). El márgen de seguridad se determina para todos los fármacos en la fase experimental preclínica y permite juzgar acerca de la seguridad de su empleo (Figueroa, 1999). La Concentración Mínima Eficaz (CME) se define como la concentración por encima de la cual suele observarse el efecto terapéutico; mientras que la Concentración Minima Tóxica (CMT) es la concentración a partir de la cual suelen aparecer efectos tóxicos (Velázquez, 2008). 17 1.5 RELACIÓN DOSIS-RESPUESTA Las características de la exposición y la gama de efectos se unen en la relación entre la dosis y la respuesta: a la respuesta de un individuo a dosis variables se le llama gradual porque el efecto medido es continuo en una gama de dosis. La relación puede describir la distribución de respuestas a diferentes dosis en una población de individuos. Las relaciones entre dosis y respuesta individuales se caracterizan por un incremento (relacionado con la dosis) de la gravedad de la respuesta. En general, la respuesta observada a dosis variable de una sustancia química en el organismo entero suele complicarse por el hecho de que la mayor parte de las sustancias tóxicas tienen múltiples sitios o mecanismos de toxicidad, cada uno con su propia relación entre “dosis y respuesta” y efecto adverso subsiguiente (Klaasen y Watkins, 2001). Al deducir la relación entre dosis y respuesta es necesario considerar diversas suposiciones antes que las relaciones entre dosis y respuesta puedan usarse de manera apropiada (Klaasen y Watkins, 2001): La respuesta se debe a la sustancia química que se administra. La magnitud de la respuesta está relacionada con la dosis. Hay uno o varios sitios moleculares o receptores con los cuales la sustancia química interactúa para producir la respuesta. La producción de una respuesta y el grado de respuestas se relacionan con la concentración del agente en el sitio receptor. La concentración en el sitio se relaciona, a su vez con la dosis. Las propiedades fisicoquímicas del agente xenobiótico. Hay tanto un método cuantificable de medición como un medio preciso de expresar la toxicidad. El vínculo entre el grado de respuesta del sistema biológico y la cantidad de tóxico administrado adopta una forma que ocurre de manera tan constante como para considerarla clásica y fundamental y se denomina la relación entre dosis y respuesta (Klaasen y Watkins, 2001). 18 1.6 DOSIS LETAL 50 (DL50) La determinación de la dosis letal media (DL50) regularmente es el primer experimento que se efectúa con una nueva sustancia química. La DL50 es la dosis única de una sustancia, que puede esperarse que produzca la muerte en 50% de los animales probados. Si se utiliza un gran número de dosis con un gran número de animales por dosis, se observa una curva de dosis- respuesta sigmoidea (Klaasen y Watkins, 2001). La determinación de la DL50 se ha convertido en un tema público debido a la preocupación cada vez mayor por el bienestar de los animales de laboratorio y la protección de los mismos. La DL50 no es una constante biológica. Muchos factores influyen sobre la toxicidad y, así, pueden alterar la estimación de la DL50 en cualquier estudio particular. Se ha demostrado que los factores como la cepa del animal, edad y peso, tipo de alimentación, tipo de alojamiento en jaula, tiempo de ayuno antes del estudio, método de administración, volumen, tipo de medio de suspensión, y duración de la observación, influyen sobre las respuestas adversas a sustancias tóxicas (Klaasen y Watkins, 2001). Varios métodos tradicionales determinan la DL50 y su límite de confianza de 95%, así como la pendiente de la línea de probit (Klaasen y Watkins, 2001). En la actualidad, la Toxicología alcanza enorme trascendencia social debido al importante número de sustancias químicas comercializadas y su posible impacto sobre la salud pública y ambiental. Ello ha conducido al desarrollo de estrategias de evaluación de riesgos con fines normativos: es el caso de la llamada "Toxicología Reguladora" (Vinardell, 2007). Existen protocolos de los diferentes ensayos toxicológicos que se realizan “in vivo”, de acuerdo con los criterios de la Organization for Economic Co-operation and Development (OECD). En éstos se han introducido diferentescriterios de reducción del número de animales y de refinamiento de las técnicas, si bien existen pocos métodos de reemplazo que hayan sido aceptados en el plano legislativo (Vinardell, 2007). La armonización de los protocolos utilizados en todo el mundo ha reducido de forma significativa el uso de animales con estos fines. Desde 1982 la OECD fue la primera organización internacional en establecer unos criterios de armonización de los ensayos realizados en animales, siendo aceptados por todos los países 19 miembros de dicha organización. De manera similar, existe desde 1990 una armonización en los ensayos de seguridad realizados con fármacos (Vinardell, 2007). 1.6.1 Transformación Probit Probit es una palabra que viene de la contracción de probability unit; a pesar de ello, no son unidades de probabilidad, sino unidades de desviación estándar incrementadas en cinco con la finalidad de evitar el uso de números negativos. Esta transformación asume que la respuesta de los individuos se distribuye en forma normal, correspondiendo la curva de respuesta a una sigmoidea o función de distribución normal acumulativa. Esta curva normal sólo se diferencia de la tradicionalmente usada, en que tiene una media de 5 y no de 0, valor que corresponde a un umbral proporcional de respuesta del 50%. (Silva, 2005) 1.6.2 Transformación Logit Algunos autores sostienen que la respuesta no se distribuye de forma normal sino de forma sigmoide o logística, por lo que sugieren que se utilice la siguiente ecuación (Silva, 2005). P= 1/(1+e -(a+bx) ) 1.6.3 Transformación Anglit o Angular La transformación angular se usa principalmente cuando los valores obtenidos experimentalmente se expresan en términos de una proporción (p), cuyo valor oscila entre 0 y 1. Esta transformación presenta el problema que puede sobrevalorar los datos extremos de la evaluación (Silva, 2005). Los probit son unidades derivadas a partir de una transformación matemática que linealiza la curva de dosis- respuesta. Estos métodos tradicionales para determinar la DL50 exigen un número relativamente grande de animales (40 a 50). Se dispone de otras técnicas estadísticas que requieren menos animales, como el método de “mover promedios” pero no proporcionan límites de confianza para la DL50 y la pendiente de la línea de probit. En casi todas las circunstancias, un estimado adecuado de la DL50 y una aproximación de los intervalos de confianza del 95% pueden obtenerse con apenas 6 a 9 animales por medio del método “incremento- disminución” (up-and-down method) (Klaasen y Watkins, 2001). 20 1.7 MÉTODO DE LORKE PARA CALCULAR DL50. Se ha propuesto que la toxicidad aguda debe ser probada en dos pasos (Lorke, 1983): 1. En las investigaciones iniciales de los rangos de dosis, la producción de efectos tóxicos serán establecidos. 2. Serán administradas dosis aún más específicas para el cálculo de la DL50. Esta experimentación se llevó a cabo tomando en cuenta un método para la investigación de la toxicidad aguda de una sustancia química desconocida con una estimación de la DL50, usando la mínima cantidad de animales de experimentación; obteniendo adecuada información sobre la toxicidad aguda y la DL50. Éste método no ha tenido limitaciones y se aplica a fármacos, industria química y agricultura. Puede ser usado por todas las vías de administración. Tal método se conoce como Método de Lorke (Lorke, 1983). En principio, es necesario determinar el rango aproximado de la toxicidad aguda. Esto es logrado dando diferentes dosis a los animales, por ejemplo 10, 100 y 1000 mg/kg de peso corporal. Los resultados muestran si una sustancia es muy tóxica, tóxica, poco tóxica o sólo ligeramente tóxica (Lorke, 1983). Debido a que el uso de un solo animal en cada grupo puede dar un resultado falso cuando por casualidad el animal en el rango no tóxico muere o el del rango tóxico sobrevive, se propone usar tres animales en cada grupo para determinar el rango tóxico. Los resultados de esta prueba son usados como una base para seleccionar las dosis subsecuentes (Lorke, 1983). De lo anterior, se hicieron las siguientes declaraciones con respecto a las pautas de dosificación posteriores (Lorke, 1983): 1. Las sustancias más tóxicas que las de 1 mg/kg son tan altamente tóxicas que no es tan importante calcular la DL50 exactamente. 2. Las DL50 de más de 5000 mg/kg no son de interés práctico. 3. Una cifra aproximada de la DL50 generalmente es adecuada para estimar el riesgo de toxicidad aguda. Con base en estas consideraciones y en investigaciones anteriores, los nuevos compuestos se administran a los animales en la primera y segunda etapa como lo marca la siguiente tabla: 21 Tabla 2. Diferentes dosis para determinar la toxicidad aguda (Lorke,1983). Dosis en mg/Kg de peso. Resultados de la investigación inicial. Dosis elegidas por la segunda prueba. 10 100 1000 0/3 0/3 0/3 1600 2900 5000 0/3 0/3 1/3 600 1000** 1600 2900 0/3 0/3 2/3 200 400 800 1600 0/3 0/3 3/3 140 225 370 600 0/3 1/3 3/3 50 100** 200 400 0/3 2/3 3/3 20 40 80 160 0/3 3/3 3/3 15 25 40 60 1/3 3/3 3/3 5 10** 20 40 2/3 3/3 3/3 2 4 8 16 3/3 3/3 3/3 1 2 4 8 **: Éstas dosis son tomadas de los resultados de la primera prueba. El método anterior demuestra que no hay ninguna ventaja en el uso de más de cinco animales por dosis. De hecho tres animales por grupo de ensayo son totalmente adecuados. Sin embargo, tres animales por grupo de dosis es tres veces más que un solo animal por grupo. El ahorro en los animales mediante el uso de un animal por cada grupo tiene que ser equilibrado contra la falta de fiabilidad en sólo el 7% de las determinaciones de toxicidad aguda. Puede ser necesario repetir aproximadamente cada 14 investigaciones. Es recomendable equilibrar las ventajas y las desventajas en un grupo de un animal, ya que proporciona información adecuada acerca de la toxicidad aguda. El ahorro en animales de experimentación con este método es excepcional. Cuando las dosis estén debidamente seleccionadas, la información sobre la toxicidad aguda generalmente se obtiene con 13 animales solamente, independientemente de la sustancia, de todas las vías de administración y todos los rangos de dosis (Lorke, 1983). 22 1.8 ENSAYOS DE TOXICIDAD La mutagénesis se refiere a la inducción de cambios permanentes y transmisibles en la estructura del material genético, afectando a un único gen o a varios. Genotoxicidad es la capacidad de una sustancia para interaccionar con al ADN. Los ensayos de genotoxicidad y mutagénesis son importantes para evaluar el riesgo de los productos. Debido a que son fenómenos complejos, no existe un único ensayo capaz de detectar estas alteraciones (Vinardell, 2007). La evaluación toxicológica de una sustancia química incluye las pruebas de toxicología genética, que tienen dos propósitos principales: 1) reconocer los agentes mutágenos y 2) caracterizar la relación dosis-respuesta y los mecanismos mutagénicos (Bello, 2001) Toda mutación producida en una célula germinal puede ser transmitida a la descendencia, pero sí se produce en una célula somática puede ser orígen de diversos trastornos, entre los que se encuentran la teratogénesis y las neoplasias, la gran mayoría de los compuestos químicos carcinogénicos son genotóxicos, es decir, tienen la capacidad de provocar daños sobre el ADN (Bello, 2001). Las alteraciones del ADN van desde las rupturas mono o bicatenarias, pasando por los entrecruzamientos entre bases del ADN y entre bases y proteínas del ADN hasta la adición de compuestos químicos a las bases del ADN (Klassen y Watkins, 2005). Se han venido utilizando diferentes métodos con animales y evaluando las alteraciones genéticas observadas, como en el ensayo de mutación genéticaen células de mamífero (preferentemente linfoma de ratón). El ensayo del micronúcleos en eritrocitos de mamíferos determina si un producto provoca o no cambios en la estructura y número de cromosomas (Vinardell, 2007). 1.8.1 Pruebas para la detección de genotoxicidad Generalmente se exige un “panel mutagénico” consistente en diferentes determinaciones que pueden ser (Rojas, 2008): In vitro: Se utilizan células bacterianas, o de mamífero que se incuban con el producto en presencia o ausencia de la fracción microsomal. In vivo: Se observan posibles efectos en el organismo vivo, principalmente en ratón. La Toxicología genética dispone de una amplia gama de análisis para identificar el potencial genotóxico de una sustancia, de las cuales las más usuales son las siguientes: Aberraciones cromosómicas: En citogenética se utiliza el análisis de la metafase para detectar anomalías cromosómicas. Las células se exponen durante un periodo sensible del ciclo celular (Fase S), y las aberraciones se generan en la primera división mitótica después del tratamiento. Es 23 fundamental que el número de células analizadas sea suficiente, además hay que registrar los resultados por clases específicas de aberraciones. En el momento de interpretar los resultados en cultivos celulares se han observado resultados positivos dudosos con dosis citotóxicas, es por eso que las pruebas deben llevarse a cabo con dosis intermedias y ampliarse hasta una dosis con la que se observe cierto grado de citotoxicidad. Las pruebas “in vivo” consisten en exponer a los animales íntegros y posteriormente disponer de un tejido, a partir del cual se prepara un gran número de células para su análisis (Klassen y Watkins, 2005). Intercambio de Cromátides Hermanas: Se observan intercambios de segmentos aparentemente recíprocos entre las dos cromátidas de un cromosoma, secundarios a errores en la replicación, mediante la tinción diferencial que es característica de ésta prueba. Requiere de al menos dos procesos de síntesis y división celular después del tratamiento. Sirve como indicador general de las exposiciones a mutágenos y detecta agentes clastogénicos y citotóxicos (Hernández, 1999). Micronúcleos: Cuerpos de cromatina que representan fragmentos acéntricos de cromosomas, o cromosomas enteros, que no se incorporaron al núcleo en la mitosis. Se emplean como indicadores de agentes clastogénicos y citotóxicos, aunque éstos también requieren al menos una fase de división celular después de la exposición al agente en estudio (Márquez, 1997). Éste tema se revisará con más detalle en el siguiente apartado, ya que fué el método utilizado en éste trabajo de investigación. Ames: Prueba in vitro para la mutagenicidad que usa cepas de mutantes de la bacteria Salmonella typhimurium, que no puede crecer en un medio con deficiencia de histidina: los agentes positivos causan mutaciones que facilitan el crecimiento de la bacteria en el medio. La prueba se puede realizar en presencia de una fracción microsómica de hígado de ratas para permitir la transformación metabólica de precursores mutagénicos a derivados activos (Rojas. 2008). Ensayo cometa: (o Electroforesis Celular en Gel): Ésta prueba permite la detección de daño directo al ADN, sin necesidad de la fase de replicación ni expresión del ADN. Ésta técnica permite el seguimiento de reparación del ADN o el monitoreo de poblaciones expuestas a agentes mutagénicos, por tanto, se utiliza para cuantificar la toxicidad de diversos compuestos con un mecanismo clastogénico tales como inductores de daño oxidativo, radiaciones y agentes alquilantes entre otros (Rojas, 2008). 24 1.9 ENSAYO DE MICRONÚCLEOS La prueba de micronúcleos fue desarrollada por W. Schmid en 1975, quien originalmente la propuso para practicarse en la médula ósea del ratón; posteriormente, la técnica se ha instrumentado en una gran variedad de tejidos y especies, y en la actualidad se le utiliza ampliamente (Zúñiga y Gómez, 2006). Las aberraciones cromosómicas estructurales pueden ser el resultado de varios eventos, entre los principales, se encuentran: el rompimiento del ADN, la replicación del ADN sobre un molde dañado y la inhibición de la síntesis de ADN (Cervantes, 2006). Los micronúcleos son fragmentos de cromosomas o cromosomas completos que espontáneamente o por causa de agentes que rompen cromosomas (clastógenos), como las radiaciones o que afectan la división celular, causando pérdida o ganancia de cromosomas enteros (anéugenos), como la vincristina; y quedan fuera del núcleo durante la mitosis. Los micronúcleos son conocidos en el campo de la hematología como cuerpos de Howell-Jolly y su forma es generalmente redonda o almendrada, con un diámetro que varía desde 0.4 a 1.6 micras. Su formación se basa en que en la anafase cualquier fragmento cromosómico que no posea centrómero no podrá integrarse a un núcleo por carecer del elemento indispensable para orientarse en el huso acromático. Después de la telofase, los cromosomas normales, así como los fragmentos que posean centrómeros, dan origen a los núcleos de las células hijas; sin embargo, los elementos rezagados –que pueden ser fragmentos o cromosomas completos– quedan incluidos en el citoplasma de las células hijas, y una proporción de ellos se transforma en uno o varios núcleos secundarios. Tales núcleos son mucho más pequeños que el núcleo principal, y de ahí su nombre de “micronúcleos”. Entonces, sí el compuesto estudiado es un clastógeno, se formarán micronúcleos pequeños, pero sí es un aneúgeno, se formarán micronúcleos grandes (Zúñiga y Gómez, 2006). El ensayo “in vivo” de micronúcleos en mamíferos está especialmente indicado para evaluar el riesgo mutagénico, ya que permite tomar en consideración factores del metabolismo “in vivo”, de la farmacocinética y de los procesos de reparación del ADN, si bien, dichos factores pueden variar según la especie, el tejido y el aspecto genético considerado. Los ensayos “in vivo” también resultan útiles para profundizar en el estudio de los efectos mutagénicos detectados en ensayos “in vitro” (Domínguez, 2009). Para la realización de la prueba de Micronúcleos “in vivo”, es indispensable utilizar un tejido en constante división, pero debe considerarse que en las células con poco citoplasma los micronúcleos no son fácilmente distinguibles de los lóbulos o proyecciones del núcleo normal. La prueba se realiza en diferentes tipos celulares: eritrocitos policromáticos de la médula ósea, cultivos de linfocitos de sangre periférica, eritrocitos jóvenes y maduros de la sangre periférica, queratinocitos, células de la mucosa bucal, hepatocitos de rata, células germinales y células de descamación de la vagina de la rata, entre otros (Zúñiga y Gómez, 2006). 25 El ensayo de Micronúcleos “in vivo” puede realizarse de dos maneras (Domínguez, 2009): a) Se administra la sustancia de prueba a los animales en una sola ocasión. Se extraen muestras de la médula ósea o de sangre periférica al menos dos veces. b) Si se efectúan dos o más administraciones a intervalos de 24 horas, ha de tomarse una muestra transcurridas de 18 a 24 horas desde la última administración si se trata de médula ósea y de 36 a 48 horas desde la última administración en el caso de sangre periférica. El estudio de micronúcleos “in vivo” se puede realizar utilizando eritrocitos jóvenes (Eritrocitos Policromáticos) obtenidos de sangre periférica, los cuales son considerados los más convenientes para dicho estudio, ya que facilitan la identificación de micronúcleos debido a que permanecen jóvenes en un periodo de 24 a 48 horas aproximadamente, carecen de núcleo y se tiñen de manera diferente a los eritrocitos maduros en circulación ya que contienen una mezcla de hemoglobina y ARN presentando así una coloración mezclada de basofilia y eosinifilia por lo que se tiñen de azul violáceo. Son un pocomás grandes que los eritrocitos maduros (Eritrocitos Normocrómicos), los cuales se tiñen de naranja rosado debido a que están constituidos principalmente de hemoglobina (Rocha, 2008). El mecanismo de formación de micronúcleos se lleva a cabo en la médula ósea junto con la eritropoyesis, el cual constituye un desarrollo continuo iniciando con la célula totipotencial seguida de la progresión normoblástica hasta llegar al eritrocito maduro. La replicación del pronormoblasto permite el desarrollo potencial de 16 eritrocitos maduros mediante cuatro divisiones mitóticas en un periodo de 72 horas. El pronormoblasto tiene la función de producir, acumular y proteger a las moléculas de hemoglobina, la cual deja de sintetizarse después de que la célula sufre tres primeras divisiones mitóticas originando la expulsión del núcleo y la diapédesis al interior de los capilares medulares donde el normoblasto ortocromático se transforma en el reticulocito, que conserva las mitocondrias, pequeñas cantidades de ribosomas, el centriolo y vestigios del aparato de Golgi (Rocha, 2008). Los reticulocitos sintetizan el 20% restante de la hemoglobina para la formación del glóbulo rojo maduro el cual obtiene la energía por la glucólisis. El ATP cumple la función de captar glucosa del plasma, conservar las concentraciones adecuadas de calcio y potasio, mantiene la forma bicóncava conservando la hemoglobina en estado reducido (Rocha, 2008). El tiempo de vida de un eritrocito en ratón es de 30 días y considera que el ciclo celular es de 10 a 20 horas. El lapso que transcurre de la división a la enucleación es de 6 horas y el tiempo de los EPC en médula ósea es de 24 horas (Domínguez, 2009). 26 Si se emplea médula ósea, se recomienda el uso de ratones o ratas, pero también pueden utilizarse otras especies de mamíferos adecuadas. Si se emplea sangre periférica, se recomienda el uso de ratones. Deben usarse animales jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en el laboratorio. La variación del peso de los animales al empezar el estudio debe ser mínima y no exceder de + 20% del peso medio de cada sexo (Domínguez, 2009). Las células de la médula suelen tomarse del fémur o la tibia, de los animales recién sacrificados, se preparan laminillas y se tiñen según métodos establecidos. La sangre periférica se extrae de la vena caudal o de otro vaso sanguíneo adecuado. Las células hemáticas se someten inmediatamente a una tinción supravital; o bien, se extienden en frotis y se les realiza una tinción diferencial con colorante Giemsa, por ejemplo, o mediante tinciones fluorescentes (Domínguez, 2009). Para cada animal se determina la relación entre los eritrocitos inmaduros y el total de eritrocitos (inmaduros + maduros) en un recuento de al menos 200 eritrocitos si se trata de médula ósea y de 1000 si se trata de sangre periférica (Domínguez, 2009). El ensayo de micronúcleos es un método sensible que permite identificar agentes que causan la formación de estas estructuras como resultado de fragmentos de cromosomas o cromosomas completos, “in vivo” es especialmente útil para caracterizar el poder genotóxico de factores del metabolismo, de fármacos y de los procesos involucrados en la reparación del ADN (Cervantes, 2006). Dentro de las ventajas de la técnica de micronúcleos se incluyen la facilidad y rapidez, la posibilidad de probar un sólo químico sin otros compuestos, la abundancia de células analizables en diferentes periodos del ciclo celular y el que los micronúcleos formados durante la división celular persisten al menos durante la siguiente interfase; además, la prueba no deja lugar a dudas sobre el daño producido, pues lo que se observa como micronúcleos es claramente una pérdida de ADN. Por otro lado, la prueba no detecta agentes que no producen pérdidas de material genético o rezagos anafásicos, y tampoco es útil en poblaciones celulares que no se dividen (Zúñiga y Gómez, 2006). 27 2. JUSTIFICACIÓN Las enfermedades cardiovasculares son muy comunes en México y son un problema serio debido a las complicaciones que pueden llegar a tener, ya que éstas pueden ser letales, es, por ésta razón, que el Laboratorio de Química Medicinal a cargo del Dr. Enrique Ángeles Anguiano retomó investigaciones pasadas acerca de derivados de la changrolina para desarrollar nuevos fármacos que combatan dichas enfermedades y que tengan una mayor potencia, eficacia y un margen de seguridad más amplio que los fármacos antihipertensivos de uso común, acercándonos cada vez más al concepto del fármaco ideal. El principal objetivo de éste trabajo de investigación es estimar la DL50 y con la población de animales que sobreviva, determinar la genotoxicidad de cuatro compuestos derivados de la serie LQM; dos compuestos monotiomorfolínicos y dos compuestos monopiperidínicos, por medio de el Ensayo de Micronúcleos “in vivo” para después compararlos entre sí y con otros fármacos antihipertensivos de mecanismo de acción conocido y poder de ésta forma, comenzar a caracterizar a cada grupo de LQM’s, ya que por tratarse de nuevos fármacos, aún se desconocen muchos aspectos de ellos. 3. HIPÓTESIS Sí los compuestos de la serie LQM300 a dosis menores a la DL50 tienen propiedades clastogénicas (inducen la ruptura de cromosomas), o aneugénicas (afectan la división celular y estructuras asociadas a la segregación cromosómica) que induzcan el rezago cromosómico, producirán un aumento en la frecuencia de micronúcleos en eritrocitos de sangre periférica de ratón. 28 4. OBJETIVO GENERAL. Evaluar la genotoxicidad y determinar la DL50 de los compuestos monotiomorfolínicos LQM318, LQM339 y los compuestos monopiperidínicos LQM336, LQM344 en ratones macho de la cepa CD1 mediante el ensayo de Micronúcleos “in vivo” y el Método de Lorke, respectivamente; para contribuir en el establecimiento de la seguridad toxicológica de estos nuevos compuestos de acción cardiovascular. 4.1 OBJETIVOS PARTICULARES Determinar la toxicidad aguda de los compuestos LQM318, LQM339, LQM336 y LQM344 mediante el método de la DL50 de Lorke y realizar la evaluación genotóxica de los mismos. Evaluar la genotoxicidad de los compuestos LQM318, LQM339, LQM336 y LQM344 mediante la prueba de Micronúcleos “in vivo” en ratones macho de la cepa CD1 a las dosis de 140, 225, 370 y 600 mg/Kg de peso. 29 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Material biológico Para la realización de éste trabajo, se utilizaron 48 ratones macho cepa CD1 provenientes del bioterio de FES Iztacala, con un peso aproximado de 25g + 5g; jóvenes, todos de la misma edad, se mantuvieron en las mismas condiciones de alimentación, temperatura y habitación; ya que el trabajo experimental se llevó a cabo en la Unidad de Aislamiento y Bioterio de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de la FESC Campo 4, a cargo del M. en C. Crisóforo Mercado Márquez. 5.2 Compuestos problema • Compuestos LQM318, LQM336, LQM339 y LQM344. Los compuestos LQM336, LQM339 y LQM344, se preparó su sal en HCl concentrado, obteniendo así su clorhidrato; sin embargo, el compuesto LQM318, no se logró disolver en HCl concentrado, por lo cual, se tuvo que solubilizar en DMSO 70%. 5.3 Reactivos • HCl concentrado (J.T. Baker). • Colorante Giemsa (SIGMA). • KH2PO4 (J.T. Baker). • NaH2PO4 (J.T. Baker). • Metanol absoluto (J.T. Baker). • Agua destilada . DMSO 70% (SIGMA). 30 5.4 Equipos y otros materiales • Microscopio óptico (Leica). • Balanza analítica (Scaltec). • Potenciómetro (Conductronic). • Pipetas volumétricas de 5 y 10 mL (PYREX) . • Piseta. • Probeta 50 Ml (PYREX). • Micropipetas de volúmen variable en rangos de 10 a 500 µL (Orange Scientific). • Estuche de disección. • Jeringas de1 mL. • Viales. • Portaobjetos. 6. METODOLOGÍA a) Determinación de la DL50 del compuesto mediante el método de Lorke (Lorke, 1983). 1. El método consiste en dos etapas. En la primera, se administraron dosis de 10, 100 y 1000 mg/Kg, teniendo como sobrevivientes a las 24 h. a los animales de las dosis 10 y 100 mg. De tal manera, que siguiendo el método (ver Tabla 1.), se eligieron las dosis de prueba de las siguiente etapa. 2. Distribución de los ratones de la cepa CD1 en 4 lotes de 3 ratones para cada compuesto. Administración del clorhidrato de los compuestos vía intraperitoneal en las dosis siguientes: Tabla 3. Dosis administradas en la segunda etapa del método de Lorke. LOTE DOSIS (mg/Kg) 1 140 2 225 3 370 4 600 31 3. Observación de los animales durante 24 hrs, registrar signos y dosis a la cual los animales vivieron o murieron. a) Obtención de la media geométrica de las dosis para calcular la DL50. b) Prueba de Micronúcleos. Determinación de la genotoxicidad de los compuestos. 1. Antes de la administración (T0), a cada ratón, realizar un frotis sanguíneo, cortando la porción terminal de la cola, después realizar el tratamiento con una sola administración intraperitoneal. Tomar muestras de sangre periférica; obtenida de la cola del ratón a (T24), (T48) y (T72) después de la administración. 2. Fijación de los frotis sumergiéndolos en metanol absoluto por tres minutos y teñir con el colorante correspondiente (Giemsa (1:10) en buffer de fosfatos a pH=6.8) 3. Determinación de la frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN) en 2000 eritrocitos policromáticos (EPC). 4. Determinación del índice de citotoxicidad por la frecuencia de eritrocitos policromáticos en 2000 eritrocitos totales (EPC + ENC). Realizar el conteo con el microscopio óptico utilizando el objetivo de inmersión (1000X). 5. Realización del análisis estadístico ANOVA por medio del software creado GraphPad Instant tm. Con un α = < 0.05. 32 7. DIAGRAMA DE FLUJO 33 8. RESULTADOS 8.1 CÁLCULOS REALIZADOS PARA DETERMINAR LA DL50 DE LOS DIFERENTES COMPUESTOS: La media geométrica (DL50) se obtiene calculando la raíz cuadrada del producto de la última dosis en la que sobrevivieron todos por la primera dosis donde hubo decesos. LQM 336 = = 117.48 LQM 339 = = 288.53 LQM 344 = = 471.16 LQM 318 = = 471.16 8.2. Tabla 4. DL50 con efectos de toxicidad COMPUESTO DL50 EFECTOS DE TOXICIDAD LQM318 471.16 mg/Kg Aletargados, dificultad para moverse, pelo erizado y seco. LQM336 177.48 mg/Kg Aletargamiento, incapacidad de movimiento, excitación exagerada, convulsiones. LQM339 288.53 mg/Kg Aletargamiento, dificultad de movimiento. LQM344 471.16 mg/Kg Aletargamiento, debilidad, respiración lenta, dificultad para moverse menos severa que en los demás compuestos 34 8.3 Tablas Eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN) para evaluar Genotoxicidad. Eritrocitos policromáticos micronucleados en 2000 eritrocitos policromáticos. 8.3.1. Tabla 5. Eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN) en LQM318. L = Lote R = Ratón 8.3.2. Tabla 6. Eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN) en LQM336. L1R1 L1R2 L1R3 L2R1 L2R2 L2R3 L3R1 L3R2 L3R3 L4R1 L4R2 L4R3 H ERITROCITOS POLICROMÁTICOS MICRONUCLEADOS/ 2000 ERITROCITOS POLICROMÁTICOS 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 24 0 0 0 0 ------ ---- ------ ---- 0 ------ ---- ------ 48 0 0 0 0 ------ ---- ------ ---- 0 ------ ---- ------ 72 0 0 0 0 ------ ---- ------ ---- 1 ------ ---- ------ 0 0 0 0 0 0 0 0 0.333 0 0.333 0 SD 0 0 0 0 0 0 0 0 0.577 0 0.577 0 L = Lote R = Ratón L1R1 L1R2 L1R3 L2R1 L2R2 L2R3 L3R1 L3R2 L3R3 L4R1 L4R2 L4R3 h ERITROCITOS POLICROMÁTICOS MICRONUCLEADOS/2000 ERITROCITOS POLICROMÁTICOS 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 ---- ---- ----- ---- ------ ---- ------ 0 ---- 0 ---- ----- 48 ----- ---- ------ ----- ------ ---- ------ 0 ---- 1 ---- ------ 72 ----- ---- ------ ----- ------ ---- ------ 0 ---- 0 ---- ------ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.333 0 0 SD 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.577 0 0 35 8.3.3. Tabla 7. Eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN) en LQM339. L1R1 L1R2 L1R3 L2R1 L2R2 L2R3 L3R1 L3R2 L3R3 L4R1 L4R2 L4R3 H ERITROCITOS POLICROMÁTICOS MICRONUCLEADOS/ 2000 ERITROCITOS POLICROMÁTICOS 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 ------ ---- 1 0 0 0 48 0 0 0 0 0 0 ------ ---- 0 0 0 0 72 0 0 0 0 0 0 ------ ---- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.333 0 0 0 SD 0 0 0 0 0 0 0 0 0.577 0 0 0 L = Lote R = Ratón 8.3.4. Tabla 8. Eritrocitos policromáticos micronuleados (EPCMN) en LQM344. L1R1 L1R2 L1R3 L2R1 L2R2 L2R3 L3R1 L3R2 L3R3 L4R1 L4R2 L4R3 H ERITROCITOS POLICROMÁTICOS MICRONUCLEADOS/ 2000 ERITROCITOS POLICROMÁTICOS 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 24 0 ----- 0 0 ----- 0 ----- 0 ---- ---- ---- 0 48 0 ----- 0 ----- ----- 0 ----- 0 ---- ---- ---- 0 72 0 ----- 0 ----- ----- 0 ----- 0 ---- ---- ---- 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.333 SD 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.577 L = Lote R = Ratón No se pudo realizar el análisis de ANOVA para ninguno de los 4 compuestos debido a que todos presentaron por lo menos para una columna, sólo un dato y para poder realizar el análisis de ANOVA se requieren mínimo 2 datos en cada columna. Dosis Administradas a cada lote: Ver tabla 2. 36 8.4 Tablas de porcentaje de eritrocitos policromáticos para evaluar Citotoxicidad. Eritrocitos policromáticos (EPC) divididos entre 2000 eritrocitos totales (eritrocitos policromáticos más eritrocitos normocrómicos (EPC+ENC)). EPC/2000 (EPC+ENC) =%EPC EN 2000 ERITROCITOS 8.4.1. Tabla 9. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM318. L= Lote R=Ratón 8.4.2. Tabla 10. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM336. L1R1 L1R2 L1R3 L2R1 L2R2 L2R3 L3R1 L3R2 L3R3 L4R1 L4R2 L4R3 H %ERITROCITOS POLICROMÁTICOS /2000 ERITROCITOS TOTALES 0 0.85 0.55 0.55 0.65 0.7 0.8 0.75 0.75 0.9 0.95 0.9 0.65 24 1.85 2.05 1.85 2.65 ------ ---- ------ ---- 2 ------ ---- ------ 48 2.85 2.05 2.25 2.9 ------ ---- ------ ---- 2.1 ------ ---- ------ 72 2.2 1.15 2.0 3.1 ------ ---- ------ ---- 2.1 ------ ---- ------ 1.9375 1.45 1.6625 2.325 0.7 0.8 0.75 0.75 1.775 0.95 0.9 0.65 SD 0.835 0.7348 0.7598 1.132 0 0 0 0 0.5852 0 0 0 L=Lote R=Ratón L1R1 L1R2 L1R3 L2R1 L2R2 L2R3 L3R1 L3R2 L3R3 L4R1 L4R2 L4R3 h % ERITROCITOS POLICROMÁTICOS /2000 ERITROCITOS TOTALES 0 0.7 0.75 0.8 0.55 0.7 0.8 0.6 0.6 0.75 0.65 0.65 0.75 24 ---- ---- ----- ---- ------ ---- ------ 1.15 ---- 1.4 ---- ----- 48 ----- ---- ------ ----- ------ ---- ------ 2 ---- 2.15 ---- ------ 72 ----- ---- ------ ----- ------ ---- ------ 1 ---- 1.6 ---- ------ 0.7 0.75 0.8 0.55 0.7 0.8 0.6 1.1875 0.75 1.45 0.65 0.75 SD 0 0 0 0 0 0 0 0.5893 0 0.6205 0 0 37 8.4.3. Tabla 11. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM339. L1R1 L1R2 L1R3 L2R1 L2R2 L2R3 L3R1 L3R2 L3R3 L4R1 L4R2 L4R3 H %ERITROCITOS POLICROMÁTICOS /2000 ERITROCITOS TOTALES 0 0.9 0.65 0.9 0.7 0.55 0.45 0.8 0.6 0.8 1 0.3 0.7 24 2.25 1.35 1.15 1.8 1.2 1.7 ------ ---- 2.45 1.8 0.9 2.05 48 1.55 1.15 1.15 1.3 1.1 1.65 ------ ---- 2 1.6 1.2 1.2 72 1 0.85 0.85 0.95 0.65 1.6 ------ ---- 0.9 1.75 1.55 ---- 1.425 1 1.0125 1.1875 0.875 1.35 0.8 0.6 1.5375 1.5375 0.9875 1.31666667 SD 0.6198 0.3109 0.1601 0.4768 0.3227 0.6014 0 0 0.8159 0.3683 0.5297 0.6825 L=Lote R=Ratón 8.4.4. Tabla 12. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM344. L1R1 L1R2 L1R3 L2R1 L2R2 L2R3 L3R1 L3R2 L3R3 L4R1 L4R2 L4R3 H %ERITROCITOS POLICROMÁTICOS
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