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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Facultad de Ciencias DETERMINACIÓN DE LA EFECTIVIDAD DE UN ANTISÉPTICO (DIGLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 0.2%) PARA SU USO EN LA PREVENCIÓN DE MASTITIS EN GANADO BOVINO. T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE BIÓLOGA P R E S E N T A MARÍA DEL CARMEN AYALA ELIZALDE DIRECTORA DE TESIS: QFB. ISAURA LUISA CARRERA GARCÍA MÉXICO, D.F. OCTUBRE, 2010 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. AYALA ELIZALDE MARÍA DEL CARMEN 56860075 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGIA 8123210-9 Q.F.B. ISAURA LUISA CARRERA GARCIA BIOLOGA REBECA GUTIERREZ ORDOÑEZ M. EN C. AIDA NAVAS PEREZ Q. F.B. MARIA DE LOS DOLORES CAMPOS ECHEVERRIA BIOLOGA MARGARITA REYES SANTOS DETERMINACION DE LA EFECTIVIDAD DE UN ANTISEPTICO (DIGLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 0.2%) PARA SU USO EN LA PREVENCION DE MASTITIS EN GANADO BOVINO. 62 2010 I DEDICATORIAS Doy Gracias a Dios por haberme permitido concluir mis estudios. El es mi pastor y mi fortaleza Salmo 17, 22 Con amor a mi hijo Mario Porque es el motivo de mi superación A mis padres Juan y Gabriela por su comprensión, amor, paciencia y colaboración que me dieron en los momentos que más los necesite para cumplir mis anhelos. A mis hermanos Lino José qepd, Victor, Juan, Mónica, Pilar y Fernando por su cariño que recibo día con día A mis sobrinos Gaby, Diana, Jovan, Hugo, Omar, Karla, Melissa, Dulce, Mariana, Fernando, Alexia, Monserrat, Juan, Oswaldo y Cristopher A la memoria de mi tía Benita Ayala gracias a su gran apoyo porque aunque no está conmigo su presencia espiritual me colma de bendiciones para seguir adelante en la realización de mis metas. A la memoria de mi abuelita Genoveva su presencia espiritual me colma de su gran cariño y amor para continuar adelante. A mi tía Lupita Elizalde por la fe que tuvo en mí para que finalizara mis estudios. II A todos mis tíos y primos con quien compartí muchos momentos agradables y me apoyaron cuando más lo necesite. A mis compañeros y compañeras, amigos y amigas con quien compartí alegrías y tristezas. Muy en especial a mis amigas (os) Laura, Ahime, Alejandrina, Rosario, Araceli, Abel, Tomas, Francisco, Fernando, Ricardo por su cariño, confianza, comprensión, y ayuda ya que fueron un motivo especial en mi vida para ver cumplidos mis anhelos. III AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional Autónoma de México por permitirme desarrollarme académicamente con los mejores maestros altamente capacitados. Por otorgarme, las mejores experiencias académicas, culturales y sociales. A la QFB Isaura Luisa Carrera García con especial admiración y agradecimiento por haber aportado sus valiosos conocimientos, porque sin su ayuda y comprensión no se hubiera podido realizar este trabajo. A la M en C Aída Navas Pérez con mucho cariño y gratitud por su valiosa colaboración y confianza que tuvo para la realización de este trabajo. Al Ing. Juan Angel Andonegui Luna por brindarme su apoyo y colaboración para realizar este trabajo. A la Bióloga Margarita Reyes Santos por brindarme su amistad, su compresión y ayuda en los momentos difíciles. A mis asesores Con admiración e infinito agradecimiento por su valioso tiempo que dedicaron para lograr la terminación de este trabajo. A José Quintana Hdez por apoyarme durante mi estancia en la facultad y por todos los momentos que pasamos juntos. IV A Alejandro Bustamante por la valiosa ayuda que me proporcionó cundo más lo necesite. A Jorge Flores por la amistad y ayuda que me brindo durante mi estancia en la facultad. A todas aquellas personas que de una u otra forma colaboraron en la realización de este trabajo. Hay dos maneras de vivir la vida: una como si nada es un milagro, y otra como si todo es un milagro. Albert Einstein. Al universo por conspirar…. Y a ti por estar leyendo …… Gracias V INDICE 1. Resumen…………………………………………………………………………….…... 1 2. Introducción…………………………………………………………………………….. 2 3. Objetivos..……………………………………….……………………………….............. 4 4. Marco Histórico…………………………………………….…………………………….. 5 5. Generalidades.……………………………………….………………………………..…. 6 5.1 Historia y evolución de los antisépticos. 5.2 Principales grupos de agentes químicos. 5.3 Clasificación de los antisépticos (Tabla 1)……………………………………………... 13 5. 4 Mecanismos de acción de los antisépticos (Tabla 2)…………………………….……... 14 6. Prevención y control de la mastitis bovina…………………………………………......... 16 6.1 Clasificación de la mastitis. 6.2 Principales agentes responsables de la mastitis. 6.3 Patógenos frecuentes en la mastitis. 7. Composición y formulación del digluconato de clorhexidina……………………………. 24 7.1 Mecanismos de acción. 7.2 Resumen de los mecanismos de acción de la clorhexidina (Tabla 3)…………………… 26 7.3 Cuadro comparativo de antisépticos (Tabla 4)……………………………….………….. 27 8. Normatividad……………………………………………………………………...…….. 28 8.1 Fundamento de la Norma…………………………………………………………………29 9. Método …………………………………………………………………………………... 30 9.1 Preparación de medios de cultivo 9.2 Preparación de la suspensión del microorganismo. 9.3 Ajuste de la suspensión del microorganismo. 9.4 Determinación de la cuenta viable inicial. 9.5 Preparación de la muestra del antiséptico. VI 10. Cuadro comparativo con las modificaciones la norma……………………………… 33 10.1 Figura No.4 conservación de los microorganismos de prueba……………………….. 34 10.2 Figura No.5 procedimiento del trabajo experimental………………………………… 35 11. Resultados …………………………………………………………………………….... 36 Tablas No. 6, 7 y 8. Gráficas No. 1, 2, 3, 4, 5, y 6 12. Discusión.......................................................................................................................... 46 13. Conclusiones..................................................................................................................... 46 14. Referencias bibliográficas…………………………………….………………………… 48 15. Apéndice I. Reactivos………………………………………………………………….... 52 16. Apéndice II. Medios de cultivo…………………………….…………………………… 52 17. Apéndice III. Soluciones………………………………………………………………... 53 18. Apéndice IV. Equipo e instrumentos………………………………………………........ 53 19. apéndice V Preparación de soluciones……………………………...………………….. 54 1 Resumen En este trabajo se realizó un estudio sobre la efectividad del antiséptico digluconato de clorhexidina al 0.2% con los diferentes microorganismos patógenos que causan la mastitis en el ganado bovino, los estudios se hicieron de acuerdo al procedimiento establecido en la norma NMX-BB-040-SCFI-1999. Adicionalmente se trabajó con cuatro microorganismos que no contempla la norma pero también causan mastitis, como son Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus uberis y Streptococcusagalactiae, para los dos últimos microorganismos y poder hacer los estudios correspondientes se hicieron algunas modificaciones a la norma. Los resultados que se obtuvieron después de la aplicación del antiséptico a nivel laboratorio, permiten concluir que la eficacia del antiséptico fue óptima ya que el porcentaje de reducción fue del 99.9999 por ciento para los microorganismos, y para Streptococcus agalactiae el porcentaje de reducción fue de 99.999 por ciento, considerando la modificación realizada. 2 DETERMINACIÓN DE LA EFECTIVIDAD DE UN ANTISÉPTICO (DIGLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 0.2%) PARA SU USO EN LA PREVENCIÓN DE MASTITIS EN GANADO BOVINO. INTRODUCCIÓN Debido a la necesidad de eliminar los diferentes tipos de microorganismos que afectan la salud y el bienestar de los seres vivos, en los últimos años el uso de los antisépticos se ha ido perfeccionando y, por lo tanto, se ha extendido en diferentes campos de trabajo. Los productos antisépticos son agentes germicidas que pueden ser utilizados sobre la piel o tejidos para inhibir o eliminar el crecimiento de microorganismos. El objetivo del uso de los antisépticos es prevenir las infecciones. Su acción consiste en la eliminación o inhibición de la flora microbiana, en general tienen una composición química definida y una concentración que permite su aplicación en forma segura sobre la piel y mucosas. En el campo veterinario y en particular en el ganado bovino se han utilizado este tipo de compuestos para evitar y controlar la mastitis ya que aproximadamente el 95% de los casos son causados por microorganismos. Esta enfermedad se caracteriza por la inflamación de la glándula mamaria, dolor, enrojecimiento e hinchazón de las ubres y pezones. Es reconocida como una de las patologías más frecuentes y costosas de la ganadería lechera pudiendo afectar a todo el hato. Las consecuencias de esta enfermedad pueden ser: - Disminución en la producción de leche. - Desaprovechamiento de la leche. - Gastos por medicamentos. - Gastos por el reemplazo de animales. - Riesgo en la salud del consumidor por ingerir leche contaminada. El objetivo principal debe ser evitar y controlar este tipo de infecciones en el ganado bovino poniendo especial atención en todo el proceso de ordeña, ya que las vacas pueden ser contagiadas e infectadas por los mismos operarios si no se tiene un buen control de la asepsia, tanto en el material que se va a utilizar para el ordeño así como en el lavado y sanitización de manos. En esta investigación se trabajó con el digluconato de clorhexidina al 0.2%, un antiséptico que además ha sido ampliamente utilizado en la antisepsia preoperatoria tanto en el humano, como en el campo veterinario. La ventaja de la clorhexidina es que tiene un efecto irritante menor que otros antisépticos, su mecanismo de acción es por ruptura de la membrana celular y precipitación del citoplasma del 3 microorganismo. Su acción empieza a partir de estar en contacto con el microorganismo y a los 30 segundos presenta una reducción del 99.9999 por ciento, y la duración de su efecto antiséptico es de seis horas. Es eficaz tanto contra las bacterias gram positivas, como las gram negativas. En este trabajo se estudia la efectividad de la clorhexidina de acuerdo con las especificaciones de la norma NMX-BB-040-SCFI-1999, utilizando cepas de Staphylococcus aureus y Escherichia coli; además se prueba la efectividad del antiséptico frente a otros microorganismos que se han reportado presentes en diversos tipos de mastitis, en particular con cepas de Klebsiella pneumoniae, y Pseudomonas aeruginosa. Además por su incidencia en los cuadros de mastitis se incluyeron dos microorganismos adicionales: Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae. Para trabajar con estos dos últimos microorganismos fue necesario hacer algunas modificaciones al procedimiento establecido de la norma; éstas fueron: - El periodo de incubación de Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae, se fijó en 48 horas en lugar de 24 horas ya que su desarrollo es más lento. - Se utilizó agar gelosa sangre en tubos inclinados con 12 mL para la siembra, y en las placas en lugar de agar para métodos estándar durante la prueba, ya que estos microorganismos requieren de este tipo de sustrato para su óptimo desarrollo. - La concentración del inóculo en el caso de Streptococcus agalactiae fue 107 UFC/mL debido a las dificultades de desarrollo de este microorganismo. (13, 19, 22) 4 OBJETIVOS: - Probar la efectividad del antiséptico digluconato de clorhexidina al 0.2% utilizando los microorganismos establecidos por la norma NMX-BB-040-SCFI-1999. - Desarrollar la metodología de la norma mexicana con los microorganismos Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae y Streptococcus uberis, microorganismos más frecuentes en la mastitis. - Establecer la metodología de control del producto germicida de acuerdo con la norma NMX- BB-040-SCFI-1999. 5 MARCO HISTÓRICO. Desde mediados del siglo XIX, con los descubrimientos de Ignaz Philipp Semmelweis y Joseph Lister, se inició una nueva era en la cirugía marcada por la utilización de antisépticos que logran reducir la mortalidad asociada con los procedimientos quirúrgicos por la disminución de sus complicaciones sépticas. Semmelweiss observó y demostró experimentalmente que los médicos transmitían enfermedades al estar en contacto con cadáveres o individuos infectados y posteriormente con personas sanas, por lo cual recomendó el lavado preoperatorio como medida de prevención. En la misma época, Pasteur descubrió la existencia de microorganismos a través de sus estudios sobre la fermentación de azúcares. Por otra parte, Tyndall demostró que las partículas que flotan en el aire contienen microorganismos. Lister en 1864, basado en los estudios de Pasteur y Tyndall, demostró que el aire atmosférico era el causante de la putrefacción de las heridas y que por lo tanto, debía ser filtrado para eliminar los gérmenes. Esta demostración constituye la definición básica del método antiséptico. Posteriormente realizó estudios sobre la cicatrización de heridas sin putrefacción con la aplicación del ácido fénico. Más tarde (1867) utilizó este método en intervenciones quirúrgicas, lavando la herida, manos e instrumentos con ácido fénico. En 1875, el método de Lister fue adoptado en todo el mundo, sin embargo, este método antiséptico resultó irritante para la piel y mucosas tanto para el cirujano como para el enfermo, hasta que el ácido fénico se sustituyó por el yodoformo (1878), menos irritante. La medicina reconoce en la actualidad la existencia de numerosas variables que evitan la aparición de infecciones en las heridas quirúrgicas. Los patógenos que comúnmente colonizan las heridas de procedimientos dermatológicos (incluyendo tratamiento con láser) son: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Pseudomonas aeruginosa; en raras ocasiones se puede presentar la infección por otras bacterias, hongos virus y parásitos. Los antisépticos son de gran utilidad ya que tienen efectividad para reducir la cantidad de microorganismos presentes en la piel, en la boca en el ambiente etc. Así como son de utilidad en el tratamiento de padecimientos no quirúrgicos, como el eccema de las enfermedades agudas, las úlceras crónicas y la curación de heridas. (11, 23, 41) 6 Antiséptico: Un antiséptico se define como una sustancia antimicrobiana de acción rápida. Su objetivo es eliminar o destruir los microorganismos presentes sobre la piel sin alterar las estructuras sobre las que se aplica. Es un coadyuvante de los mecanismos de defensa de la piel, ya sea eliminando losmicroorganismos (acción bactericida) o evitando su multiplicación (acción bacteriostática). El antiséptico ideal tendría un amplio espectro, una acción de inicio rápido y de larga duración. Los antisépticos se pueden utilizar sobre la piel en las preparaciones preoperatorias, en la prevención de infecciones o como complemento de algún tratamiento antibiótico, también son denominados germicidas. (13, 22) Principales grupos de agentes químicos antimicrobianos. Los principales agentes químicos antimicrobianos se agrupan de acuerdo con su composición y propiedades químicas ver Tabla 1. (25, 34) Fenol y compuestos fenólicos: El fenol (ácido fénico) tiene la doble distinción de haber sido utilizado por Lister en la década de 1860 en su trabajo para desarrollar técnicas quirúrgicas asépticas y de haber sido utilizado como el patrón de comparación para evaluar la acción germicida de otros antisépticos. Este tipo de compuestos actúa dañando la membrana celular y posteriormente desnaturalizando las proteínas de las células. Los compuestos fenólicos son bactericidas o bacteriostáticos dependiendo de la concentración en la que se usen. Entre los derivados fenólicos que se utilizan en la actualidad se encuentran el clorocresol, cuya concentración óptima es de 0.1 a 0.3% y se encuentra en combinación con hexamidina, clorhexidina y el triclosán, bacteriostáticos ampliamente utilizados con concentraciones óptimas de 1 a 2%. Sin embargo puede producir dermatitis por contacto. Triclosán. Es un derivado fenólico que actúa produciendo daño en la pared celular de los microorganismos. De amplio espectro bacteriano, con mejor actividad contra microorganismos gram positivos, es absorbido por la piel intacta lo cual determina su persistencia y su rapidez de acción intermedia. Su actividad es mínimamente afectada por la materia orgánica. La concentración de uso habitual es entre 0.3% y 2.0%. (24, 34) 7 Alcoholes: El alcohol etílico CH3 CH2 OH, líquido transparente, volátil, soluble en agua y éter puede absorberse por vía cutánea. La concentración óptima para su efecto antiséptico es de 70% y en concentraciones menores de 50% resulta inactivo. Los alcoholes superiores, propílico, butílico, amílico y otros son más germicidas que el etílico. Su acción antiséptica se basa en la desnaturalización de las proteínas y la disolución de las membranas lipídicas de los microorganismos en presencia de agua. Tienen efecto rápido de corta duración y son bactericidas, incluyendo micobacterias, virucidas y fungicidas. Se encuentran en numerosas preparaciones para lavado de manos preoperatorio y en solución en diferentes concentraciones. (25, 34) Halógenos: El yodo es uno de los agentes germicidas más antiguos y eficaces, es reconocido por la Farmacopea de Estados Unidos desde 1830. El yodo puro es muy poco soluble en agua pero soluble en alcohol y soluciones acuosas de yoduro de sodio o potasio. Este elemento se usa tradicionalmente como agente germicida en la forma conocida como tintura de yodo. Es el más utilizado en dermatología y cirugía por su amplio espectro. También sirve para la desinfección del agua. El yodo es un oxidante potente, produce alteraciones de las enzimas de las cadenas respiratorias y de los ácidos nucleicos en microorganismos susceptibles; actúa contra microorganismos gram positivos y gram negativos, micobacterias, hongos, esporas y virus. Tiene un inicio de acción rápido (aproximadamente 10 segundos). (25, 34) Cloro y compuestos de cloro. Actúan sobre las membranas celulares, desnaturalizan las enzimas microbianas; su acción aumenta de acuerdo con la concentración. Tienen acción contra bacterias gram positivas y negativas, virus y esporas. Se inactivan por presencia de materia orgánica (pus, sangre). El cloro ya sea como gas o en ciertas combinaciones químicas es uno de los desinfectantes de uso más común. El gas comprimido se emplea de manera universal para la purificación de los suministros de agua potable. El compuesto más utilizado es el hipoclorito de sodio en concentraciones de 0.06 a 0.5%; su uso se limita únicamente como desinfectante por su efecto irritante y cáustico. 8 Clorhexidina.- Su acción está dirigida a la membrana celular y precipitación del citoplasma. Actúa sobre microorganismos gram positivos y gram negativos, no tiene acción sobre el bacilo tuberculoso, actúa poco sobre hongos. Su acción antiviral incluye VIH, herpes e influenza. Su uso es seguro, incluso sobre la piel de los recién nacidos, y la absorción a través de la piel es mínima. Las ventajas del uso de clorhexidina son: acción germicida rápida duración prolongada de hasta seis horas después de su aplicación, y poca o nula irritabilidad de la piel y mucosas. (25, 34) Oxidantes no halogenados. Peróxido de hidrógeno. Actúa desnaturalizando las proteínas microbianas. Su efecto es rápido y de corta duración; tiene actividad contra bacterias gram positivas y algunos virus (VIH). Por el desprendimiento de oxígeno produce limpieza mecánica y hemostasia, sin embargo altera el proceso de cicatrización, puede producir irritación y no se debe usar en zonas cercanas a la conjuntiva o con otros antisépticos oxidantes. (25, 34) Metales pesados y sus compuestos. La mayoría de los metales pesados, ya sea solos o en ciertos compuestos, causan daño a los microorganismos. Los más efectivos son el mercurio, plata y cobre. Las sustancias que contienen mercurio y se utilizan como antisépticos son: merbromina, mercurobotol y tiomersal o timerosal; funcionan como bactericidas y fungistáticos suaves y su acción se reduce en presencia de materia orgánica. Los compuestos derivados de la plata son bacteriostáticos, más activos contra microorganismos gram negativos que contra gram positivos. Su mecanismo de acción incluye la inhibición de la replicación del ADN microbiano. Los compuestos de cobre son antisépticos débiles. Funcionan como astringentes y cáusticos, se utilizan en forma de soluciones de sulfato de cobre al 0.1%. El efecto adverso más frecuente es la dermatitis por contacto. El sulfato de zinc es un antiséptico débil, funciona como bacteriostático, tiene acción irritante, astringente y cáustica en concentraciones elevadas. Se utiliza al 0.3% en solución. Este tipo de compuestos actúan contra los microorganismos al combinarse con las proteínas celulares y desnaturalizarlas. Las sales de los metales pesados también precipitan las proteínas, y en concentraciones elevadas estas causan la muerte de las células. (24, 34) 9 Colorantes. Existen dos clases de compuestos colorantes que tienen especial interés como agentes antimicrobianos y son los colorantes del trifenilmetano y algunos derivados de la acridina. Colorantes de trifenilmetano. En esta categoría se incluyen el verde de malaquita, el verde brillante y el cristal violeta, los microorganismos gram positivos son más susceptibles a estos compuestos que los microorganismos gram negativos. El cristal violeta inhibe cocos gram positivos en diluciones de 1:200000 a 1:300000; se necesita una concentración 10 veces mayor para inhibir a Escherichia coli. El verde de malaquita inhibe a Staphylococcus aureus en concentraciones de 1:1000000; mientras que se necesitan concentraciones de 1:30000 para inhibir a Escherichia coli. En general la reacción y la susceptibilidad de los microorganismos a los colorantes tiene gran número de aplicaciones prácticas. Se preparan medios selectivos con concentraciones bajas (alrededor de 1:100000) de colorantes como el cristal violeta, el verde brillante y el verde de malaquita; en estos medios de cultivo sólo crecerán bacterias gram negativas. Estos medios se usan en bacteriología sanitaria donde la detección de Escherichia coli es importante. También se utiliza la susceptibilidad a los colorantes para la identificaciónde bacterias. El mecanismo de acción de los colorantes del trifenilmetano se desconoce, y en cuanto a su acción inhibidora, se sabe que interfiere con los procesos de oxidación celular. (24) Colorante de acridina. Los colorantes derivados de la acridina son la acriflavina y la proflavina, ambos compuestos muestran inhibición selectiva contra las bacterias, son más eficaces contra bacterias gram positivas; actualmente tienen menos aplicaciones que antes de que aparecieran los antibióticos y otros agentes quimioterapéuticos. Se les utiliza en el tratamiento de las quemaduras y heridas, en aplicaciones oftálmicas, así como irrigaciones de la vejiga. Estos colorantes se encuentran en desuso como antisépticos. (24) Detergentes sintéticos. Las sustancias que disminuyen la tensión superficial, o agentes humectantes, empleados principalmente para la limpieza de superficies se llaman detergentes. El jabón es un ejemplo; sin embargo es un detergente muy pobre en aguas duras. Por esta razón se han desarrollado muchos agentes limpiadores modernos más eficaces que el jabón, como los surfactantes o detergentes 10 sintéticos, pues no forman precipitados con las aguas alcalinas o ácidas, ni producen depósitos con los minerales de las aguas duras. Químicamente los detergentes se clasifican en: 1.- Ionizantes, en los que la propiedad del detergente reside en los aniones son llamados “detergentes aniónicos” ejemplo, jabón y lauril sulfato de sodio. Los que ionizan, con la propiedad del detergente que reside en el catión, son “detergentes catiónicos” ejemplo cloruro de cetilpiridinio. 2.- No ionizantes, el valor real de este tipo de jabones ordinarios tienen relación directa con la acción mecánica de eliminar los microorganismos. El agua jabonosa tiene la propiedad de emulsionar y dispersar aceites y polvo, los microorganismos son después atrapados por el jabón y arrastrados por el agua corriente. Se han agregado varias sustancias químicas a los jabones para incrementar su actividad germicida. (25, 34) Compuestos cuaternarios de amonio. En los últimos años, los compuestos de esta categoría han tomado una posición de agentes microbianos. Son compuestos bipolares cuyo polo positivo se une a la superficie celular negativa de los microorganismos, provocando daños irreversibles en la membrana. Por su acción tensoactiva funcionan como detergentes. Tienen mayor actividad sobre los microorganismos gram positivos; funcionan como bacteriostáticos, fungistáticos y tiene acción sobre VIH. Los más usados son: Cloruro de benzalconio, y cloruro de miristalconio. En los últimos años, los compuestos de esta categoría han tomado una posición de agentes antimicrobianos. (25, 34) Ácidos y álcalis. Los microorganismos pueden tolerar hasta cierto límite la acidez o la alcalinidad. Los medios de cultivo para el crecimiento de bacterias se deben ajustar a pH 7, que representa la neutralidad. A los mohos y levaduras les favorecen los medios ligeramente ácidos, pero cambios radicales del pH necesario para su crecimiento dan como resultado el cese del metabolismo y causan la muerte. Los ácidos son sustancias ampliamente utilizadas como conservadores en los productos cosméticos. El ácido bórico es el que tiene más utilidad en dermatología, los ácidos benzoico, acético, láctico y tartárico se usan como conservadores. Su acción antiséptica depende de su 11 carga negativa, son activos contra microorganismos gram negativos y en menor medida contra gram positivos y hongos. Funcionan como bacteriostáticos y fungistáticos. Álcalis, en general los más poderosos son más efectivos contra las bacterias gram negativas y los virus que contra las gram positivas. Las bacterias ácido resistentes son particularmente resistentes a los ácidos. (25, 34) Aldehídos. Son compuestos orgánicos que se forman a través de la oxidación de hidrocarburos por acción de la luz o por combustión incompleta. Los más utilizados son el formaldehído y el glutaraldehído. Poseen un amplio espectro, rápido efecto y acción prolongada. Son bactericidas, virucidas y esporocidas. Sin embargo, por resultar irritantes y producir dermatitis por contacto, en la actualidad únicamente se utilizan como desinfectantes el formaldehído al 4.0% y el glutaraldehído al 2.0%. (25, 34) Toxicidad y otros efectos adversos de la clorhexidina. Después de 30 años de uso se han descrito escasísimas reacciones alérgicas o de irritación de piel y mucosas. No hay evidencias de carcinogénesis. Se absorbe poco por la piel, ni siquiera en quemados o neonatos y no hay evidencia de que esta mínima absorción, si se produce, pueda ser tóxica. A concentraciones altas se han descrito casos de irritaciones conjuntivales o corneales y problemas al utilizarla en la desinfección, pues la concentran hasta más de 100 veces produciendo conjuntivitis. En aplicaciones bucales, se combinan con los cromógenos de la dieta y producen tinción de los dientes. No debe aplicarse sobre Sistema Nervioso Central (SNC), meninges o en oído medio ya que puede llegar a producir sordera (25, 34) Toxicidad y otros efectos adversos de alcoholes. Son líquidos estables pero inflamables, por lo que se deben mantener en recipientes bien cerrados y sin exposición al calor o al sol ya que estos se evaporan y por otro lado también pueden llegar a explotar. La toxicidad se incrementa con el número de carbonos, por lo que no se suelen usar más que el alcohol etílico o el alcohol isopropílico. Las mezclas de estos con la clorhexidina, N-duopropenida y etilsulfato, tienen menor graduación alcohólica, pero siguen siendo inflamables, por lo que se deben dejar secar completamente si se utilizan en antisepsia del campo 12 quirúrgico y se va a utilizar el bisturí eléctrico sobre este. El digluconato de clorhexidina al 0.2% está en base alcohólica. (25, 34) Toxicidad y otros efectos adversos de los Halogenados (yodados). En su utilización como antiséptico, se ha detectado aumento de captación de yodo en recién nacidos (cuyas madres recibieron aplicaciones de este yodóforo en Obstetricia), o en caso de quemados y adultos sanos (en aplicación sobre mucosas). (25, 34) En general el uso de un antiséptico está recomendado para: - Disminuir la colonización de la piel con gérmenes - Lavado de manos en unidades de alto riesgo - Preparación preoperatoria de la piel - Lavado quirúrgico de manos En cuanto a las propiedades de un antiséptico ideal este debe tener: - Amplio espectro de acción - Acción rápida - Efecto prolongado - Baja toxicidad 13 Tabla. 1. Clasificación de los antisépticos con base en su composición y propiedades químicas. (23) Antiséptico Clases Grupo químico Fenol y compuestos fenólicos Hexaclorofeno Triclosán Alcoholes Etílico Isopropílico Halogenados Yodo Clorhexidina Soluciones de yodo Metales pesados y sus compuestos Sustancias que contienen mercurio Compuestos derivados de la plata Compuestos derivados del cobre Colorantes Cristal violeta Acridina Detergentes sintéticos Halofenoles Aniónicos Catiónicos Cloroxilenol Jabones Derivados de amonio cuaternario Compuestos de amonio cuaternarios Cloruro de benzalconio Cloruro de miristalconio Ácidos y álcalis Ácido bórico, benzoico, acético Aldehídos Formaldehído Glutaraldehído 14 Tabla. 2. Mecanismos de acción de los antisépticos (23) Antiséptico Blanco Mecanismo de acción Glutaraldehido Sobre la células ( pared celular o membrana externa ) Rompe las ligaduras de proteínas. EDTA y otros Permeabilizadores Membrana citoplasmática interna En bacterias gram negativas causa disminución de Mg2+ por la formación del complejo.Sales cuaternarias de amonio Causa daño generalizado a la membrana, en particular los fosfolípidos. Clorhexidina En bajas concentraciones afecta la integridad de la membrana. En altas concentraciones causa precipitación del citoplasma. Diaminas Induce la salida de los aminoácidos. p-hidroxi benzoato de metilo (PHMB) Afecta la formación de la membrana lipídica. Fenoles Causa desacoplamiento en las ligaduras Formaldehído Causa rompimiento de ligaduras de proteínas de DNA y RNA Glutaraldehído Macromoléculas Causa rompimiento de proteínas 15 Antiséptico Blanco Mecanismo de acción Continuación Tabla. 2. Acridinas DNA Interacción de moléculas de acridinas entre 2 cadenas de pares de base en DNA. Compuestos de plata Grupos tiol Desnaturaliza las proteínas por interacción con grupos tiol. Halógenos DNA Inhibición de la síntesis de DNA Peróxido de hidrógeno y iones de plata Rompimiento de la cadena de DNA Halógenos Agentes oxidantes Oxidación de grupos tiol a disulfuros, sulfóxidos o disulfóxidos. Peróxidos Peróxido de hidrógeno, forma la actividad de radicales hidroxi (OH) de los grupos tiol. 16 La utilización de antisépticos se ha generalizado y en el área veterinaria su empleo se ha incrementado debido a la necesidad de prevenir y controlar las infecciones. En la tabla 2 se muestra el mecanismo de acción de los antisépticos. La industria lechera sufre pérdidas económicas importantes debido a la infección de la ubre en las diferentes edades y en los diferentes estados del ciclo de lactación en el ganado bovino. (11, 13, 19, 21, 23, 24, 25, 32) Mastitis La mastitis es la inflamación de la glándula mamaria causada por microorganismos y sus toxinas, por traumas físicos como son las caídas, golpes, malos ordeños, presiones indebidas, por cambios climáticos como el calor o frío extremo y por agentes químicos irritantes, como se observa en la figura 1 (3,4,5). En la mayoría de los casos es resultado de la invasión de microorganismos patógenos a través del pezón, donde encuentran condiciones favorables para su desarrollo generando así un proceso inflamatorio en la glándula como mecanismo de defensa, lo que produce alteraciones físicas y químicas que repercuten en la calidad de la leche. La producción de leche de vaca en México tiene una tradición de más de 400 años; Los españoles trajeron los primeros bovinos. A principios del siglo pasado se inicio la importación de bovinos lecheros la que se consolido en los años 40. Entre los años de 1950 a 1970 se integró la industria lechera con la producción de las pasteurizadoras e industrializadoras de productos lácteos (quesos, yoghurt, requesón y mantequilla). La mastitis se da a nivel mundial y en México se presenta como en cualquier otro país del mundo, esta enfermedad es una infección que ocasiona grandes pérdidas a la ganadería productora de leche. En México ocasiona pérdidas de aproximadamente 2,500,000.00 pesos que representa solamente del 20 al 30% de las mastitis clínicas y la otra parte 70 y 80% de pérdida de diciembre de 2008 a enero de 2009, que no representa síntomas externos que son la mastitis subclínicas. Debido a la presencia y frecuencia de los microorganismos que causan los problemas de mastitis, se decidió realizar las pruebas de evaluación de la actividad antiséptica utilizando cepas de estos microorganismos. (27,28,35,37,42,46) 17 Figura 1. Mecanismo de infección de la ubre (36) Una vez que los microorganismos han ingresado al pezón, estos se multiplican rápidamente e invaden el tejido mamario. Las bacterias inicialmente afectan al tejido que cubre los grandes lactoductos transportadores, los colectores y cisternas de la leche, dañando pequeñas áreas del tejido. Después las bacterias penetran a los conductos pequeños y áreas alveolares de las porciones más altas de la glándula, probablemente por multiplicación y corrientes de la leche producidas por el movimiento de las vacas Figura 2. (3,4,5) En las infecciones crónicas el proceso de esta fase puede ser lenta y las bacterias colonizan y dominan las partes bajas de la glándula, en el proceso infeccioso algunas bacterias permanecen en los conductos, otras pueden penetrar por los espacios de recubrimiento proliferando en todo el parénquima glandular. Una vez que las bacterias han conquistado territorialmente el sistema canalicular o las sustancias metabólicas se han liberado, es cuando se considera establecida la fase de inflamación, entonces aparece la mastitis clínica y aumenta el número de leucocitos en la leche ordeñada. En los capilares cercanos, las uniones endoteliales se relajan y las células migran hacia la membrana basal atravesándola por entre las uniones intercelulares por lo que llegan fácilmente a la luz del alvéolo. Millones de células se incorporan a la secreción y van rodeadas de plasma y sus componentes, fibrinógeno que posteriormente se transformará en fibrina la cual se encargará de atrapar células somáticas, leucocitos, bacterias y desechos celulares lo que contribuirá a la formación de coágulos y grumos típicos de la mastitis. (3,4,5) 18 Figura 2. Esquema de la parte interna de la ubre (36) En consecuencia se altera la composición de la leche tanto desde el punto de vista físico como químico y la leche en pocas horas comienza a tornarse acuosa y de aspecto blanquecino. La síntesis de proteínas como la caseína se reduce al igual que la lactosa. Hay presencia de albúmina sérica, inmunoglobulina, cloruro y bicarbonato de sodio que traen como consecuencia inmediata que la leche tome un sabor salado y aumente su pH. La inflamación de los tejidos y la coagulación de la leche en el interior de la glándula traerá como consecuencia que los conductos galactíferos queden obstruidos, lo que posteriormente puede conducir a la proliferación de tejido fibroso que engrosará los ductos, dificultando y haciendo lento el drenaje de la glándula. El oportuno y adecuado tratamiento en este momento para evitar la mastitis provocará que en 72 horas disminuya la reacción inflamatoria lográndose una involución de tejido glandular con marcada disminución de microorganismos patógenos, disminución en el tamaño de los tapones de fibrina que facilitará su evacuación, aunque algunos de ellos permanezcan bloqueando el sistema de los canalículos transportadores. Como consecuencia de lo anterior se producirá una mejoría de la glándula mamaria y aumento en la producción de leche. Cuando el daño de la glándula es extenso y severo, la destrucción del tejido celular glandular llevará a la formación de tejido cicatrizal y a una atrofia terminal. En aquellos casos en los cuales persiste la obstrucción de los conductos, se irá acumulando el material purulento que posteriormente aunque cicatrice seguirá siendo fuente de infección debido a la continua y periódica liberación de bacterias. 19 El interior del conducto del pezón elabora una sustancia de aspecto gomoso que es la queratina, constituida por proteínas y lípidos que le permite una defensa química frente a la bacteria que trata de penetrar al interior del pezón, la queratina bloquea la entrada y el conducto del pezón por lo que también actúa como una barrera física frente a los microorganismos patógenos. El conducto del pezón cuenta con tres mecanismos de defensa que son: - Adsorsion de bacterias - Descamación de las bacterias adheridas a la queratina - Desecación de la luz del canal facilitando así el sellamiento de las superficies queratinizadas. Esta queratina permiteque la bacteria sobreviva adherida a ella por lo que es removida e introducida a la glándula por las cánulas en los tratamientos intramamarios. (4, 7, 8,14, 16, 27, 45, 46) Los signos más característicos de la mastitis son: - Inflamación del cuarto afectado. - Aumento localizado de la temperatura. - Enrojecimiento y dolor, acompañado de cambios en la leche, que afectan su calidad. En gran parte estos cambios son dependientes del tipo de bacteria causante de la enfermedad. Clasificación Subclínica Stapylococcus aureus de la Streptococcus agalactiae mastitis Clínica Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae Streptococcus uberis Pseudomonas aeruginosa Actinomyces pyogenes Enterobacter aerogenes micoplasmas y otros 20 Mastitis clínica.- Se reconocen cuatro formas de mastitis clínica según el curso de la enfermedad y la intensidad de los síntomas como son: Subaguda, aguda, peraguda o crónica. (3,5) Mastitis subclínica.- Generalmente no se distinguen signos externos de enfermedad en el animal afectado y la leche conserva su apariencia normal, es de larga latencia y puede afectar al animal durante toda su vida productiva al no tratarse en forma efectiva y oportuna. Este tipo de mastitis se detecta mediante el análisis de pruebas bacteriológicas de muestras de leche, para detectar en ella el aumento en el número de leucocitos y otros microorganismos invasores. En vacas afectadas durante el periodo de lactancia la infección se manifiesta clínicamente pero tiende a desaparecer por sí sola. (3,5) Mastitis aguda.- Son evidentes y notorios los síntomas de inflamación (ubre agrandada, usualmente caliente y dolorosa) acompañada por una disminución en la producción de leche, que incluso puede llegar hasta la supresión total de la lactancia, se observan alteraciones en la leche como presencia de coágulos o secreciones purulentas; también se acompaña de un ligero aumento en la temperatura corporal. (3,5) Mastitis subaguda.- El estado de salud del animal aparentemente es normal y se manifiesta por una leve disminución en la producción de leche y por aumento en el contenido de células somáticas. (3,5) Mastitis peraguda.- Cuando el desarrollo de la enfermedad es muy rápido e intenso. (3,5) Mastitis crónica.- Cuando la inflamación se prolonga por largo tiempo sin presentar cambios en el estado general del animal, o también cuando se presentan ataques recurrentes con pocos cambios en la composición de la leche. (3,5) 21 Principales agentes responsables de mastitis. Existen principalmente dos grandes grupos de patógenos causantes de la enfermedad: Bacterias contagiosas o autocontagio y bacterias ambientales o contagio del ambiente. a) Autocontagio.- Las bacterias contagiosas son transmitidas desde partes infectados a partes no infectados, o de un animal enfermo a un animal sano, por medio de las manos del operario, paños o trapos de lavado de las ubres, equipo de ordeño, parto, amamantamiento del ternero etc. Estos organismos están bien adaptados para sobrevivir dentro de la ubre y por lo general presentan infecciones subclínicas leves pero de larga duración. Además de persistir en la glándula, también pueden hacerlo en la piel, aparato respiratorio y tracto genitourinario. Las bacterias más comunes son Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae. b) Contagio del ambiente.- Las bacterias ambientales incluyen algunos tipos de estreptococos y el grupo coliforme. Están presentes en el ambiente en el cual se desenvuelve el animal por ejemplo en camas, aguas de mala calidad bacteriológica, heces, suelo, materiales de las plantas etc. También se pueden presentar casos de mastitis producidas por bacterias patógenas no comunes como Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium pyogenes, Nocardia sp, micoplasma, levaduras y hongos. Cuando ocurren estos tipos de infecciones son por lo general esporádicos y afectan solamente a una o a pocas vacas, lo cual no significa que no causen problemas graves. Bacterias frecuentes en la mastitis: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Klebsiella pneumoniae, y Pseudomonas aeruginosa. Staphylococcus aureus.- Infecta y se desarrolla lentamente, provoca la destrucción de los tejidos productores de la leche y del sistema conductor galactífero. Los conductos y tejidos dañados pueden reabrirse por lo que liberan bacterias que colonizan otras áreas dentro de la misma glándula, por lo que el proceso infeccioso tiende a repetirse. La transmisión se realiza durante la faena del ordeño, especialmente el mecánico, a través de las pezoneras que están en íntimo contacto con la glándula infectada y que transportan en las gotas de leche remanentes, bacterias a otras vacas constituyéndose así la fuente de contagio de las vacas sanas. (27) 22 Escherichia coli.- Es una bacteria que se encuentra abundantemente en los excrementos de los animales. Cuando el microorganismo muere libera una endotoxina responsable de los síntomas de la enfermedad. Escherichia coli se multiplica en la leche dentro de la ubre y para que esta multiplicación se detenga debe haber un altísimo recuento de leucocitos (más de 900,000/mL). Ataca por lo general una sola parte, sobretodo los conductos posteriores de la glándula. (27) Streptococcus agalactiae.- Causa del 70 – 75% de los casos de mastitis, es el único patógeno que para lograr su desarrollo y supervivencia necesita permanecer dentro de la ubre, en la leche, por ésta razón es susceptible de ser erradicado. La fuente de la infección es la ubre de las vacas infectadas aunque, cuando no se cumple con las reglas de higiene la contaminación ambiental puede actuar como fuente de infección. La bacteria penetra la glándula aún no desarrollada de los terneros, cuando estos se crían en grupos y tienen contacto con leche proveniente de las vacas infectadas. Al mamar o succionar los pezones entre los mismos terneros el germen puede ser introducido a la glándula en formación, donde puede sobrevivir por un largo periodo. La infección se establece con mayor rapidez en las vacas más viejas y al principio de cada lactación. (6,27) Streptococcus uberis.- Es uno de los microorganismos causales más frecuente, se encuentra sobre la piel de los pezones y la ubre, en el vientre y en los miembros superiores del animal. No se multiplica fácilmente dentro del canal del pezón pero se le encuentra con frecuencia en muestras de leche por sobrevivir cerca de la entrada del pezón como bacteria contaminante. La enfermedad causada por el Streptococcus uberis puede ser de mayor duración que la causada por coliformes y promueve un aumento en el recuento de leucocitos que puede alcanzar un millón o más por mL. La mayoría de los animales con este tipo de mastitis se recuperan por sí mismos. No se presentan cambios importantes en las características físicas de la leche aparte de pequeños grumos que aparecen en la primera ordeña que a continuación desaparecen y no cambian de color ni de consistencia en la leche. (1, 2, 6, 12, 16, 20, 27) Klebsiella pneumoniae.- La principal fuente de este microorganismo lo constituye el suelo y el agua. Ocasiona mastitis subaguda o aguda, a veces con síntomas generales en el animal. El cuarto afectado se seca como consecuencia de la enfermedad, por lo menos por el resto de periodo de 23 lactancia. Se encuentra una alta concentración de esta bacteria cuando se usa como cama el aserrín o restos de madera que contienen corteza de árboles. (27) Pseudomonas aeruginosa.- Esta bacteria se puede encontrar en el suelo, agua contaminada, deposiciones de hombre y animales y en utensilios de ordeño queno hayan sido limpiados correctamente. En los tejidos afectados se forma pus de color verdoso debido a la piocianina, pigmento que produce esta bacteria. Una de las principales formas de contagio se presenta luego de la administración de infusiones intramamarias con jeringas o cánulas contaminadas; también por la falta de higiene en el momento de preparar el pezón para el tratamiento intramamario, sobre todo cuando se utilizan para el secado de los pezones toallas húmedas con las que anteriormente se ha secado algún animal con infección. Produce una fuerte reacción sistémica, inflamación aguda de la glándula y secreción de leche grumosa y de color anormal. Pseudomonas es muy resistente a la mayoría de antibióticos utilizados para el tratamiento de la mastitis. (27) 24 Composición y Formulación de la Clorhexidina (1,1’ hexametilen bis [ 5 - (4 clorofenil) biguanida ] ) digluconato) La clorhexidina es uno de los compuestos que presenta más actividad germicida. Pertenece al grupo químico de las biguanidas (Clorofenilbiguanida). En la figura 3 se muestra la fórmula química. Es un producto incoloro, inodoro y moderada o libremente soluble en agua. La clorhexidina y sus derivados han sido usados como desinfectantes tópicos desde mediados de 1970. Figura. 3. Composición y Formulación de Digluconato de Clorhexidina. (38) Mecanismo de acción. La clorhexidina es absorbida rápidamente por la pared celular de la superficie bacteriana. La absorción se aumenta incrementando el pH, esto es probablemente debido a la mayor ionización sobre la superficie celular en concentraciones bajas (menos de 0.2%) la absorción es seguida por la pérdida rápida e irreversible del contenido citoplasmático. Su acción está determinada por causar daño a la membrana celular y precipitación del citoplasma. Purcher and Daniel J.J. en 1992 mencionan que al observar las fotomicrografías electrónicas indican que el citoplasma se coagula, esto puede ser posiblemente debido a la precipitación de proteínas y de los ácidos nucleicos. 25 Posee un amplio espectro de acción, actúa sobre bacterias gram positivas y gram negativas, no tiene acción sobre el bacilo tuberculoso y poca acción contra hongos. Su acción antiviral incluye VIH, herpes e influenza. Las ventajas del uso de la clorhexidina son la acción antiséptica rápida y su duración prolongada, debido a que esta sustancia tiene gran adhesividad a la piel, tiene un buen índice terapéutico. La rapidez de su acción se clasifica como intermedia y posee alto nivel de persistencia debido a una fuerte afinidad con la piel, por lo que sus efectos antimicrobianos permanecen hasta seis horas después de su uso, mayor efecto que cualquiera de los agentes utilizados para el lavado de manos Presenta un importante efecto acumulativo de modo que su acción antimicrobiana aumenta con su uso periódico. Su uso es seguro incluso en la piel de los recién nacidos y la absorción a través de la piel es mínima. Solo se recomienda no ser utilizado en oído medio y ojos. Su actividad no se ve afectada por la presencia de sangre u otras sustancias orgánicas, sin embargo su acción se puede ver afectada por surfactantes no iónicos o aniones inorgánicos presentes en el agua dura y componentes utilizados en su preparación, razón por la cual su actividad es fórmula dependiente y esto determina las distintas concentraciones de uso. Se han probado concentraciones de 0.2 a 1.0 % de digluconato de clorhexidina como antisépticos de pezones en el ganado bovino, pero se utiliza más frecuentemente al 0.2 por ciento, ya que esta concentración es efectiva y elimina todo tipo de microorganismos que ocasiona la mastitis. Se ha usado en diferentes productos como las cremas dermatológicas, enjuague bucal y desinfectantes usados para la preparación de la piel para procedimientos quirúrgicos. Actualmente la clorhexidina ha sido incorporada en los productos cosméticos como conservador, ya que estos al estar abriéndolos constantemente se pueden contaminar con mayor facilidad, y pueden llegar a producir infección al ser aplicados. (8, 31, 39, 44) 26 Tabla. 3. Resumen de los mecanismos de acción de la Clorhexidina (23) Tipo de microorganismos Mecanismo Esporas bacterianas No es esporocida, pero inhibe la esporulación aunque no la germinación. Micobacterias Micobacteriostático (mecanismo desconocido) pero no micobac- tericida. Otras bacterias no es- poruladas Agente membrana - activo, causa lisis de protoplastos y sero- plastos en altas concentraciones causa precipitación de proteínas y ácidos y ácidos nucleícos. Levaduras Agente membrana - activo, causa lisis en los protoplastos y aper- tura intracelular, en altas concentraciones causa coagulación intracelular. Virus Baja actividad contra muchos virus. Protozoa Estudios en Exophiala castellani han demostrado la actividad rana de la de la de la membrana para trofozoítos y menor para quistes. 27 Tabla. 4. Cuadro comparativo de productos antisépticos de mayor uso (18) Clorhe- xidina Alcohol Povidona yodada Tintura de yodo Triclosán Concentración 0.2 – 4 % 70 - 90 % 7.5 - 10 % 1-2 en 70 % 0.3 - 2 % Espectro amplio amplio amplio amplio regular Acción intermedia rápida intermedia rápida Intermedia Efecto excelente mínimo mínimo mínimo Excelente Persistencia alta no posee intermedia intermedia alta Irritación baja alta alta alta baja Toxicidad no para la piel reacciones alérgicas reacciones alérgicas no Inactivación mínima alta alta intermedia mínimo Observaciones se inactiva con cloro, nitrato o jabón. volátil , sin efecto residual, inflamable se absorbe por las mucosas. No debe usarse en patología tiroidea debe removerse al secarse. no actúa sobre Pseudomonas. 28 Normatividad La norma mexicana NMX-BB-040-SCFI-1999 establece Métodos Generales de Análisis – Determinación de la Actividad Antimicrobiana en Producto Germicidas. La Ley Federal sobre Metrología y Normalización publicó en el Diario Oficial de la Federación el 1º de Julio de 1992, los lineamientos en materia de metrología, normalización, certificación, acreditación y verificación de las normas. En el artículo tercero, apartado décimo de esta Ley se define como Norma Mexicana (NMX): a la que elabore un organismo nacional de normalización, o la Secretaria de Comercio y Fomento Industrial, en los términos de esta Ley, que prevée para un uso común y repetido reglas, especificaciones, atributos, métodos de prueba, directrices, características o prescripciones aplicables a un producto, proceso, instalación, sistemas, actividad, servicio o método de producción u operación, así como aquellas relativas a terminología, simbología, embalaje, marcado o etiquetado.En esta misma Ley en el apartado décimo primero del artículo tercero, se define como Norma Oficial Mexicana (NOM): a toda aquella “regulación técnica de observancia regulatoria expedida por las dependencias competentes, conforme a las finalidades establecidas en el artículo 40” (de esa misma Ley), que establece reglas, especificaciones, atributos , directrices, características o prescripciones aplicables a un producto, proceso, instalación sistema, actividad, servicio o método de producción u operación, así como aquellas relativas a la terminología, embalaje, marcado o etiquetado y las que se refieran a su cumplimiento o aplicación. Una NOM tiene el mismo poder que una Ley. La mayor parte de las Leyes mexicanas incluyen varias NOM, algunas Leyes incluyen muchas de ellas, cada NOM atiende a un tipo específico de actividades. En el caso específico de las NOM relativa a productos, describen todos los reglamentos que son obligatorios en cuanto al uso, manejo, descripción, mantenimiento y garantía, a fin de poder venderse en el mercado mexicano. A diferencia de las NOM, las NMX son voluntarias. Sin embargo, si una NOM hace referencia a una NMX, dicha NMX adquirirá el carácter de obligatoria. En este trabajo se utilizó la norma NMX- BB – 040 – SCFI – 1999. 29 Fundamento de la NOM en el presente trabajo. Para la determinación de la actividad antimicrobiana, se establece oficialmente un solo método; éste se basa en determinar el porcentaje de reducción de un número determinado de microorganismos, cuando éstos se ponen en contacto con una solución germicida, bajo condiciones de pruebas específicas. Las cepas utilizadas para realizar el presente trabajo son: Staphylococcus aureus ATCC 6538 Escherichia coli ATCC 11229 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 Streptococcus uberis ------------------ Streptococcus agalactiae ------------------ A estas dos últimas cepas Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae se verificó la viabilidad en el laboratorio de microbiología del departamento de control analítico de la Facultad de Química de la UNAM, de muestras tomadas directamente de la ubre del ganado bovino de la Ciudad de Cuernavaca Morelos con la colaboración de los MVZ Salvador Ávila, Abner Gutiérrez y Francisco Silva y bajo la supervisión de las QFB Isaura Carrera y María Dolores Campos. 30 MÉTODO Los disolventes y reactivos que se utilizan deben ser grado reactivo, a menos que se indique otra pureza, así como el agua que se va a emplear debe ser recientemente destilada, a menos que se indique otra especificación. Las soluciones deben prepararse de acuerdo a lo indicado en el capítulo de los apartados MGA 0305 Efectividad de preservativos antimicrobianos de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos La norma NMX-BB-040-SCFI-1999 indica utilizar agar para método estándar para la determinación de la cuenta viable inicial de los microorganismos. Así mismo para la preparación de la suspensión de los microorganismos de prueba y establece que: Antes de realizar la prueba, efectuar dos resiembras de cada uno de los microorganismos de prueba e incubar de 20 h a 24 h a una temperatura de 308°K a 310° K (35°C a 37°C). A partir de estos cultivos, resembrar cada uno de los microorganismos de prueba, en tubos de 22 mm x 175 mm que contengan cada uno 12 mL de agar inclinado e incubar en las condiciones señaladas. Remover el crecimiento de cada tubo, con 3 mL de solución salina estéril, transferir el sobrenadante a un tubo de ensayo estéril y continuar diluyendo con la misma solución hasta obtener una suspensión que leída a una longitud de onda de 580 nm, de una lectura entre 1% y 5% de transmitancia. Preparación de los medios de cultivo. Preparar y esterilizar los medios de cultivo de acuerdo con las instrucciones marcadas por el fabricante en la etiqueta del producto. ( ver apéndice). Para el caso del medio de cultivo agar para método estándar con neutralizante, antes de esterilizar, adicionar a un litro del medio de cultivo agar para método estándar, 25 mL de la solución neutralizante concentrada. En este medio se sembraron las muestras que fueron probadas con los microorganismos Staphylococcus aureus y Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae. Se preparó además el medio de cultivo agar gelosa sangre para Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae. En el caso del medio de cultivo agar gelosa sangre, después de esterilizar dejar enfriar entre 45ºC - 50°C y adicionar 5% de sangre de cordero o conejo desfibrinada estéril, girando suavemente el 31 matraz para evitar la formación de burbujas, homogenizar y vaciar en las cajas de Petri conteniendo la muestra a valorar, o en su caso para la resiembra del microorganismo. Preparación de la suspensión del microorganismo de prueba. Conservación de cepas: Todos los microorganismos se resiembran semanalmente en tubos de 16 x 125 mm que contengan 12 mL de agar nutritivo inclinado, se incuban entre 35ºC - 37ºC durante 20 – 24 h los cultivos se conservan en refrigeración. Antes de realizar la prueba se efectúan dos resiembras consecutivas de cada uno de los microorganismos de prueba en medio de cultivo agar nutritivo y se incuban entre 35ºC - 37ºC durante 20 h - 24 h. Sin embargo para Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae se resembraron en tubos que contenían 12 mL de agar gelosa sangre, y se incubaron entre 35°C - 37°C durante 48 h. A partir de estos cultivos, resembrar por duplicado cada uno de los microorganismos de prueba, en tubos que contengan cada uno 12 mL de agar nutritivo y agar gelosa sangre inclinado e incubar en las mismas condiciones antes señaladas, como se observa en la figura 4. Después de la incubación, remover en condiciones asépticas el crecimiento de cada uno de los tubos con 3 mL de solución salina fisiológica estéril y transferir la suspensión de ambos tubos a un tubo de ensayo previamente esterilizado. Para Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae se removieron con 2.5 mL de solución salina en un tubo. El contenido de este tubo se agregó al segundo tubo para resuspenderlo, con la finalidad de concentrarlo más y se tomo la lectura en el espectrofotómetro. Ajuste de la suspensión del microorganismo. De esta suspensión hacer las diluciones necesarias con solución salina fisiológica estéril, para obtener una suspensión que a 580 nm registre 0.13% de transmitancia para Staphylococcus aureus 0.16% para Escherichia coli, 0.33%, para Pseudomonas aeruginosa, 0.22% para Klebsiella pneumoniae, 0.06% para Streptococcus uberis y 0.14% para Streptococcus agalactiae, para los dos últimos microorganismos no se diluyó la suspensión ya que el crecimiento fue escaso. En caso de no obtener esta lectura diluir o concentrar según sea necesario hasta que dé el porcentaje deseado. Utilizar solución salina fisiológica como blanco para hacer el ajuste del espectrofotómetro al 100% de transmitancia. 32 Determinación de la cuenta viable inicial. A un matraz Erlenmeyer que contenga 99 mL de solución amortiguadora de fosfatos diluida (preparación 1.25 mL de la solución amortiguadora 0.25 M en 1000 mL) estéril, transferir 1 mL de la suspensión ajustada del microorganismo de prueba y efectuar las diluciones decimales que sean necesarias en tubos que contengan 9 mL de solución amortiguadora, para obtener placas que contengan cada una entre 25 y 250 colonias. Colocar en cajas petri estériles, por duplicado 1 mL de cada una de las diluciones, se probó a partir de la dilución 106, y agregar a cada placa de 15 a 18 mL de agar para métodos estándar; homogenizar y dejar solidificar, invertir y colocar en la estufa para incubarentre 35ºC - 37º C durante 48 h. Contar las colonias que se desarrollen en cada una de las cajas; se utiliza un contador de colonias marca Darkfield Quebec. Calcular el promedio de las UFC (Unidades Formadoras de Colonias) y multiplicar por el factor de dilución. Una vez establecida la dilución de trabajo adecuada para el inóculo, se trabaja de manera simultánea la determinación de la cuenta viable inicial y la determinación de las UFC de microorganismos sobrevivientes a la acción germicida; a la dilución donde tenga de 75 a 125 x 108 UFC/mL se le denomina suspensión de trabajo. Preparación de la muestra del Antiséptico. El digluconato de clorhexidina al 0.2% (Ubriseptic ) en este trabajo se utilizó sin necesidad de hacer ninguna dilución, de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Como se observa en la figura 5. Inoculación de la muestra: Para cada uno de los microorganismos de prueba, medir exactamente y por duplicado 99 mL del antiséptico digluconato de clorhexidina al 0.2% y transferir a matraces Erlenmeyer de 250 mL estériles con tapón de rosca. Inocular 1 mL de la suspensión de trabajo del microorganismo en el matraz que contiene los 99 mL de la muestra, agitar manualmente y exactamente después de 30 segundos; transferir 1mL a un tubo de ensayo que contenga 9 mL de solución neutralizante diluida, agitar durante 10 segundos y transferir por cuadriplicado 1 mL a cajas de Petri estériles, y continuar diluyendo 1 mL de esta solución de trabajo a un tubo que contiene 9 mL de caldo neutralizante. 33 Transferir por duplicado 1 mL en cajas de Petri estériles y continuar haciendo este mismo procedimiento hasta tener las diluciones necesarias para obtener placas que contengan de 75 a 125 UFC/mL. Agregar a cada placa de 15 a 18 mL del medio agar para métodos estándar con neutralizante, homogenizar y dejar que solidifiquen las placas. Incubar las placas invertidas durante 48 horas entre 35º - 37ºC. Después del período de incubación, con la ayuda de un contador de colonias, contar el número de UFC presentes en las cajas de Petri, y proceder a hacer los cálculos. Tabla. 5. Resumen de modificaciones realizadas a la norma NMX-BB-040-SCFI-1999 en este trabajo, para realizar la prueba con los microorganismos Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae. (20, 21, 30, 31, 32) NMX-BB-040-SCFI-1999 MODIFICACIONES Medios de cultivo Agar para método estándar Agar gelosa sangre Tiempo de incubación en los tubos para el inoculo. 24 horas para el crecimiento del microorganismo 48 horas para el crecimiento del microorganismo Periodo de resiembra para conservación 10 días 10 días Resiembra en tubos inclinados 12 mL agar nutritivo 12 mL agar gelosa sangre Suspensión microorganismos con sol. salina fisiológica 3.0 mL 2.5 mL Concentración de UFC/mL 75 a 125 x 108 75 a 125 x 107 para Streptococcus agalactiae 34 Preparación de la conservación para cada uno de los microorganismos de prueba (resiembra semanal) Obtención de la suspensión de prueba de cada uno de los microorganismos. Figura 4. Representación esquemática para la conservación de c/u de los microorganismos de prueba para verificar la viabilidad de: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus uberis, y Streptococcus agalactiae. 35 Figura 5. a) Procedimiento del trabajo experimental para probar la efectividad del Digluconato de Clorhexidina al 0.2% para c/u de los microorganismos: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae. b) Procedimiento para obtener las UFC/mL que marca la NOM NMX-BB-040-SCFI-1999. PREPARACION DE MUESTRA EXPERIMENTAL a) Preparacion de microorganismos de prueba. 3ml saludon Salina isotónica b) 6ml de ¡nócula concentrado en SSF 1 mi Ajus tar 0.5% deT A gar para metodo estánda r co n sol. Neutra li zante 1 O -~n icroorgani smos 1.0ml 3 1.0 mI 3 99m l Digluconato de Clorhexidina 0.2% I mi 9ml 1.0ml 3 1.0 ml 3 de sol ucion neutra lizante Incuba r a 3 5 oC po r 4 8 hrs CUA N TIF IC A C IO N D E POBLAC ION IN IC IAL I mI 1 m i 1 m I 1 m i 1 mi ~?00~0;o' 10 -2 Q 99 mi de sol amort iguadora de fos fatos diluida ( A FD) U U U 9ml AFD 9ml AFD 9ml AFD 9 m i 9 mi 9 mI A FD AFD A FD ~ I m i l mi ~ I m i 1:::::::J-1 j I I 75 a 125 U FC / ml sembrar po r dup licado y agreg ar Agar para m éto dos e stándar -I.-' ncubar a 35 0 durante 4 8 hrs 36 RESULTADOS La determinación de la efectividad antiséptica del digluconato de clorhexidina al 0.2%, utilizando la metodología indicada en la norma se realizó por triplicado (3 repeticiones), llegando a la concentración que se señala en la norma de 75 a 125 x 108 UFC/mL con los siguientes microorganismos: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, ver tabla 6 y en las gráficas 1 y 2 se observa la acción del antiséptico, cuenta viable inicial y cuenta viable final. Pseudomonas aeruginosa, y para Klebsiella pneumoniae, solo se realizó 2 veces por falta de tiempo (periodo vacacional), ver tabla 7. En las gráficas 3 y 4 se observa la acción del antiséptico de la cuenta viable inicial a la cuenta viable final. Streptococcus uberis; y en el caso de Streptococcus agalactiae, no fue posible obtener la concentración de trabajo de 75 a 125 x 108 UFC/ mL indicada en la norma, debido a las exigencias para el crecimiento del microorganismo, y solo se obtuvo la concentración de 75 a 125 x 107 UFC/mL. ver tabla 8 en las gráficas 5 y 6 se observa la acción del antiséptico de la cuenta viable inicial a la cuenta viable final. En la realización de este trabajo se hicieron algunas modificaciones a la norma (como se menciona en la tabla 5) para los dos últimos microorganismos Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae ya que estos microorganismos son hemolíticos y requieren de sangre para su óptimo desarrollo, su periodo de incubación fue más largo (48h), ya que en el periodo de 24 horas para la preparación del inóculo no se podía observar el crecimiento. Un producto etiquetado como germicida, debe tener un por ciento de reducción de la cuenta viable de 99.9999% en 30 segundos de contacto a la concentración de uso recomendada, cuando la cuenta viable inicial se encuentra entre 75 y 125 X 108 UFC/mL Determinación del % de reducción Se calculó de la siguiente manera: Se promedia los resultados de las placas de la cuenta viable inicial de los microorganismos sobrevivientes y se calcula el % de reducción mediante la siguiente fórmula: % de reducción = 100 – (S x 100) C.V. Donde: S = Son los microorganismos sobrevivientes UFC/mL C. V. Es la cuenta viable inicial. 37 Tabla 6. Muestra los resultados de las pruebas realizadas con los microorganismos Staphylococcus aureus y Escherichia coli antes (cuenta viable inicial) y después (cuenta viable final) de la aplicación del antiséptico Digluconato de clorhexidina al 0.2% en la cual se observa el porcentaje de reducción. MICROORGANISMOS % T. CUENTA VIABLE INICIAL (C.V.) UFC/mL CUENTA VIABLE FINAL (S) UFC/mL DETERMINACION DEL % DE REDUCCION Staphylococcus aureus ATCC 65389 0.12 % 78 x 108 3 x 103 99.9999% 0.18 % 76 x 108 5 x 103 99.9999 % 0.11 % 78 x 108 3 x 103 99.9999 % Promedio 77 x 108 4 x 103 Escherichia coli ATCC 11229 0.11% 100 x 108 2 x 103 99.9999 % 0.21 % 84 x108 3 x 103 99.9999 % 0.17% 98 x 108 3 x 103 99.9999 % Promedio 94 x 108 3 x 103 (%T) porcentaje de transmitancia. 38 Gráfica 1 Representa la reducción de la concentraciónde Staphylococcus aureus después del contacto con el antiséptico digluconato de clorhexidina durante 30 segundos. 39 Grafica 2. Representa la reducción de la concentración de Escherichia coli después del contacto con el antiséptico digluconato de clorhexidina durante 30 segundos. C.V.I. Cuenta Viable Inicial 40 Tabla 7. Muestra los resultados de las pruebas realizadas con los microorganismos Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae antes (cuenta viable inicial) y después (cuenta viable final) de la aplicación del antiséptico Digluconato de clorhexidina al 0.2% en la cual se observa el porcentaje de reducción. (% T) porcentaje de transmitancia. MICROORGANISMOS % T CUENTA VIABLE FINAL (C.V) (UFC/mL) CUENTA VIABLE FINAL (S) (UFC/mL) % DE REDUCCION Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 0.31% 85 x 108 0 99.9999 % 0.39% 78 x 108 0 99.9999 % 0.29% 86 x 108 1 x 103 99.9999% Promedio 83 x 108 1 x 103 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 0.21% 88 x 108 0 99.9999% 0.22% 81 x 108 1 x 103 99.9999% Promedio 85 x 108 1 x 103 41 Gráfica 3. Representa la reducción de la concentración de Pseudomonas aeruginosa después del contacto con el antiséptico digluconato de clorhexidina durante 30 segundos. 42 Gráfica 4. Representa la reducción de la concentración de Klebsiella pneumoniae después del contacto con el antiséptico digluconato de clorhexidina durante 30 segundos. 43 Tabla 8. Muestra los resultados de las pruebas realizadas con los microorganismos Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae antes (cuenta viable inicial) y después (cuenta viable final) de la aplicación del antiséptico Digluconato de clorhexidina 0.2% en la cual se observa el porcentaje de reducción. MICROORGANISMO % T CUENTA VIABLE INICIAL (C.V) UFC/mL CUENTA VIABLE FINAL (S) UFC/mL DETERMINACION DEL % DE REDUCCION Streptococcus uberis 0.06% 83 x 108 2 x 103 99.9999% 0.07% 76 x 108 3 x 103 99.9999% 0.06% 79 x 108 1 x 103 99.9999% Promedio 79 x 108 2 x 103 Streptococcus Agalactiae 0.16% 206 x 107 0 99.999% 0.11% 255 x 107 3 x 103 99.999% 0.15% 195 x 107 1 x 103 99.999% Promedio 219 x 107 2 x 103 (% T) porcentaje de transmitancia. 44 Gráfica 5. Representa la reducción de la concentración de Streptococcus uberis después del contacto con el antiséptico digluconato de clorhexidina durante 30 segundos. C.V.I. Cuenta Viable Inicial 45 Gráfica 6. Representa la reducción de la concentración de Streptococcus agalactiae después del contacto con el antiséptico digluconato de clorhexidina durante 30 seguundos. 46 DISCUSIÓN De acuerdo con los resultados registrados en las tablas 6, 7 y 8 se observa la cuantificación de reducción de los microorganismos que hubo después de la aplicación del antiséptico digluconato de clorhexidina al 0.2% con un tiempo de contacto de 30 segundos. El porcentaje de reducción fue del 99.9999%. Para el microorganismo Streptococcus agalactiae el porcentaje de reducción fue de 99.999% considerando la concentración del microorganismo que se trabajo que fue una dilución menor 107, aún así se puede considerar que es un antiséptico muy efectivo sobre las bacterias que causan la mastitis en el ganado bovino. Esta prueba establecida por la norma NMX- BB- 040-SCFI-1999, ésta diseñada estadísticamente para poder contar y demostrar la reducción del número de microorganismos viables, como se observa en las gráficas, debido a la acción del antiséptico que se evalúa, ya que desde el momento que entra en contacto con los microorganismos empieza a actuar y por lo tanto a eliminarlos durante los primeros 30 segundos que es lo establecido por la norma, lo que indica que el antiséptico a probar resulto muy efectivo. CONCLUSIÓN Los resultados demostraron que el antiséptico digluconato de clorhexidina al 0.2% tiene un efecto positivo de reducción del 99.9999% sobre la viabilidad de los diferentes tipos de microorganismos que se utilizaron en este trabajo y que causan la mastitis, a la concentración indicada por el proveedor, sin diluir. El número de bacterias se puede estimar en función de la concentración celular (número de unidades formadoras de colonias por unidad de volumen). Esto hizo posible evaluar la eficacia del antiséptico por medio de ensayos in vitro, ya que se realizó en el laboratorio, controlando todas las variables posibles: como la asepsia, la temperatura, periodo de incubación, medios de cultivo, esterilidad del material, así como la concentración óptima tanto de la suspensión del microorganismo como del antiséptico a evaluar, siguiendo estrictamente las condiciones especificadas de la norma NMX-BB-040- SCFI-1999. Las modificaciones que se hicieron a la norma fueron de gran utilidad para poder realizar el trabajo en los microorganismos Streptococcus uberis y Streptococcus agalactiae, en cuanto a lograr su óptimo desarrollo, para emplearlas en las pruebas realizadas para evaluar la eficacia del antiséptico. 47 El amplio espectro de eficacia que tiene este antiséptico lo hace ideal para usarse en la prevención de la mastitis, ya que la rapidez con la que actúa es de gran ventaja para que se obtenga buena producción de leche tanto en calidad como en cantidad. Además su acción prolongada permanece hasta por seis horas después de su aplicación. 48 BIBLIOGRAFÍA 1. Almeida R.A. y Oliver S.P. 1993. Antiphagocytic effects of the capsule of Streptococcus uberis. J. Vet. Med. B, 40,707-714 2. Almeida R.A. y Oliver S. P. 1993. Growth curve, capsule expresión and characterizacion of the capsular materiel of selected strains of Streptococcus uberis. J Vet. Med. B, 40, 697 - 706 3. Ávila T. S. 2002. 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