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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIOES IZTACALA CARRERA DE BIOLOGIA Efecto del acigigib sobre el agrietamiento y la calidad del fruto de la granada roja cv. Apaseo tardia (Punica granatum) TESIS QUE PARA OBTENER EL TITULO DE BIOLOGO PRESENTA: Escudero Melo Yadira Elizabeth DIRECTOR DE TESIS: M. en C. Ismael Aguilar Ayala Margarita Texto escrito a máquina Los Reyes, Iztacala, Estado de México 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. A G R A D E C I M I E N T O S En primera instancia me agradeceré a mi director de tesis Ismael Aguilar Ayala por su tiempo y paciencia incondicional durante esta investigación, además de su compañía en cada una de las visitas a la huerta y por compartir conmigo una gran parte de sus conocimientos. De la misma manera es de vital importancia agradecer a los señores Antonio y Francisco Pérez García, debido a la oportunidad brindada por ellos para realizar la investigación en su huerta y también por la información brindada respecto a la misma. Agradezco también al profesor Gerardo Ortiz, Daleth Guedea y laboratoristas del módulo de metodología científica I de la FESI, por facilitarme los reactivos y el material necesario para elaborar las pruebas de calidad de los frutos colectados. En última instancia pero no de menor importancia quiero agradecer a todas aquellas personas que me acompañaron de alguna manera durante la realización de este proyecto de investigación, compañeros, amigos, familiares y en especial a quien estuvo muy presente en la conclusión de esta tesis Irving Cuevas Hernández. D E D I C A T O R I A Quiero dedicar de manera muy especial esta tesis a mi madre Magdalena Melo Lara, quien siempre ha estado a mi lado y que nunca perdió la confianza en mí; sin duda eres tú mi mayor ejemplo a seguir. La especie humana estaba hecha como una especie de pequeño milagro de la bioquímica. Es como si una dijera que la materia es narcisa y quería inventar alguien que la aplaudiera. Porque es divina la conciencia de la materia. Hace los milagros mas increíbles entre insectos y plantas y cosas y todo esto es maravilloso pero, por decirlo así, se queda sin testimonio. Entonces hacer un animal que es testigo y que goza de la divinidad de la materia y de la bioquímica, es la función del cerebro, que estaría hecha para que fuera consciente de todo esto y manifestara esta consciencia como si la naturaleza quisiera que la aplaudiera. Roberto Matta Resumen En México el cultivo de la granada roja (punica Granatum) cultivar Apaseo tardía presenta problemas severos debido al agrietamiento del fruto en un 60-70%, ocasionando pérdidas en la producción, en la calidad del fruto, induciendo enfermedades, concentración estacional. Considerando que el agrietamiento del fruto es uno de los principales problemas para la producción del mismo, en esta investigación se evaluó la aplicación el ácido giberelico con la finalidad de disminuir el porcentaje de agrietamiento del fruto. El presente estudio se realizó en una huerta comercial de granada roja cultivar Apaseo tardía de 8 años de edad ubicada en Ixmiquilpan Hidalgo, se realizó bajo un diseño experimental completamente al azar en donde la unidad fue un árbol de granada roja con 10 frutos y 5 repeticiones; los tratamientos evaluados fueron los siguientes: 0, 50, 100 y 200 mg/l. Se realizaron tres aplicaciones directamente al fruto a punto de goteo la primera fue el 9 de julio, la segunda fue 12 días después y la ultima 14 días después, se evaluaron las siguientes variables número de frutos agrietados y sin agrietar, peso, diámetro, potencial de hidrogeno, ácido ascórbico y solidos solubles totales, los resultados indican que, las concentraciones de 50, 100 y 200 mg/l de ácido giberelico disminuyeron de forma altamente significativa el agrietamiento de los frutos, ya que se encontraron 0 frutos agrietados con respecto al testigo que presento 31 frutos agrietados, mientras que las variables de calidad: peso, diámetro, potencial de hidrogeno, ácido ascórbico; azucares totales y solidos solubles totales, no fueron afectadas por la aplicación de ácido giberelico al no encontrar diferencias estadísticas entre ellas. I N D I C E 1.0 Introducción 1 2.0 Antecedentes 4 2.1 Clasificación y características botánicas de la granada roja 4 2.2 Cultivares y variedades de Granada roja 5 2.2.1 Importancia de la granada roja en México 7 2.2.2 Descripción varietal de cultivares y variedades de granada roja 7 2.3 Usos de la granada roja 10 2.4 Problemática de la granada roja 15 2.4.1 Principales plagas y enfermedades 15 2.4.2 Golpe de sol 16 2.4.3 Deficiencia nutrimental de hierro. Clorosis 16 2.4.4 Agrietamiento del fruto 16 2.5 Principales fitohormonas y reguladores de crecimiento 17 2.5.1 Giberelinas 20 2.5.2 Biosíntesis de giberelinas 21 2.5.3 Función de las giberelinas en las plantas 24 2.5.3.1 Función de las giberelinas en la raíz 24 2.5.3.2 Función de las giberelinas en el tallo 24 2.5.3.3 Función de las giberelinas en el brote 25 2.5.3.4 Función de las giberelinas en las semillas 25 2.5.3.5 Función de las giberelinas en las flores 26 2.5.3.6 Función de las giberelinas en los frutos 26 2.6 La calidad del fruto y sus elementos. 28 Agrietamiento del fruto 28 Tamaño y peso del fruto 29 Azúcares totales 30 Acidez titulable 30 Ácido ascórbico 31 Clorofila A, B y total 31 Solidos solubles totales 31 Antocianinas 32 Potencial de Hidrógeno 33 3.0 Objetivos 34 3.1 General 34 3.2 Particulares 34 4.0 Procedimiento experimental 35 4.1 Descripción del área de estudio 35 4.2 Material experimental 38 4.3 Diseño experimental 39 4.3.1 Factor y nivel de factor 39 4.3.2 Tratamientos 39 4.3.3 Unidad experimental, repeticiones y diseño experimental 39 4.3.4 Aplicación de los tratamientos 40 4.3.5 Variables de estudio o respuesta y técnicas de evaluación 41 Cuantificación de frutos agrietados 41 Tamaño del fruto 41 Peso del fruto 41 Curvas de crecimiento en longitud y diámetro 42 Azúcares totales 42 Acidez titulable 43 Ácido ascórbico 43 Clorofila A, B y total 44 Solidos solubles totales 45 Antocianinas 45 5.0 Resultados y discusión 46 4.1 Cuantificación de frutos agrietados 46 4.2 Tamaño del fruto 52 4.2.1 Tamaño del fruto en diámetro 52 4.2.2 Tamaño del fruto en longitud 54 4.3 Curvas de crecimiento en longitud y diámetro 55 4.4 Masa del fruto 57 4.5 Azúcares totales 604.6 Acidez titulable 63 4.7 Ácido ascórbico 65 4.8 Clorofila A, B y total 67 4.9 Sólidos solubles totales 72 4.10 Antocianinas 75 4.11 Potencial de hidrógeno 77 6.0 Conclusiones 80 7.0 Literatura citada 81 Índice de figuras, gráficas y cuadros. Cuadros Cuadro1. Principales características de algunos cultivares de Granada roja (Punica granatum) 6 Cuadro 2. Actividad antibacterial y antiviral de extractos diferentes partes de la planta de granada roja (Punica grantum) 12 Cuadro 3. Comparación de frutos agrietados y no agrietados 47 Cuadro 4. Efecto del acicigib sobre la cantidad y porcentaje final de frutos agrietados 50 Cuadro 5. Efecto del acicigib sobre el diámetro del fruto de Granada roja (Punica granatum) cultivar Apaseo tardia. 52 Cuadro 6. Efecto del acicigib sobre el tamaño en longitud del fruto de Granada Roja (Punica granatum) cultivar Apaseo tardia 54 Figuras Figura 1. Granada roja (Punica granatum) cultivar Tecozautla 8 Figura 2. Granada roja (Punica granatum) cultivar Apaseo 9 Figura 3. Granada roja (Punica granatum) cultivar Apaseo Tardia 10 Figura 4. Componentes responsables de la actividad antioxidante del fruto de la granada roja (Punica granatum) 13 Figura 5. Usos de la Granada roja (Punica granatum) de acuerdo con Argueta 1994 14 Figura 6. Kaureno, molécula precursora de las giberelinas tomado de Jordan, 2006 21 Figura 7. Biosintesis y terpenoides de Gibberella 22 Figura 8. Biosintesis de Giberelina tomado de Avalos 2000 23 Figura 9. Ubicación del municipio Ixmiquilpan dentro del estado de Hidalgo 36 Figura 10. Localización de la huerta con respecto al Municipio de Ixmiquilpan, Hgo. 37 Figura 11. Satelital de la huerta donde se realizó la investigación. 38 Graficas Grafica 1comparacion del incremento de frutos agrietados tratados con 0, 50, 100 y 200 mg/l de acigigib en frutos de granada roja cultivar Apaseo tardia por muestreo. 48 Grafica 2. Efecto de acigigib sobre el total de frutos agrietados de la granada roja. Apaseo tardia. 49 Grafica 3. Efecto del acigigib sobre la curva de crecimiento en diámetro del fruto de granada roja (Punica granatum) Apaseo tardia 56 Grafica 4. Efecto de acigigib sobre la masa del fruto de granada roja (Punica granatum) cultivar Apaseo Tardia 58 Grafica 5. Efecto de acigigib sobre la concentración de azúcares en el jugo de la granada roja (Punica granatum) cultivar Apaseo Tardia 61 Grafica 6. Efecto de acigigib sobre el porcentaje de acidez en el jugo de la granada roja (Punica granatum) cultivar Apaseo tardia 64 Grafica 7. Efecto de acigigib sobre el porcentaje de acidez en el jugo de la granada rojaPunica granatum) cultivar Apaseo tardia 66 Grafica 8. Efecto de acigigib sobre la cantidad de clorofila a en el pericarpo de la granada roja (Punica granatum) cultivar Apaseo Tardia 68 Grafica 9. Efecto de acigigib sobre la cantidad de clorofila b en el pericarpo de la granada roja (Punica granatum) cultivar Apaseo Tardia 69 Grafica 10. Efecto de acigigib sobre la cantidad de clorofila en el pericarpo de la granada roja (Punica granatum) cultivar Apaseo Tardia 70 Grafica 11. Efecto de acigigib sobre la concentración de solidos solubles totales en el jugo de la granada roja cultivar Apaseo Tardia 72 Grafica 12. Efecto de acigigib sobre el porcentaje de antocianinas en el jugo de la granada roja (Punica granatum) cultivar Apaseo Tardia 76 Grafica 13. Efecto de acigigib sobre el potencial de hidrogeno en el jugo de la granada roja (Punica granatum) Appaseo tardia. 78 1 1. Introducción De acuerdo con la organización de las naciones unidas para la agricultura, la granada roja (Punica granatum.) tiene flores solitarias o reunidas en grupos de 2 a 5 al final de las ramas nuevas, de 3-4 cm, de color rojo, lustrosas, acampanadas, subsentadas, con 5 - 8 pétalos y sépalos, y el cáliz persiste en el fruto. En algunos cultivares las flores son abigarradas e incluso matizadas en blanco; El fruto es una baya su epicarpo es brillante y grueso coriáceo y glóbulos de 10 - 15 cm de diámetro, contiene numerosas semillas, con arilo muy gustoso de color rojo vivo violáceo, su interior está dividido por medio de una membrana blanquecina donde cada receptáculo alberga numerosas semillas de color rosa o rojo de sabor agridulce que recuerda vagamente al de las grosellas. La granada roja fresca es un cultivo muy antiguo, es originaria del medio oriente y de allí se expande a todo el mundo. Su principal característica es que se adapta a tierras bajas en fertilidad y es resistente a la sequía, cuando llega a los 3 ó 4 años comienza su producción llegando a 4000 kg por hectárea. En México la granada es consumida en forma esporádica y estacional, usualmente como fruta fresca y como guarnición de platillos y ensaladas de fiestas patrias (Mercado, 2011), también se elaboran jugos de granada mezclado con otras frutos; por ejemplo con manzana debido al contenido de antioxidantes en ambos; cuenta con amplia adaptación y buena calidad de la fruta en los cultivares Apaseo y Apaseo tardía (Mondragón y Juárez, 2008); sin embargo, es un frutal de poca importancia económica ya que su valor de producción en miles de pesos del 2011 fue de 30,733.36, es decir de 4,050.82 ton, siendo menor que la producción del nanche que fue de 6,159.71 toneladas (Sistema de Información Agrícola y Pesquera, 2011); la baja producción nacional posiblemente esté asociada a una baja demanda, debido a las dificultades involucradas en su consumo como fruto fresco; el cual es difícil de mondar y algunas variedades liberan polifenoles que tiñen las manos o ropa del 2 consumidor (Mercado, 2011) o por el agrietamiento del fruto que de acuerdo con Mondragon es un desorden fisiológico que se inicia con la presencia de grietas que abren el fruto dejando ver los arilos, ocasionando una gradual decoloración de éstos y representando una entrada fácil de hongos, bacterias y plagas. Se cree que el agrietamiento del fruto puede ser ocasionado por tres factores que pueden interactuar para provocar el daño: 1. susceptibilidad varietal, 2. des- balances hídricos entre el fruto en crecimiento y el suelo, ocasionado por lluvias fuertes, o bien por someter a la planta a periodos de sequías prolongados y dar riegos mas allá de capacidad de campo y 3. Por deficiencias de calcio, boro o de potasio (Melgarejo 1992; Hepacksoy, 2000; Mondragón et al 2008). En Guanajuato, Mex se reporta que hasta un 62% de los árboles presentan frutos agrietados, que se venden en las calles sin la higiene adecuada (Juárez, 2009). Las posibles soluciones a este problema podrían ser el uso de sistemas de riego por goteo en donde sea factible de instalarlo para evitar des-balances hídricos, mantener adecuados niveles de fertilización principalmente de calcio, boro y potasio y realizar aplicaciones de fitohormonas principalmente auxinas y giberelinas; tomando en cuenta a acción de estas fitohormonas. En México la mayor parte de la superficie del cultivo de la granada se encuentra establecido bajo condiciones de secano sin embargo existe superficies que disponen de agua para al menostres riegos por año , como es el caso de las huertas ubicadas en Ixmiquilpan Hidalgo y sin embargo, presentan un alto porcentaje de frutos agrietados que oscila entre 60 y70%; considerando que el agrietamiento del fruto de la granada roja puede ser disminuido o tal vez controlado con la aplicación de fitohormonas que produzcan división y elongación celular como es el caso del ácido giberelico. Las giberelinas, son hormonas de crecimiento, su estructura es de un diterpenoide tetra cíclico, involucradas en diferentes procesos de desarrollo en las plantas; su síntesis se detecta en hojas, y yemas para el caso de las plántulas, y en 3 organismos adultos a nivel de frutos (Jordan,2006). Uno de los efectos más notables de la aplicación de esta fitohormona es el crecimiento por elongación celular; de la misma manera se conoce distintos efectos en cada parte de la planta; por ejemplo, la síntesis de estos compuestos puede ser realizada por la raíz (Taiz, 2006), en el caso de las yemas las giberelinas causan un incremento en la tasa de división celular, es decir: mitosis, lo cual provoca aumento en la prolongación de los brotes (Laja, 2001), también estimula la germinación de algunas semillas al igual que promueve el desarrollo de la floración en algunas plantas, particularmente en las de días largos y en algunos casos se asocia con fitocromos con la finalidad de inducir la floración (Lluna, 2006). Para el caso de los frutos, las giberelinas promueven el desarrollo tras la polinización; en algunos casos como el limón en posible demorar la senescencia del fruto con la finalidad de extender su periodo de comercialización (García-Martínez et al., 1977); por otra parte se a observado que las giberelinas son buenas productoras en la fructificación partenocarpica (Lluna, 2006) y por último, en el tallo es donde se encontrado el efecto más notable, ya que induce crecimiento en altura debido a que estimula la división y elongación celular (Jordan, 2000; Lluna,2006). Conocidas estas características es posible pensar que la aplicación de esta fitohormona debido a su capacidad de promover elongación celular, en este punto es donde radica la importancia del problema fisologico de la granada roja, conocido como agrietamiento del fruto y que afecta fuertemente la producción, ya que la aplicación de esta hormona puede disminuir, o incluso controlar el problema, ya que al ser aplicado directamente al pericarpo del fruto, puede promover división y elongación celular y en consecuencia cuando se presente un desbalance hídrico, el agua disponible sea distribuida tanto en las células del pericarpo, como en la de los arilos; considerando lo anterior, el objetivo de esta investigación es evaluar la aplicación del acigigib sobre el agrietamiento y la calidad del fruto de la granada roja Cv. Apaseo tardia. 4 2. Antecedentes 2.1 Clasificación y características botánicas de la grada roja La granada roja (Punica granatum) es una especie perteneciente al Reino Plantae, su división es Magnoliophyta; la clase es Magnoliopsidae, el orden Myrtales y la familia Punicaceae, a la que pertenece el género Púnica; este género solo contiene dos especies, la Punica protopunica y la Punica granatum, que es un árbol caducifolio, con una altura de entre de 3 a 6 m, con tallo semi- leñoso, sus hojas son de color verde brillante, lustrosas por el haz y con el borde entero (Meillon, 2010; Argueta, 1994); por su parte, las flores pueden ser solitarias o reunidas en grupos de 2 a 5, con un tamaño de 3-4 cm, de color rojo, lustrosas, acampanadas, subsentadas, con una cantidad de 5-8 pétalos y sépalos, y el cáliz persiste en el fruto. En algunos cultivares las flores son abigarradas e incluso matizadas en blanco (Meillon, 2010); tras la fecundación de la flor, comienza el desarrollo del ovario ínfero hasta ser una baya que contiene en su interior las semillas o arilos, que es la parte comestible del fruto correspondiente al 55-60 % del mismo, mientras que el epicarpioes alrededor del 40-45 % del fruto; los arilos contienen un 75-85 % de zumo, procedente de la cubierta externa de la semilla y un 15-25 % que sería la semilla propiamente dicha (Serrano, 2010); generalmente tiene 8 carpelos; su epicarpio es brillante y de 10 - 15 cm de diámetro; las membranas carpelares y la corteza representan el 25-42% del peso del fruto. El fruto completo posee aproximadamente un 80% de agua (Meillon, 2010; Melgarejo, 2010). Respecto a su fisiología, la granada es un fruto de baja tasa respiratoria, del tipo no-climatérico, es decir que no madura fuera del árbol ni siquiera mediante tratamientos con etileno y se debe recolectar cuando está totalmente maduro para asegurar un sabor óptimo de modo que las características como sólidos solubles, azúcares totales, acidez, contenido de fenoles y de antocianinas son dependientes de la madurez del fruto (Palou, 2010; Cea, 2011).Durante la maduración del fruto ocurre una serie de cambios bioquímicos en el árbol que conducen a que el fruto alcance una elevada calidad cuando llega a su plena madurez. La madurez implica un 5 aumento en la concentración de azúcares (glucosa y fructosa), una disminución en la acidez (cítrico y málico) y un aumento en la concentración de antocianinas (Serrano, 2010). En frutal que se adapta a tierras bajas en fertilidad, crece y se desarrolla en climas cálido, semi-cálido, semi-seco y templado, asociada a bosques tropicales caducifolio, sub-caducifolio y perennifolio, matorral xerófilo y bosques espinoso, mesófilo de montaña, de encino y de pino habitando desde el nivel del mar hasta los 2200 msnm (Argueta, 1994) cuando su desarrollo llega a los 3 ó 4 años comienza su producción llegando a 4000 kg por hectárea (Meillon, 2010). La granada, se considera uno de los frutos comestibles más antiguos usados por el hombre debido a que los arilos contienen un 80% de zumo, el cual es rico en azúcares, ácidos orgánicos, vitaminas y nutrientes minerales (Valero, 2010); Su origen se encuentra en medio oriente principalmente en Iran, y de allí se expandió a todo el mundo; llegando a Europa y con la con la conquista de América, fue trasladado a la parte occidental del planeta, lo que provocó la búsqueda de una mejor calidad del fruto por parte de los productores. 2.2 Cultivares y variedades de Granada roja Con la finalidad de aumentar la calidad de los frutos, el hombre siempre ha intentado, a lo largo de la historia, seleccionar los mejores organismos, proceso que da como resultado una serie de variedades y cultivares; en el mundo han sido citadas más de 500 variedades de granada roja, lo que da una idea de la riqueza genética existente y, por tanto, de las posibilidades para obtener nuevos individuos que satisfagan la demanda de los diferentes sectores que aprovechan esta fruta. En la actualidad no sólo se pueden seleccionar variedades para su cultivo por sus cualidades organolépticas y de captación gustativa para el consumo en fresco, sino que además hay que seleccionarlas para la industrialización, con fines nutricionales o 6 medicinales entre otros, como ya se hacía desde antiguo en culturas como la hindú (Melgarejo 2010). La diversidad genotípica de la especie es muy grande, pero los estudios de selección y caracterización del material vegetal son muy recientes; la calidad del material vegetal es un problema actual que a sido referenciado desde tiempos antiguos, por ejemplo por Columela (I d.C.), en su libro V: “El granado y sus remedios”, puso de manifiesto la problemática todavía actual sobre el rajado (agrietamiento), la acidez y la dureza de las semillas (Melgarejo 2010). Gracias a este proceso de selección artificial, se han obteniendo entre otras las siguientes variedades: mollar de Valencia, Mollar del Elche, Wonderful y Bedana por citar algunosejemplos, mismas que son descritas en el cuadro número 1. Cultivar Características Cosecha Mollar de Valencia Roja Semilla reducida SST: 13.9-15.5 Acidez: 0.14-0.26 % zumo: 29.3-53.8 Finales de agosto a mediados de septiembre Wonderful Rojo brillante Peso: 200-700 g Productividad: 18000 kg/ha Otoño Mollar del Elche Semilla reducida y blanda SST: 13.4-17.7 Acidez: 0.24-0.35 % zumo: 34.4-40 Octubre Noviembre Bedana Semilla muy reducida Epicarpio marron Arilos rosados Sepulveda, 2000; Mondragon, 2008; Cambayas, 2010; Melgarejo, 2010 Cuadro1. Principales características de algunos cultivares de Granada roja (Punica granatum) 7 2.2.1 Importancia de la granada roja en México En México, la granada roja fue introducida por los españoles después de la conquista junto con otros frutales como el durazno, la manzana, la higuera y la vid. Su cultivo fue promovido en huertas familiares por los frailes que evangelizaron a los grupos indígenas. Estas huertas proveían de fruta fresca para el consumo doméstico y el mercado local (Mondragon et al., 2008) en la actualidad este fruto, solamente se cultiva en los estados de Guanajuato e Hidalgo siendo en Guanajuato un frutal de importancia mínima producido comercialmente en menos de 100 hectáreas, en dos municipios, Apaseo el Alto y Apaseo el Grande. Este último posee una tradición del cultivo de granada que data de más de 60 años. (Mondragon et al., 2008) y es precisamente de estos lugares donde se han obtenido las variedades apaseo y apaseo tardías. 2.2.2 descripción varietal de cultivares y variedades de granada roja de México Con la finalidad de tener una mayor producción de granada roja, en México se han realizado selecciones, buscando adaptación tanto climatológica, como a los suelos; ejemplo de esto son los siguientes cultivares: Cultivar Tecozautla. Originaria de Tecozautla, Hgo. Los árboles son tolerantes a suelos ligeramente alcalinos y pesados; su producción es alrededor de 200 frutos por árbol, que se han cultivado en Hidalgo, Querétaro y Guanajuato. Florea a finales de marzo y abril, y la maduración del fruto se produce a partir de finales de junio y principios de agosto. Los frutos pesan alrededor de 250 g, el epicarpo tiene un color, amarillo-naranja con un rubor de color rosa-rojizo leve. Arilos de color rojo oscuro, (ver figura 1) jugo dulce con semillas pequeñas y suaves (Mondragón et al., 2011). 8 Figura 1. Fruto granada roja cultivar Tecozautla Cultivar Apaseo Es la principal variedad comercial de México, producto de la selección y propagación llevada a cabo por productores de Apaseo El Alto, Gto., que la han cultivado desde hace más de 60 años. Disponible desde julio hasta septiembre. La fruta es llega a alcanzar hasta 750g, aunque el peso promedio es alrededor de 300g. Es de cáscara gruesa muy resistente al manejo, madura en amarillo-naranja el arilo es de color rojo brillante y dulce, la semilla es semidura y de tamaño aceptable (Ver figura 2). Es un árbol caducifolio, cuya floración empieza en marzo, lo cual le permite escapar de las heladas. Produce en ramas del mismo año. Muy productiva, ya que con buen manejo rinde más de 40 kg por árbol. Es susceptible a la deficiencia de fierro y al agrietamiento del fruto (Mondragon et al., 2008) 9 Figura 2. Fruto de granada roja (Punica granatum) del cultivar Apaseo. Selección identificada por el INIFAP en huertas de productores de Apaseo el Alto, Gto. Produce frutos de color verde-amarillento, de epicarpio delgado, los arilos son de color rojo oscuro (Ver figura 3.) Es un fruto con peso promedio de 400 g, pero puede alcanzar hasta 800 g. Madura a fines de agosto y se puede encontrar hasta la primera quincena de octubre, de manera que si se incrementa su cultivo, podría complementar a la variedad anterior. El árbol es ligeramente menos productivo que Apaseo, con un rendimiento promedio por árbol de 30-40 kg. Los primeros frutos de esta variedad, usualmente se venden mezclados con la variedad anterior. Es menos susceptible al agrietamiento de fruto que Apaseo, pero también es sensible a la deficiencia de fierro. (Mondragon et al., 2008) también conocida como clorosis. 10 Figura 3. Fruto de granada roja (Punica granatum) del cultivar Apaseo tardia. 2.3 Usos de la granada roja El zumo de granada es una bebida muy popular en Oriente Medio y es muy utilizado en la cocina Siria, Iraní e Hindú. El jarabe de granadina es un zumo concentrado y azucarado que se emplea para hacer cocktails. Antes de que llegara el tomate a Oriente Medio, la granadina era utilizada en muchos platos Persas y puede encontrase todavía en recetas tradicionales. Las semillas desecadas se emplean como especia, en la cocina Hindú y Pakistaní recibiendo el nombre de anardana (Tomás-Barberán, 2010). 11 Por la parte meramente industrial, se conocen dos usos principalmente: el uso de la madera como tal y por otra parte el epicarpo en el curtido de pieles: el árbol de granada roja se ha utilizado desde la antigüedad para obtener madera y entre las partes más utilizadas se citan la corteza de raíz, donde se conocen tradicionalmente 5 alcaloides (peletierina, pseudopeletierina, isopeletierina, pseudopeletierina y metilpeletierina), en cantidades que varían entre el 0,5 y el 0,9%, que se encuentran también en menor cantidad en la corteza del tronco y ramas; posteriormente Tanakaen 1985 descubrió un nuevo alcaloide llamado Punicafolin (Merlgarejo, 2010). También se emplea en Túnez la corteza de la granada para teñir de amarillo tejidos y otras fibras (Tomás-Barberán, 2010). Otro uso esta relacionado con la cáscara de la granada ya que contiene un gran porcentaje de taninos que hace que se emplee en la industria del curtido de pieles, particularmente para hacer pieles en Marruecos y también en medicina. En cuanto a los usos medicinales de la granada roja algunos son conocidos desde la antigüedad; por ejemplo para diabetes ya que disminuye el estrés oxidativo de lípidos y proteínas (Coop, 2011); diarreas, ulceras, aftas, antihelmintico y vermífugo (Larrosa Et al., 2010; Melgarejo, 2010). La granada roja presenta actividad antibacterial (Argueta, 1994) en extractos de partes diferentes de la planta (Ver cuadro 2); antioxidante (Gil et al., 2000) debido a diferentes compuestos contenidos en el zumo del fruto (Ver figura 4); anticancerígeno en casos de próstata (Tomás- Barberan, 2010), pulmón, mama y colon (Chechile, 2010). 12 Actividad antibacterial y antiviral de granada roja Extracto Órgano Bacteria Etanolico Partes aéreas Bacillusanthracis Proteusvulgaris Salmonella paratyphia Cascara Bacillussubtilis Salmonella typhosa Shigelladysenteriae Staphylococcusaureus Candidaalbicans Semillas Mycobacterium tuberculosis Salino Hojas Staphylococcusaureus Acuoso Fruto CoxsackieB5 Herpes Simplex Influenza (LEE) Poliovirus I Reovirus tipo I. Argueta, 1994 Cuadro 2. Actividad antibacterial y antiviral de extractos diferentes partes de la planta de granada roja (Punica grantum) 13 Figura 4. Compuestos responsables de la actividad antioxidante del fruto de la granada roja Punica granatum, con su respectivo porcentaje Por si fuera poco la ingesta del zumo de granada roja repercute de manera positiva al sistema cardiovascular (Tomás-Barberán, 2010), y por ultimo hay estudios que confirman que la granada roja estimula la producción de leche mediante un baño diario dado tres días después del parto con el cocimiento de granada, guayaba y naranja agria. Se le atribuye actividad estrogénica y se considera útil como un anticonceptivopermanente; en problemas de piel como sarampión, sarna y rubiola, se menciona que es de utilidad; así como para lavar, con el cocimiento de la corteza, granos, llagas y heridas (Argueta, 1994). Porcentaje de accion Compuesto Actividad Antioxidante Punicalagina 50 % Taninos hidrolizables 33% Acido elagico 3% Gil et al., 2000 http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=anticonceptivo http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=sarna http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=granos http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=llaga http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=herida 14 Su uso a nivel nacional se relaciona principalmente en el tratamiento de las diarreas, información descrita para el Distrito Federal, Estado de México, Guerrero, Guanajuato, Hidalgo, Jalisco, Morelos, Oaxaca, Puebla, Quintana Roo, Sonora, Tabasco y Veracruz y para la disentería en Guerrero, Morelos, Oaxaca, Puebla y Tlaxcala (Ver figura 5) Por lo general, se ingiere el cocimiento del fruto - cáscara principalmente- aunque también se utilizan la hoja, la flor, la corteza y las yemas. Otros padecimientos para los cuales el uso de la granada es frecuente, son las parasitosis intestinales lombrices, como tenias, solitarias y específicamente, Ascarislumbricoides (Argueta 1994) Figura 5. Usos de la granada roja (Punica granatum)en diferentes estados de la república Mexicana de acuerdo con Argueta(1994) http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=diarrea http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=disenter%C3%ADa http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=lombrices http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=solitaria 15 2.4 Problemática de la granada roja Como cualquier cultivar, la granada roja presenta una serie de problemas que requieren ser controlados con la finalidad de que la producción de la misma sea remunerable para el productor, estos problemas pueden ser clasificados en problemas fisiológicos como el agrietamiento del fruto, la clorosis y el golpe de sol y en segundo término, pero no menos importantes las plagas que tienen relación con el cultivar y pueden comprometer la producción de una huerta de granada roja. 2.4.1 Principales plagas Chinches. El daño por estos insectos se realiza al pinchar el fruto para alimentarse, lo cual produce una mancha negra endurecida sobre su superficie. El fruto picado puede continuar su desarrollo hasta ser cosechado sin mayor problema, salvo que tuviera muchos piquetes de chinche que demeriten su apariencia. El daño más grave ocurre cuando hay alta humedad en el ambiente ya que en los frutos con picaduras de chinches, se propicia el desarrollo de hongos que entran al fruto y pueden podrirlo. La etapa crítica para este problema es desde el comienzo de la fructificación, poco antes de la cosecha, y durante la época de lluvias (Mondragonet al., 2008) Pulgones. Estos insectos chupan la sabia, originando enrrollamiento de las hojas, caída de flores y frutos, debilitando el árbol. Su excremento, es depositado en el envés de las hojas, el cual propicia la llegada de hongos y demás microorganismos (Mondragon, et al., 2008) 16 2.4.2 Golpe de sol Es originado por una exposición directa del fruto al sol. Se caracteriza porque el epicarpo se reseca, produciendo pequeñas grietas que le dan apariencia de acorchado; la zona más expuesta al sol, resulta ser la más dañada, la cual toma un color marrón hasta negro, como si estuviera quemada (Mondragon, et al., 2008) es una fisiopatía que afecta los frutos en días muy calurosos, ya que transpiran más agua de la que reciben, provocando este desequilibrio quemaduras en la superficie de los frutos (Martinez, 2010) 2.4.3 Deficiencia nutrimental de hierro. La deficiencia de fierro es la causa más común del amarillamiento de las hojas o clorosis y se conoce como clorosis férrica. En el caso de la granada mueren los tallos principales, y la planta forma cayos, con los cuales puede regenerarse el árbol. Las causas más comunes de clorosis férrica son: los suelos de drenaje pobre, compactados, alcalinos o calcáreos y árboles con raíces dañadas y escasas, insuficientes para una absorción adecuada. El problema persiste si las condiciones del suelo no cambian y si la variedad no es tolerante a la deficiencia de fierro (Mondragon, 2008). 2.4.4 Agrietamiento del fruto Uno de los problemas fisiológicos de mayor importancia en cuanto a producción, y por lo tanto económico de la granada roja es el agrietamiento, ya que produce la pérdida de un porcentaje importante de la producción, siendo más del 50% de la misma. Se piensa que el agrietamiento del fruto puede ser ocasionado por tres factores que pueden interactuar para provocar el daño: 1. Susceptibilidad varietal, 2. Des-balances hídricos entre el fruto en crecimiento y el suelo, ocasionado por lluvias fuertes, o bien por someter a la planta a periodos de sequías prolongados y dar riegos más allá de capacidad de campo y 3. Por deficiencias de calcio, boro o de potasio (Melgarejo 1992; Hepacksoy, 2000; Mondragón et al 2008). En Guanajuato, 17 México se reporta que hasta un 62% de los árboles presentan frutos agrietados, que se venden en las calles sin la higiene adecuada. (Juárez, 2009). Cuando el fruto está en un estado avanzado de su desarrollo la capacidad de crecimiento del interior del fruto es mayor que el de las células de la corteza, por lo que, bajo determinadas circunstancias termina produciéndose el agrietamiento del fruto. (Martínez, 2010). Las posibles soluciones a este problema podrían ser el uso de sistemas de riego por goteo en donde sea factible su instalación para evitar des-balances hídricos, mantener adecuados niveles de fertilización principalmente de calcio, boro y potasio y realizar aplicaciones de fitohormonas principalmente auxinas y giberelinas, que al ser aplicada en el fruto puede inducir la elongación de las células que forman el pericarpo del fruto, y en consecuencia esto permitirá que en todas las células del fruto, incluyendo el pericarpo y los arilos el agua sea distribuida considerando lo anterior, el objetivo de esta investigación es evaluar la aplicación del acigigib (que es un producto que al disolverse en agua libera ácido giberelico) en el fruto de la granada roja en precosecha con la finalidad de evitar el agrietamiento. 2.5 fitohormonas y reguladores de crecimiento Las plantas, para crecer, además de agua, nutrientes, luz solar y dióxido de carbono, necesitan hormonas, conocidas como fitohormonas. Que son sustancias orgánicas que se encuentran a muy baja concentración, se sintetizan en determinado lugar de la planta por ejemplo la raíz o las yemas y se translocan a otro, que es donde ejercen sus efectos reguladores (Luna, 2006); Las fitohormonas se caracterizan por participar en variadas respuestas morfogenéticas y de crecimiento de manera pleotrópica, esto quiere decir, que una misma hormona participa en diferentes procesos y además, que dependiendo de su concentración, la misma hormona puede ser estimulatoria o inhibitoria de una misma respuesta, de acuerdo con su estructura y función fisiológica. A diferencia de los reguladores de crecimiento las fitohormonas son sintetizadas por la planta en pequeñas concentraciones, son 18 capaces de actuar en presencia o ausencia de luz, dependiendo de cuál sea el caso de fitohormona, su sitio de síntesis se encuentra en la planta y debe llevar un proceso de translocación para llegar al sitio de acción. Las hormonas han sido clasificadas en varios grupos que comprenden a las auxinas, citoquininas (CK), ácido abscísico(ABA), giberelinas (GA), entre otras (Cruz, 2010). El etileno es un gas incoloro, es una molécula orgánica con actividad biológica, producida por todas las plantas, algunos hongos, levaduras y bacterias (Srivastava 2002) que provoca un amplio rango de respuestas en las plantas. Se sintetiza en las hojas donde induce o promueve senecesncia y en el caso de los frutos afecta el proceso de maduración,(Bibwell, 1993) Se transporta de célula a célula por el simplasto y el floema, difundiéndose en el citosol, debido a que es lo suficientemente soluble en agua y lo suficientemente no polar para pasar rápidamente a través de las membranas; por lo general, el sitio de acción es próximo al sitio de síntesis; es de vital importancia mencionar que la producción de etileno en las plantas es estimulada por las auxinas (LLuna, 2006). Las auxinas fueron las primeras fitohormonas identificadas y es precisamente el ácido indol acético AIA, la principal auxina endógena en la mayoría de las plantas (Srivastava 2002). La mayoría de las moléculas que integran este grupo son derivados indólicos, aunque también se encuentran algunos compuestos fenoxiacéticos, benzoicos o picolínicos con actividad auxínica. Las auxinas se encuentran en la planta en mayores cantidades en las partes donde se presentan procesos activos de división celular, lo cual se relaciona con sus funciones fisiológicas asociadas con la elongación de tallos y coleóptilos, formación de raíces adventicias, inducción de floración, diferenciación vascular, algunos tropismos y promoción de la dominancia apical (McSteen y Zhao 2008). Son sintetizadas en los meristemos y hojas nuevas, y su sitio de acción es la raíz, inhibiendo su crecimiento. Una característica importante de las auxinas es que al ser aplicado puede provocar un efecto negativo en la floración siguiente a su aplicación debido a que induce crecimiento vegetativo, no reproductivo (Bidwell, 1993; Jordan, 2006). 19 Las citocininas han sido consideradas estructuralmente como derivadas de adeninas o purinas (Cruz, 2010). Se cree que las citocininas son sintetizadas en tejidos jóvenes o meristemáticos como ápices radiculares, yemas del tallo, nódulos de raíces de leguminosas, semillas en germinación, especialmente en endospermas líquidos y frutos jóvenes; desde donde se transportan vía xilema hacia la hoja donde se acumula, para luego ser exportada vía floema hacia otros órganos como los frutos (Srivastava 2002). Entre las funciones de las citocininas es posible mencionar que estimula la progresión del ciclo celular, la iniciación de brotes, organogénesis y androgénesis, retardar la senescencia de las hojas, provocando que las mismas permanezcan más tiempo verdes debido al mayor contenido de clorofila, ya que las citocininas permiten el desarrollo de cloroplastos, también la sobreproducción de citocininas resulta en una dormancia apical reducida (Jordan, 2006). Otra fitohormona es el ácido abcísico que fue descubierto por Wareing, la biosíntesis, tiene lugar en semillas, frutos, tallos y raíces; es estimulada por frio o luz, principalmente; se moviliza por el xilema y el floema, su movimiento es lento y no polar (Lluna, 2006); cumple un papel importante en la regulación de las relaciones hídricas, por su relación determinante en la respuesta de las células guarda estomáticas y en el mantenimiento del crecimiento radical durante el déficit hídrico, lo cual se encuentra ampliamente estudiado y documentado en la actualidad (Kim et ál., 2010). Parece inducir el letargo en las plantas perennes y en los árboles y causa o mantiene el letargo en varias semillas, además de que contrarresta el efecto de las giberelinas en algunas plantas y si estructura es similar (Bidwel, 1993) 20 2.5.1 Giberelinas Las giberelinas (Gas) son hormonas de crecimiento diterpenoidestetraciclicos involucrados en varios procesos de desarrollo en vegetales; la síntesis de Gas ocurre en varios lugares, en plántulas la síntesis se detecta en hojas y yemas, y en material adulto a nivel de frutos (Jordan, 2006). El efecto más notable de las Gas es inducir el crecimiento por elongación celular induciendo crecimiento en altura en las plantas de plantas genéticamente enanas, además de inhibir la brotación de yemas que darán origen a las inflorecencias y flores; promueven la germinación en semillas en condiciones de dormancia; además de estar involucradas en la movilización de reservas en granos de cereales (Jordan, 2006). En el caso de la giberelina es conocida su capacidad para promover crecimiento por elongación celular, y es precisamente en este punto donde radica la importancia del problema fisiológico de la granada roja, que es el agrietamiento del fruto considerando que el agrietamiento del fruto de la granada roja puede ser disminuido o tal vez controlado con la aplicación de fitohormonas que produzcan división y elongación celular como es el caso del ácido giberelico 21 2.5.2 Biosintesis de giberelinas Actualmente hay más de 90 giberelinas aisladas en tejidos vegetales, que varían en estructura y actividad; la mejor conocida es la GA3, mejor conocida como ácido giberelico que es producido por el hongo Giberella fujikuroi (Lluna, 2006) En la plantas, las giberelinas son sintetizadas en los primordios apicales de las hojas, en puntas de las raíces y semillas en desarrollo, posteriormente ocurre el proceso de translocacion, o de transportación, que para el caso de la giberelina es de tipo activo; ya que se transporta por medio del floema junto con los productos de la fotosíntesis, y también por el xilema, (Lluna, 2006) hasta llegar al sitio de acción que puede ser una célula blanco, algún tejido u órgano de la planta. Con algunas investigaciones posteriores a la segunda guerra mundial se logró descubrir que existen muchos compuestos naturales con estructuras similares al aislado en Gibberella presentes en las plantas en cantidades variables en todos los órganos de las plantas, sin embargo las concentraciones mayores se encuentran en los órganos jóvenes (Lluna, 2006) y derivaban en una secuencia de síntesis a partir del isopreno, denominada vía o ciclo de los terpenoides. Esta ruta es también precursora de varias otras hormonas promotoras y/o de función inhibitoria. Una primera fase importante es la formación de la molécula de kaureno, (Ver figura 6) la cual es la molécula precursora del GA12-aldehido; siendo ésta a su vez precursora natural de las más de 100 giberelinas conocidas por hoy (Jodan, 2006). Figura 6.Kaureno, molécula precursora de las giberelinastomado de Jordan, 2006 22 Las giberelinas" son terpenoides, compuestos que derivan del difosfato de isopentenilo. Esta molécula se puede sintetizar por dos rutas biosintéticas diferentes. La primera usa como intermediarios el hidroximetilglutaril-CoA y el mevalonato; la segunda, descubierta más recientemente, usa como intermediario el fosfato de gliceraldehído y el piruvato (Rohmer et al., 1993) (ver figura 7) Figura 7. Biosíntesis de terpenoides de Gibberella. Las flechas discontinuas representan más de una reacción. Tomado de Avalos, 2000. Un paso crítico en la síntesis de giberelinas es la ciclación del difosfato de geranílgeranílo para dar kaureno, el primer diterpenotetracíclíco en la ruta; El kaureno se oxida sucesivamente a kaurenol, kaurenal, ácido kaurenoico y ácido 7a- hidroxíkaurenoico. La contracción del anillo del ácido 7a-hidroxíkaurenoíco da lugar al aldehído de GA12, primer compuesto con la estructura típica de las giberelinas, con dos anillos pentagonales y dos hexagonales (esqueleto ent-giberelano). 23 A partir de ahí, la ruta en Gibberella se escinde en dos vías paralelas que se diferencian en la presencia o ausencia de una hidroxilación en el carbono3 del aldehído de GA12. (Avalos, 2000) (Ver figura 8) Figura 8. Biosíntesis de giberelina tomado de Avalos, 2000. 24 2.5.3 Función de las giberelinas en las plantas Aunque originalmente, las giberelinas fueron descubiertas como causantes de una enfermedad en el arroz que estimula la elongación del entrenudo, las giberelinas endógenas influyen en una gran variedad de procesos del desarrollo. Además de la elongación del tallo, las giberelinas controlan varios aspectos de la germinación de las semillas, como la dormancia, y también la movilización de las reservas del endospermo (Taiz, 2006) 2.5.3.1 Función de las giberelinas en la raíz La raíz de las plantas es uno de los lugares donde se realiza el proceso de síntesis de giberelinas; estos compuestos tienen un escaso efecto sobre el crecimiento de la raíz, sin embargo el crecimiento radical de las enanas extremas es menor que el de las plantas silvestres, pero aún no se sabe con certeza si el crecimiento de la raíz es directo o indirecto (Taiz, 2006). 2.5.3.2 Función de las giberelinas en el tallo El efecto más notable de las GAs es inducir crecimiento en altura; en muchos casos atribuibles a GA1 endógenas debido a que estimulan fuertemente la división y elongación celular en la porción sub-apical de los tallos y también en el meristemo intercalar. Los mecanismos de división y elongación de la pared no están aún bien aclarados a nivel celular, pero se asume que el efecto de “soltura” de la pared celular sería diferente a la ejercida por la auxina (o reguladores de este tipo), aunque sería un efecto complementario (Jordan, 2000; Lluna 2006); es decir, el efecto del tratamiento con giberelinas consiste en la combinación de un cambio en el número de células con la variación del tamaño de estas, dando lugar a efectos sobre el crecimiento vegetal en cada una de las regiones del tallo que contribuyen al crecimiento longitudinal: el meristemo apical, el subapical y la zona de elongación, dando lugar al 25 alargamiento de los entrenudos, (Taiz, 2006), todos estos procesos tiene como consecuencia la elongación de los tallos en las plantas. 2.5.3.3 Función de las giberelinas en el brote y las yemas Para el caso de los brotes y las yemas, las giberelinas causan incremento en la tasa de división celular, mejor conocida como mitosis; estimulando la división y/o la prolongación celular, lo cual, provoca un aumento en la prolongación de los brotes en muchas especies (Loja, 2001); por otra parte el ácido giberelico retrasa la iniciación de primordios florares en yemas que se desarrollan en condiciones que promueven la floración (Vázquez, 2006). 2.5.3.4 Función de las giberelinas en las semillas Las giberelinas, estimulan la germinación de semillas en muchas especies, en cereales movilizan las reservas para el crecimiento inicial de la plántula (Lluna, 2006); en términos más específicos, estimula la producción de la enzima (α-amilaza) y otras enzimas en la germinación de granos de cereales para la movilización de las reservas de las semillas (Lluna, 2006). 26 2.5.3.5 Función de las giberelinas en las flores También es conocido que las Giberelinas promueven el desarrollo súbito de inflorescencias y la floración en muchas plantas, particularmente en aquellas de día largo o que requieren temperaturas bajas para la floración, ya que satisface la necesidad de horas frio (Lluna, 2006); en algunos casos se asociación con fitocromos para promover la inducción de la floración (Jordan, 2000; Loja,2001); por ejemplo: en el caso de las dicotiledóneas como el pepino, la aplicación de giberelinas promueve la formación de flores femeninas (Taiz, 2006), en el caso de los pinos la floración se estimula con GA4 y GA7 también las giberelinas pueden inhibir, retrasar o adelantar la floración de árboles de mango 'Tommy Atkins' y 'Ataulfo', dependiendo de la época y dosis de aplicación. Lo que plantea una alternativa para manipular la floración y cosecha de este cultivo de acuerdo a la conveniencia del productor para obtener mejores beneficios económicos al comercializar su producto (Pérez–Barraza, 2008). 2.5.3.6 Función de las giberelinas en los frutos Para el caso de los frutos, las giberelinas promueven el desarrollo de muchos frutos después de ocurrida la polinización en varias especies, inducen partenocarpia y tienen una aplicación especial en la producción de uvas “sin semilla” (Kato et al. 2000). Esto es importante debido a que el tamaño del fruto incide sobre su calidad y precio. Con aplicaciones de GA4 y GA7 se estimula el desarrollo de manzanos y, en algunos casos como en cítricos, es posible demorar la senescencia para poder así mantener los frutos más tiempo en el árbol o si están cosechados, extender el periodo de su comercialización (García-Martínez & Hedden 1997). Se ha observado que las Gas son buenas productoras de la fructificación partenocárpica y que llega a presentar una actividad más elevada que la auxina natural; también se sabe que retrasa la maduración en los frutos y la senescencia de la hoja en cítricos (Lluna, 2006). En el caso de la giberelina es conocida su capacidad para promover crecimiento por elongación celular, y es precisamente en este punto donde radica la 27 importancia del problema fisiológico de la granada roja, que es el agrietamiento del fruto considerando que el agrietamiento del fruto de la granada roja puede ser disminuido o tal vez controlado con la aplicación de fitohormonas que produzcan división y elongación celular como es el caso del ácido giberelico , el cual al ser aplicada en el fruto puede inducir la elongación de las células que forman el pericarpo del fruto, y en consecuencia esto permitirá que cuando exista algún des- balance hídrico, el agua sea distribuida en las células del pericarpo sin que afecte los arilos, considerando lo anterior, el objetivo de esta investigación es evaluar la aplicación del acigigib (que es un producto que al disolverse en agua libera ácido giberelico) en el fruto de la granada roja en pre-cosecha. Otra característica encontrada por Martinez-Damian en 1999 es que la adición de Ga a cualquiera de las concentraciones usadas que son 5, 10 y 20 mg/l de Ga mantuvo o aumentó el contenido de clorofila existente en cáscara en comparación con el testigo, siendo las diferencias altamente significativas. Esto está relacionado con lo encontrado por Lewis y Coggins (1964), quiénes mencionaron que este regulador de crecimiento amplía el período de síntesis de clorofila y retarda la biosíntesis de carotenoides a nivel flavedo, apareciendo un retraso por consiguiente en la maduración externa del fruto, caracterizado por una degradación más lenta de las clorofilas de la cáscara (Agustí y Almela, 1988). 28 2.6 La calidad del fruto y sus elementos. La calidad es un término subjetivo que engloba las características de un fruto más apreciadas por los consumidores, las cuales pueden desglosarse en tres bloques: organoléptica, nutritiva y funcional. La calidad sensorial u organoléptica es la apreciada por los sentidos e incluye color, sabor, aroma, firmeza y apariencia (ausencia de defectos o daños y tamaño y coloración homogéneos). La calidad nutritiva está determinada por los componentes del fruto que nos sirven de nutrientes, como carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos orgánicos y minerales. Finalmente, la calidad funcional se debe al aporte de compuestos bioactivos con efectos beneficiosos para la salud, como fenoles, carotenoides y vitaminas. (Serrano, 2010) Agrietamiento del fruto Usenik en 2004 en su trabajo titulado Cambios fisicoquímicas de frutas cerezas dulces relacionados con aplicación de ácido giberelico encontró que al aplicarGA3 en los cultivares cerezo dulce. 'Van', 'Sunburst' y 'Elisa' cultivadas en un clima con lluvias frecuentes durante la maduración de la fruta; el agrietamiento fruta fue significativamente menor para las frutas tratadas con GA3 del cv. 'Sunburst' Kataoka et al en 2009 evaluaron los efectos de la adición de ácido giberélico (GA) a las soluciones de auxina sobre el contenido de azúcar y la acidez titulable en la madurez de 60 tomates del cultivar “Luis” las actividades de la enzima sucrolytic y el desarrollo celular durante las primeras etapas de desarrollo de los frutos que fueron examinados para explicar los mecanismos fisiológicos. En los resultados encontraron que la madurez y acidez valorable no se vieron afectados por la adición GA. A partir de 1 día después del tratamiento, el tamaño celular incremento en frutas tratadas con GA y resultó en un aumento en el espesor del pericarpio en la madurez. Estos resultados sugieren que la adición GA en la antesis puede promover un crecimiento en las células de pericarpio individuales inmediatamente después del tratamiento. Las actividades de 29 VAI y neutral invertasa (NI) fueron mayores en frutos tratados con GA con alrededor de 5 días después del tratamiento. Lal y compañía entre el 2008 y 2009 evaluaron el efecto de diferentes productos químicos en el agrietamiento del fruto de la granada roja en el valle de Cachemira, utilizando 5 variedades y como tratamientos sulfato de calcio (2.000, 3.000, 4.000 ppm), giberelina GA 3 (40, 80, 120 ppm), bórax (25, 50, 75 ppm) y el control (agua)en cuanto a los resultados obtenidos El mínimo agrietamiento de fruta se observó con el tratamiento de 3000 ppm de CaSO 4 seguido de CaSO 4 2000 ppm, GA380 ppm y 40 ppm bórax 50 comparado con el control en ambas estaciones. Tamaño y peso. En 2001 Salah y compañía realizaron un estudio de los cambios físicos y químicos durante la maduración de la granada roja (Punica Granatum L.) del cultivar Taifi; en sus resultados encontraron un diámetro de 6.64 cm. Cea 2011 en su trabajo titulado Caracterización Física, química y sensorial de frutos de granado cv. Wonderful provenientes de tres regiones de Chile encontró un rango de entre 7 y 15 cm para el diámetro del fruto; Mondragon en 2011 estudio los efectos de condición del fruto y temperatura de almacenamiento en la calidad de granada rojay encontró un diámetro de 8.3 cm para frutos del cultivar Apaseo. Tehranifar, en 2010 realizaron una investigación relacionada con los aspectos fisicoquímicos y la actividad antioxidante de 20 cultivares iranís de granada, ya que Irán es el centro de origen de la granada encontrando como resultados un peso de entre 196 y 315 g; Cea, que en 2011 realizo la Caracterización Física, química y sensorial de frutos de granado cv. Wonderful Provenientes de tres regiones de Chile, encontró que el peso de los frutos de las localidades estudiadas varió entre 280 y 520 g. En Chile la empresa Unifrutti, que exporta frutos de granada de la variedad 30 Wonderful, obtiene pesos promedio heterogéneos de fruto que fluctúan entre 210 hasta frutos con pesos superiores a 600 gramos. Azucares totales En 2001 Salah y compañía realizaron un estudio de los cambios físicos y químicos durante la maduración de la granada roja (Punica Granatum L.) del cultivar Taifi; en sus resultados encontraron un total de 14.1 g de azucares Poyrazoğlua, E. et al (2002) en su trabajo Los ácidos orgánicos y compuestos fenólicos en las granadas de trece cultivares en Turquia, encontró que los azúcares totales oscilaron entre 13.9 y 16 (promedio de 14.8g/100ml) en jugos de granada roja. Tehranifar y compañía en 2010 realizaron una investigación relacionada con los aspectos fisicoquímicos y la actividad antioxidante de 20 cultivares iranís de granada, ya que Irán es el centro de origen de la granada y como resultado para azucares totales fue de 13.23 g/L. Acidez titulable. Durante la conservación post-recolección se producen cambios que afectan al sabor, ya que disminuye significativamente el contenido de acidez (Mirdehghan et al., 2007a), debido fundamentalmente a disminución en los ácidos mayoritarios (Serrano, 2010) Cea en su caracterización de granada roja de la variedad Wonderfoul de tres regiones de Chile encontró los valores de acidez entre 1 y 1,9 g/100mL y Coop en 2011 menciona un porcentaje de acidez titulable se entre 0.33 y 1.75%-. 31 Ácido ascórbico. Especial atención merece el ácido ascórbico, por su papel como vitamina C y sus propiedades antioxidantes, cuya concentración disminuye durante las primeras fases del desarrollo del fruto y se mantiene en valores más o menos estables en las últimas fases de la maduración, con unos valores entre 10 y 36 mg/100 g, dependiendo de la variedad (Kulkarni y Aradhya, 2005; Sayyari et al., 2010). Clorofila Drogoudi en 2011 menciona en su trabajo Morphological and physiological characteristics in pomegranate cultivars with different yields haber encontrado la clorofila total en un rango de entre 5.9 y 6.5 mg dm-2 Sólidos solubles totales. En 2001 Salah y compañía realizaron un estudio de los cambios físicos y químicos durante la maduración de la granada roja (Punica Granatum L.) del cultivar Taifi; en sus resultados encontraron un total de 16.5 grados Brix. Tehranifar, en 2010 realizó una investigación relacionada con los aspectos fisicoquímicos y la actividad antioxidante de 20 cultivares iranís de granada, encontró 11.37 grados Brix como resultado de solidos solubles totales; Cea en 2011 realizo una caracterización Física, química y sensorial de frutos de granado de sólidos solubles variaron entre 15 y 16 Brix. Mercado y compañía en 2011 evaluó los efectos de condición del fruto y temperatura de almacenamiento en la calidad de granada roja y los valores se situaron en un intervalo de 14 a 16 ºBrix, Coop en 2011 en su tesis titulada Efecto protector del jugo de granada (púnica granatum l.) Sobre complicaciones de la diabetes reporta un intervalo de 15.38 a 17.63 ° y para el cultivar Apaseo, Mondragon en 2011 en su manual para productores de granada reporta 11 grados Brix. Rajasekar en 2012 realizo 32 una investigación en la que evaluó las características físico-químicas del jugo de granada roja de 15 cultivares de Georgia extraído por dos métodos que son por medio de una licuadora y una prensa mecánica, en cuanto a sus resultados encontró entre 14 y 16.5 grados Brix. Antocianinas. Las antocianinas son consideradas responsables del color rojo de las granadas y de sus semillas, siendo este un atributo de calidad importante. El color rojo depende de la concentración en antocianinas que éstas contengan y del tipo de antocianina. En el granado se han identificado 6 antocianinas como los responsables del color del zumo de la granada: delfinidina 3-glucósido y 3,5-diglucósido; cianidina 3- glucósido y 3,5-diglucósido y pelargonidina 3-glucósido y 3,5-diglucósido (Du et al., 1975). La concentración de antocianinas en el fruto maduro, al igual que el color, depende de la variedad, con valores entre 10 y 220 mg/100 g (Mirdehghan et al., 2006; Ozgen et al., 2008; Sayyari et al., 2010; 2011). Cea en la variedad Wonderful encontró una concentración de antocianinas en un rango de 30 a 90 mg en 100 ml de jugo. Cea en 2011 en su caracterización Física, química y sensorial de frutos de granado en la variedad Wonderful encontró una concentración de antocianinas en un rango de 30 a 90 mg en 100 ml de jugo. Rajasekar en 2012 realizo una investigación en la que evaluó las características físico-químicas del jugo de granada roja de 15 cultivares de Georgia extraído por dos métodos que son por medio de una licuadora y una prensa mecánica, en cuanto a sus resultados encontróun amplio rango para la variable de antocianinas que va de 0.40 a 41.97 mg, dependiendo del cultivar y el método de extracción del jugo. Varasteh et al en 2012 estudiaron los cambios en las antocianinas presentes en arilos de granada recubierta de quitosano- (Punica granatum L. cv. Rabbab-e-Neyriz) durante el almacenamiento en frío; para el caso de antocianinas encontraron un resultado máximo de 93.5 mg/100ml de antocianinas totales en el momento de la cosecha. 33 Potencial de Hidrogeno En 2001 Salah y compañía realizaron un estudio de los cambios físicos y químicos durante la maduración de la granada roja (Punica Granatum L.) del cultivar Taifi; en sus resultados encontraron un potencial de hidrogeno acido con un valor de 3.48. Al-Said que en 2009 realizo un trabajo en el cual evaluó las características fisicoquímicas y la textura de 4 cultivares en el cual encontró valores de 2,76 a 3.93; en 2010 Tehranifar, en su investigación relacionada con los aspectos fisicoquímicos y la actividad antioxidante de 20 cultivares iranís de granada encontró un pH de 3.16 y Coop en su tesis para maestría realizada en 2011 titulada Efecto protector del jugo de granada (Punica granatum L.) sobre complicaciones de la diabetes, encontró valores entre 3.09 y 4.30. Rajasekar en 2012 realizo una investigación en la que evaluó las características físico-químicas del jugo de granada roja de 15 cultivares de Georgia extraído por dos métodos que son por medio de una licuadora y una prensa mecánica, en cuanto a potencial de Hidrogeno los valores obtenidos son de 2.5 a 4.08, es decir un fruto ácido 34 3. Objetivos 3.1 General Evaluar el efecto de acigigib sobre el agrietamiento y la calidad del fruto de la granada roja (Punica granatum) 3.2 Particulares Determinar longitud y diámetro de los frutos durante el tratamiento precosecha con la finalidad de obtener las curvas de crecimiento. Determinar clorofila total a y b, sólidos solubles totales, acidez titulable, ácido ascórbico, antocianinas, azúcares totales, masa y relación acidez titulable/Brix. 35 4. Procedimiento experimental. 4.1 Descripción del área de estudio La presente investigación se realizó en el Tephe, municipio de Ixmiquilpan del estado de Hidalgo que se encuentra situado en la porción central de la república Mexicana, entre los estados de México, Tlaxcala, Puebla, Veracruz, San Luis Potosí y Querétaro, la entidad hidalguense, posee un ancho de 20.813 kilómetros cuadrados, surcados en su parte media por la Sierra Madre Oriental, que recorre longitudinalmente todo su territorio, dando paso a las 10 grandes regiones naturales que la conforman geográficamente. Este estado cuenta con 84 municipios, uno de ellos es el municipio Ixmiquilpan cuenta con una superficie de 565.3 kilómetros cuadrados. Lo cual representa el 2.7% de la superficie total del Estado de Hidalgo se localiza en el eje neo volcánico en un 70% formado por llanuras y en menor proporción por lomeríos, el otro 30% se localiza en la Sierra Madre Oriental formada por sierra. Dentro de sus elevaciones principales se encuentran los cerros la palma, Thito, la Muñeca, Xintza, Guadril, Temboo, DExitzo( la cruz) y Daxhie. En lo que respecta a la hidrología del municipio, Ixmiquilpan se encuentra posicionado en la región del panuco, en la cuenca del rio Moctezuma; el clima es semiseco templado en la mayor parte de la superficie municipal, que representa un 51.22% además existe un clima seco semicalido en un 23.67% y templado subhúmedo con lluvias en verano de 21.58% el restante tiene un clima semi seco semi calido. La temperatura promedio para la temporada más fría del año es de 14.5º C y durante las temperaturas más altas tiene un promedio de 21.4 grados centígrados; la temperatura promedio en el municipio es de aproximadamente 18.5; la precipitación anual en el municipio en promedio es de alrededor de los 363.8 mm. Este municipio dentro de sus recursos naturales tiene pino, encino, sabino, pirúl, mezquite, jacaranda y oyamel, así como arboles exóticos; aguacate, durazno granada e higo, en su zona de bosque existe encino prieto, encino manzanilla y como 36 matorral el garambullo, palma y nopal. La fauna perteneciente a este municipio está compuesta de tejón, ardilla, tlacuache, onza, conejo, zorro, zorrillo, liebres, ratón de campo, serpientes y una gran variedad de insectos y reptiles. Figura 9. Ubicación del municipio Ixmiquilpan dentro del estado de Hidalgo, tomado dehttp://www.galeon.com/elfithzi/productos1961502.html Para realizar la presente investigación se seleccionó una huerta ubicada en el kilómetro 1 de la carretera 30, del estado de Hidalgo en la localidad el Thepe; este lugar pertenece al municipio de Ixmiquilpan Hidalgo, a 1700 metros sobre el nivel del mar a 20°28‟55”latitud norte y 99°10‟15” longitud oeste, el clima en esta región es semiseco templado, la cual fue visitada por primera vez el día 22 de junio de 2012, con la finalidad recorrerla y conocer la ubicación exacta, así como el medio y tiempo requeridos para llegar a ella. (Ver figura 10 y 11) http://www.galeon.com/elfithzi/productos1961502.html 37 Figura 10. Localización de la huerta con respecto al municipio de Ixmiquilpan, Hgo. Tomado de https://www.google.com.mx/maps/place/Ixmiquilpan. 38 Figura 11. Imagen satelital de la huerta en la que se realizó la investigación tomado de https://www.google.com.mx/maps/place/Ixmiquilpan 4.2 Material experimental La huerta en la que se realizó la aplicación de los tratamientos se encuentra en el kilómetro 1 de la carretera 30, del estado de Hidalgo. Los árboles que se encuentran en ella tienen un tamaño de alrededor de 2.5 metros, con una edad de 5 años de estos árboles se eligieron frutos con un tamaño de longitud entre 3.7 y 4.9 cm y de diámetro entre 4.3 y 5 cm; que no presentaron plagas, grietas o daños mecánicos 39 4.3 Diseño experimental 4.3.1 Factor y nivel de factor En la presente investigación el factor fue la giberelina en su presentación comercial de nombre acigigib. Se aplicaron los siguientes niveles de factor; 0, 50, 100 y 200 mg/l. Al combinar el factor y los niveles de factor se obtuvieron los siguientes tratamientos. 4.3.2 Tratamientos. Los tratamientos que se evaluaron en la presente investigación fueron las siguientes: 1. 0 mg de acigigib + 50 frutos de granada roja 2. 50 mg de acigigib + 50 frutos de granada roja 3. 100 mg de acigigib + 50 frutos de granada roja 4. 200 mg de acigigib + 50 frutos de granada roja 4.3.3 Unidad experimental, repeticiones y diseño experimental La unidad experimental para el trabajo de campo de esta investigación fue un árbol de granada roja (Púnica granatum) cv. Apaseo Tardia de aproximadamente 2.5 m de alto y estructura similar; en el cual se marcaron 10 frutos por cada árbol; para cada tratamiento se realizaron 5 repeticiones. Teniendo un total de 50 frutos por tratamiento; el diseño experimental utilizado fue un diseño experimental completamente al azar. Para evaluar las variables de calidad en el laboratorio se obtuvo el jugo de cada fruto de donde se tomaron las muestras para cada variable, cada variable se realizó con seis repeticiones cada una por tratamiento. 40 4.3.4 Aplicaciones de tratamiento. Para la aplicación de los tratamientos se preparó 1 litro de cada tratamiento; para el caso del tratamiento 1 (0 mg/l) se aplicó solamente agua potable, para el tratamiento 2 (50 mg/l) se disolvieron 0.5g de acicigib/1 litro; para el tratamiento 3 (100 mg/l) se disolvió 1 g de acicigib/ 1 litro de agua y para el tratamiento 4 (200 mg/l) se disolvieron 2 g de acicigib/1 litro; debido a que el acigigib contiene 10% de ácidogiberelico. Estas soluciones se aplicaron asperjando directamente a los frutos hasta llegar al punto de goteo; repitiendo el proceso en tres ocasiones los días 9 y 21 de julio y 4 de agosto de 2012. Manejo del huerto Durante el crecimiento y desarrollo del fruto como parte del manejo del huerto con la finalidad de mejorar la calidad del fruto se realizaron 5 riegos los días 15, 28 de junio, 11 y 24 de julio, y 5 de agosto, y de la misma forma se realizaron dos podasen un periodo de 12 meses, esto realizado por el productor. Traslado del material experimental El día 15 de septiembre se realizó el corte del fruto, los frutos fueron cortados con ayuda de unas tijeras de jardinero, fueron acomodados en huacales de madera; se utilizaron dos huacales para cada tratamiento. El traslado duro alrededor de 2 horas. Extracción del jugo. Para poder realizar las pruebas de laboratorio que conciernen a la calidad del fruto fue necesario realizar la extracción del jugo, esta se llevó a cabo mediante la trituración de los arilos en un mortero y posteriormente el jugo se guardó en frascos de cristal con tapas herméticas con esto se obtuvieron 6 frascos de muestra de jugo por cada uno de los tratamientos y a partir de estos se realizaron las pruebas de calidad del fruto dentro de laboratorio. 41 4.3.5 Variables de estudio o de respuesta y técnicas de evaluación 4.3.5.1 Cuantificación del número de frutos agrietados Para la cuantificación de frutos agrietado se hicieron 5 visitas a la huerta, con fechas referentes al 9 de julio, 3 y 19 de agosto y en el mes de septiembre el día 1 y 15, siendo el último el día de corte y estas fueron enumeradas del 1 al 5 respectivamente. El total de frutos agrietados se cuantificó durante las visitas realizadas a la huerta cada quince días aproximadamente después de la primera aplicación realizada el 9 de julio, se usó una técnica conteo directo de los frutos agrietados y no agrietados en cada uno de los tratamientos; con la información anterior se obtuvo el número de frutos por cada fecha de muestreo y el total de frutos agrietados y frutos no agrietados, posteriormente se realizaron los cálculos correspondientes con la finalidad de obtener el porcentaje de frutos agrietados por tratamiento. 4.3.5.2 Tamaño del fruto Los muestreos se realizaron cada quince días correspondiendo a las siguientes fechas 22 de junio 9, 21 de julio, 4 y 19 de agosto en estos muestreos se midió el tamaño del fruto en longitud y diámetro con un vernier de metal para lo que se marcó con tinta indeleble el sitio del fruto . 4.3.5.3 Peso del fruto La fecha de corte de la granada roja fue el 15 de septiembre las granadas se transportaron en cajas de madera al laboratorio donde fueron pesadas en una balanza vernier, tomando en cuenta pesar 15 frutos de cada tratamiento, con un total de 60 frutos pesados. 42 4.3.5.4 Curvas de crecimiento del fruto. Las curvas del crecimiento del fruto fueron realizadas con los datos obtenidos del incremento de longitud y diámetro y con los datos obtenidos fue elaborada una curva por cada tratamiento, tomando en cuenta las medidas del diámetro y longitud de sus frutos para compararla con el grupo testigo. 4.3.5.5 Azucares totales Con la finalidad de evaluar la concentración de azucares totales en las muestras de los tratamientos se utilizó la técnica propuesta por Withan, 1971. Parte de la técnica fue hacer la curva patrón de glucosa, para esto es necesario pesar 15 mg de glucosa y aforarla a 100 ml de agua destilada, el procedimiento fue el antes mencionado, la curva se realizo con 10 tubos, para los cuales la cantidad de glucosa fue aumentando 0.1 ml iniciando con 0.1 ml y terminando en 1 ml, a cada tubo se le agregó el agua necesaria para tener un volumen de 3 ml y se utilizaron 3 ml de antrona-acido por tubo. El modelo de regresión lineal obtenido fue el siguiente: y = 0.5216x + 0.1705 R² = 0.9235 Los intervalos obtenidos para la absorbancia a 600 mn fue de entre 0.19 y 0.593. Para lo cual Se tomaron 0.25 ml de jugo y se agregaron 20 ml de etanol al 80% para llevarlo abaño maría hasta evaporar el etanol, el concentrado se disolvió en 50 ml de agua y se hizo una dilución 1:10 del cual se tomaron 0.250 ml, se agregaron 0.750ml de agua destilada y 3 ml de antrona-ácido sulfúrico teniendo los tubos al agregarla en un baño de hielo. Posteriormente se calentaron en baño maría en ebullición por 3 min. Pasado los tres minutos, se leyeron las muestras a una absorbancia a 600 nm. En un espectrofotómetro Shimadazu UV_1201S. 43 4.3.5.6 Acidez titulable. Con la finalidad de conocer el pH del jugo de la granada roja se tomó en cuenta la técnica propuesta por la Asociation Oficial Analisys Chemical 1985. Official methods of analysis of the asociation oficial agricultural chemist que consiste en tomar una alícuota de jugo de 20 ml, que se tituló con hidróxido de sodio 0.1N; hasta obtener un pH de 8.3, lo cual se midió con un potenciómetro de la marca Hanna y por último se calculó el porcentaje de acidez en base al acido que se encuentra en mayor proporción de acuerdo a la siguiente formula. Dónde: N= normalidad de NaOH V= volumen total (ml de extracto después de moler en la licuadora) Meq. Ac. Mili equivalente del ácido que se encuentra en mayor proporción. 4.3.5.7 Ácido ascórbico. Para la obtención de la cantidad de ácido ascórbico se tomó como base la técnica del Jagota y Dani, 1982 En este caso también fue necesario preparar una curva patrón, el procedimiento consistió en hacer una solución de ácido ascórbico de 50 µg/ml, de la cual se ocuparon 0, 150, 200, 250, 300 350 y 400 µl a los cuales se les añadió agua para completar un volumen de 2 ml y 800 µl de ácido tricloroacético. Se leyeron los datos en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 760 nm; los datos obtenidos se graficaron y se realizó una regresión lineal obteniendo el siguiente modelo: y =0, 000237x+ 0,077 R² = 0,987 44 El rango de absorbancia a 600 nm obtenido con esta curva fue de entre 0.110 y 0.173 Para trabajar las muestras se mezclaron 0.8 ml de ácido tricloroacético con 0.2 ml del extracto de jugo, posteriormente se agitaron vigorosamente y se colocaron en un baño de hielo por 5 minutos, se centrifugó la muestra 3000 rpm por 5 minutos y se tomaron alícuotas de 0.5 ml que se deben diluir 2 ml con agua bidestilada y se agregaron 0.2 ml de Folin-ciocalteau y agitar vigorosamente, se deja reposar durante 10 minutos y leer absorbancia a 760 nm. En un espectrofotómetro de la marca Shimadazu UV_1201S. 4.3.5.8 Clorofila total, a y b. Las concentraciones de clorofila total, a y b fueron obtenidas con la técnica propuesta por Whitham et al. 1971 en la que se pesaron 100 gramos de tejido fresco y se cortó en pedazos pequeños para que pudieran ser macerados con 5 ml de acetona al 80% y se dejó reposar por 3 minutos en la oscuridad; posteriormente se centrifugó al 14000 rpm por 30 minutos. Se decantó en tubos de vidrio, se afora a 10 ml y se dejó reposar 10 minutos, se midió la absorbancia a 645 y a 633 nm en un espectrofotómetro de la marca Shimadazu UV_1201S y se procedió a realizar los siguientes cálculos: ( ( ) ( )) ( ) ( ( ) ( )) ( ) ( ( ) ( )) ( ) 4.3.1.9 Solidos solubles totales. 45 Para esta técnica se utilizó un refractómetro, que arrojó como resultado la cantidad de solidos solubles totales; consideramos al jugo de fruta como una sustancia constituida por agua. Se colocó una muestra sobre el prisma del refractómetro (dos o tres gotas), la tapa se presionó para asegurar que no
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