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Que UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA ESTUDIO DE LAS VARIANTES ALÉLICAS (RS1042642 Y RS2032582) EN EL GEN ABCB1 Y DE LA VARIANTE (RS2231142) EN EL GEN ABCG2 EN PACIENTES PEDIÁTRICOS CON DIAGNÓSTICO DE LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA P R E S E N T A BLANCA ERICKA BAUTISTA CADENA MÉXICO, D. F. 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: DRA. SOBEIDA SÁNCHEZ NIETO VOCAL: DR. SAMUEL CANIZALES QUINTEROS SECRETARIO: DRA. LUZ MARÍA TORRES ESPÍNDOLA 1er. SUPLENTE: QFB. ALEJANDRO ZAMORANO CARRILLO 2° SUPLENTE: DR. IGNACIO GONZÁLEZ SÁNCHEZ SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA, INSTITUTO NACIONAL DE PEDIATRÍA, TORRE DE INVESTIGACIÓN “JOAQUÍN CRAVIOTO” ASESOR DEL TEMA: Dra. Luz María Torres Espíndola SUPERVISOR TÉCNICO: Dr. Juan Luis Chávez Pacheco SUSTENTANTE: Blanca Ericka Bautista Cadena 3 CONTENIDO ÍNDICE DE TABLAS ...........................................................................................................................................6 ABREVIATURAS...................................................................................................................................................8 RESUMEN ........................................................................................................................................................... 11 1.ANTECEDENTES ........................................................................................................................................... 12 1.1 Leucemia. ................................................................................................................................................... 12 1.1.1 Leucemia aguda .................................................................................................................................. 12 1.1.2 Leucemia crónica ................................................................................................................................ 13 1.2 Epidemiología de la leucemia en México. ...................................................................................... 13 1.3 Tratamiento para LLA en pacientes pediátricos. ........................................................................ 14 1.4 Metotrexato ............................................................................................................................................... 16 1.4.1 Mecanismo de acción ......................................................................................................................... 17 1.4.2 Farmacogenética del metotrexato. ............................................................................................. 18 1. 5 Transportadores de fármacos tipo ABC ........................................................................................ 19 1.5.1 Gen ABCB1. ......................................................................................................................................... 21 1.5.1.1 Proteína del gen ABCB1 ................................................................................................................ 22 1.5.1.2 Polimorfismos del gen ABCB1 .................................................................................................... 23 1.5.1.3 Impacto clínico de los polimorfismos C3435T (rs 1045642) y G2677T/A (rs 2032582) ........................................................................................................................................................... 25 1.5.1.3.1 Polimorfismo C3435T (rs 1045642)..................................................................................... 25 1.5.1.3.2 Polimorfismo G2677T/A (rs 2032582) ................................................................................ 25 1.5.2 Gen ABCG2 ............................................................................................................................................ 26 1.5.2.1 Proteína del gen ABCG2 ............................................................................................................... 27 1.5.2.2 Polimorfismos del gen ABCG2 .................................................................................................... 28 1.5.2.3 Impacto clínico del polimorfismo C421A (rs 2231142). .................................................. 29 2. HIPÓTESIS ................................................................................................................................................... 30 3. OBJETIVOS ................................................................................................................................................... 30 3.1 General........................................................................................................................................................ 30 3.2 Particulares ................................................................................................................................................ 30 4. JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................................................... 31 5. DISEÑO EXPERIMENTAL ......................................................................................................................... 32 5.1 Diseño del estudio .................................................................................................................................. 32 4 5.2 Población de estudio .............................................................................................................................. 32 5.2.1 Población objetivo ............................................................................................................................... 32 5.3 Criterios de selección ............................................................................................................................ 32 5.3.1 Criterios de inclusión ......................................................................................................................... 32 5.3.2 Criterios de exclusión ................................................................................................................ 32 5.3.3 Criterios de eliminación .................................................................................................................... 32 6. METODOLOGÍA ........................................................................................................................................... 33 6.1 Estrategia experimental ...................................................................................................................... 33 6.2 Toma de muestra .................................................................................................................................... 34 6.3 Separación de los leucocitos...............................................................................................................34 6.4 Extracción de DNA a partir de sangre periférica para banco de DNA ................................ 34 6.5 Cuantificación del DNA .......................................................................................................................... 35 6.6 Genotipificación por sondas TaqMan® ........................................................................................... 36 6.7 Cuantificación del Metotrexato mediante UPLC acoplado a masas. .................................... 38 7. RESULTADOS .............................................................................................................................................. 39 7.1 Características de la población de estudio .................................................................................... 39 7.2 Frecuencias de las variantes alélicas en el gen ABCB1 ............................................................ 39 7.3 Niveles de Metotrexato en sangre. .................................................................................................. 44 7.3.1 Asociación de la variante alélica (rs 1045642) en el gen ABCB1 con los niveles de metotrexato en sangre. ................................................................................................................................ 46 7.3.2 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 A) en el gen ABCB1 con los niveles de metotrexato en sangre. ......................................................................................................................... 48 7.3.3 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 T) del gen ABCB1 con los niveles de metotrexato en sangre. ................................................................................................................................ 49 7.3.4 Asociación de la variante alélica (rs 2231142) del gen ABCG2 con los niveles de metotrexato en sangre. ................................................................................................................................ 50 7.4 Niveles de Metotrexato en plasma................................................................................................... 51 7.4.1 Asociación de la variante alélica (rs 1045642) en el gen ABCB1 con los niveles de metotrexato en plasma ................................................................................................................................ 52 7.4.2 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 A) en el gen ABCB1 con los niveles de metotrexato en plasma ................................................................................................................................ 54 7.4.3 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 T) en el gen ABCB1 con los niveles de metotrexato en plasma ................................................................................................................................ 55 5 7.4.4 Asociación de la variante alélica (rs 2231142) en el gen ABCG2 con los niveles de metotrexato en plasma ................................................................................................................................ 56 8. DISCUSIÓN .................................................................................................................................................. 57 9. CONCLUSIÓN .............................................................................................................................................. 62 10. ANEXOS ...................................................................................................................................................... 63 11. REFERENCIAS ........................................................................................................................................... 67 6 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.Tasa de mortalidad en la población menor de 20 años, por principales tumores malignos, según sexo. ................................................................... 14 Tabla 2. Esquema de tratamiento para LLA conforme al grado de riesgo. ......... 15 Tabla 3. Dosis administradas de metotrexato dependiendo el tipo de riesgo. .... 15 Tabla 4. Efectos clínicos de los genes de la familia de transportadores ABC ..... 20 Tabla 5. Frecuencia alélica reportada por HapMap para los SNPs rs 2032582 y rs 1045642. ................................................................................................. 24 Tabla 6. Frecuencia alélica reportada por HapMap para los SNPs rs 2231142 y rs 2231137. ................................................................................................. 29 Tabla 7. Sondas que se emplearon en la genotipificación para cada gen. ......... 36 Tabla 8. Mezcla de reacción para el ensayo de discriminación alélica. .............. 37 Tabla 9. Datos de la población de estudio. .................................................... 39 Tabla 10. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 1045642. ............. 40 Tabla 11. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2032582A. ........... 41 Tabla 12. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2032582T. ........... 42 Tabla 13. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2231142. ............. 43 Tabla 14. Datos de las medianas y percentiles 25 y 75 de sangre y plasma, en los distintos tiempos de la obtención de la muestra (2, 24 y 36 h). ................ 46 Tabla 15.Concentración del MTX a las 2, 24 y 36 h al inicio de la infusión de MTX en plasma. ............................................................................................... 51 Tabla 16. Datos de las medianas y percentiles 25 y 75 de sangre y plasma, en los distintos tiempos de la obtención de la muestra (2, 24 y 36 h). ................ 52 Tabla 17. Frecuencias alélicas y génicas del gen ABCB1 polimorfismo rs 1045642, en distintas poblaciones. ............................................................................ 59 Tabla 18. Frecuencias alélicas y génicas del gen ABCB1 polimorfismo rs 2032582 T/A, en distintas poblaciones. ..................................................................... 60 Tabla 19. Frecuencias alélicas y génicas del gen ABCG2 polimorfismo rs 2231142, en distintas poblaciones. ............................................................................ 61 7 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura química del Metotrexato. ............................................... 16 Figura 2. Mecanismo de acción del Metotrexato.. .......................................... 17 Figura 3. Representación esquemática del cromosoma 7. ............................... 21 Figura 4. Estructura del gen ABCB1. . .......................................................... 21 Figura 5. Glicoproteína gp (P-gp). ............................................................... 22 Figura 6. Representación esquemática del cromosoma 4. ............................... 26 Figura 7. Estructura del gen ABCG2 y su proteína derivada.. .......................... 26 Figura 8. Representación esquemática de la proteína del gen ABCG2. .............. 27 Figura 9. Sondas TaqMan.. ......................................................................... 36 Figura 10. Condiciones de la amplificación. .................................................. 37 Figura 11. Curva de discriminación alélica del SNP rs 1045642. ...................... 40 Figura 12. Curva de discriminación alélica del rs 2032582A. ........................... 41 Figura 13.Curva de discriminación alélica del rs 2032582T.. ........................... 42 Figura 14 Curva de discriminación alélica del rs 2231142.. ............................. 43 Figura 15. Monitoreo de la concentración de MTX del paciente LAL 45. ............. 44Figura 16. Concentraciones de MTX a las 2, 24 y 36 h al inicio de la infusión de MTX en sangre de 28 pacientes. .................................................................. 45 Figura 17. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 1045642), del gen ABCB1 en sangre ........................................................................... 47 Figura 18. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2032582A), del gen ABCB1, en niveles sanguíneos........................................ 48 Figura 19. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2032582 T), del gen ABCB1, en niveles sanguíneos. ................................................... 49 Figura 20. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2231142), del gen ABCG2, en niveles sanguíneos.. ....................................................... 50 Figura 21. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 1045642), del gen ABCB1, en niveles plasmáticos. ....................................................... 53 Figura 22. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2032582A), del gen ABCB1, en niveles plasmáticos.. ...................................................... 54 8 Figura 23. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2032582T), del gen ABCB1, en niveles plasmáticos. ...................................... 55 Figura 24. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2231142), del gen ABCG2, en niveles plasmáticos. ....................................................... 56 9 ABREVIATURAS Cuando en esta tesis se haga referencia a las siguientes abreviaturas, se entenderá: µg Nanogramo µmol Micromol µL Microlitro °C Grado Celsius ABC Transportador de membrana dependiente de ATP Ala Alanina ATP Adenosín trifosfato BCRP Proteína de Resistencia a Cáncer de Mama CA California CONAPO Consejo Nacional de Población dbSNP Base de Datos de Polimorfismos de un Solo Nucleótido DHFR Dihidrofolato Reductasa DNA Ácido desoxirribonucleico dUMP Desoxiuridinmonofosfato EDTA Ácido Etilendiaminotetraacético FH2 Dihidrofolato FH4 Tetrahidrofolato FPGS Poliglutamato Sintetasa GGH Gamma Glutamil Hidrolasa Gln Glutamina h Horas HCT Hidrocortisona HMG-CoA 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A Ile Isoleucina IMSS Instituto Mexicano del Seguro Social INEGI Instituto Nacional de Estadística y Geografía INP Instituto Nacional de Pediatría ISSSTE Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado kb Kilobase kDa Kilodalton L Litro L-Ap L-Asparagina LLA Leucemia Linfoblástica Aguda LLC Leucemia Linfocítica Crónica LMA Leucemia Mieloide Aguda LMC Leucemia Mieloide Crónica Lys Lisina 10 MATE Transportador de Extrusión de Múltiples Antibióticos y Compuestos Tóxicos MGB Unión a Surco Menor min Minutos mL Mililitros MTHFR Metilentetrahidrofolato Reductasa MTX Metotrexato MXR Proteína Resistente a Mitoxantrona NCBI Centro Nacional para la Información Biotecnológica NFQ Inhibidor No Fluorescente nm Nanómetro OAT Transportadores de Aniones Orgánicos OMS Organización Mundial de la Salud PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa P-gp o PGP Glicoproteína G RFC Transportador de Folato Reducido RNA Ácido ribonucleico RNAm Ácido ribonucleico mensajero Ser Serina SNC Sistema Nervioso Central SNP Polimorfismo de un solo Nucleótido Thr Treonina TIT Tratamiento Intratecal Triple TMP Timidinmonofosfato TTP Timidintrifosfato UPLC Cromatografía Líquida de Ultra Eficacia USA Estados Unidos de América UV/Vis Ultravioleta-Visible VIH Virus de Inmunodeficiencia Humana 11 RESUMEN Antecedentes. En México, la leucemia es una de las causas principales de morbilidad y mortalidad en población pediátrica y el tratamiento de esta enfermedad implica quimioterapia, inmunoterapia y agentes que modifican la respuesta biológica, de los cuales la quimioterapia es el más efectivo y siendo el metotrexato (MTX) el de mayor empleo en las fases de consolidación y mantenimiento durante el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (LLA). Sin embargo, algunas células cancerosas generan resistencia a diferentes medicamentos, por lo que existe un impedimento a una respuesta exitosa a la quimioterapia, esta resistencia generalmente resulta de la expresión de bombas de flujo dependientes de ATP, siendo principalmente los transportadores ABCB1 MDR- 1) y ABCG2 (BCRP O MXR), que de manera normal tienen una función de protección contra metabolitos, xenobióticos; pero en los cánceres se encuentran sobre expresados. En este trabajo se investigaron los SNPs (rs 1045642 y rs 2032582, del ABCB1 y el rs 2231142 del ABCG2) asociados con altos niveles del fármaco y sus frecuencias alélicas y genotípicas, así como la relación entre éstos y los niveles del MTX en sangre y plasma. Metodología. DNA genómico de 92 pacientes (1-19 años de edad) fue genotipificado identificando polimorfismos ABCB1 C3535T, G2677T/A y ABCG2 C421A, mediante la técnica de discriminación alélica con el uso de sondas TaqMan de Applied Biosystems. Muestras de sangre de 28 pacientes, tomadas a las 2, 24 y 36 h durante la quimioterapia, de las cuales se obtuvo el plasma para la cuantificación del MTX en ambas muestras, por medio de cromatografía líquida de ultra eficacia (UPLC) de fase reversa. La relación entre los polimorfismos y los niveles de MTX de ambos transportadores fueron analizados estadísticamente. Resultados. Las frecuencias que se encontraron en esta población, para el polimorfismo rs 1045642 el genotipo más frecuente fue el GA (53.1%); para el rs 2031142A el genotipo de mayor frecuencia fue CC (44.6%); para el rs 2031142T el genotipo de mayor frecuencia fue CC (87.2%) del gen ABCB1 y para el polimorfismo estudiado rs 2231142 del gen ABCG2, el genotipo más frecuente es GG (46.8%). En la cuantificación del MTX en sangre la mediana de la concentración a las 2 h fue de 41.1 µmol/L (Q25 24.7-Q75 52.2), a las 24 h fue de 16.7 µmol/L (Q25 2.6- Q75 23.4) y a las 36 h la mediana encontrada fue de 0.7 µmol/L (Q25 0.5-Q75 1.5). Las medianas de la concentración de MTX en plasma a las 2 h fue de 54.4 µmol/L (Q25 37.2-Q75 66.6), a las 24 h de 16.7 µmol /L (Q25 2.1- Q75 31.57) y a las 36 h la mediana de la concentración de MTX fue de 1.04 µmol /L (Q25 0.56-Q75 2.05). Conclusiones. No se encontró asociación entre el genotipo y los niveles de MTX en sangre ni en plasma en esta cohorte de pacientes analizada. 12 1. ANTECEDENTES 1.1 Leucemia. La leucemia se define como: un grupo heterogéneo de neoplasias malignas del sistema hematopoyético, que involucra la transformación de células progenitoras linfoides, y menos frecuentemente la transformación de progenitoras de las líneas celulares mieloides, de monocitos, eritroides y megacariocíticas. Las alteraciones que contribuyen a la transformación leucémica de las células hematopoyéticas madres afecta a los procesos regulatorios aumentando de forma ilimitada la capacidad de autorrenovación, lo que produce una pérdida del control de la proliferación normal, bloqueo en la diferenciación y resistencia a la muerte celular programada 1,2,3. La leucemia se clasifica en aguda (crece rápidamente) o crónica (crece lentamente), siendo más frecuente y la primer causa en niños y adolescentes (uno de cada tres casos) la leucemia linfocítica aguda (LLA) y en menor proporción la mieloide aguda 4; las leucemias linfoblásticas agudas generalmente se presentan después del primer año de vida hasta la adolescencia 5. 1.1.1 Leucemia aguda Los tipos principales de leucemia aguda son: Leucemialinfocítica aguda (linfoblástica) (LLA) (acute lymphocytic leukemia, ALL): Alrededor de tres de cuatro leucemias en niños son LLA. Esta leucemia se origina de formas tempranas de linfocitos en la médula ósea. Leucemia mieloide aguda (LMA) (acute myelogenous leukemia, AML): Este tipo de leucemia también llamada leucemia mieloide aguda, leucemia mielocítica aguda o leucemia no linfocítica aguda, representa la mayoría de los casos remanentes. La LMA se inicia a partir de las células mieloides que forman los glóbulos blancos (que no son linfocitos), los glóbulos rojos o las plaquetas. Leucemia de linaje híbrido o mixto: En estas leucemias poco comunes, las células tienen características de la LLA y de la LMA. En niños, son generalmente tratadas como la LLA y usualmente responden a este tratamiento como la LLA. 4 13 1.1.2 Leucemia crónica Este tipo de leucemia es más común en adultos que en niños, se desarrollan más lentamente que las agudas y se dividen en dos tipos: Leucemia mieloide crónica (LMC) (chronic myelogenous leukemia, CML): Esta leucemia ocurre rara vez en niños. El tratamiento es similar al empleado en adultos. Leucemia linfocítica crónica (LLC) (chronic lymphocytic leukemia, CLL): Esta leucemia se presenta muy pocas veces en los niños. 4 1.2 Epidemiología de la leucemia en México. Por sexo y grupo de edad, se observa que las leucemias afectan más a los hombres que a las mujeres; es en los primeros años de vida cuando la brecha por sexo es más estrecha (52.5 y 47.5%, respectivamente), ésta se incrementa en cada uno de los grupos de edad hasta llegar a una diferencia de 28.4 puntos porcentuales en la población de 15 a 19 años 6. Si referimos sólo al grupo de edad de 0 a 14 años, la OMS reporta 1 691 defunciones en el 2012 con una tasa de mortalidad de 5.1 por cada 100 000 habitantes, siendo el sexo masculino el más afectado con una tasa de 5.5 y el femenino 4.8. Los tipos de cáncer con mayor tasa de mortalidad en este grupo de edad son leucemias, tumores de SNC y Linfoma no Hodking, en ese orden, sin diferencias significativas en la distribución por sexo 7. A pesar de los esfuerzos de las instituciones para diagnosticar y atender a las personas con cáncer, muchos mexicanos mueren por esta causa. En el Distrito Federal, en 2012, del total de defunciones de residentes habituales de la entidad, 14.2% se debieron a algún tumor y de éstas, 94.3% por neoplasias (tumores) malignas. Del total de muertes de jóvenes menores de 20 años (2 mil 946), se tiene que 5.6% fallecieron por algún tumor, de los cuales 87.3% eran cancerosos, principalmente en órganos hematopoyéticos con una tasa de mortalidad de 3.0 defunciones por cada 100 mil personas en esa edad, siendo más alta en los hombres que en las mujeres (3.7 y 2.3 por cada 100 mil personas de cada sexo, respectivamente Tabla 1); la segunda causa de muerte en esta población es por cáncer en encéfalo y otras partes del sistema nervioso central (uno de cada 100 mil personas menores de 20 años) 6. 14 Tabla 1.Tasa de mortalidad en la población menor de 20 años, por principales tumores malignos, según sexo. Fuente: INEGI (2014). Estadísticas de mortalidad. Base de datos 2012 y CONAPO (2014). Proyecciones de la población en México 2010-2050. 1.3 Tratamiento para LLA en pacientes pediátricos. En nuestro país, los gastos del tratamiento para cáncer infantil como la leucemia linfoblástica y mieloblástica aguda en pacientes que no son derechohabientes del IMSS o ISSSTE son absorbidos por el Seguro Popular mediante el Fondo de Protección para Gastos Catastróficos 8, el cual incluye la adquisición de medicamentos como predisona, ácido folínico, hidrocortisona, ciclofosfamida, L- asparaginasa y antineoplásicos como citarabina, vincristina, 6-mercaptopurina y MTX; este último es el fármaco de mayor uso en la fase de consolidación para el tratamiento de la LLA (Protocolo de la Atención para Leucemia Linfoblástica).9 En las LLA infantil se acostumbra a identificar 3 grupos pronósticos que además condicionarán el protocolo terapéutico a emplear: Bajo riesgo (25-30% de los casos). Son paciente con edades comprendidas entre 1 y 9 años, con pocos leucocitos al diagnóstico, con fenotipo B común o pre-B, sin infiltración de sistema nervioso u otros territorios, sin alteraciones citogenéticas o moleculares y que responden bien al tratamiento de inducción. Alto riesgo (12-15% de los casos). Son pacientes fuera de los rangos de edad mencionados, con alteraciones citogenéticas y/o moleculares que no responden adecuadamente al tratamiento de inducción. Riesgo intermedio (55-60% de los casos). Todas las restantes, excepto en menores de 1 año y en pacientes con fenotipo B maduro que requieren de tratamientos diferenciados. Muy alto riesgo, si tiene respuesta rápida o lenta los primero 7 días de terapia de inducción. De acuerdo a los “Protocolos técnicos cáncer en niños”, la LLA puede tratarse con diferentes esquemas de acuerdo al grado de riesgo (Tabla 2). Cada esquema de Principales tumores malignos Total Hombres Mujeres Órganos hematopoyéticos 3.0 3.7 2.3 Encéfalo y otras partes del sistema nervioso central 1.0 0.9 1.2 Tejido linfático y afines 0.3 0.4 0.2 Tumores malignos de los huesos y de los cartílagos articulares 0.3 0.4 0.2 Tumores malignos de los órganos genitales masculinos/femeninos 0.2 0.4 0.1 15 tratamiento comprende al menos cuatro segmentos durante el tratamiento: a) Inducción a la remisión, b) Consolidación, c) Mantenimiento de la quimioterapia y d) la fase final de cese electivo de la quimioterapia 10. Tabla 2. Esquema de tratamiento para LLA conforme al grado de riesgo. Bajo riesgo Riesgo habitual Alto riesgo Muy alto riesgo Vincristina Vincristina Vincristina Vincristina L-asparagina L-asparagina L-asparagina L-asparagina Prednisona Prednisona Prednisona METOTREXATO METOTREXATO METOTREXATO METOTREXATO 6-Mercaptopurina 6-Mercaptopurina 6-Mercaptopurina 6-Mercaptopurina Hidrocortisona Hidrocortisona Hidrocortisona Hidrocortisona Ara-C Ara-C Ara-C Ara-C Dexametasona Dexametasona Dexametasona Dexametasona Leucovorin Leucovorin Leucovorin Leucovorin Ciclofosfamida Ciclofosfamida Ciclofosfamida Doxorrubicina Doxorrubicina Daunorrubicina Daunorrubicina Etopósido Etopósido 6-Tioguanina De acuerdo con la Tabla 2, el MTX y la 6-mercaptopurina son fármacos de amplio uso en la quimioterapia y con predominancia en el éxito terapéutico; el MTX se administra en dosis dependientes del tipo de riesgo y de acuerdo a esquemas de varios fármacos 6-mercaptopurina, MTX, leucovorin, TITmetotrexato+HCT , Ara- C,L-Ap Tabla 3.10 Tabla 3. Dosis administradas de metotrexato dependiendo el tipo de riesgo. Tipo de riesgo Dosis Administración Muy bajo 2 g/m2 4 sesiones (1 por semana) Riesgo habitual 2 g/m2 3 sesiones (días 36,68 y 94) Alto riesgo (pre-B) 2 g/m2 2 sesiones (días 47 y 54) Alto riesgo (pre-T) 5 g/m2 4 sesiones(días 8,22,36 y 50) Muy alto riesgo 5 g/m2 4 sesiones (días 1 y 8 del curso MARAM y del VIMARAM) 16 1.4 Metotrexato Es un antagonista del ácido fólico, introducido en 1950 como un fármaco en la quimioterapia contra el cáncer y sigue siendo de gran importancia en la terapia contra la Leucemia Linfoblástica Aguda 11. El compuesto (N-[4-[[(2,4-diamino-6- pteridinil)metil] metil-amino] benzoil]-Lácido glutámico es un fármaco citotóxico del grupo de los antimetabolitos (Figura 1)12. Inhibidor reversible de la dihidrofolato reductasa (DHFR), necesaria para la conversión del ácido fólico a su forma activa el tetrahidrofolato (FH4), que sirve como donador de carbono para la síntesis de la timina in vivo, por lo que el MTX actúa como un potente inhibidor de la síntesis de DNA; clasificándose comoun agente específico de fase, eliminando células durante la fase S del ciclo celular 13. Es ampliamente utilizado para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda, cáncer de mama, de testículo y de pulmón, linfoma No-Hodgkin, linfosarcoma, osteosarcoma y en enfermedades como la artritis reumatoide, psoriasis, dermatomiositis y sarcoidosis10. Figura 1. Estructura química del Metotrexato. 17 1.4.1 Mecanismo de acción El ingreso del MTX a la célula está mediado por la vía receptor de folatos y por el transportador de membrana RFC (Reduced Folate Carrier), debido a su similitud estructural. Cuando está en el interior de la célula es poliglutamizado por la enzima poliglutamato sintasa 14, tanto el MTX como el MTX poliglutamizado [MTX (Glu)n] inhiben a la enzima DHFR, evitando la formación del tetrahidrofolato (FH4) que impide la formación de purinas y en consecuencia la síntesis del DNA (Figura 2)15. Figura 2. Mecanismo de acción del Metotrexato. Se observan los transportadores involucrados en la salida del fármaco, así como las enzimas involucradas. Dónde: Timidinmonofosfato (TMP), desoxiuridinmonofosfato (dUMP), dihidrofolato (FH2), timidintrifosfato (TTP) y metil tetrahidrofolato reductasa (MTHFR). 18 1.4.2 Farmacogenética del metotrexato. La farmacogenética investiga la variabilidad genética interindividual en una secuencia de DNA de blancos de fármacos, enzimas, transportadores de fármacos o genes asociados a alguna enfermedad, expresión de RNA o en la traducción de proteínas de genes que afectan la respuesta de los medicamentos así como su seguridad 13. Múltiples transportadores y enzimas participan en el metabolismo del ácido fólico y muchos de ellos demuestran polimorfismos genéticos que pueden afectar el metabolismo y actividad del metotrexato 10; por lo que las diferencias en la secuencia de los genes, como las causadas por polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), pueden provocar cambios en la secuencia de aminoácidos. El cambio en la secuencia de la proteína puede alterar el efecto del fármaco y/o la actividad sobre éste, en consecuencia afectar la eficacia del tratamiento 16. Uno de los cambios con mayor frecuencia a nivel molecular son las variaciones puntuales en la secuencia, ya sean inserciones/deleciones o sustituciones de una sola base nitrogenada (Single Nucleotide Polymorphism, SNP). Los SNP´s que afectan la secuencia codificante de una proteína pueden modificar (llamados no sinónimos) o no (llamados sinónimos) la cadena de aminoácidos; son importantes los SNP´s localizados en regiones no codificantes, ya que tienen consecuencias en los procesos de splicing y/o en la unión de los factores de transcripción 17. En el caso del MTX se han realizado múltiples ensayos para describir la relevancia de polimorfismos en enzimas relacionadas a su efecto (MTHFR, DHFR, AICAR), así como en proteínas de transporte- excreción (RFC, transportadores del tipo ABC) y en enzimas del metabolismo del fármaco (FPGS y GGH). 19 1. 5 Transportadores de fármacos tipo ABC Los transportadores son proteínas integrales de membrana que median la translocación de sustancias químicas, fármacos y otras moléculas dentro y fuera de las células utilizando mecanismos activos y pasivos 18. Este tipo de transportadores se expresan en el hígado, intestino delgado, placenta y barrera hematoencefálica, donde juega un papel muy importante en la absorción, distribución y excreción. En el riñón del ser humano, estos transportadores se expresan en la membrana apical luminal de las células epiteliales del túbulo proximal. 19 En los transportadores de salida se incluyen: la familia de transportadores de membrana dependiente de ATP (ATP-Binding Cassette, ABC) y la familia de transportadores de extrusión de múltiples antibióticos y compuestos tóxicos (Multidrug Toxin Extrusion Proteins, MATES). Son tres tipos de transportadores de entrada: los transportadores de aniones orgánicos (Organic Anion Transporters, OATs), los transportadores de cationes orgánicos (Organic Cation Transporters, OATPs) y transportadores de oligopéptidos. Además de sustancias fisiológicas, los fármacos también son sustratos para algunos transportadores y afectan en su absorción, su distribución en los tejidos y la eliminación de los fármacos, es decir, están implicados en la determinación de las concentraciones de los fármacos en plasma y tejidos periféricos, afectando así la eficacia y toxicidad de los fármacos 20. La familia de transportadores de membrana dependiente de ATP (ABC), forman un total de 49 proteínas en humanos, por lo que es la familia más grande de proteínas transmembranales que se unen al ATP y utilizan la energía para el transporte de diversas sustancias, se clasifican en siete familias (ABCA-ABCG) basadas en el dominio de unión a nucleótido y de dominios transmembranales 18, 20. Los transportadores ABC se han encontrado en barreras tisulares y órganos excretores, donde el flujo de sustancias de un órgano a otro es gracias a un gradiente de concentración, son conocidos como transportadores de resistencia a multi-fármacos (Multidrug Resistance Transporters MDRs o MDR1 o ABCB1) debido a que ayudan al flujo de quimioterapéuticos y otros fármacos a sus células blanco; se conocen 49 genes de los transportadores ABC, pero los que están involucrados en el transporte de fármacos son los ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCC3 y ABCG2; en la Tabla 4 se muestran las implicaciones clínicas de estos transportadores 21. 20 Tabla 4. Efectos clínicos de los genes de la familia de transportadores ABC (Tabla modificada de Yiannakopoulou, 2013). Gen Genotipo Nucleótido afectado Fármaco afectado Efecto ABCB1 TT C3435T Digoxina Disminución de concentraciones plasmáticas después de la administración oral TT C3435T Clopidogrel Disminución de biodisponibilidad con altos grados de efectos adversos cardiovasculares (muerte, infarto al miocardio, accidente cerebrovascular no fatal) CT y TT C3435T Taxano Neutropenia y neuropatía periférica ABCG2 S/D R482G/T (líneas celulares) Antraciclinas, mitoxantrona, camptotecinas Niveles altos de resistencia debida a sobreexpresión del transportador. CA Gefitinib Diarrea ABCC11 G538A Metotrexato Eficacia quimioterapéutica, afecta la función y estabilidad de la síntesis de novo de la proteína ABCC2 CC −24C>T Irinotecan Mielosupresión GG c.1774G>del c.1249G>A Diclofenaco Hepatotoxicidad 21 1.5.1 Gen ABCB1. El gen ABCB1 de humano también conocido como proteína de permeabilidad o MDR122 está localizado en la región cromosómica 7q21.12 (Figuras 3 y 4), compuesto de 209,461 pares de bases 23, de 29 exones y el RNAm consiste en 4872 pares de bases, que codifica para una proteína transportadora de membrana llamada P-glicoproteína, P-gp o PGP con peso de 170kDa y constituida de 1200 aminoácidos. Pertenece a un grupo de genes que carecen de la caja TATA, dentro de la región proximal del promotor, por lo que inicia con la secuencia iniciadora (Inr) y está compuesto de una secuencia CCAAT (-82 a -73)24. Figura 3. Representación esquemática del cromosoma 7. Brazo corto del cromosoma, posición 7q21.12. Fuente: NCBI-Map Viewer Figura 4. Estructura del gen ABCB1. (Tanabe M, et al 2001). Se muestran los polimorfismos de este gen, así como el exón donde se localizan. 22 1.5.1.1 Proteína del gen ABCB1 El gen ABCB1 codifica para la proteína transportadora dependiente deATP, P- glicoproteína, P de permeabilidad, (PGP, p-gp); la cual es una glicoproteína integrante de la membrana plasmática de 170 kDa, perteneciente a la súper familia ABC, tiene dos miembros humanos (MDR1, MDR2/3) y tres miembros en roedores (mdr1,mdr2 y mdr3); se ha demostrado que las células MDR1 expresan el fenotipo de multirresistencia y la sobre expresión de MDR2/3 no está implicada en la resistencia celular 25. La secuencia de sus aminoácidos muestra la presencia de dos grupos de seis dominios transmembrana y dos sitios de unión al ATP mismos que lo hidrolizan sitio blanco de inhibidores (Figura 5) 25. La función de ABCB1 es secretar agentes tóxicos generados en la célula y cuando se sobre-expresa, actúa como una “bomba expulsora” de agentes quimioterapéuticos, que al retirar a los fármacos deja viva a la célula cancerígena.26 La expresión de P-gp determina un fenotipo celular resistente a xenobióticos tóxicos y agentes quimioterapéuticos incluyendo las antraciclinas, alcaloides de la vinca, taxanos, etopósido, inhibidores de la tirosin cinasa, como el Imatinib, el Nilotinin y Dasatinib; inhibidores de la proteasa de VIH, así como inhibidores de la HMG-CoA .27,28 En los humanos, se expresa en la membrana apical del epitelio mucoso del tracto gastrointestinal, en la membrana de los canales biliares de los hepatocitos y en la superficie apical de las células de los túbulos proximales del riñón. 20 Figura 5. Glicoproteína gp (P-gp). Modelo bidimensional de 1280 aminoácidos, los círculos negros indican las mutaciones puntuales que alteran la especificidad del sustrato de la P-gp, las zonas azules el sitio de unión de ATP (Cascales M, 2012). Regiones de fotoafinidad: Zonas con moléculas biológicamente activas que se unen covalentemente a las enzimas o ligandos proteicos, la unión se realiza por activación con luz ultravioleta. Estas regiones son utilizadas para la identificación de los sitios de enlace en proteínas. 23 1.5.1.2 Polimorfismos del gen ABCB1 Se ha encontrado más de 76 SNP´s para el gen ABCB1, de ellos solo 47 llevan a un cambio en la composición de aminoácidos y los 29 que restan se consideran silenciosos. Los SNP´s con mayor relevancia clínica son C1236T (silencioso), G2677T/A (Ala893Ser/Thr) y C3435T (Ile 1145 Ile) 23 y otros polimorfismos afectan la función bien caracterizada de este gen. El SNP rs1045642, es un polimorfismo sinónimo (Ile) en el exón 27, también nombrado C3435T 28, con secuencia AAGAGAT [A/C/T] GTGAGGG, el cual modifica la expresión del gen para la proteína P-gp sin alterar la secuencia de esta (mutación puntual) 29, sin embargo altera los procesos de splicing (corte y empalme), proceso de regulación y traslocación del RNAm; así como el plegado de la proteína lo que lleva a la modificación de su especificidad. 30 Simon T, et al. en el año 2009, sugirió que los individuos homocigotos TT para esta variante, cuando son tratados con clopidogrel, tienen niveles más bajos de metabolito activo del fármaco y en consecuencia presentan mayores reacciones adversas (P=0.009). 31 El SNP rs 2032582, es un polimorfismo no sinónimo localizado en el exón 21, también nombrado G2677T/A, con secuencia CTAGAAGGT [G/C/T] GGGAAGGT, el SNP GCT codifica para Alanina, TCT para Serina y ACT para Treonina en el aminoácido 893 de la secuencia proteica, en esta última variante disminuye la actividad en comparación con 893 Ser, por lo que al igual que el C3435T, se relacionan con variaciones en la farmacocinética. 32 El SNP rs 1128503, es un polimorfismo que no ocasiona un cambio de aminoácido (sinónimo) manteniendo el aminoácido glicina 33 localizado en el exón 12, también nombrado C1236T. Su efecto su asocia al afectar a la inserción de la gp-P en la membrana34; también a diversas manifestaciones clínicas, como es el caso de la epilepsia y leucemia mieloide aguda. 35 24 La frecuencia génica reportada por la base HapMap (Tabla 5) para los polimorfismos C3435T (rs1045642) y G2677A (rs 2032582) de ABCB1: Tabla 5. Frecuencia alélica reportada por HapMap para los SNPs rs 2032582 y rs 1045642. rs 2032582 rs 1045642 Origen étnico Alelo T Alelo C Alelo A Alelo G CEU (Europeo) 0.469 0.531 0.571 0.429 MEX(Mexicanos en EU) 0.430 0.570 0.460 0.540 HCB (Este de Asia) 0.589 0.411 0.402 0.598 JPT (Japonés) 0.552 0.448 0.459 0.541 MKK (Kenia, África) 0.087 0.913 0.152 0.848 ASW (Africanos en EU) 0.094 0.906 0.202 0.798 CHD (Chinos en EU) 0.506 0.494 0.369 0.631 GIH (Hindús en EU) 0.653 0.347 0.597 0.403 25 1.5.1.3 Impacto clínico de los polimorfismos C3435T (rs 1045642) y G2677T/A (rs 2032582) 1.5.1.3.1 Polimorfismo C3435T (rs 1045642) Este polimorfismo (C3435T) es el más estudiado y sus frecuencias génicas difieren entre los distintos grupos étnicos, como por ejemplo, según lo descrito por Kishi S, et al, en el 2004, para el genotipo CC se reporta que está asociado (p= 0.16) con un incremento en la “clarificación” de etopósido en niños con LLA. 36 Leal –Ugarte y cols., en el 2008, reportaron la frecuencia génica de este SNP para población pediátrica mexicana en 107 niños con LLA y 111 niños sanos, no se encontró asociación de genotipos con mayor riesgo de esta neoplasia (frecuencias: CC=0.17 vs 0.14; CT=0.61 vs 0.53 y TT=0.22 vs 0.33 en niños con LLA y sanos, respectivamente), no hubo diferencias significativas en frecuencias alélicas (p>0.176) y frecuencia genotípica (p>0.255), aunque no se determinó riesgo por toxicidad, niveles plasmáticos de antineoplásicos o variables de mejoría entre los 16.37 1.5.1.3.2 Polimorfismo G2677T/A (rs 2032582) En estudios en población egipcia de 96 pacientes con leucemia mieloide crónica comparándolos con 90 pacientes sanos, bajo tratamiento con Imatinib, Elghannam D y colaboradores reportaron que hubo diferencia significativa en la frecuencia de los pacientes con resistencia y respuesta al fármaco (p=0.02), el genotipo TT se asoció con respuesta hematológica completa (p=0.01) y mejor respuesta (p<0.001), relacionado también con factor protector contra resistencia a Imatinib (p=0.008).38 26 1.5.2 Gen ABCG2 ABCG2, también conocida como proteína de resistencia del cáncer de mama (Breast cancer resistance protein, BCRP) 17 o proteína resistente a mitoxantrona (Mitoxantrone-resistant protein, MXR) 39, es el segundo miembro de la familia G de los transportadores ABC. Se encuentra localizado en la región cromosómica 4q22 (Figura 6) compuesto de 16 exones de más de 66 kb que codifica a una proteína de membrana con peso de 72 kDa y constituida de 655 aminoácidos. 38 En la Figura 7, se muestra la estructura de este gen de humanos y de la proteína derivada del mismo (BCRP), mostrándose la ubicación de los polimorfismos más estudiados. 40 Figura 6. Representación esquemática del cromosoma 4. Brazo corto del cromosoma, posición 4q22. Fuente: NCBI-Map Viewer. Figura 7. Estructura del gen ABCG2 y su proteína derivada. (Staud y Pavek, 2005). Se muestra la región de unión de nucleótidos (NBD, Nucleotide Binding Domain) y las regiones transmembrana (TM, Transmembrane regions). 27 1.5.2.1 Proteína del gen ABCG2 El gen codifica para una proteína transmembranal de 72 kDa (similar a la proteína P-gp), que consta de seis dominios y un sitio de unión al ATP, funciona como un homodímero u homotetrámero para trasladar los sustratos de manera eficiente a través de la membrana celular (Figura 8). 41 Figura 8. Representación esquemáticade la proteína del gen ABCG2. Modelo bidimensional, se muestra el sitio de glicosilación (Υ) y el sitio de unión al ATP. (Imagen modificada Sharom, 2008). Esta proteína tiene una función protectora de sustancias tóxicas, se expresa en células de órganos clave para la biodisponibilidad de fármacos y se ha sugerido que podría ejercer como mecanismo compensatorio ante el incremento de sustratos asociados al estrés oxidativo.42 La expresión de ABCG2 se correlaciona con el mantenimiento de la población en situación de pluripotencialidad, participando en la autorrenovación, así como en la regeneración de tejido dañado. En humanos sanos, se expresa en varios tejidos incluyendo placenta, cerebro, próstata, testículo, hígado, intestino delgado, colon, ovario, riñones y corazón.43 Algunos sustratos de este transportador son antibióticos (nitrofurantoína, fluoroquinolonas), la vitamina B2, la biotina, el ácido úrico y los ácidos biliares.44 Altos niveles de expresión de la proteína se ha asociado con la resistencia a agentes anticancerígenos, incluyendo antraciclinas, mitoxantrona y camptotecinas, MTX, topotecan, estatinas, entre otros y compuestos no terapéuticos como los flavonoides y porfirinas. 36 Se ha detectado su expresión en leucemias agudas y en tumores sólidos, como cáncer de pulmón.45 28 1.5.2.2 Polimorfismos del gen ABCG2 Se han descrito 80 variaciones naturales de la secuencia, siendo 26 de polimorfismos no sinónimos, 5 polimorfismos sinónimos (c.114T>C, c.369C>T, c.474C>T, c.1098G>A y c.1425A>G), 3 mutaciones sin sentido (Q126X, E334X y R575X) y una mutación en el marco de lectura (c.1515delC). Los SNPs más frecuentes en humanos se localizan en el exón 2 (G34A dando lugar a V12M) y en el exón 5 (C421A dando lugar a Q141K).46 El SNP G34A (rs 2231137), se ha asociado con la susceptibilidad de linfomas de células B grandes difusas;47 este polimorfismo es del tipo no sinónimo y tiene una secuencia reportada de TTTTATCCCA GTG TCACAAGG, con cambio de Valina (GTG) a Metionina (ATG). El SNP C421A (rs 2231142) ha sido reportado generar una proteína de baja expresión y con baja actividad y se ha asociado con eventos adversos por MTX.48 Este SNP en el exón 5 no sinónimo, tiene una secuencia AACTTA CAG TTCTCA con cambio de Glutamina (CAG) a Lisina (AAG) en el codón 141 (Q141K).49 Otros SNPs descritos en pacientes japoneses, como el C376T (Q126Stop) en el cual la glutamina en posición 126 es sustituida por un codón de terminación 50 y el G1322A (S441N), pueden afectar la expresión y la localización celular del transportador 51 y éstos entre otros ( F208S, S248P y E334Stop) son caracterizados por presentar un transporte anormal de hematoporfirinas, lo que se sugiere que puede presentarse una mayor susceptibilidad a fototoxicidad inducida por porfirinas en individuos que presenten estos alelos. 52 29 La frecuencia génica reportada por la base HapMap (Tabla 6) para los SNPs de ABCG2, C421A (rs 2231142) y G34A (rs 2231137): Tabla 6. Frecuencia alélica reportada por HapMap para los SNPs rs 2231142 y rs 2231137. 1.5.2.3 Impacto clínico del polimorfismo C421A (rs 2231142). Suthandiram S y colaboradores, en el año 2014 evaluaron el impacto de este SNP con la toxicidad del MTX, en 71 pacientes asiáticos adultos con LLA o Linfoma no Hodgkin, midiendo niveles del MTX en plasma a las 48 h, pero no asociaron ninguna toxicidad, para los genotipos CA (p=0.922) y AA (0.591).53 Mesallamy E y colaboradores, también en el 2014, determinaron los niveles plasmáticos de MTX a las 23, 42 y 68 h en niños egipcios con LLA, y no encontraron diferencia estadística entre la concentración plasmáticas con pacientes con y sin el SNP.54 rs 2231142 rs 2231137 Origen étnico Alelo T Alelo C Alelo A Alelo G CEU (Europeo) 0.889 0.111 0.983 0.429 MEX(Mexicanos en EU) 0.800 0.200 n.d n.d HCB (Este de Asia) 0.708 0.292 0.711 0.289 JPT (Japonés) 0.657 0.343 0.807 0.193 MKK (Kenia, África) 0.990 0.010 n.d n.d ASW (Africanos en EU) 0.962 0.038 n.d n.d CHD (Chinos en EU) 0.685 0.315 n.d n.d GIH (Hindús en EU) 0.938 0.062 n.d n.d 30 2. HIPÓTESIS Los polimorfismos de los genes involucrados en el transporte, metabolismo así como los que participan en el bombeo del metotrexato al exterior celular modifican la concentración total (sangre) y sistémica (plasma) del fármaco. 3. OBJETIVOS 3.1 General Determinar la asociación de variantes alélicas de SNPs, en los genes ABCB1 (rs 1045642 y rs 2032582) y ABCG2 (rs 2231142), con la concentración de metotrexato en población pediátrica con diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda. 3.2 Particulares Seleccionar la población pediátrica con diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda en fase consolidación y mantenimiento de la quimioterapia. Recolectar los productos biológicos (sangre) para la obtención de DNA y para niveles de fármaco (plasma). Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de las variantes en los genes de transporte de metotrexato (ABCB1 y ABCG2). Correlacionar las variantes alélicas en los genes de interés con los niveles de metotrexato en sangre y plasma. 31 4. JUSTIFICACIÓN La población mexicana es muy diversa genéticamente, se sabe que en promedio la población mestizo-mexicana tiene 55.2% de ancestría genética amerindia, 41.8% de ancestría europea y 3.5% de ancestría africana. Conocer la frecuencia génica de SNPs (polimorfismos de un solo nucleótido) por sus siglas en inglés en genes del metabolismo de metrotexato permitirá en un futuro poder realizar un tamizaje de aquellos pacientes que tengan polimorfismos en los genes que codifican para transportadores, enzimas y proteínas que participan en la distribución y metabolismo de fármacos antineoplásicos, estos SNPs pueden modificar la expresión de estas proteínas o su actividad biológica, por lo tanto las concentraciones plasmáticas del fármaco se verá afectada y en consecuencia se afectará la citotoxicidad del metotrexato. A los pacientes que se les determine el alelo de riesgo se les proporcionaría un tratamiento alternativo y como consecuencia generar en ellos una mayor y mejor calidad de vida. Esta investigación busca un impacto directo en fortalecer el esquema de quimioterapia individualizada buscando el uso del medicamento correcto para cada paciente correcto. Otro de los beneficios es disminuir la estancia intrahospitalaria del paciente por complicaciones, disminuyendo los costos de hospitalización que se generan por la presencia de toxicidad grave. 32 5. DISEÑO EXPERIMENTAL 5.1 Diseño del estudio Es un estudio prospectivo, observacional y longitudinal. 5.2 Población de Estudio 5.2.1 Población objetivo Pacientes del servicio de Hemato-Oncología del Instituto Nacional de Pediatría, los cuales hayan sido diagnosticados con leucemia linfoblástica aguda. 5.3 Criterios de Selección 5.3.1 Criterios de inclusión Se incluirán pacientes del INP cursando Leucemia Linfoblástica Aguda en el rango de edad de 1 a 17 años, con tipo de riesgo definido por factores clínicos, morfológicos y moleculares. La quimioterapia debe incluir al MTX en la fase de consolidación. Para todos los pacientes se requerirá una Carta de Consentimiento Informado por parte de los padres y/o tutores, en el caso de pacientes mayores a 10 años deberán firmar Carta de Asentimiento. 5.3.2 Criterios de exclusión Pacientes con falla renal, falla hepática, transfusión sanguínea previa al estudio, desnutrición de grado III y/o cualquier afección que pueda afectar la determinación de los niveles del fármaco.5.3.3 Criterios de eliminación Pacientes a quienes se les retire MTX de la quimioterapia, no acudan regularmente a su tratamiento (No apego al tratamiento: determinado por un porcentaje menor al 50% de administraciones efectivas), retiren voluntariamente su consentimiento y/o asentimiento para participar en el estudio y aquellos pacientes en los que no se obtenga la cantidad de muestras suficientes para el análisis de SNPs y/o de concentraciones del fármaco. 33 6. METODOLOGÍA 6.1 Estrategia experimental 34 6.2 Toma de muestra Se tomaron muestras de sangre (3 mL) a los pacientes, antes de la administración de MTX (pre-dosis) para el análisis de su material genético, esto en base a los Protocolos Técnicos Cáncer en Niños. A partir de 1 mL de sangre se extrajo el DNA mediante el DNA Isolation Kit de QIAGEN, este DNA fue preservado hasta su estudio. 6.3 Separación de los leucocitos Para separar la fracción de los leucocitos se requirió centrifugar la sangre a 3,500 rpm por 20 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se observaron 3 diferentes fracciones: la capa clara superior (plasma); la capa intermedia (leucocitos) y la capa del fondo que contiene eritrocitos concentrados. De esta fracción (la capa intermedia), es posible obtener DNA en una cantidad 5 a 10 veces mayor a la obtenida por una cantidad equivalente de sangre total. 6.4 Extracción de DNA a partir de sangre periférica para banco de DNA Para la purificación de DNA se empleó el método descrito en el QIAamp DNA blood mini kit (QIAGEN™) el cual permite la purificación del contenido total del DNA genómico, mitocondrial y viral a partir de muestras de sangre total, plasma, suero, capa de leucocitos, linfocitos u otros fluidos biológicos. a) Al concentrado de leucocitos se añadieron 20 μL de proteasa (proteinasa K) en el fondo de un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y luego se añadieron 200 μL de buffer AL (QIAGEN™). b) Se homogenizó durante 15 segundos aproximadamente en vórtex, para lograr una lisis eficiente es necesario asegurarse que el buffer AL sea mezclado perfectamente para obtener una solución homogénea. c) La muestra (leucocitos con buffer AL y proteinasa K) se incubó a 56 °C por 10 min. d) Se adicionó 200 μL de etanol (96-100%) a la muestra. e) Se homogenizó de nuevo por pulso de 15 segundos en vórtex. f) Se aplicó cuidadosamente la muestra a la columna de QIAamp Mini spin (en un tubo de colección de 2 mL) sin mojar el borde. g) Se cerró la tapa y se centrifugó a 8,000 rpm durante 1 min. Se descartó el filtrado. h) Se adicionó 500 μL de buffer AW1 (QIAGEN™), sin mojar el borde a la columna QIAamp Mini spin y se centrifugó a 8,000 rpm durante 1 min. Se descartó el filtrado. 35 i) Se adicionó 500 μL de buffer AW2 (QIAGEN™) sin mojar el borde y se centrifugó a 14,000 rpm durante 3 min., se descartó el filtrado. j) Se centrifugó a 14,000 rpm durante 1 min. para remover restos del buffer AW2 evitando así la contaminación de la muestra. k) Posteriormente se colocó la columna en un tubo nuevo de colección de 2 mL y se descartó el tubo de colección conteniendo el filtrado. l) Se adicionó 200 μL de buffer AE y se incubó a temperatura ambiente (15 – 25 °C) durante 1 min, y después se centrifugó a 8,000 rpm durante 1 min. m) Para almacenar el DNA a largo plazo se recomienda eluir con buffer AE (QIAGEN™) y almacenar a -20°C. Una muestra de 200 μL de sangre total humana (aprox. 5 x 106 leucocitos/mL) típicamente rinde 6 μg de DNA en 200 μL de agua (30 ng/ μL) con una proporción de A260/A280 entre 1.7 y 1.9. El DNA será cuantificado para obtener una solución conteniendo 20 ng/ μL, la cual será empleada para los ensayos de genotipificación. 6.5 Cuantificación del DNA Se cuantificó la concentración de DNA y se evaluó su pureza por espectrofotometría en el equipo EPOCH™ de Bio Tek y leyéndose los datos a través del Software para Análisis de Datos Gen5™. Debido a que los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta (UV) por tener en su estructura bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de la cadena de DNA, por lo cual cada base tiene su propio espectro, tienen un máximo de absorción a una longitud de onda de 260 nm. La presencia de proteínas en las preparaciones de DNA ocurre. El máximo de absorbancia de las proteínas es de 280 nm y se puede estimar el grado de impurezas aportadas por las proteínas a partir del cociente A260/280. El DNA de doble hebra en solución de alta pureza presenta una relación A260/280 mayor o igual a 1.8 36 6.6 Genotipificación por sondas TaqMan® El análisis de los genotipos se llevó a cabo por medio del ensayo de discriminación alélica utilizando sondas TaqMan®, los dbSNP, la secuencia, las debidas sustituciones y cambios se muestran en la Tabla 7. Tabla 7. Sondas que se emplearon en la genotipificación para cada gen. Este ensayo se basa en la amplificación por PCR de un segmento del gen que contiene el polimorfismo de interés mediante oligonucleótidos y posterior discriminación alélica mediante sondas que poseen unido covalentemente un compuesto fluorescente (colorante reportero) y se emplean dos sondas: una que contenga uno de los dos tipos de colorantes, VIC, con un rango de emisión de 552 nm, en el extremo 5’ para el alelo 1 y complementariedad y la otra sonda posee FAM, con una emisión máxima a 518 nm para el alelo 2 y su complementariedad. Ambas sondas contienen una molécula que es capaz de unirse al surco menor del DNA (Minor Groove Binder, MGB) y que aumenta la especificidad de unirse exclusivamente a su alelo, así como una molécula que inhibe la emisión de fluorescencia mientras la sonda permanece intacta (Non fluorescent quencher, NFQ), localizada en el extremo 3’ (Figura 9). Figura 9. Sondas TaqMan. Representación del mecanismo de acción de la liberación de la fluorescencia. Gen dbSNP Secuencia Sondas Taqman Sustitución Cambio ABCB1 rs104564 2 TGTTGGCCTCCTTTGCTGCCCTCAC(A/G )ATCTCTTCCTGTGACACCACCCGGC C_7586657_20 C3435T Ile 1145 Ile rs 2032582 TATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAG(C/A) ACCTTCTAGTTCTTTCTTATCTTTC C11711720C30 C11711720D40 G2677A Ala 893 Ser/Tre ABCG2 rs 2231142 GCAAGCCGAAGAGCTGCTGAGAACT(G/ T)TAAGTTTTCTCTCACCGTCAGAGTG C_1585416370 C421A Gln 141 Lis 37 Durante la reacción de PCR los oligonucleótidos hibridan con una secuencia específica del templado de DNA. Si éste contiene la secuencia polimórfica, la sonda TaqMan también híbrida con su secuencia homóloga. Durante la PCR, la AmpliTaq Gold, que tiene actividad tanto de DNA polimerasa como de exonucleasa 5’-3’, es capaz de digerir la sonda marcada durante la amplificación y liberar el colorante fluorescente de la acción del inhibidor de la fluorescencia de tal manera que dadas las condiciones de astringencia utilizada durante la reacción, sólo la sonda específica para el polimorfismo presente será capaz de hibridar; por lo tanto, es posible diferenciar un alelo del otro con base en el tipo de fluorescencia emitida. Se cuantificó la fluorescencia de cada muestra en un equipo Step One, utilizando el software SDS 2.2.1 para discriminación alélica (Applied Biosystems Foster City, CA, USA). Los reactivos utilizados se muestran en la Tabla 7. La amplificación se realizó empleando las condiciones de la PCR, para el equipo Step One (Figura 10). Tabla 8. Mezcla de reacción para el ensayo de discriminación alélica. Volúmenes necesarios para la placa de 48 pozos. Reactivos Volumen necesario para 1 reacción (μL) Volumen necesario para 48 reacciones (μL) Master Mix (2x) 5.0 264 DNA 1 52.8 Sonda 0.50 26.4 Agua 3.5 184.80 Total 10 528Figura 10. Condiciones de la amplificación. Tiempo de la rampa de temperaturas. 38 6.7 Cuantificación del Metotrexato mediante UPLC acoplado a masas. La cuantificación de MTX total en sangre periférica y plasma se realizó mediante HPLC en fase reversa empleando la metodología validada por Barrera.55 Las muestras de sangre obtenidas de los pacientes que se encontraban recibiendo quimioterapia con MTX en fase de consolidación serán separadas en 2 alícuotas. La primera alícuota sé preservó en EDTA para evitar su coagulación (muestra de sangre total), la segunda alícuota será centrifugada a 3,000 rpm por 10 minutos para la obtención de plasma. Extracción. A un volumen de 180 μL de muestra (sangre o plasma) se adicionaron 20 μL de estándar de MTX en solución, en un tubo eppendorf de 1.5 mL y se agitó en Vórtex por 1 min, posteriormente se agregó 50 μL de SDS para lisar los eritrocitos, se agitó por 1 min y se agregaron 250 μL de acetona como agente desnaturalizante, nuevamente se agitó por 5 min y posteriormente se centrifugó a 10,000 rpm por 10 min; el sobrenadante se recolectó. Al sobrenadante se adicionó 400 μL de butanol y 500 μL de éter dietílico para llevar a cabo una segunda extracción. Se homogeneizó la mezcla por 5 min y se descartó el sobrenadante; se recuperó la fase acuosa (inferior) y se agregó solución salina hasta un volumen de 100 μL, se tomó la muestra resuspendida y se pasó al inserto del equipo UPLC agregando 10 μL más de solución salina, para un volumen final de 110 μL. Para el plasma se tomaron los mismos volúmenes de muestra y estándar que en sangre, pero se omitirá la adición de SDS. Separación y detección. El sistema cromatográfico usado consiste en una bomba Waters modelo 515, un autoinyector Waters modelo 717 y un detector Water UV/Vis modelo 486. La separación se llevó a cabo a temperatura ambiente en una columna Gemini C18 (Phenomenex) de 150 x 4.6 mm, 5 μm, con fase móvil de solución amortiguadora de fosfato dibásico de sodio monohidratado con una concentración de 0.05 M a un pH 4.85 y tetrahidrofurano (95:5 v/v) a una velocidad de flujo de 1.00 mL/min. El compuesto se detectó a 313 nm. Cuantificación. Para determinar la cantidad de MTX en las muestras analizadas se empleó una curva de calibración con concentraciones de 25, 50, 100, 250, 500, 750 y 1000 ng/mL del fármaco. Para determinar parámetros como repetibilidad y reproducibilidad del ensayo se emplearon concentraciones control de 50, 250 y 750 ng/mL. Se cuantificó el fármaco en las muestras por la relación de área bajo la curva del pico de MTX con respecto a la curva de calibración. La curva de calibración de seis puntos tuvo un coeficiente de correlación (r) igual o mayor a 0.99. 39 7. RESULTADOS 7.1 Características de la población de estudio Se analizaron 92 pacientes con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda, el promedio de edad fue de 8 años en el sexo masculino y 7 años en el sexo femenino, 35 pacientes del género femenino (38 %) y 57 pacientes del género masculino (62 %), 72 pacientes (78 %) fueron de riesgo alto, 18 pacientes presentan riesgo habitual (20 %) y 2 pacientes de riesgo bajo (2 %), esto se resume en la Tabla 9. Tabla 9. Datos de la población de estudio. Variables n % Sexo Mujeres Hombres 35 57 38 62 Edad promedio(años) Mínima Máxima 8 1 16 - - - Tipo de riesgo Alto: 72 Habitual: 18 Bajo: 2 78 20 2 7.2 Frecuencias de las variantes alélicas en el gen ABCB1 Se analizaron 3 polimorfismos de un solo nucleótido en el gen ABCB1 (rs 1045642, rs 2032582A y rs 2032582T) en 92 muestras de DNA genómico provenientes de pacientes con el diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda, del servicio de oncología del Instituto Nacional de Pediatría. El análisis de los SNP se realizó por discriminación alélica en placas de 48 pozos se incluyeron un control negativo y un positivo (muestra con el genotipo conocido). Para la variante rs 1045642 se encontró un 27.1 % para el genotipo GG, un 53.1 % para el genotipo heterocigoto GA, y el genotipo homocigoto AA con un 19.8 %. El alelo G se encontró en un 53.6 %, y en un 46.4 % para el alelo A, como se muestra en la Tabla 10. Esta población se encuentra en Equilibrio Hardy-Weinberg. 40 Tabla 10. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 1045642. La distribución de genotipos encontrados en el SNP rs 1045642 del gen ABCB1, se muestran en la Figura 11, los puntos rojos que corresponden a genotipos de homocigotos silvestres, los puntos verdes corresponden a genotipos heterocigotos, los puntos azules a los homocigotos mutados, mientras que las cruces negras corresponden a muestras que no amplificaron y los cuadros negros controles negativos. Figura 11. Curva de discriminación alélica del SNP rs 1045642. Se observan los genotipos de los homocigotos silvestres ( ), homocigotos mutados ( ) y heterocigotos ( ), asimismo se muestran los controles negativos ( ) y las muestras que no amplificaron ( ). Genotipo Alelo Gen/polimorfismo n GG GA AA n G A ABCB1/rs1045642 96 26 51 19 192 103 89 (%) 27.1 53.1 19.8 53.60 46.4 41 Respecto a la variante rs 2032582A se encontró un 44.6 % para el genotipo CC, un 41.3 % para el genotipo heterocigoto CA, y el genotipo homocigoto AA con un 14.1 %. El alelo C se encontró en un 65.2 %, y en un 34.8 % para el alelo A, como se muestra en la Tabla 11. Esta población se encuentra en Equilibrio Hardy- Weinberg. Tabla 11. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2032582A. En la Figura 12 se muestra la distribución de genotipos realizada mediante discriminación alélica. Se encontró un mayor número de muestras que no amplificaron, las cuales posteriormente se volvieron a analizar y se determinó su genotipo, las muestras que no amplificaron en tres equipos distintos de PCR, fueron excluidas. Figura 12. Curva de discriminación alélica del rs 2032582A. Se observan los genotipos de los homocigotos silvestres ( ), homocigotos mutados ( ) y heterocigotos ( ), asimismo se muestran los controles negativos ( ) y las muestras que no amplificaron ( ). Genotipo Alelo Gen/polimorfismo n CC CA AA n C A ABCB1/rs 2031582 A 92 41 38 13 184 120 64 (%) 44.6 41.3 14.1 65.2 34.8 42 Respecto a la variante rs 2032582T se encontró un 87.2 % para el genotipo CC, un 5.3 % para el genotipo heterocigoto CT, y el genotipo homocigoto TT con un 7.4 %. El alelo C se encontró en un 89.9 %, y en un 10.1 % para el alelo T, como se muestra en la Tabla 12. Esta población no se encuentra en Equilibrio Hardy- Weinberg. Tabla 12. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2032582T. En la Figura 13, se muestra la distribución de genotipos realizada mediante discriminación alélica, de algunas de las muestras analizadas. Figura 13.Curva de discriminación alélica del rs 2032582T. Se observan los genotipos de los homocigotos silvestres ( ), homocigotos mutados ( ) y heterocigotos ( ) y se muestran los controles negativos ( ). Genotipo Alelo Gen/polimorfismo n CC CT TT n C T ABCB1/rs 2031582 T 94 82 5 7 188 169 19 (%) 87.2 5.3 7.4 89.9 10.1 43 En el caso del gen ABCG2 para la variante rs 2231142 se encontró un 46.8 % para el genotipo GG, un 45.7 % para el genotipo heterocigoto GT, y el genotipo homocigoto TT con un 8.5 %. El alelo C se encontró en un 69.7 % y en un 31.4 % el alelo T, como se muestra en la Tabla 13. Esta población se encuentra en Equilibrio Hardy-Weinberg. Tabla 13. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2231142. En la Figura 14,se muestra la distribución de genotipos realizada mediante discriminación alélica del rs 2231142 del gen ABCG2 de algunas muestras analizadas. Figura 14 Curva de discriminación alélica del rs 2231142. Se observan los genotipos de los homocigotos silvestres ( ), homocigotos mutados ( ) y heterocigotos ( ), se muestran los controles negativos ( ) y las muestras que no amplificaron ( ). Genotipo Alelo Gen/polimorfismo n GG GT TT n G T ABCG2/rs 2231142 95 44 43 8 190 131 59 (%) 46.3 45.3 8.4 68.9 31.1 44 7.3 Niveles de Metotrexato en sangre. La cuantificación del MTX se realizó en 45 pacientes, de los cuales en sólo 28 pacientes se obtuvieron muestras completas de los tres tiempos (2 h, 24 h y 36 h). Los cuales se monitorearon por medio de UPLC acoplado a espectrometría de masas en tándem. Los resultados de este monitoreo se muestran en la Figura 15 de un paciente con las tres muestras en un lapso de 5 min y en Tabla 16 los datos de todos los pacientes. Esta cuantificación se realizó en dosis de 2 y 5 g/m2, pero no se obtuvieron muestras completas en pacientes con dosis de 5 g, por lo que el estudio se realizó con pacientes cuya dosis administrada era de 2 g/m2, en sangre y plasma. Figura 15. Monitoreo de la concentración de MTX del paciente LAL 45. 45 Figura 16. Concentraciones de MTX a las 2, 24 y 36 h al inicio de la infusión de MTX en sangre de 28 pacientes. No. paciente Concentración a las 2 h (μmol/L) No. Paciente Concentración a las 24 h (μmol/L) No. Paciente Concentración a las 36 h (μmol/L) LAL-1 53.35 LAL-1 7 LAL-1 0.66 LAL-2 29.07 LAL-2 12.22 LAL-2 0.37 LAL-6 41.82 LAL-6 14.58 LAL-6 0.69 LAL-8 38.17 LAL-8 9.39 LAL-8 1.00 LAL-10 22.93 LAL-10 18.48 LAL-10 0.41 LAL-11 33.73 LAL-11 2.92 LAL-11 1.27 LAL-12 7.75 LAL-12 4.88 LAL-12 3.38 LAL-14 6.91 LAL-14 0.43 LAL-14 0.22 LAL-15 20.15 LAL-15 13.67 LAL-15 0.66 LAL-16 41.02 LAL-16 0.27 LAL-16 0.15 LAL-21 35.22 LAL-21 37.36 LAL-21 0.72 LAL-23 44.43 LAL-23 22.75 LAL-23 2.03 LAL-24 49.13 LAL-24 25.40 LAL-24 1.28 LAL-25 37.70 LAL-25 0.90 LAL-25 0.67 LAL-26 77.83 LAL-26 24.14 LAL-26 1.60 LAL-27 41.22 LAL-27 0.90 LAL-27 0.28 LAL-28 68.24 LAL-28 2.44 LAL-28 1.57 LAL-30 23.29 LAL-30 16.16 LAL-30 0.51 LAL-31 90.21 LAL-31 27.57 LAL-31 0.28 LAL-37 42.96 LAL-37 0.96 LAL-37 0.69 LAL-38 60.08 LAL-38 44.24 LAL-38 0.52 LAL-39 4.56 LAL-39 4.02 LAL-39 2.87 LAL-42 49.11 LAL-42 4.02 LAL-42 0.78 LAL-45 54.79 LAL-45 51.08 LAL-45 21.28 La mediana de la concentración de MTX en sangre a las 2 h fue de 41.1 µmol/L (Q25 24.7-Q75 52.2), a las 24 h fue de 16.7 µmol/L (Q25 2.6- Q75 23.4) y a las 36 h la mediana encontrada fue de 0.7 µmol/L (Q25 0.5-Q75 1.5). Claramente se observa una reducción del MTX en sangre en todos los pacientes. 46 Tabla 14. Datos de las medianas y percentiles 25 y 75 de sangre y plasma, en los distintos tiempos de la obtención de la muestra (2, 24 y 36 h). Tiempo (h) Sangre (µmol/L) (Q25-Q75) Plasma (µmol/L) (Q25-Q75) 2 41.1 24.7-52.2 54.4 37.2-66.6 24 13.6 2.6-23.4 16.7 2.1-31.57 36 0.7 0.5-1.5 1.04 0.56-2.05 7.3.1 Asociación de la variante alélica (rs 1045642) en el gen ABCB1 con los niveles de metotrexato en sangre. Se han reportado estudios donde se asocian los niveles altos de fármacos antineoplásicos con un genotipo de riesgo, para población mexicana hay muy pocos trabajos encaminados a estudiar esta asociación y los pocos que ya se han reportado no han determinado una clara asociación; esto quizá pueda deberse al tamaño de muestra, a las variables estudiadas o a la estratificación. En este trabajo estudiamos una posible asociación entre variantes en genes que codifican para proteínas de transporte de MTX y sus niveles en 37 pacientes con diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda. Se estudió el polimorfismo rs 1045642 del gen ABCB1 tomándose muestras a diferentes tiempos: 2, 24, 36 h en sangre. A las 2 h (Figura 17 A) los pacientes que presentaron el genotipo de riesgo (AA) tuvieron niveles bajos de MTX (36.6924 µmol/L), a las 24 h en el genotipo de riesgo se disminuyó la concentración de MTX (15.3332 µmol /L) y en el caso de las 36 h fue menor todos los genotipos, siendo el silvestre el que presenta una menor cantidad de fármaco de 0.6029 µmol /L (Figura 17 C). 47 Figura 17. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 1045642), del gen ABCB1 en sangre. A. MTX 2 h, B a las 24 h y C a las 36 h; dónde se muestran los genotipos de riesgo (AA), el heterocigoto (AG) y el silvestre (GG). Y se muestra la comparación de niveles de MTX de acuerdo al genotipo de la variante rs 1045642 en ABCB1, en pacientes pediátricos con LAL. De acuerdo a la prueba de Kruskal Wallis no se observaron diferencias estadísticamente significativas (p = 0.64). 48 7.3.2 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 A) en el gen ABCB1 con los niveles de metotrexato en sangre. Se estudió el polimorfismo rs 2032582A del gen ABCB1, se tomaron muestras en diferentes tiempos: 2, 24, 36 h en sangre. Los resultados que se obtuvieron en sangre a las 2 h (Figura 18 A) fueron los siguientes: los pacientes que presentaron el genotipo de riesgo (AA) tuvieron niveles bajos de MTX (38.1657 µmol/L). A las 24 h el genotipo de riesgo presentó una mayor concentración del MTX (25.4005 µmol /L) con respecto a los otros genotipos y en el caso de las 36 h se observó una concentración mínima de MTX en todos los genotipos AA, AC y CC, siendo el genotipo de riesgo el que presenta una mayor cantidad de fármaco (C) teniendo un valor de la mediana de 1.1410 µmol /L. Figura 18. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2032582A), del gen ABCB1, en niveles sanguíneos. Este gráfico muestra la comparación de niveles de MTX de acuerdo al genotipo de la variante rs 2032582A en ABCB1, en pacientes pediátricos con LAL. De acuerdo a la prueba de Kruskal Wallis no se observaron diferencias estadísticamente significativas (p =0.60). 49 7.3.3 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 T) del gen ABCB1 con los niveles de metotrexato en sangre. Se estudió el polimorfismo rs 2032582 del gen ABCB1, tomándose muestras en diferentes tiempos: 2, 24, 36 h en sangre. Para el genotipo de riesgo no hubo ningún paciente, por lo cual no existe comparación significativa entre los genotipos a las 2 h en sangre; el paciente que presentó el genotipo silvestre (CC), tuvo una mayor concentración del fármaco siendo el valor de su mediana de 41.2222 µmol/L y a las 24 h (Figura 19 B) con un valor de 14.5806 µmol/L y en el caso de las 36 h (C) el genotipo silvestre es el que presenta una menor concentración siendo el valor de la mediana de 0.6767 µmol/L. Figura 19. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2032582 T), del gen ABCB1, en niveles sanguíneos. Se muestra la comparación de niveles de MTX de acuerdo al genotipo de la variante rs 2032582 en ABCB1, en pacientes pediátricos con LAL. De acuerdo a la prueba de U de Mann-Whitney no se observaron diferencias estadísticamente significativas (p =1.00). 50 7.3.4 Asociación de la variante alélica (rs 2231142) del gen ABCG2 con los niveles de metotrexato en sangre. Se estudió el polimorfismo rs 2231142 del gen ABCB1, se tomaron muestras en diferentes tiempos: 2, 24, 36 h en sangre. Los resultados que se obtuvieron en sangre a las 2 h (Figura 20 A) fueron los siguientes: el genotipo de riesgo presentó una menor concentración siendo de 10 µmol/L siendo la
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