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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MEDICINA DIVISIÓN DE POSTGRADO INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL HOSPITAL DE ESPECIALIDADES “DR. ANTONIO FRAGA MOURET” CENTRO MÉDICO NACIONAL LA RAZA “DETERMINACIÓN DE LINFOCITOS T GAMMA-DELTA PRODUCTORES DE IL-17 EN PACIENTES CON MIELOMA MÚLTIPLE Y SU IMPACTO EN LA RESPUESTA CLÍNICA” TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE ESPECIALISTA EN HEMATOLOGÍA P R E S E N T A: LAURA NAYELI TECAYEHUATL NEGRETE ASESOR D. en C. JORGE VELA OJEDA CIUDAD DE MÉXICO, 2017 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 DR. JESÚS ARENAS OSUNA DIVISIÓN DE EDUCACIÓN EN SALUD DR. JORGE VELA OJEDA TITULAR DEL CURSO UNIVERSITARIO DE HEMATOLOGÍA DRA. LAURA NAYELI TECAYEHUATL NEGRETE MÉDICO RESIDENTE DE HEMATOLOGÍA HOSPITAL DE ESPECIALIDADES, CENTRO MÉDICO NACIONAL “LA RAZA” PROTOCOLO NÚMERO R-2016-3501-39 3 ÍNDICE RESUMEN 4 INTRODUCCIÓN 6 MATERIAL Y MÉTODOS 17 RESULTADOS 19 DISCUSIÓN 21 CONCLUSIÓN 23 BIBLIOGRAFÍA 24 ANEXOS 27 4 RESUMEN Título. Determinación de linfocitos T gamma delta productores de IL-17 en pacientes con mieloma múltiple y su impacto en la respuesta clínica. Material y métodos. Cohorte, observacional, prospectivo, transversal. Se obtuvieron muestras de sangre periférica y médula ósea de pacientes con mieloma múltiple de novo del hospital de especialidades del centro médico nacional La Raza. Se realizó determinación de linfocitos T gamma delta productores de IL-17 al diagnóstico por citometría de flujo y se evalúo la respuesta clínica después de 3 meses. Análisis estadístico: Regresión logística. Resultados. Se incluyeron 16 pacientes con Mieloma múltiple de novo, con media de edad de 54.9 años. 10 pacientes fueron hombres y 6 mujeres. 6 pacientes presentaron respuesta clínica. Se realizaron dos grupos de acuerdos a la respuesta clínica. Se observó mayor expresión de Linfocitos T gamma delta productores de IL-17 en el grupo de SI respuesta con una media de 16.85 células/mcl, que en el grupo de NO respuesta con una media de 5.2 células/mcl (p=0.03). Conclusión: Los niveles de linfocitos gamma-delta productores de IL-17 predicen de manera significativa la respuesta clínica de los pacientes con mieloma múltiple. La media de la cuenta de linfocitos gamma delta productores de IL-17 fue mayor en los pacientes que tuvieron respuesta clínica al mieloma múltiple. Palabras clave: Mieloma múltiple, Linfocitos T gamma-delta, IL-17, respuesta clínica. 5 ABSTRACT Title. Determination of gamma delta T cells producing IL-17 in patients with multiple myeloma and their impact on clinical response. Material and methods. Cohort, observational, prospective, transversal. Samples of peripheral blood and bone marrow of patients with multiple myeloma were obtained novo. Determination of gamma delta T cells producing IL-17 diagnostic was performed by flow cytometry and clinical response after 3 months was evaluated. Statistical analysis: Logistic Regression. Results. 16 patients with multiple myeloma de novo were included, with mean age of 54.9 years. 10 patients were men and 6 women. 6 patients had clinical response. greater expression Lymphocyte T gamma delta producers of IL-17 was observed in the group of SI response with an average of 16.85 cells / mcl, than in the group of NO response with an average of 5.2 cells / mcl (p = 0.03). Conclusion. Levels of gamma-delta lymphocytes producing IL-17 significantly predict the clinical response of patients with multiple myeloma. Mean lymphocyte counts gamma delta producers of IL-17 it was higher in patients who had clinical response to multiple myeloma. Keywords: multiple myeloma, gamma-delta T lymphocytes, IL-17, clinical response. 6 INTRODUCCIÓN Antecedentes El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia de células B diferenciadas a nivel de centro postgerminal. Se caracteriza por una proliferación multifocal de células plasmáticas clónales, de larga vida en médula ósea (MO), destrucción esquelética asociada, gammapatía monoclonal, inmunosupresión y secuelas de órganos diana.1 El mieloma múltiple representa el 10% de las neoplasias hematológicas y el 1% de todos los tumores malignos. 2 Extrapolando estas cifras con los incidencia estimada de cáncer a nivel mundial la incidencia es de aproximadamente 120 000 casos por año, con una edad media de 70 años al momento del diagnóstico y en una población que envejece rápidamente éstas cifras probablemente aumentarán significativamente a alrededor de 350 000 casos para el año 2050. A pesar de que las tasas de incidencia estandarizada varían con la etnicidad de 4.3/100 000 en Estados unidos, 3.9/100 000 en china y 12.7/100 000 en África (datos SEER)3 las cifras indican que el mieloma múltiple plantea un problema importante para la salud mundial. El diagnóstico de mieloma múltiple se realiza mediante los criterios del Myeloma International Working Group, los cuales fueron modificados en el 2014, siendo estos los siguientes: 4,5 1. Más del 10% de células plasmáticas en médula ósea de características clónales, lo cual es determinado por un fenotipo IgS-, IgC+, CD38+, CD138+, CD19-, CD56+, o plasmocitoma extramedular en conjunto con uno o más de los eventos atribuidos a mieloma múltiple, los cuales se engloban en la nemotecnia “CRAB” la cual define hipercalcemia (> 11 mg / dL o >1 mg / dL límite superior de la normalidad), lesión renal (creatinina sérica > 2 mg / dL o una depuración de creatinina menor de 40 ml/min anemia (hemoglobina <10 g / dL o 2 g menos de lo normal) y lesiones óseas líticas. 7 2. Uno o más de los siguientes marcadores de malignidad a. Células plasmáticas clónales mayor de 60% en médula ósea b. Ratio de cadenas ligeras libres en suero igual o mayor de 100 c. Más de 1 lesión focal en estudios de resonancia magnética Aunque la mediana de supervivencia es de aproximadamente 3 años, algunos pacientes con MM pueden vivir más de 10 años. La sobrevida depende del estadio de la enfermedad al diagnóstico. Desde 1975, el sistema de Durie y Salmon (anexo 1) se ha usado para estadificar a los pacientes con MM, dicha clasificación establece tres estadios con base en la masa tumoral valorada a partir de la cuantificación del componente M sérico y urinario, calcemia, cifra de Hb y grado de afección esquelética4. Dada la correlación que la creatinina tenía con la supervivencia, cada uno de los estadios se subclasificó en A o B. Según la función renal fuera normal o no (creatinina ≥ 2 mg/dL). La frecuencia de estadios I, II y III en las distintas series suele ser de 5-10%, 25 -30% y 60-65% respectivamente, sin embargo, este sistema de estadificación es limitado, especialmente en la categorización de lesiones óseas. El Internacional Myeloma Working Group ha propuesto la clasificación conocida como Internacional Staging System (ISS), derivada del análisis de los datos de 11 171 pacientes procedentesde grupos cooperativos e instituciones de América, Asia y Europa. El ISS se basa en los niveles séricos de B2-microglobulina y albúmina, discrimina tres grupos de riesgo con medianas de supervivencia global de 62, 44 y 29 meses, respectivamente (anexo 2). Resulta particularmente interesante que la capacidad discriminativa de estos tres grupos de riesgo es independiente de la edad, área geográfica y tipo de tratamiento (quimioterapia a dosis estándar o trasplante autólogo de células tallo hematopoyéticas). Este sistema puede resultar ampliamente reproducible y mejorar con la inclusión de nuevos parámetros pronósticos.6 En 2013 fue publicado un sistema de estratificación en base a anormalidades cromosómicas, concluyéndose en riesgo estándar, intermedio y alto (anexo 3) otorgando medianas de supervivencia de 3, 4-5 y 8-10 años respectivamente, 8 siendo esto de gran relevancia, ya que el tratamiento va dirigido de acuerdo a dicho riesgo.7 Fisiopatología La patogenia del mieloma múltiple involucra alteraciones cromosómicas y genéticas así como una serie de alteraciones secundarias a la interacción de las células plasmáticas clónales con el nicho hematopoyético que involucran factores de transcripción, moléculas de adhesión, factores de crecimiento y citocinas. Una de las principales citocinas implicadas en el desarrollo del mieloma es la IL- 17. Los linfocitos T gamma delta se localizan principalmente en tejidos no linfoides, su localización y funciones sugieren un papel como primera línea de defensa en la inmunidad innata. Los linfocitos T gamma delta responden rápidamente a las señales del TCR, a las señales por PRR´s a la secreción de citocinas o actividad citotóxica. Diversos estudios han asociado de forma diferente la acción de los linfocitos T-γδ con distintas neoplasias. Dentro de las principales citocinas secretadas por los linfocitos T- γδ se encuentra la IL-17. Para los términos de las poblaciones de las células inmunológicas se puede mencionar que las células dendríticas presentan funciones anormales, las células T presentan una inversión de la proporción de las células CD4:CD8, Th1/Th2. Las principales causas de muerte asociadas a esta neoplasia son las infecciones asociadas a bacterias encapsuladas como Streptococcus pneumoniae y Hemophilus influenzae y la insuficiencia renal (nefropatía, hipercalcemia, enfermedad de deposición y otros) debido a las terapias antineoplásicas y complicaciones relacionadas con el tratamiento de la enfermedad.8 Esta enfermedad se ha convertido en una condición crónica con muchas recidivas seguidas de terapias de salvamento que en conjunto llevan una inmunosupresión acumulativa con un alto riesgo de infección. Se ha documentado que los niveles de los LT CD4+ naive y activados, disminuyen significativamente con el incremento de los ciclos de quimioterapia, este decremento está fuertemente asociado con las enfermedades oportunistas. 9 La médula ósea tiene características particulares, almacena células T de memoria que tienen la capacidad de estimular células T naive, además de ser un reservorio de células T reguladoras, el ambiente celular está regulado con detalle por las citocinas, respecto a esto, existe la hipótesis de que los niveles elevados de IL-6 evitan la maduración de linfocitos T reguladores, lo cual brinda la posibilidad de que en el mieloma múltiple, que produce una cantidad alta de IL-6, pudiera alterarse el equilibrio entre los linfocitos Th17 y los T reguladores. Esto se ve reforzado por Noonan et al. 2010, quienes encontraron en la médula ósea de donadores sanos un alto porcentaje de CD4+/CD25+ comparado con la sangre periférica de los mismos donadores, pero en los pacientes con mieloma múltiple los porcentajes de CD4+/CD25+ eran más altos en la sangre que en la médula ósea, (es decir, están invertidos), esto se confirmó en la expresión de FoxP3 que fue mucho mayor en la médula ósea de los donadores normales (70%) en comparación con los pacientes de mieloma múltiple (2.2%).9 La comunicación intercelular entre las células de mieloma múltiple y las células de la médula ósea estimula la producción de citocinas inmunomoduladoras que sesga las poblaciones celulares a convertirse en tipo Th17, por medio de la estimulación de IL-6 y TGF-β y modulan las respuestas antitumorales del mieloma múltiple. Esto se sugiere que la IL-17 promueve el crecimiento del mieloma y la formación de colonias vía el receptor de IL-17 de las células estromales de médula ósea. En un modelo murino con SCID, el bloqueo del receptor de IL-17 inhibe el efecto en células de mieloma múltiple e indica que una combinación de IL-17 e IL-22 inhibe de forma significativa la producción de citocinas Th1 (IFN-γ) y aumenta las citocinas en la médula ósea (IL-1, TGF-β e IL-1β) lo que impulsa la conversión de las células a una población Th17. Prabhala et al. (2010) en su estudio encontró una elevación en las células Th17 de sangre periférica y de la médula ósea en comparación con donadores sanos, así como un aumento de IL-17, IL-21, IL-22 y IL23 en el suero y en la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple, en comparación con donadores sanos. Es importante mencionar que la IL-23 mejora las funciones efectoras de las células Th17 así como de las T-γδ que tienen el 10 receptor para IL-23 pero bajo condiciones no patológicas, IL-23 tiene un efecto de protección en el tejido óseo, inhibiendo la osteoclastogénesis.12 Prabhala et al. (2010) demuestra que las células mononucleares de sangre periférica que han sido polarizadas a Th17 inducen la producción de IL-13, IL-17 y IL-23, en comparación con las células mononucleares de donadores sanos. Se ha reportado que la elevación significativa de los niveles de IL17 en los estadíos II y III de Mieloma Múltiple se reducen después de terapia con bifosfonatos.10 Las células de mieloma múltiple conducen a una destrucción ósea. Los osteoclastos en mieloma múltiple poseen anormalidades cromosómicas presentes en las clonas primarias de mieloma que sugieren la fusión de estos dos tipos de células. En ése sentido, el trabajo de Martin et al. (2009) destaca que la deficiencia de IL-6 no disminuye la generación de IL-17 pero la generación de IL-17 estuvo comprometida en ausencia de IL-23.10 Por otro lado, las células CD4+ y Tγδ tuvieron capacidades similares de promover genes de osteoclastogénesis en cultivos in vitro, siendo IL-17 capaz de promover estos efectos vía RANKL.12 En relación a otras poblaciones celulares en mieloma múltiple se ha reportado expansión clonal de CD4+ y CD8+ asociándolo a un mejor pronóstico teniendo la hipótesis de que pudieran controlar la sobrevivencia y crecimiento de la célula tumoral, sin embargo han sido descritas aberraciones funcionales y fenotípicas para estas células (CD4+ y CD8+ ). Estudios recientes han mostrado que las células T en mieloma múltiple tienen un repertorio defectuoso del TCR, y discapacidad citotóxica viral específicamente contra influenza y el virus de Epstein Barr.10 Linfocitos T-γδ Los linfocitos T gamma delta se localizan principalmente en tejidos no linfoides (pulmones e intestino), su localización y funciones sugieren un papel como primera línea de defensa en la inmunidad innata.13 Las Tγδ se diferencian a partir de las células CD4- CD8-, por una recombinación exitosa de ambos locus Tcrδ y Tcrγ, la cual promueve el ensamblaje de un TCR γδ en los dobles negativos 11 (CD4- CD8-).14 Los linfocitos T gamma delta responden rápidamente a las señales de TCR, a las señales por PRR´s a la secreción de citocinas o actividad citotóxica14, los ligandos reconocidos por el TCR gamma delta son aún desconocidos (Martin et al. 2009). En relación a la señalización de TCR una hipótesis sugiere una independencia de estas señales y más bien favorecidas por el desarrollo ontogenético que contribuye en el proceso de selección tímica de los T γδ, ya que salen del timo como T γδmaduros, e incluso los recién salidos presentan marcadores asociados con linfocitos T experimentados con antígeno por lo que no existirían los T γδ “naive”, de igual forma se ha sugerido que este compromiso ocurre en el timo.14 Linfocitos T gamma delta IL-17 De igual forma a las Th CD4+, las distintas subpoblaciones de T γδ pueden ser agrupadas en relación a la producción de distintas citocinas: los productores de Interferón gamma (gamma-delta T1 con la expresión de NK1.1. y CD27) y las γδ productoras de IL-17 (gamma delta T17 con expresión de Scart-2 y CCR6). La expresión constitutiva del receptor para Interleucina 23 identifica a un subtipo de gamma delta no canónicas, sin embargo muestran un TCR restringido de cadena gamma 4, por esto las Scart 2+, CCR6+ γ 4 γ o γ T17 se sobreponen con las IL23R+ γδ en los órganos linfáticos periféricos.14 En relación a su desarrollo las γδ T17 tienen factores de transcripción como ROR- γt, el cual junto con Sox13, promueve a un fenotipo productor de IL17, y podría ser regulado activamente por distintos factores (NFAT, NF-kB ) para la expresión de T-bet que lleva a la producción de IFN-γ. En el timo adulto este proceso requiere el compromiso del TCR gamma delta. Esto ha sido sugerido por distintas observaciones en las que las γδ que fueron estimuladas vía TCR-antígeno afín en el timo se convirtieron en productoras de IFN γ, en comparación con T γδ con un ligando “naive” que produjeron IL-17, esto es sorprendente, ya que las gamma delta T17 podrían no requerir selección por el TCR en el timo, sin embargo usan un TCR fuertemente restringido a Vγ4. Otro marcador descubierto que las 12 asemeja a las Th17 es el receptor de Aril hidrocarbon (Ahr) el cual, se cree que es expresado únicamente en órganos linfoides secundarios para impulsar la expresión de IL23 y IL22. Las T gamma delta T17 que son Ahr-/- pueden expresar IL-17 pero no producen IL-22.14 Martin et al. (2009) señalan que el receptor de AhR fue un prerrequisito para la producción de IL-22 pero no para la producción de IL-17; el aumento de producción de IL-17 se vio favorecido por la presencia de IL-23. Así mismo se indica que la dectina 1 tiene problemas para su marcaje debido a la regulación negativa de este receptor después de la activación in vitro, En este estudio también se indica que los ensayos de FACS que usaban CD44, CCR6 arrojaban una población que casi al 100% producían IL17, sin embargo no menciona si éstos tenían el marcador T-γδ. En éste sentido Moira- W et al. (2011) señala que CD161 se presenta en las Th17 de donadores sanos, de igual forma en el estudio de Kryczek se menciona que los linfocitos Th17 infiltrados en cáncer de ovario presentaban CXCR4, CCR6 y CD16116, Wakita et al. (2010) indican que las Tγδ productoras de IL-17 se han definido como CD27- CCR6+, Tγδ + esto nos hace suponer que los tres receptores que deben ser tomados en cuenta son: CD161, TCR γδ y CCR6 (CD196).15 Una vez que salen del timo los linfocitos T gamma delta IL-17 se expanden hasta hallar sus ligandos de TCR γδ o citocinas como IL-6 ó IL-23, a éste respecto la IL- 2 también ha sido propuesta para ser necesaria en el mantenimiento de linfocitos T γδ T17 ya que las productoras de IL17 (pero no productoras de Interferón gama) expresan el receptor de alta afinidad CD25.14 Mecanismos de evasión tumoral Wakita et al. (2010) propone que para obtener una respuesta antitumoral efectiva el balance entre la IL-12 y la IL-13 refleja el mismo balance entre las respuestas Th1 y Th17 y que se desbalancea dirigiendo la respuesta a IL-23 vía la activación de STAT3, a lo cual se ha mencionado que el hallazgo de células tumorales 13 estromales y los macrófagos asociados a tumor producen IL-23, contribuyendo a la inducción del cáncer, promoviendo la inflamación.15 En el modelo murino utilizando los anticuerpos anti IL6 R anti TGF-β y anti IL-23, los ratones redujeron la migración de T-γδ al tejido tumoral. Es notable que en éste estudio las T-γδ en ausencia de estimulación vía TCR produjeran IL-17 en presencia de IL-23, mientras que IL-6 más TGF-β no indujeron producción de IL- 17, lo que sugiere que tanto IL-6 como TGF-β estimularon a las T-γδ a diferenciarse como productoras de IL-17. Por su parte Noonan et al. (2010) sugieren que éste mecanismo (IL6+IL23+RORγt) junto con STAT3 activan a Th17 a producir la enfermedad lítica ósea.15 CCR6 y CCL20 CCR6 es un receptor de quimiocinas que en humanos está localizado en el cromosoma 6q27 y en ratón está ubicado en el cromosoma 17, tiene un solo ligando agonista conocido CCL20, el cual es una quimiocina inflamatoria y homeostática. La expresión de CCR6 fue originalmente descrita en tejido linfático como no linfático, el bazo, los nódulos linfáticos, apéndice, timo, intestino delgado, hígado fetal y testículos.19 CCR6 es expresado en linfocitos B maduros, subpoblaciones de CD4+ de memoria o efectoras y linfocitos CD8+ y en células dendríticas maduras, pero no en células dendríticas plasmacitoides o linfocitos T naive. Entre las CD4+ CCR6+ ha sido asociado con las subpoblaciones Th1 y Th17. En ese sentido y contrario al punto referente a la células dendríticas, Ito et al. (2011) señalan que CCR6 se expresa en células dendríticas inmaduras y se regula de forma negativa durante el proceso de maduración de las células dendríticas en su migración al nódulo linfático para cumplir su función como célula profesional presentadora de antígeno, por ello, CCR6 es una quimiocina específica para células dendríticas inmaduras aunque coincide en señalar que se presenta en muchos de las subpoblaciones de linfocitos B y células NKT, señalando que se expresa en células de memoria central y memoria efectora que se caracterizan por la expresión de CCR7.18 14 En Leucocitos CCR6 es activador de quimiotaxis. Existen varios estudios que apuntan a un papel de CCR6 entre los tejidos de mucosa y linfoide. Ratones que no tienen CCR6 (CCR6-/-) demuestran tener un papel importante en varias enfermedades de pulmón e intestinal , ya que CCR6 media la ubicación de las CD4+ y las células dendríticas dentro del tejido linfoide de mucosas de los intestinos, añadiendo a éste punto se ha encontrado que las quimiocinas y los receptores de quimiocinas han sido usados por las células cancerosas, aunque la expresión de CCR6 es encontrada en la mucosa normal del colon, en donde está sobreexpresado.CCR6 se encuentra en otros tipos de cáncer y la estimulación por su ligando CCL20 promueve la proliferación de la células cancerosas y migración in vitro; más aún, las interacciones entre CCR6 y CCL20 aparentemente participan en la selección del órgano en los cuales se hace la metástasis, sin embargo CCR6 juega un papel no redundante en la inducción de la migración de células dendríticas hacia la capa epitelial de mucosa cuando los patógenos y antígenos invaden los tejidos periféricos.17 Es notable el hallazgo de Wakita et al. (2010) donde tanto las células CCR6+ como las CCR6- eran productoras de IL-17 en el sitio del tumor18. Estudios recientes también han mostrado que CCR6 es un marcador específico de las Th17 y linfocitos T reguladores distinguiéndolas de otras Th. Varias citocinas han mostrado regular la expresión de CCR6 en pulmón. CCL20 que fue inicialmente definida como la quimiocina de activación y regulación de hígado (LARC) es llamada de forma alternativa como la proteína de inflamación de macrófago - 3 alfa ó Exodus -1 fue primero identificada en el hígado, CCL20 está también expresada de forma constitutiva en tejido linfático (MALT).15 CCL20 es expresado por una variedad de células epiteliales incluyendo queratinocitos, células pulmonares epiteliales y por células epiteliales del intestino, CCL20 se expresa poco de forma basal pero puede ser fuertemente inducido por señales proinflamatorias que incluyen citocinas primarias y agonistas de receptores tipo Toll (TLR´s) que se originan de microbios.18CD161 15 El receptor de tipo C parecido a lectinas es un marcador bien establecido para los linfocitos T productor de IL17. CD161 también es conocido como el receptor KLRB1 (killer cell lectin like receptor superfamily B member 1) ó NKRP1a (natural killer receptor protein 1alfa) es una glicoproteína membranal tipo II con características de la superfamilia de lectina tipo C.17 La función de CD161 no ha sido definida de forma clara aunque se ha indicado su función en las células T como co-estimulador, más aún CD161 ha sido implicado en un papel de migración endotelial, se expresa moderadamente en las células CD4+ pero dentro de las CD8+ distintas subpoblaciones expresan altos niveles de CD161. El fenotipo comparable entre las Th17 y las CD161 hi CD8+ incluyendo la producción explícita de IL-17 y su expresión de RORγt sugiere que éstas células son el equivalente de las Th17 dentro de la población CD8+ llamadas Tc17. Distintivamente los linfocitos T que expresan CD161 muestran altos niveles del receptor CCR6.17 IL-17 La IL-17 es una citocina filogenéticamente antigua que es usada por el sistema inmune adaptativo y que lleva a cabo funciones biológicas significativas en la interfase del organismo con su ambiente. IL-17 es promotora de granulopoyesis y la acumulación de neutrófilos para eliminación de patógenos.13 La IL-17 es una citocina proinflamatoria que puede inducir la producción de otras citocinas proinflamatorias, quimiocinas y prostaglandinas, tales como IL-6, TGF-β, G-CSF, M-CSF, metaloproteinasas de matriz y molécula de adhesión intercelular-1 en varios tipos de células incluyendo las células estromales de médula ósea se constituye por seis miembros (IL17 A –F) 15. Se ha reportado que la IL-17 induce angiogénesis tumoral.15 Estructuralmente IL-17 es un homólogo de la familia de proteínas de cisteína-knot con una intracadena de puentes disulfuro, relacionada con TGF-β, el factor de crecimiento neural y el factor derivado de plaquetas.10 En diversos estudios la han vinculado en defensa de infecciones contra Candida y Klebsiella y se ha descrito 16 que coordina actividades inmunológicas como promover factores proinflamatorios de células residentes en articulaciones y estimulación del receptor activador ligando de NF-KB (RANKL).12 IL-17 es producida por varias células del sistema inmune innato como mastocitos, células epiteliales, células de músculo liso, células de Paneth, y las células T NK.13 Los neutrófilos también llegan a producir cantidades variables de IL17. 9 Martin et al. (2009) sugiere que la capacidad de producción de IL17 es adquirida cuando los linfocitos viajan a la periferia. La vía del señalizador transductor de Janus/Cinasa y activador de transcripción (STAT) es crítica para muchas de los efectos mediados por citocinas Th17, siendo las mutaciones en STAT-3 en detrimento para la producción de IL-17, Wakita et al. (2010) en un modelo de ratones IL17 -/-, obtuvieron una reducción de las lesiones tumorales, mostrando que la principal fuente de linfocitos infiltrantes no eran linfocitos de piel sino linfocitos provenientes de circulación, es importante señalar que en este ensayo la neutralización de interleucina 23, IL-6, y TGF-β inhibieron la producción de inducción de linfocitos productores de IL-17.10 La IL-17 se ha implicado en varios desórdenes inflamatorios como colitis, artritis reumatoide, asma, lupus eritematoso sistémico y enfermedades intestinales15, en el caso de la artritis reumatoide Pöllinger et al. 2011 encontró números equivalentes de CD4+ Th17 y T gamma delta productoras de IL-17 en las articulaciones de ratones artríticos. 17 MATERIAL Y METODOS Objetivo general Determinar la relación que existe entre el número de linfocitos T γδ productores de IL-17 y la respuesta clínica del paciente con mieloma múltiple sintomático de novo Diseño de estudio Cohorte, observacional, prospectivo, transversal. Se obtuvieron muestras de sangre periférica y médula ósea de pacientes con mieloma múltiple de novo del servicio de Hematología en el Hospital de Especialidades del Centro Médico Nacional “La Raza”. Se realizó la determinación de linfocitos T gamma delta productores de IL-17 al diagnóstico mediante citometría de flujo (Figura 1). Los resultados se registraron en la hoja de captura de datos. Fueron registrados los datos demográficos en la hoja de recolección de datos. Se dio seguimiento a los casos para conocer la respuesta clínica obtenida a los tres meses de tratamiento. Dichos datos fueron registrados en la hoja de recolección de datos para su posterior análisis estadístico. Fig.1. Citometría de flujo de medula ósea mieloma múltiple de novo para determinar linfocitos T gamma delta 17+ 18 CRITERIOS DE SELECCIÓN Criterios de Inclusión • Pacientes con diagnóstico de mieloma múltiple sintomático de novo, • Derechohabientes IMSS • Edad (mayor o igual de 16 años en adelante) • Género masculino y femenino • Cualquier estadio clínico según la clasificación de Durie y Salmon. • Aceptación del paciente en la participación en el estudio Criterios de no inclusión • Haber recibido tratamiento previo para mieloma múltiple Criterios de eliminación • Mieloma múltiple indolente • Plasmocitoma solitario • Abandono del estudio por parte del paciente Análisis de datos Se realizó un análisis de la información utilizando medidas de proporciones, tendencia central y dispersión. Se establecieron grupos con respecto al tipo de respuesta clínica de los pacientes. Mediante regresión logística se compararon los grupos de acuerdo a la respuesta clínica del paciente. Se consideró estadísticamente significo un valor de p=0.05. 19 RESULTADOS Características clínicas Se incluyeron un total de 16 pacientes con diagnóstico de Mieloma múltiple de novo registrados en el departamento de hematología del hospital de especialidades del centro médico nacional La Raza, de acuerdo a los criterios de inclusión para el estudio. La media para la edad fue de 54.9 años (rango 32-73 años). De los 16 pacientes 10 fueron hombres y 6 mujeres. Las variantes del mieloma múltiple fueron 8 IgG, 4 IgA y 4 enfermedad de cadenas ligeras. De acuerdo a la estadificación de Durie-Salmon 5 correspondieron a un estadio IIB, 3 a un estadio IIIB, 5 a un estadio IIA y 3 a un estadio IIIA. Los 16 pacientes, solo 6 pacientes presentaron respuesta clínica, dichos resultados fueron agrupados de acuerdo a la respuesta clínica (Tabla 1). Se observó mayor cantidad de Linfocitos T gamma delta productores de IL-17 en el grupo de SI respuesta clínica con una media de 16.85 células/mcl, que en el grupo de NO respuesta clínica con una media de 5.2 células/mcl. Tabla 1. Características clínicas y biológicas de los pacientes en estudio N° Sexo Edad Tipo de MM Estadio Clínico Número total de linfocitos T γδ IL-17+ (cel/mcl) PACIENTES CON RESPUESTA 2 Fem 54 IgG IIB 4.3 4 Mas 56 Cadenas ligeras IIB 40.7 6 Fem 63 IgG IIB 26 8 Mas 71 IgA IIA 3.5 10 Fem 44 IgG IIA 15.3 13 Mas 32 IgG IIIA 11.3 PACIENTES SIN RESPUESTA 1 Mas 57 Cadenas ligeras IIB 0.8 3 Fem 51 IgG IIIB 1.8 5 Fem 57 IgG IIB 6.2 7 Mas 73 IgA IIA 15.6 9 Mas 58 IgG IIA 1.2 11 Fem 69 IgA IIIB 4.4 12 Fem 43 Cadenas ligeras IIIA 0.8 14 Mas 50 Cadenas ligeras IIIB 13 15 Mas 50 IgA IIB 2.26 16 Mas 51 IgG IIA 6 20 Para evaluar la predicción de la respuesta clínica de acuerdo a la cantidad de linfocitos T gamma-delta productores de IL-17 al diagnóstico, se realizó un análisis univariado con regresión logística. La variable dependiente fue la respuesta clínica y como independiente la cantidad de linfocitos gamma-delta productores IL-17. Al realizar el análisis se encontró un valor de p=0.03. Grafica 1. Distribución de la cuenta de linfocitos T gamma-delta IL-17+ en pacientes con y sin respuesta 21 DISCUSIÓN Los linfocitos gamma-deltaproductores de IL-17 son parte de la primera línea de defensa de la respuesta innata. Cambios en la frecuencia de estas células se han asociado a varias neoplasias, incluyendo al mieloma múltiple13. Ya se ha reportado que los pacientes con mieloma múltiple tienen niveles mayores de estas células en comparación con donadores sanos y se ha visto que estas células se asocian a la proliferación de las células de mieloma10, 12. Sin embargo, ningún estudio había evaluado si los niveles de estos linfocitos pueden predecir la respuesta terapéutica en estos pacientes. Nuestra hipótesis constituía que los pacientes con menores niveles de linfocitos gamma-delta productores de IL-17 tendrían una mejor respuesta terapéutica, sin embargo los niveles de estos linfocitos fueron mayores en el grupo que tuvo respuesta clínica en comparación con los que no la tuvieron. Esta observación puede explicarse al contemplar que las células de mieloma al tener mayor capacidad de proliferación podrían tener mayor sensibilidad al tratamiento. Se ha visto que las células con menor tasa proliferativa pueden ser menos sensibles al efecto citotóxico de los quimioterápicos y los esteroides4. Dentro del tratamiento de nuestros pacientes se incluye la talidomida, conocida por su acción inmunomoduladora, antiinflamatoria y potencialmente antineoplásica. Los datos de estudios in vitro y pruebas clínicas sugieren que dichos efectos pueden estar relacionados con la supresión de la producción excesiva del factor de necrosis tumoral α y la regulación negativa de la expresión de determinadas moléculas de adhesión intercelular, involucradas en la migración de leucocitos y en la actividad antiangiogénica21. Tiene propiedades coestimuladoras con linfocitos T, con aumento de la producción IL-2 e IL-12. La IL- 2, a su vez aumenta la proliferación de linfocitos T, mientras que la IL-12 e IFN α estimulan a las células NK. Por otra parte, la talidomida también aumenta la susceptibilidad de las células cancerosas a la apoptosis bajo la regulación de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y mejora la sensibilidad a la apoptosis inducida por 22 Fas21. Dado lo anterior es posible que los pacientes con mayores niveles de linfocitos gamma-delta IL-17+ tuvieran mayor efectividad de la terapia inmunomoduladora. Así mismo dentro del tratamiento del mieloma múltiple se incluyen los bifosfonatos a fin de limitar y reducir la enfermedad ósea presente en esta patología. Existen estudios que sugieren la posibilidad de que ciertos bisfosfonatos podrían contribuir a un beneficio en la supervivencia mediada por la respuesta inmune de los pacientes con mieloma múltiple, ya que también ejercen efectos antitumorales a través de la estimulación de linfocitos T gamma delta por la relación estructural entre los bifosfonatos y los ligandos de estos linfocitos. Así bien dicha situación pudo interferir en la respuesta clínica de los pacientes, ya que in vitro se ha demostrado que la acción de los bifosfonatos podría corresponder a la inducción de actividad contra células plasmáticas mediada por células T gamma delta22. Además se ha reportado que la elevación significativa de los niveles de IL17 en los estadíos II y III de Mieloma Múltiple se reducen después de terapia con bifosfonatos.10 De acuerdo a esto es posible que en el grupo con mayores niveles de linfocitos T gamma delta IL 17+, el efecto de los bifosfonatos hubiese incrementado aún más niveles de dichos linfocitos favoreciendo el efecto contra células plasmáticas, además de reducir los niveles de la IL-17 secretada por los linfocitos T gamma delta. Dentro de las limitantes de nuestro estudio están tener una muestra reducida de pacientes (N=16), que existió heterogeneidad en el subtipo de mieloma que se incluyó en el estudio y que en nuestra institución se cuenta sólo con el análisis de electroforesis de proteínas para evaluar la respuesta de los pacientes. Probablemente al realizar un estudio con mayor número de pacientes en sólo un subtipo de mieloma, analizando la respuesta con estudios más sensibles como inmunofijación o análisis de cadenas ligeras en sangre y en orina, así como considerar otras líneas de tratamiento; se podría evaluar de mejor manera la relación entre las subpoblaciones linfoides y la respuesta terapéutica. 23 CONCLUSIONES Los niveles de linfocitos gamma-delta productores de IL-17 predicen de manera significativa la respuesta clínica de los pacientes con mieloma múltiple. La media de la cuenta de linfocitos gamma delta productores de IL-17 fue mayor en los pacientes que tuvieron respuesta clínica al mieloma múltiple. Es necesario estudios con mayor cantidad de pacientes, así como una la evaluación de la respuesta con estudios más sensibles para detección de proteína monoclonal. 24 BIBLIOGRAFIA 1. Anderson K and Carrasco R. Pathogenesis of Myeloma. Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2011. 6:249–74 2. 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Targeting IL-17A in multiple myeloma: a potential novel therapeutic approach in myeloma. Leukemia. 2016 Feb; 30(2):379-89. 21. Jung H, Hoon J, Rok Y. et al. Combination of Melphalan, Prednisone, and 50 mg Thalidomide Treatment in Non Transplant Candidate Patients with Newly Diagnosed Multiple Myeloma. Korean J Intern Med. 2011; 26(4): 403- 09. 22. Kunzmann V, Bauer E, Feurle J. et al. Stimulation of γδ T cells by aminobisphosphonates and induction of antiplasma cell activity in multiple myeloma. Blood 2000; 96(2): 384-92. 27 ANEXOS ANEXO 1. CLASIFICACIÓN POR ESTADIOS DEL MIELOMA MÚLTIPLE (DURIE Y SALMON) Greipp P., San Miguel J., Durie B.. International Staging System for multiple myeloma. J. Oncol 2005; 23(15) 3412-20. ESTADIO CRITERIOS MASA TUMORAL (células x 1012/m2) I Todos los siguientes 1. Hemoglobina >10 g/dl 2. Calcemia normal 3. Radiología ósea normal 4. Bajo componente monoclonal: a. IgG < 5 g/dl b. IgA < 3 g/dl c. cadenas ligeras en orina < 4g/24 h Baja (<0.6) II No clasificable en estadio I ni III Intermedia (0.6-1.2) III Uno o más de los siguientes 1. Hemoglobina <8.5 g/dl 2. Calcemia corregida > 11.5 mg/dl 3. Lesiones óseas avanzadas (escala 3) 4. Alto componente monoclonal: a. IgG > 7 g/dl b. IgA > 5 g/dl c. Cadenas ligeras orina >12 g/24 h Alta (>1.2) A. creatinina < 2 mg/dl B. creatinina ≥ 2 mg/dl 28 ANEXO 2.- INDICE PRONÓSTICO INTERNACIONAL Greipp P., San Miguel J., Durie B.. International Staging System for multiple myeloma. J. Oncol 2005; 23(15) 3412-20. 29 ANEXO 3. ESTADIFICACIÓN DE RIESGO DE ACUERDO A ALTERACIONES CITOGENETICAS Mikhael J., Dingli D., Roy V., et al. Management of Newly Diagnosed Symptomatic Multiple Myeloma: Updated Mayo Stratification of Myeloma and Risk-Adapted Therapy (mSMART) Consensus Guidelines 2013. Mayo Clin Proc.;2013: 88(4):360-76 30 ANEXO 4. CRITERIOS DE RESPUESTA MIELOMA MÚLTIPLE DE ACUERDO AL INTERNATIONAL MYELOMA WORKING GROUP RESPUESTA COMPLETA Se requieren estas 3 condiciones: • Ausencia de componente monoclonal en suero y orina, comprobada por inmunofijación • Menos de 5% de células plasmáticas en médula ósea. •Desaparición de plasmocitomas (si existen al diagnóstico). Si enfermedad sólo medible por cadenas ligeras libres (FCL): ratio FLC normal RESPUESTA COMPLETA ESTRICTA Remisión Completa y además: • Ratio FLC normal y • Ausencia de células clónales en médula ósea por inmunohistoquímica o citometría de flujo (de 2 ó 4 colores) MUY BUENA RESPUESTA PARCIAL Componente monoclonal sérico o urinario detectable por inmunofijación pero no en electroforesis o Reducción mayor o igual del 90% en el componente monoclonal sérico y Componente monoclonal urinario < 100mg/24h. En pacientes cuya enfermedad sólo sea medible por FLC: disminución ≥ 90% en la diferencia entre los niveles de FLC alterada vs no alterada con ratio persistentemente anormal. RESPUESTA PARCIAL Reducción ≥ 50%-<90% del componente monoclonal sérico. y • Reducción ≥ 90% del componente monoclonal urinario o <200 mg/24h. • En pacientes cuya enfermedad sólo sea medible por cadenas ligeras libres: disminución ≥ 50% en la diferencia entre los niveles de cadenas ligeras libres alterada vs no alterada con ratio persistentemente anormal. 31 • Disminución del tamaño de plasmocitomas de partes blandas ≥50% (si aplicable). Si el componente monoclonal en suero y orina y las cadenas ligeras libres no son medibles, se requerirá una disminución ≥ 50% de las células plasmáticas, suponiendo que el porcentaje basal de CP es ≥30% RESPUESTA MÍNIMA Reducción ≥ 25% pero ≤ 49% del componente monoclonal en suero y reducción del componente monoclonal en orina de 24 horas entre el 50%-89%. Disminución del tamaño de plasmocitomas de partes blandas entre el 25-49% (si aplicable) ENFERMEDAD ESTABLE Todos los enfermos que no cumplen criterios de Respuesta completa Muy buena respuesta parcial Respuesta parcial Respuesta mínima ó Enfermedad progresiva PROGRESIÓN DE LA ENFERMEDAD Incremento > 25% desde los valores basales de: Componente monoclonal sérico (con incremento absoluto ≥ 0,5 g/dl) Componente monoclonal urinario (con incremento absoluto ≥ 200 mg/24h) En pacientes sin enfermedad medible en suero u orina: incremento > 10 mg/dL en la diferencia entre los niveles de cadenas ligeras libres afectada y no afectada. Sólo en pacientes sin enfermedad medible en suero / orina ni por cadenas ligeras libres: Incremento en el porcentaje de células plasmáticas medulares ≥10%. Portada Índice Resumen Texto Conclusiones Bibliografía
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