Práctica 3

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Facultad de Ciencias Químicas–Orizaba 
Universidad Veracruzana 
Laboratorio de Análisis Instrumental 
___________________________________________________________________________________________ 
Dr.
José
Angel
Cobos–Murcia
(2010)

Práctica
3

Validación
de
métodos
analíticos
empleando
hoja
de
cálculo

Equipo
No
insertar;
Castro–Zamudio,
E.1,
Domíngez–Orea
J.R.1,
Flores–Bello
M.2,
Suarez–Madero
M.A.,3
y
Zamora–Pérez
J.R.,1.

1)
QFB
Gen
S09,
2)
IAQ

Gen
S09
y
3)
QFB
Gen
S08





Resumen.

.

1. Introducción.

Una
vez
que
el
experimento
ha
sido
diseñado
y
optimizado
es
necesario
realizar
su
validación.
Es
decir,
que

dicho
 experimento
 puede
 ser
 realizado
 por
 cualquier
 experimentador
 o
 laboratorio,
 y
 que
 su
 resultado

siempre
será
el
correcto
con
un
intervalo
de
error
aceptable.

Validación.

Los
métodos
 de
 validación
 analítica
 son
 una
 de
 las
medidas
 universalmente
 reconocidas
 como
 parte
 del

aseguramiento
de
la
calidad
en
la
química
analítica.
Son
criterios
que
debe
cumplir
un
método
analítico
para

cumplir
ciertas
normas
nacionales
e
internacionales
que
demuestran
que
un
método
es
confiable.

En
 la
 actualidad
 existen
 legislaciones
 regulatorias
 en
 la
 industrias,
 como
 la
 FDA
 y
 la
USP,
 que
 presentan

procedimientos
 analíticos
 para
 la
 caracterización
 de
 los
 métodos
 analíticos.
 Así
 mismo
 existen
 otros

protocolos
 y
 guías
 redactadas
 por
 otras
 organizaciones
 como,
 las
 publicaciones
 IUPAC,
 las
 ISO,
 AOAC

internacional,
 The
 international
 conference
 on
 harmonization
 (ICH),
 entre
 otras.
 Los
 criterios
 analíticos

recomendados
por
estas
organizaciones
para
la
validación
de
métodos
analíticos
son,
exactitud,
presición,

selectividad,
límite
de
detección,
límite
de
cuantificación,
intervalo
de
linealidad
y
robustez.

Finalmente,
una
vez
que
el
experimento
ha
sido
planteado
y
optimizado
es
posible
realizar
su
validación.

Esto
implica
que
el
experimento
planteado
presenta
una
certeza
y
reproducibilidad
adecuada,
siendo
así
un

procedimiento
confiable.
Que
podrá
ser
empleado
en
cualquier
otra
parte
y
podrá
reproducir
los
resultados.

Por
ejemplo,
considerando
la
determinación
amperométrica
de
un
neurotransmisor,
en
donde
la
respuesta

obtenida
 es
 la
 corriente
 eléctrica
 durante
 la
 determinación.
 El
 método
 se
 calibra
 y
 se
 valida
 para
 un

intervalo
de
1
a
10
µM,
por
lo
tanto
se
realiza
una
curva
de
calibración
determinando
el
valor
de
la
corriente

eléctrica
al

cambiar
el
valor
de
la
concentración,
como
se
puede
observar
en
la
Tabla
1,
para
cada
valor
de

concentración
corresponde
un
valor
de
corriente.


Tabla
1:
Curva
de
calibración
para
un
método
amperométrico
en
el
intervalo
de
concentración
de
0
a
10
mM
y

sus
correspondientes
respuestas.

Concentración del 
neurotrasmisor /mM 
Corriente / 
mA 
0 0 
1 75 
2 150 
3 220 
4 295 
5 365 
6 435 
7 510 
8 580 
9 656 
10 725 


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Dr.
José
Angel
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Intervalo
de
 linealidad:
Es
el
 intervalo
de
concentraciones
a
 las
cuales
el
método
presenta
 linealidad
o
se

ajusta
al
modelo
que
lo
describa.
En
este
caso
el
intervalo
es
de
1
a
10µM.
Para
evaluar
si
el
método
es
lineal

y
se
ajusta
al
modelo
es
necesario
realizar
la
regresión
lineal.

En
 la
 Figura
 1
 se
 muestra
 la
 gráfica
 de
 los
 puntos
 de
 la
 Tabla
 4
 y
 su
 correlación
 lineal.
 El
 valor
 de
 la

pendiente
 y
 que
 se
 interpreta
 como
 la
 sensibilidad
 del
 método,
 presentando
 nuestro
 ejemplo
 una

sensibilidad
de
72mAmM‐1
y
una
intersección
o
punto
cuando
la
concentración
es
cero
de
2.9
mA.
Además

obtenemos
 el
 valor
 del
 coeficiente
 de
 correlación
 lineal
 que
 representa
 que
 tan
 bien
 ajustados
 están
 los

datos
experimentales
al
modelo
lineal.
Siendo
en
este
ejemplo
de
0.999,
muy
cercano
a
1
lo
que
indica
que

se
ajustan
casi
de
manera
perfecta
al
modelo.




Figura
1:
Curva
de
calibración
y
su
regresión
lineal
de
los
datos
experimentales.



Exactitud:
Es
la
capacidad
del
método
para
determinar
un
valor
determinado
en
varias
ocasiones
dentro
de

un
intervalo
de
error.
Para
obtenerlo
se
coloca
en
repetidas
ocasiones
una
muestra
con
una
concentración

determinada
dentro
del
intervalo
de
linealidad
del
método,
evaluando
las
variaciones
para
conocer
el
error

de
la
medición,
analizando
la
desviación
estándar
y
el
coeficiente
de
variación.
En
el
ejemplo,
se
evaluó
el

valor
de
6
mM
por
triplicado,
mostrando
un
coeficiente
de
variación
de
1.66
%
y
un
porcentaje
de
recobro

de
98
%

Precisión:
Al
someter
el
método
a
cambios
de
al
menos
tres
concentraciones,
en
repetidas
ocasiones
y
en

orden
 aleatorio.
 El
 método
 debe
 reportar
 siempre
 el
 mismo
 valor
 de
 respuesta
 para
 cada
 uno.

Determinando.
En
el
ejemplo
del
método
amperométrico,
se
evalúan
los
valores
de
3,
6
y
9
mM,
cada
uno

por
triplicado,
en
orden
aleatorio
y
los
parámetros
por
analizar
son
la
desviación
estándar
y
el
coeficiente

de
variación
de
1.65
%.

2. Objetivo.

Conocer
 las
 herramientas
 para
 diseñar
 experimentos,
 así
 como
 optimizarlos
 de
 acuerdo
 a
 la
 respuesta

obtenida
 por
 el
 método
 analítico
 y
 validar
 el
 método.
 Empleando
 las
 herramientas
 computacionales
 del

programa
computacional
Excel.

3. Metodología.

Material.

El
material
que
se
utilizará
en
esta
práctica
serán
los
mostrados
en
la
Tabla
2,
que
corresponde
a
resultados

experimentales
hipotéticos.
Se
muestran
los
valores
de
absorbancia
para
cada
valor
de
concentración
en
un

intervalo
de
0
a
20
%
de
concentración
del
analito.


Tabla
2:
Datos
de
concentración
y
su
respuesta
en
unidades
de
absorbancia
en
el
intervalo
establecido.

% 
concentración 
Unidades de 
absorbancia 
0 0 
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2 0.15 
4 0.33 
6 0.45 
8 0.65 
10 0.75 
12 0.88 
14 1.13 
16 1.32 
18 1.34 
20 1.61 


Para
la
determinación
de
la
exactitud
y
la
precisión
del
método
se
evalúa
una
muestra
que
contiene
10.1
%

y
que
obtiene
como
respuesta
una
lecturas
en
unidades
de
absorbancia
de:
0.775,
0.769,
0.776
y
0.773.


Equipo

Se
empleará
el
programa
computacional
Microsoft
Excel
para
el
análisis
de
los
datos.

Procedimiento.

1. Graficar
los
datos
de
la
Tabla
2.
Realizar
la
correlación
lineal
y
determinar
los
valores
de
pendiente

(m)
e
intersección
(a).

2. Vaciar
los
datos
de
la
Tabla
3
en
una
nueva
hoja
de
cálculo
de
Excel.

3. Para
conocer
si
el
método
analítico
es
preciso
y
exacto
se
deben
determinar
los
valores
estadísticos

de
promedio,
desviación
estándar,
porcentaje
de
recobro
y
coeficiente
de
variación.


4. Insertar
los
valores
de
la
intersección
(a)
y
la
pendiente
(m)
calculados
en
la
regresión
lineal
de
la

Figura
y
colocarlos
en
las
celdas
B1
y
B2

5. Agregar
 el
 valor
 de
 la
 concentración
 a
 la
 cual
 se
 realizó
 la
 determinación
 en
 la
 celda
 B4.

Mencionado
en
las
sección
de
materiales.

6. Agregar
los
resultados
de
la
determinación
hechas
por
cuadruplicado
y
mencionado
en
las
sección

de
materiales
en
las
celdas
B7
a
B10
(B7:B10).

7. Para
calcular
el
valor
de
concentración
a
través
de
los
valores
de
la
absorbancia
de
luz.
Por
lo
que,

necesario
 despejar
 la
 ecuación
 del
 modelo
 lineal
 (E1
 
 E2),
 calculado
 para
 cada
 una
 de
 las

mediciones
realizadas
B7:B10.

8. Para
calcular
el
valor
promedio
de
la
concentración
se
escribe
la
fórmula
=PROMEDIO(E7:E10)
que

nos
ayudará
a
conocer
que
tan
cercana
se
encuentra
el
valor
calculado
con
el
valor
real
agregada.


9. Para
 calcular
 la
 desviación
 estándar
 se
 escribe
 la
 fórmula
 =DESVEST(E7:E10)
 que
 nos
 indicará

cuanta
es
la
desviación

de
la
medición
determinada
usando
el
método.


Tabla
3:
hoja
de
cálculopara
determinar
la
exactitud
y
la
precisión
de
un
método
analítico.

 A B C D E 
1 Pendiente (m) insertar valor Ecuación lineal Abs=a+(m*concentración) 
2 Intersección (a) insertar valor Despeje concentración=(abs–a)/m 
4 
Concentración 
agregada /% 
insertar valor 
 
Concentración 
recobrada /% 
 
6 Mediciones Concentración /% 
7 medición 1 insertar valor =(B6–$B$3)/$B$2 
8 medición 2 insertar valor =(B7–$B$3)/$B$2 
9 medición 3 insertar valor =(B8–$B$3)/$B$2 
10 medición 4 insertar valor =(B9–$B$3)/$B$2 
11 
12 Promedio =promedio(E7:E10) 
13 desviación =DESVEST(E7:E10) 
14 Recobro /% =(E12*100)/E4 
15 CV =(E13/E12)*100 




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10. Para
conocer
si
el
método
es
preciso,
el
porcentaje
de
recobro
nos
indica
que
tan
cerca
se
encuentra

la
 señal
 detectada
 de
 la
 cantidad
 real
 agregada.
 Para
 ello
 se
 requiere
 del
 valor
 del
 valor
 real

agregado
en
la
determinación.
El
cálculo
se
realiza
multiplicando
el
promedio
por
cien
y
dividiendo

entre
el
valor
real,
escribiendo
en
la
celda
E14
la
fórmula
=(E12*100)/E4. 

11. La exactitud nos indica si el método repite un valor lo más cercano al valor cercano, por lo 
que para conocer éste parámetro se determina con el coeficiente de variación (CV). Para ello 

dividiendo
 la
 desviación
 estándar
 entre
 el
 promedio
 y
 multiplicado
 por
 100,
 para
 este
 caso
 se

ingresa
en
la
celda
E15
la
fórmula, =(E13/E12)*100.