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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA PRODUCCIÓN DE INULINASAS UTILIZANDO JUGO DE Agave tequilana Weber COMO SUSTRATO. T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS PRESENTA BLANCA ESTELA GARNICA GARCÍA MÉXICO, D.F. AÑO JURADO JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE VOCAL SECRETARIO 1er. SUPLENTE 2do. SUPLENTE RAÚL GENARO AGUILAR CABALLERO MARÍA DEL CARMEN WACHER RODARTE ABEL BLANCAS CABRERA FRANCISCO RUÍZ TERÁN MARICARMEN QUIRASCO BARUCH SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS, UNIDAD DE BIOPROCESOS. UNAM. ASESOR DEL TEMA SUPERVISOR TÉCNICO ___________________________________ ____________________________________ Ing. Abel Blancas Cabrera Biól. Jesús Villegas Cruz SUSTENTANTE ______________________________________ Blanca Estela Garnica García ÍNDICE INDICE Pág. CAPÍTULO I. RESUMEN 1 CAPÍTULO II. INTRODUCCIÓN 3 CAPÍTULO III. GENERALIDADES 6 3.1 Los Agaves y su Importancia Económica 6 3.2 Características del Agave tequilana Weber var. Azul 8 3.3 El Potencial del Agave tequilana para la Producción de Enzimas Comerciales 10 3.4 Características de los Hongos y del Género Aspergillus 12 3.5 Efecto del Nitrógeno en las Células y en la Producción de Inulinasas 16 3.6 Efecto de algunos Iones sobre la Producción Enzimática 19 3.7 Características de la Enzimas y su Importancia 21 3.8 Producción de las Inulinasas 24 3.9 Los Fructanos como Sustancias de Reserva 26 3.10 Características de la Inulina 27 3.11 Importancia de la Inulina, Agavinas y Fructooligosacáridos (FOS) como Prebióticos 30 3.12 El Potencial de los Fructanos para la Producción de Biocombustibles 33 ÍNDICE CAPÍTULO IV. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS 36 CAPÍTULO V. OBJETIVOS 37 5.1 OBJETIVO GENERAL 37 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 37 CAPÍTULO VI. MATERIALES Y MÉTODOS 38 6.1 Aspergillus niger CH – A – 2010, microorganismo productor de inulinasas 38 6.2 Elaboración de los Medios de cultivo 38 6.2.1 Reactivos Utilizados 38 6.2.2 Formulación del Medio de Cultivo para la Propagación de la Cepa 38 6.2.3 Método para la Conservación de la Cepa 39 6.2.4 Medios de cultivo a nivel de matraz Fernbach para la producción de inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 39 6.2.5 Medios de cultivo para fermentaciones de 2, 10 y 12 L para la producción de inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 40 6.3 Propagación del hongo Aspergillus niger CH – A – 2010 40 6.4 Proporción de Inóculo en los Medios de Cultivo 40 6.5 Tratamiento de la Fuente de Carbono: Jugo de Agave tequilana 41 6.6 Fermentaciones y muestreo 41 6.7 Obtención de filtrados enzimáticos 41 6.8 Ensayo para la determinación de la actividad inulinolítica 42 6.9 Diseño Factorial para la Producción de Inulinasas 42 ÍNDICE 6.10 Evaluación de algunos Iones sobre la Producción de Inulinasas 44 6.11 Evaluación del Jugo de Agave sobre la Producción de Inulinasas 44 6.12 Diagrama general de trabajo 45 CAPÍTULO VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 46 7.1 El jugo de Agave tequilana Weber var. Azul como Fuente de Carbono para la Producción de Inulinasas de Aspergillus niger CH– A – 2010. 46 7.2 Efecto del jugo de Agave tequilana sobre la Producción de Inulinasas de la cepa Aspergillus niger CH – A – 2010 cuando es suplementado con Fuentes de Nitrógeno Orgánico a nivel de Matraz Fernbach 47 7.3 Efecto de la harina de soya sobre la producción de inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 a nivel de fermentador de 2 y 12 L 49 7.4 Efecto del extracto de levadura sobre la producción de inulinasas de A. niger CH – A – 2010 en fermentador con 2 L de medio de cultivo 50 7.5 Producción de inulinasas de A. niger CH – A – 2010 con las diferentes condiciones propuestas en el diseño factorial 51 7.6 Efecto del extracto de levadura sobre la producción de inulinasas de A. niger CH – A - 2010 en fermentador de 10 L 56 7.7 Efecto de la adición de sulfato de magnesio sobre la producción de inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 en fermentador de 2 L cuando se utiliza extracto de levadura como fuente de nitrógeno 57 ÍNDICE 7.8 Efecto de la mezcla de micronutrientes sobre la producción de inulinasas de A. niger CH – A – 2010 a nivel de matraz Fernbach cuando se utiliza jugo de agave adicionado con extracto de levadura como fuente de nitrógeno 58 7.9 Evaluación del efecto de la peptona de caseína sobre la producción inulinolítica de A. niger CH – A – 2010, en cultivos sumergidos a nivel de fermentador de 2 L, cuando se utiliza jugo de agave como fuente de carbono 59 7.10 Efecto del jugo de agave sobre la producción de inulinasas en fermentador de 2 L utilizando extracto de levadura como fuente de nitrógeno 61 7.11 Efecto del jugo de agave sobre la producción de inulinasas de A. niger CH – A – 2010 en fermentador de 2 L cuando se utiliza peptona de caseína como fuente de nitrógeno 62 CAPITULO VIII. CONCLUSIONES 64 CAPITULO IX. PERSPECTIVAS 66 CAPITULO X. BIBLIOGRAFÍA 67 RESUMEN 1 CAPÍTULO I. RESUMEN El cultivo de Agave tequilana Weber var. Azul es importante en México porque es la única planta permitida por la NOM – 006 – SCFI – 1994 para la producción de tequila. Estudios realizados a estas plantas, muestran que su material de reserva está conformado principalmente por mezclas complejas de fructanos ramificados, los cuales, se encuentran unidos entre sí mediante enlaces β-2,1 y también β-2,6 glicosídicos, por lo que esta característica, ha llevado a renombrar a estos fructanos como agavinas. De acuerdo con las características de las agavinas, se han realizado estudios sobre su potencial para la producción de enzimas de interés biotecnológico, dentro de las cuales destacan las inulinasas. Las aplicaciones de estas enzimas microbianas podrían abarcar desde la elaboración de alimentos y bebidas, hasta la obtención de azúcares reductores para la producción de bioetanol. Por otra parte, se ha observado que los microorganismos más empleados para producir inulinasas, son los del género Kluyveromyces spp. y Aspergillus spp. La cepa CH – A – 2010 de Aspergillus niger utilizada en el presente estudio, fue aislada de un campo de cultivo de agave en el estado de Jalisco y en un estudio previo se mostró que es capaz de producir inulinasas extracelulares en cultivos sumergidos cuando se utilizan pencas de agave como fuente de carbono adicionadas con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno y fosfatos, las cuales generaron un nivel de actividad de 1.48 U/mL. Adicionalmente, otros estudios han demostrado que es posible incrementar el nivel de actividad de las inulinasas extracelulares de algunas cepas de Kluyveromyces sp., tales como: Kluyveromyces sp. Y-85 y K. marxianus YS-1, utilizando diferentes sustratos como son: extracto de Alcachofa de Jerusalén en la primera cepa y extractos de la raíz de Asparagus racemosus ó inulina extraída de tubérculos de Dalia en la segunda. En todos los casos, se observó que las fuentes de nitrógeno orgánico favorecen la producción de inulinasas, especialmente los extractos de carne, cuando se comparan con algunas fuentes de nitrógeno inorgánicas, dentroRESUMEN 2 de las que se encuentran el cloruro de amonio, sulfato de amonio, nitrato de amonio, nitrato de sodio y urea (Singh, et al., 2007). En este trabajo, se evaluó la producción de inulinasas extracelulares de Aspergillus niger CH – A – 2010 en cultivo en lote sumergido a nivel de matraz Fernbach con 1 litro de medio de cultivo, utilizando jugo de Agave tequilana Weber var. Azul como fuente de carbono adicionado con diferentes fuentes de nitrógeno orgánico como: agua de cocimiento de maíz, extracto de levadura, harina de soya y peptona de caseína, en tanto que la fuente de nitrógeno inorgánico utilizada fue el sulfato de amonio, además del uso de fosfatos en todos los casos. Se estableció que a nivel de matraz Fernbach el jugo de agave puede ser utilizado como fuente de carbono, ya que la producción de inulinasas cuando se utilizó sulfato de amonio como fuente de nitrógeno fue de 0.98 U/mL. Por otra parte, se observó que las fuentes de nitrógeno orgánico incrementaban el nivel de actividad de las inulinasas en la cepa utilizada, siendo la harina de soya la fuente con la cual se obtuvo el mayor nivel de actividad inulinolítica (4.9 U/mL) entre las fuentes evaluadas. Posteriormente, se evaluó la producción de inulinasas bajo las condiciones anteriores en fermentadores con 2 y 12 L de medio, en los cuales se obtuvieron actividades máximas de 0.6 y 1.17 U/mL respectivamente. Adicionalmente, se elaboró un experimento factorial 23, en el cual se valoraron dos niveles de tres condiciones del cultivo que fueron: la velocidad de agitación, la concentración de la fuente de carbono (jugo de agave) y de la fuente de nitrógeno (extracto de levadura). Con dicho experimento, se estableció que la formulación del medio de cultivo que permite incrementar la producción de inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 con respecto a las otras condiciones evaluadas en el presente estudio, consta de jugo de agave como fuente de carbono al 1% suplementado con extracto de levadura como fuente de nitrógeno al 1% y 300 RPM de agitación, obteniendo un nivel de actividad inulinolítica de 5.4 U/mL hacia las 120 h de cultivo, esto es 5.51 veces mayor a la actividad encontrada cuando se utilizó el sulfato de amonio como fuente de nitrógeno. INTRODUCCIÓN 3 CAPÍTULO II. INTRODUCCIÓN A partir de la segunda mitad del siglo XX se introdujeron en la industria alimentaria los jarabes de fructosa obtenidos del maíz. En los últimos años se ha observado que la fructosa juega un papel importante debido a que tiene un bajo costo, es un producto estable, resalta sabores y colores, es un azúcar GRAS (generalmente reconocido como seguro) y su poder endulzante es aproximadamente 1.5 – 2 veces mayor que el de la sacarosa. Dichas características hacen que estos azúcares sean ampliamente utilizados en muchos alimentos y bebidas. En este sentido se destacan los fructanos, nombre genérico que se da a compuestos constituidos por largas cadenas de moléculas de fructosa unidas químicamente, y que pueden tener diferentes tipos de enlace, en el caso de la inulina son β-2,1-glicosídicos; mientras que en la levana son β-2,6-glicosídicos, en tanto que las agavinas contienen ambos tipos de enlaces. Estas moléculas constituyen el reservorio energético de una amplia diversidad de plantas, dentro de las que se incluyen: las raíces de Dientes de León y de Achicoria, los tubérculos de la Alcachofa de Jerusalén y de Dalia, los bulbos de Iris y los tallos o “piñas” de los agaves (Rocha, 2006; González-González, et al. 2007). Debido a que el Agave tequilana Weber var. Azul es una planta abundante y barata, es muy importante en México como materia prima para la producción de tequila, ya que posee un alto contenido de fructanos dentro de los que destacan las agavinas. A partir de dichos fructanos es posible generar otros productos con valor agregado, como es el caso de las inulinasas, que son enzimas útiles para obtener fructooligosacáridos (FOS). Los FOS podrían ser incorporados como ingredientes activos en los alimentos funcionales, pues son considerados sustancias prebióticas que se caracterizan por ser carbohidratos no digeribles para el intestino humano además de estimular selectivamente el crecimiento o la actividad de microorganismos probióticos benéficos, previniendo así enfermedades gastrointestinales e inflamatorias (Bautista, 2001; Jing, 2003; Stewart, 2008). INTRODUCCIÓN 4 Otro producto que es posible obtener con las inulinasas, son los llamados “jarabes de fructosa”, que pueden ser utilizados como sustitutos de la sacarosa por las siguientes razones: poseen un alto poder endulzante semejante al de la sacarosa, hay una disminución de costos, mayores rendimientos y existe una amplia disponibilidad de materias primas (Chen, 2011). Las inulinasas se clasifican como endo – inulinasas, cuando actúan sobre los enlaces internos de la molécula de inulina produciendo inulo – oligosacáridos, mientras que las exo – inulinasas cortan las unidades de fructosa en el extremo terminal de la cadena liberando monómeros de fructosa. Las principales fuentes para obtener estás enzimas son las de origen microbiano, sin embargo, los hongos producen tanto endo como exo inulinasas extracelulares, lo que facilita los procesos de separación y purificación. Es así que los hongos filamentosos del género Aspergillus han sido los microorganismos más estudiados. Particularmente la cepa Aspergillus niger CH – A – 2010, que fue aislada de un campo de cultivo de agave en el estado de Jalisco, demostró ser capaz de producir inulinasas en fermentaciones sumergidas cuando se utilizan pencas de agave como fuente de carbono, adicionadas con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno (Rica, 2007; Kango, 2008; Stewart, 2008; Huitrón, 2008). Por otra parte, se han realizado diferentes investigaciones sobre la influencia de las fuentes de nitrógeno adicionadas al medio de cultivo sobre la producción de inulinasas de algunos microorganismos, como en el caso de la cepa Kluyveromyces marxianus YS-1, en el que se observó que la producción de inulinasas parece incrementarse en cultivos donde se utilizan sustratos de inulina extraída de tubérculos de dalia ó de extractos de la raíz de Asparagus racemosus, adicionados con algunas fuentes de nitrógeno orgánico en comparación con las fuentes de nitrógeno inorgánicas evaluadas en dicho estudio. Por otra parte, otro estudio demostró que utilizando extracto de alcachofa de Jerusalén como fuente de carbono en la cepa Kluyveromyces sp. Y–85, es capaz de producir más inulinasas cuando se adicionan fuentes de nitrógeno orgánico, especialmente con extracto de carne de cerdo; sin embargo, también se observó un incremento en la actividad INTRODUCCIÓN 5 cuando se utilizan conjuntamente la urea y el licor de maíz como fuentes de nitrógeno en el medio de cultivo, pues se obtiene una mayor actividad inulinolítica que las fuentes orgánicas por sí solas (Wei, 1998; Singh, 2006; Singh, 2007). Por lo tanto, el jugo de A. tequilana es un inductor en la producción de enzimas con actividad inulinolítica a partir de la cepa CH – A – 2010 de Aspergillus niger y adicionalmente, las fuentes de nitrógeno orgánico incrementan el nivel de actividad. La producción de estas enzimas entonces, podría ser de gran valor para la industria de los alimentos, debido al potencial que ofrecen para la obtención de fructooligosacáridos y jarabes de fructosa. GENERALIDADES 6 CAPÍTULO III. GENERALIDADES 3.1 Los Agaves y su Importancia Económica Los Agaves son plantas endémicas de América de distribución tropical y subtropical, frecuentemente presentes en zonas de clima árido, de las que el mayor número de especies son originarias de nuestro país. En las figuras 1 y 2 se muestra de manerageneral la anatomía de los agaves, que son plantas con variación en el tamaño dependiendo de cada especie; están conformadas por tallos gruesos y hojas rígidas lineales rodeadas de pequeñas espinas y algunas poseen inflorescencia en panícula densamente ramosa (Valenzuela, 2003; Verduzco-Martínez, 2008). Fig.1. Agave con inflorescencia Fig. 2. Anatomía general de las plantas de agave Durante el florecimiento de las culturas mesoamericanas, los agaves o magueyes como se les conoce comúnmente, desempeñaron un papel importante para el hombre, ya que le proporcionaban alimento, calor, techo, vestido, medicina, bebida, eran de uso religioso, de ornato, para muebles, para implementos agrícolas, como forrajes y otros usos diversos. GENERALIDADES 7 En la actualidad, las agavaceas representan un grupo de plantas con gran importancia biológica, ecológica y económica del país, dado que muchas especies son utilizadas como alimento, en la obtención de fibras para cordelería y textiles, como plantas ornamentales y principalmente en la producción de diferentes tipos de bebidas alcohólicas. Los agaves comprenden más de 200 especies, de las cuales aproximadamente tres cuartas partes se encuentran en México, área considerada como el centro de origen del género. La producción de bebidas alcohólicas es uno de los sectores industriales más exitosos en el mundo. En el caso de México, la bebida alcohólica emblemática que cubre una parte importante del mercado nacional es el tequila, que de acuerdo con la NOM-006-SCFI-1994 es una bebida alcohólica regional obtenida por destilación y rectificación de mostos, derivado de la molienda de las cabezas maduras del Agave tequilana Weber var. Azul, previamente hidrolizadas o cocidas y sometidas a fermentación alcohólica con levaduras. Además esta bebida cuenta con denominación de origen, lo que significa que el Agave tequilana que es destinado para la elaboración de tequila, solamente se produce en un territorio protegido que comprende todo el estado de Jalisco y algunos municipios de los estados de Guanajuato, Michoacán, Nayarit y Tamaulipas (Vázquez – García, 2007). Sin embargo, también se elaboran otras bebidas tradicionales, como el pulque (Agave salmiana Otto ex Salm., A. mapisaga Trel., A. atrovirens Karw. Ex Salm., A. ferox Koch, A. hookeri Jacobi y A. americana L.), la bacanora (Agave angusifolia), el sotol (Dasylirion spp.) y los mezcales (Agave angusifolia, A. potatorum, A. salmiana y otras especies). El común denominador de estas bebidas es que todas ellas se producen a partir de diferentes especies de agave, siendo los fructanos la fuente principal de azúcares fermentables (Valenzuela, 2003; Lachenmeier, 2006). En las agaváceas existen diferencias interesantes en la estructura de sus fructanos, por ejemplo, en el Agave tequilana y Agave americana se había reportado la presencia mayoritaria de fructanos tipo inulina lineal, mientras que en GENERALIDADES 8 Agave veracruz los fructanos predominantes son de tipo levana, sin embargo en estudios más recientes se demostró que los fructanos del Agave tequilana no son inulinas lineales, sino más bien una mezcla de inulinas y levanas ramificadas. Dichas variedades estructurales pueden ser, en buena parte, responsables de las diferencias que caracterizan a las bebidas que de ellas se derivan (Olivera, 2007). 3.2 Características del Agave tequilana Weber var. Azul En términos generales se cree que los agaves fueron usados para la producción de azúcares y fibras mucho antes de la llegada de los españoles. Estas plantas son monocotiledóneas y lentas en su crecimiento. Su tamaño varía de mediano a grande de 1.70 a 2.00 m de altura, 1.5 m de ancho, decreciendo significativamente en tamaño cuando florecen; extendidas radialmente, con tallos gruesos y ovoides. Hojas rígidas de 90 a 120 (-140) cm de largo y 8 a 12 cm de ancho, excluyendo el margen con dientes, es linear-lanceolada, generalmente azules a azul-verdosas. La forma del tallo es más oval en altitudes bajas y húmedas (menores a 1600 m) y oval esférica en áreas templadas y altas. Las hojas son elongadas en climas calientes sin restricción de humedad y menores en longitud en zonas templadas. Las plantas que crecen en predios sombreados (árboles de copa densa y construcciones) tienen hojas largas y flexas, con tallos pequeños (15 cm) de color verdoso y dificultad para madurar y florecer. Los suelos pobres en materia orgánica producen plantas de dimensiones menores (Valenzuela, 2003). Entre sus características, destaca la capacidad de acumular altas cantidades de fructanos en los tallos o piñas que son polímeros u oligómeros compuestos principalmente de unidades de fructosa (Waleckx, 2008). Análisis realizados a las piñas del Agave tequilana Weber var. Azul, muestran que es una planta que contiene la mayor cantidad de fructanos (20 – 24%), comparada con otras variedades como Carpintero, Pata de mula, Bermejo, Zopilochino, Sihuin GENERALIDADES 9 y chato (14.3 a 19.8%), por lo que es una materia prima perfecta para obtener fructanos de alta pureza (Bautista, 2001; Praznik, 2003). En la tabla 1 se muestra la composición de la piña de Agave tequilana determinada por métodos de la AOAC (Asociación de Comunidades Analíticas) y en la tabla 2, se muestra el contenido y composición de los carbohidratos presentes en la piña de agave, que fueron analizados con técnicas cromatográficas y enzimáticas (Gutiérrez, 2011). Tabla 1. Composición del Agave tequilana Weber var. Azul (Praznik et al, 2002) Determinación Piña y base de la penca (%) Penca zona media (%) Materia seca 31 -31.5 17.4 Proteína 1.3 – 1.4 0.35 Minerales 1.7 – 1.9 0,7 Fibra dietética insoluble 5.9 – 7.1 6.8 Carbohidratos 22.3 – 22.7 9.0 Tabla 2. Composición aproximada de los carbohidratos en Agave tequilana Weber var. Azul (Praznik et al, 2002). Determinación Piña y base de la penca (%) Penca zona media (%) Monosacáridos (Glu – Fru) Ausentes 5.2 Sacarosa 0.5 – 1.3 9.3 Fructooligosacáridos DP 3 – 10 35 – 43 60 Fructooligosacáridos DP 11 – 60 56 – 64 30 Particularmente el Agave tequilana Weber var. Azul, es una de las especies mexicanas más importantes, no solo por ser la única planta permitida para la producción del tequila, sino porque también es una potencial fuente de prebióticos, ya que un estudio reveló que en las piñas de A. tequilana, se encuentran mezclas GENERALIDADES 10 complejas de fructooligosacáridos ramificados, conformados por enlaces β-2,1, pero también β-2,6. Esta característica, ha llevado a renombrar a estos fructanos como agavinas y en la figura 3 se muestra su estructura (López, 2003; Mancilla- Margalli, 2006). Fig. 3. Estructura de los fructanos encontrados en plantas de Agave tequilana Weber var. Azul de 8 años de edad propuesta por López, et al 2003. 3.3 El Potencial del Agave tequilana para la Producción de Enzimas Comerciales Debido a la composición de carbohidratos en el Agave tequilana, se ha investigado el potencial uso de esta planta como sustrato para la producción de enzimas de importancia comercal. Una investigación demostró que las cepas de Aspergillus niger CH – A – 2010 y CH – A – 2016, aisladas de un campo de cultivo de agave en el estado de Jalisco, son capaces de producir algunas enzimas de interés, tales como: inulinasas, GENERALIDADES 11 xilanasas, celulasas, exo y endo pectinasas principalmente, en cultivos sumergidos a nivel de matraz con 500 mL de medio, cuando se utilizan las pencas del Agave tequilana como sustrato (fuente de carbono) adicionadas con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno y fosfatos. A continuación se muestra en la tabla 3 que en el caso de la cepaCH – A – 2016, existe mayor producción de xilanasas y endo – pectinasas con 1.52 U/mL y 2.7 RFU respectivamente, mientras que la cepa CH – A – 2010, demostró ser capaz de excretar en su mayoría inulinasas con 1.48 U/mL (Huitron, 2008). Tabla 3. Actividades enzimáticas extracelulares producidas por los hongos aislados de los desperdicios de Agave tequilana. Por otra parte, se han establecido las condiciones de cultivo bajo las cuales el hongo A. niger CH – A – 2010 es capaz de producir enzimas en cultivos sumergidos a nivel de fermentador de 10 L cuando se utilizan pencas de Agave tequilana como fuente de carbono, adicionadas con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno y fosfatos. Se obtuvieron extractos enzimáticos crudos con actividad de inulinasas que permitieron evaluar su capacidad de hidrólisis sobre sustratos ricos en fructanos como penca de agave, fructanos de agave en polvo y nanofiltrados, inulina de achicoria y jugo de agave, y se determinó que el nivel de las enzimas producidas por el hongo es muy semejante al de las enzimas comerciales (Gutiérrez, 2011). GENERALIDADES 12 3.4 Características de los Hongos y del Género Aspergillus Entre los organismos eucariotas, las especies más conocidas en el trabajo de la biotransformación son las levaduras y los mohos. Como organismos eucariotas, los hongos poseen núcleo y muchos organelos citoplasmáticos tales como: retículo endoplasmático, componentes del citoesqueleto y mitocondrias. La pared celular está constituida principalmente por quitina y en menor medida por celulosa, son organismos inmóviles que no contienen clorofila y se pueden reproducir sexual o asexualmente mediante las esporas. Muchos hongos filamentosos están naturalmente adaptados al crecimiento sobre superficies de diferentes sustratos, la mayoría son aerobios y algunos son anaerobios facultativos; no se conocen hongos anaerobios estrictos. Su tamaño celular es mayor que el de las bacterias, teniendo una anchura de 4 – 20 µm y longitudes de más de 100 µm. Los hongos exhiben como grupo una diversidad de posibilidades metabólicas casi tan grande como las bacterias. Su taxonomía se basa más en características morfológicas que en reacciones bioquímicas o tintoriales. Requieren un contacto cercano con el sustrato debido a su nutrición heterótrofa, secreción de enzimas extracelulares y absorción de nutrientes a través de la pared celular, muchas especies pueden crecer en medios mínimos siempre y cuando exista una fuente de carbono orgánico y nitrógeno en forma de NH4 + ó NO3 -, suelen crecer mejor a pH ácido alrededor de 5.0 y son capaces de crecer sobre sustancias con poco contenido de humedad. Muchos necesitan determinados aminoácidos y vitaminas para crecer, sin embargo requieren poco menos nitrógeno que las bacterias. La mayoría de los hongos viven como saprófitos en el suelo y agua donde descomponen principalmente materia vegetal y son más resistentes que las bacterias a la presión osmótica, por tanto pueden crecer en concentraciones elevadas de azúcar y sal. También algunos de ellos pueden hidrolizar las complejas moléculas orgánicas de la madera, hueso, cuero curtido, quitina, ceras e incluso plásticos sintéticos (Tortora, 1993; Davis, 1996; Lee, 2002; Izarra, 2010). GENERALIDADES 13 Están conformados por una estructura vegetativa llamada micelio, que es un sistema muy ramificado de hifas. Dentro de esas hifas hay una masa móvil de citoplasma que contiene muchos núcleos. Los largos y finos filamentos de células dentro del micelio llamados hifas pueden formar esporas o conidios asexuales a menudo muy pigmentados y resistentes a la desecación, que sirven como forma de dispersión del hongo en nuevos hábitats y son considerados el principio y el final del desarrollo en el ciclo de los hongos. Una vez formados los conidios, cambia el color blanco del micelio adquiriendo distintos tonos de verde, pardo, amarillo, blanco, gris y negro, dicha coloración es la principal característica macroscópica para la identificación de los grupos de Aspergillus. Cuando las esporas latentes encuentran un lugar conveniente en el medio ambiente, comienza el proceso de germinación. Las cabezas conidiales presentan bajo el microscopio las formas básicas: globosa, radiada y columnar o claviforme como se muestra en la figura 5 y a simple vista las más grandes suelen parecer diminutos alfileres sobre el sustrato (Carrillo 2003; Herrera, 2004). Fig. 5. Estructura de los hongos del género Aspergillus spp. GENERALIDADES 14 Estos Aspergillus, son uno de los géneros más importantes de mohos a nivel industrial. La mayoría de los productos útiles de estos organismos son algunos medicamentos, ácidos orgánicos y enzimas (Lee, 2002) Este género, se encuentra dentro de la división Eumycota, subdivisión Deuteromycotina, clase Hyphomycetes, orden Moniliales y familia Moniliaceae. Incluye todos los hongos imperfectos que producen sus conidios en conidióforos hialinos, o directamente de hifas hialinas no diferenciadas en conidióforos. Se han descrito aproximadamente 200 especies y una gran cantidad de variedades. Los conidióforos de Aspergillus terminan en un hinchamiento llamado vesícula que en conjunto con las cadenas de conidios se le conoce como cabeza conidial. Aspergillus es de los hongos que presentan una mayor distribución geográfica, encontrándose desde las regiones árticas hasta el Ecuador. El aire y el suelo de casi cualquier parte del mundo contienen los conidios de diferentes especies. Son los hongos más omnívoros que existen, capaces de asimilar como alimento una enorme variedad de sustancias, debido al número de enzimas que pueden producir para degradarlas. Los dos requisitos principales que deben tener los diferentes sustratos para que se desarrollen estos hongos, son la presencia de algún tipo de materia orgánica y un poco de humedad; si ambos factores están presentes, los aspergilos pueden crecer casi en cualquier sustancia, sin embargo también debe existir nitrógeno ya sea como ion amonio o como nitrato ya que es un componente específico de proteínas y ácidos nucleicos como moléculas complejas que intervienen en la elaboración de materia viva. Debido a las grandes actividades enzimáticas que presentan los Aspergillus, varias especies son utilizadas en diversos procesos industriales para la elaboración comercial de productos que abarcan desde ácidos orgánicos hasta enzimas, antibióticos y alimentos fermentados de varias clases, éstos últimos principalmente en países orientales. Por ejemplo los ácidos cítrico y glucónico son sintetizados en una escala industrial utilizando cultivos seleccionados de A. niger (Herrera, 2004) GENERALIDADES 15 Entre las fuentes microbianas, son un grupo de mayor interés industrial en la producción de enzimas. Particularmente Aspergillus niger es uno de los microorganismos más utilizados para dicha producción a nivel industrial, debido a sus altos niveles de secreción de proteínas, lo que posibilita la producción a gran escala, sus productos son generalmente considerados como GRAS (generalmente reconocido como seguro), lo que permite su aplicación en la industria de alimentos tanto para el hombre como para los animales y cuenta con una amplia capacidad metabólica para la utilización de diversos sustratos. Por lo que desempeña un papel importante en el campo de la biotecnología. Estos hongos, son la fuente más importante del mundo para la producción algunas enzimas como las pectinasas, proteasas, amiloglucosidasas, celulasas, hemicelulasas y lipasas aunque también se ha observado que pueden secretar inulinasas (Huitron, 2008; Driouch, 2010; Izarra, 2010). El sistema de cultivo más empleado en la producción de enzimas comerciales es por fermentación sumergida. En este aspecto,la producción de enzimas con hongos filamentosos en procesos biotecnológicos a menudo se correlaciona con la morfología, la cual es de crucial importancia para lograr una mayor producción. Los factores que afectan la morfología incluyen el tipo y concentración de la fuente de carbono, la concentración del inóculo, los niveles de hidrógeno, fósforo y otros minerales traza, el O2 y CO2 disueltos, el pH y la temperatura, y factores físicos como geometría del fermentador, tipo de agitación, aireación y sistema de cultivo. Las principales morfologías desarrolladas por los hongos Aspergillus en los sistemas de fermentación sumergida, corresponden al crecimiento tipo pellet, que se caracteriza por ser una esfera de micelio y el crecimiento micelial o filamentoso que a menudo parece favorable y se considera como requisito previo para garantizar una alta productividad y rendimiento debido a que esta conformación permite un mayor suministro de oxígeno a las células para estimular el crecimiento y la producción (Papagianni, 2004; Driouch, 2010). GENERALIDADES 16 3.5 Efecto del Nitrógeno en las Células y en la Producción de Inulinasas Los principales elementos necesarios para la vida son; hidrógeno, oxígeno, carbono, nitrógeno, fósforo y azufre; éstos se pueden unir de varias maneras para formar moléculas de vida. Una característica importante de las células es su capacidad para llevar a cabo reacciones químicas y organizar sus moléculas para formar estructuras específicas. Las células están compuestas fundamentalmente de macromoléculas y agua, y éstas macromoléculas a su vez, se componen de unidades más pequeñas denominadas monómeros. En esencia, la nutrición microbiana consiste en suministrar a la célula los ingredientes químicos (nutrientes) que necesitan para sintetizar monómeros. Diferentes organismos requieren diferentes tipos de nutrientes y a menudo los requerimientos son específicos. Además, no todos los nutrientes se requieren en las mismas cantidades; algunos llamados macronutrientes se precisan en grandes cantidades, tal es el caso del carbono y del nitrógeno. El carbono es el principal elemento de todas las clases de macromoléculas, en una célula típica constituye el 50% en peso seco. Después del carbono, el siguiente elemento más abundante en la célula es el nitrógeno. En una bacteria típica alrededor del 12% de su peso seco es nitrógeno, este elemento es importante como componente estructural de proteínas, ácidos nucleicos y otras biomoléculas como las vitaminas. En la naturaleza, el nitrógeno se presenta en forma orgánica e inorgánica. Sin embargo, la mayor parte del nitrógeno natural disponible está en forma inorgánica, como amoniaco, nitratos o nitrógeno atmosférico (N2). Sólo un número limitado de microorganismos puede utilizar el N2 mediante un proceso denominado fijación de nitrógeno; por lo tanto, el reciclado del nitrógeno de la tierra tiene lugar en su mayor parte con las formas más fácilmente disponibles, el amoniaco y el nitrato. El amoniaco se produce durante la descomposición de los compuestos orgánicos de nitrógeno tales como GENERALIDADES 17 aminoácidos y nucleótidos a pH neutro y se encuentra en forma de radical amonio (NH4 +). (Brock 2004) El nitrógeno, se encuentra en los compuestos orgánicos de la célula, principalmente en forma reducida como grupos amino, así los microorganismos lo toman en diferentes estados de oxidorreducción y también pueden actuar como se muestra a continuación: Fuente de nitrógeno; en cuyo caso es asimilado e incorporado al material celular, lo que ocurre en todos los microorganismos. La mayoría de los microorganismos fotosintéticos, muchas bacterias no fotosintéticas y los hongos, asimilan este elemento en estado inorgánico oxidado, como nitratos; su utilización implica, por tanto, una reducción preliminar; la reducción de nitritos a amoniaco para su incorporación al material celular se conoce como reducción asimilatoria de nitratos. Algunos microorganismos son incapaces de efectuar esa reducción, por lo que este elemento debe ser proporcionado en su forma reducida, como sales de amonio o como compuestos orgánicos que los contengan. Donadores de electrones; en este caso el amoniaco es oxidado a nitritos y éstos a nitratos, y a partir de estas oxidaciones las bacterias nitrificantes obtienen su energía. Aceptores de electrones; en este caso los nitratos se reducen a nitritos, óxidos de nitrógeno y nitrógeno elemental a través de un proceso desasimilatorio conocido como desnitrificación. Este proceso se lleva a cabo bajo condiciones de anaerobiosis. (Ramírez 2000) En cualquier medio de cultivo microbiano, la presencia de cantidad suficiente de nitrógeno es de primordial importancia, podría ser complementado en forma orgánica o inorgánica. Las fuentes de nitrógeno orgánicas más empleadas para la producción de inulinasas son; el extracto de levadura, agua de cocimiento de maíz, peptona y extractos de carne entre otros. La influencia de las fuentes de GENERALIDADES 18 nitrógeno orgánico en la producción inulinolítica ha sido descrita por muchos investigadores (Pandey, 1999). Citando algunos ejemplos de los efectos del nitrógeno, se encuentran casos como la producción de inulinasas por Kluyveromices fragilis estudiada por Snyder y Phaff (1960). Estos autores, encontraron que casaminoácidos son excelentes para el crecimiento del microorganismo y mejoran la producción enzimática, sin embargo, la purificación de estas inulinasas es difícil. En tanto que el uso de NH4H2PO4 demostró funcionar bien como amortiguador del medio. Con Candida kefyr, los niveles más altos de inulinasas fueron observados cuando se utiliza 0.35% de extracto de levadura y 0.2% de urea como una fuente de nitrógeno compleja, en un medio que contenía 5% de lactosa y 2% de inulina como sustrato. Por otra parte, Kim (1982) probó que un amplio número de fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico son efectivas para la producción de inulinasas en una cepa de Penicillium sp., sin embargo, la peptona y el licor de maíz estimulan dicha producción enzimática, mientras que la urea y el extracto de levadura tienen menor influencia. De las fuentes de nitrógeno inorgánicas, el (NH4)H2PO4 y el (NH4)2HPO4 dan altas producciones de enzimas, pero adicionalmente el sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio, nitrato de sodio y nitrato de potasio también fueron responsables en la producción. Resultados similares fueron obtenidos por Nakamura et al. (1978) con una cepa de Aspergillus niger (Vandamme, 1983). Sin embargo, otro aspecto interesante, es que en otras investigaciones recientes se ha observado que la producción de inulinasas en la cepa Kluyveromyces marxianus YS-1 se incrementó cuando se utilizaron fuentes de nitrógeno orgánico en comparación con las de origen inorgánico, cuando se utilizaron sustratos como inulina extraída de tubérculos de dalia ó con extractos de la raíz de Asparagus racemosus. En esta cepa la fuente de nitrógeno que incrementó la producción inulinolítica fue el extracto de carne, sin embargo cuando se valoró una concentración mayor de esta fuente se observó un efecto inhibitorio. Por otra parte GENERALIDADES 19 también se observó que algunas fuentes de nitrógeno inorgánico como son: el sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y la urea son inhibidores de la síntesis de inulinasas, presumiblemente por la liberación de iones amonio. Por otra parte, en 2007 se informó que las fuentes de nitrógeno complejas fueron mejores que las fuentes de nitrógeno inorgánico en la producción de inulinasas de Chrysosporium pannorum y Kluyveromyces sp. Y-85 (Singh, 2006; Singh, 2007). 3.6 Efecto de algunos Iones sobre la Producción Enzimática De manera general, se ha observado que las células utilizanalgunos iones para funciones específicas como se mencionará a continuación: El fósforo se presenta en la naturaleza en forma de fosfatos orgánicos e inorgánicos, y la célula lo necesita fundamentalmente para la síntesis de ácidos nucleícos y fosfolípidos. El azufre se requiere porque es un componente estructural de los aminoácidos cisteína y metionina y porque se presenta en ciertas vitaminas, como la tiamina, la biotina y el ácido lipoíco, así como también en la coenzima A. El potasio es necesario en todos los organismos. Una gran diversidad de enzimas lo requieren específicamente como por ejemplo, algunas implicadas en la síntesis de proteínas. El magnesio funciona como estabilizador de los ribosomas, las membranas celulares y los ácidos nucleícos, y también se necesita para la actividad de muchas enzimas. El calcio en algunos casos, ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y tiene una función importante en la termorresistencia de las endosporas. En la tabla 3 se muestran otros micronutrientes con las funciones asociadas en las células. GENERALIDADES 20 Tabla 3. Micronutrientes asociados a funciones celulares. Elemento Función Celular Manganeso (Mn) Activador de muchas enzimas; presente en algunas superóxido dismutasas y en la enzima que rompe el agua en fotótrofos oxigénicos. Zinc (Zn) Anhidrasa carbónica, alcohol deshidrogenasa, RNA y DNA polimerasas y muchas proteínas que se unen al DNA. Hierro (Fe) a Citocromos, catalasas, peroxidasas, proteínas de hierro y azufre, oxigenasas y todas las nitrogenasas. No todos los micronutrientes indicados son requeridos por todas las células; algunos se necesitan sólo en microorganismos muy específicos. a Necesario en mayores cantidades que otros metales. Normalmente no se considera elemento traza. Fuente: Brok et al., Biología de los microorganismos. El estudio del efecto de la adición de algunos iones sobre la producción de inulinasas se ha evaluado en algunas cepas y se ha observado que la adición de NaNO3 incrementa dicha producción en Fusarium oxysporum, sin embargo, dicha sal, causa un efecto inibitorio en la producción enzimática de Kluyveromyces fragilis En el caso de la cepa Aspergillus ficum, también se ha estudiado el efecto de algunos iones, como fueron: Mg2+ y Zn2+, los cuales favorecen la producción enzimática. Sin embargo, también se observo que la adición de otros iones como fueron: K+, Ca2+, Cu2+, Fe2+ y Mn2+, inhiben la producción de inulinasas (Pandey, et al., 2006). Otros estudios muestran que en la levadura Kluyveromyces marxianus, solamente Mn2+ (0.1 mM) y Ca2+ (0.5 mM), incrementan la producción de inulinasas, mientras que Mg2+, Cu2+, Zn2+, Co2+, K+, BO3 3- y MoO4 2- no tienen influencia sobre la GENERALIDADES 21 producción enzimática, sin embargo, altas concentraciones de estos elementos, genera un impacto negativo en la síntesis de inulinasas. Fe2+ y Ni2+ disminuyeron dicha producción (Singh, 2007). En tanto que en la cepa Aspergillus ochraceus, la producción de inulinasas es estimulada por la adición de Mn2+, Mg2+, Na+ y Ba2+ y se inhibe con Cu2+ y Hg2+ (Guimarães, 2007). 3.7 Características de la Enzimas y su Importancia Los fenómenos y las transformaciones biológicas han sido utilizados por el hombre en forma instintiva y práctica desde los inicios de la humanidad, siendo las industrias productoras de cerveza, quesos y similares, la base de la biotecnología enzimática, ya que por ellas se descubrió que los procesos biológicos se realizan por moléculas de naturaleza proteica conocidas como enzimas. Éstas presentan un gran potencial por las siguientes características: 1. Son muy específicas. 2. La velocidad de reacción es de dos a tres órdenes de magnitud mayor que la de los catalizadores inorgánicos. 3. Las condiciones de reacción, temperatura y presión son relativamente bajas, hace que su uso sea poco costoso (Quintero, 1987). Con el propósito de manejar la nomenclatura de forma sistemática, la Unión Internacional de Bioquímica constituyó una Comisión cuyos informes, complementados con revisiones periódicas, se aceptan actualmente como base para la clasificación de enzimas. El sistema está basado en la división de enzimas en 6 categorías principales que dependen del tipo de reacción catalizada. Esto se muestra en la tabla 4. GENERALIDADES 22 Tabla 4. Clasificación de las enzimas en base a las reacciones que catalizan Clase Tipo de reacción Oxidorreductasa Oxidorreducción en la que se gana o se pierde oxígeno e hidrógeno. Transferasa Transferencia de grupos funcionales, como amino, acetilo o fosfato. Hidrolasa Hidrólisis (adición de agua). Liasa Eliminación de grupos de átomos sin hidrólisis. Isomerasa Reorganización de átomos dentro de una molécula. Ligasa Unión de dos moléculas con energía procedente de la rotura de ATP. Fuente: Tortora et al., Introducción a la microbiología 1993. A cada categoría se le asigna un número EC por sus siglas en inglés <<Enzyme Commission>> de 4 dígitos y un nombre sistemático para cada enzima: Todas las enzimas pertenecen a uno u otro grupo de los seis principales. El primer dígito denota la clase principal, el segundo la subclase en función del tipo de sustrato, el tercero la sub-subclase de acuerdo con el requerimiento por coenzima y finalmente el cuarto número hace referencia a la reacción que cataliza (Lee, 2002; García, 2004) Las enzimas obtenidas de fuentes microbianas pueden ser clasificadas en tres campos de aplicación: las que se pueden utilizar para sintetizar compuestos útiles, GENERALIDADES 23 por ejemplo la renina, la fumarasa ó la aminotransferasa, otras que pueden llevar a cabo reacciones importantes de bioconversión debido a que son estereoespecíficas, tales como: las transferasas, pectinasas e invertasas y otro campo de aplicación lo ocupan algunas otras enzimas que son capaces de hidrolizar los polímeros en monómeros interesantes, como es el caso de la pululanasa, α y β – amilasa, lactasa e inulinasa. Todas estas reacciones pueden ser desarrolladas bajo condiciones óptimas con recursos renovables como sustrato (Vandamme, 1983; García, 2004). Para la producción comercial de una enzima, se consideran algunos factores como son: el microorganismo a utilizar, la viabilidad económica, la toxicidad química relacionada con la actividad de la enzima, las reacciones alérgicas, los rendimientos y la materia prima entre otros. Los microorganismos producen una enorme gama de enzimas potencialmente útiles, muchas de las cuales son segregadas al exterior celular. Por otra parte, son capaces de desarrollarse fácil y rápidamente en su medio de cultivo y la tecnología al respecto a gran escala se encuentra hoy bien establecida. Las enzimas extracelulares poseen tres ventajas. La primera es que dado a que la molécula es segregada fuera de la célula, no se requieren técnicas de ruptura celular, técnicas que a veces son difíciles de aplicar a gran escala, la segunda es que el número de proteínas que se segregan es limitado y por eso es relativamente fácil aislar una enzima concreta a partir de una mezcla amplia de sustancias, que incluye otras proteínas y materiales contaminantes, tales como los ácidos nucleicos y la tercera es que las enzimas extracelulares suelen presentar una estructura más compacta y son menos susceptibles a la desnaturalización que las enzimas intracelulares. En consecuencia se prefiere el uso de microorganismos que segregan enzimas (Gasesa, 1990). GENERALIDADES 24 3.8 Producción de las Inulinasas Las inulinasas, son fructofuranosil hidrolasas que pueden fragmentar a la molécula de inulina y son producidas por muchos microorganismos incluyendo, bacterias, hongos y levaduras. La reacción general involucraprincipalmente la acción de dos enzimas; las exo-inulinasas (β – D – fructan fructohidrolasa) con número EC 3.2.1.80 que cortan los enlaces glicosídicos de las unidades de fructosa en el extremo terminal de la molécula de inulina y puede continuar hasta llegar a la glucosa del extremo opuesto y las endo-inulinasas, (2,1-β-D-fructan fructanohidrolasa) con número EC 3.2.1.7 que cortan específicamente los enlaces internos β-2,1 de la inulina para producir inulotriosa, inulotetraosa e inulopentaosa como productos principales. Además ofrecen perspectivas interesantes en vista de la creciente necesidad para la producción de los llamados “jarabes fructosados” a partir de la hidrólisis parcial de la inulina y no del almidón, o bien para la obtención de fructooligosacáridos (FOS), que son ampliamente utilizados en la industria de los alimentos (Vandamme, 1983; Nakamura, 1995; Kango, 2008; Chi, 2010). Cuando las exo-inulinasas actúan sobre el extremo reductor de la molécula de inulina, liberan moléculas de fructosa y glucosa, que pueden ser fácilmente transformadas en etanol por Sacchromyces cerevisiae. Además, la inulina es un mejor material que el almidón, la celulosa y el xilano para producir altas concentraciones de etanol (Chi, 2010). Para la producción de fructosa, la inulina es hidrolizada por exo-inulinasas, este método, incluye fuentes microbianas que secretan grandes cantidades de inulinasas y pueden producir fructosa a partir de inulina en una reacción catalítica de un solo paso y con rendimientos mayores del 95%, o bien, cuando éstas actúan sinérgicamente con las endo-inulinasas, observándose un mayor rendimiento, debido a que las endo-inulinasas cortan a la inulina en varios oligosacáridos incrementando los sitios de ataque para las exo-inulinasas. (Nakamura, 1995; Kushi, 2000; Rocha, 2006; Rica, 2007; Muñoz-Gutiérrez, 2009; Chi 2010). GENERALIDADES 25 Se ha observado que muchas cepas de bacterias y hongos filamentosos mostrados en la tabla 5, producen inulinasas que pueden ser fácilmente utilizadas para hidrolizar inulina para la obtención de fructooligosacáridos (Chi, 2010). Tabla 5. Microorganismos empleados para la producción de inulinasas Microorganismo Tipo de enzima Referencias Hongos Aspergillus aureus Extracelular Gupta et al. 1994 b Aspergillus awamori Extracelular Kulminskaya et al. 2003 Aspergillus ficuum Aspergillus fischeri Extracelular Extracelular Carniti et al. 1991, Tai-Boong et al. 1999, Jing et al. 2003, Ettalibi & Baratti 2001, Gupta et al. 1994 b Fusarium sp. Extracelular Roquette-Freres 1989 Fusarium oxysporum Extracelular, Intracelular Gupta et al. 1998 Penicillium sp. Extracelular Wenling et al. 1997 P. purpurogenum Extracelular Sharma et al. 2003 Rhizopus sp. Extracelular Ohta et al. 2002 Streptomyces sp. Bacterias Extracelular Gill et al. 2003 Acetobacter sp. Arthobacter sp. Extracelular Extracelular Roquette-Freres 1989 Elyachioui et al. 1992 Bacillus sp. Extracelular, Intracelular Allais et al. 1986 Escherichia coli Flavobacterium mulivorum Staphylococcus sp. Levaduras Candida sp. Kluyveromyces marxianus Intracelular Intracelular Intracelular Extracelular Extracelular Yun et al. 1997 Allais et al. 1986 Selvakumar & Pandey 1997, 1998 a, b, 1999 a, b Roquette-Freres 1989 Selvakumar & Pandey 1998b, 1999b Fuente: Pandey Ashok et al. Enzyme Technology Tradicionalmente las inulinasas son producidas en fermentaciones sumergidas. Entre los productores de enzimas Aspergillus sp., es el hongo mejor estudiado y GENERALIDADES 26 puede producir tanto endo como exo inulinasas con alta termoestabilidad, el cual es un criterio sumamente importante que determina la conveniencia del uso de estas enzimas para aplicaciones industriales, ya que las altas temperaturas aseguran la solubilidad de la inulina y también previenen la contaminación microbiana (Singh, 2006; Chen, 2011). 3.9 Los Fructanos como Sustancias de Reserva Tanto el almidón como la sacarosa se encuentran presentes en muchas plantas como carbohidratos de reserva. Algunos cereales como el maíz, el trigo y el arroz, o los tubérculos como la papa, la yuca o el camote, almacenan glucosa en forma de almidón como fuente de carbono y energía. Sin embargo, se ha observado que los fructanos son otra forma de almacenamiento de hidratos de carbono, éstos se encuentran como mezclas heterogéneas con diferentes estructuras y grados de polimerización, en un amplio número de plantas, tales como: la cebolla, el ajo, la achicoria, la alcachofa y los agaves, entre otros. Debido a que se ha descubierto que es un ingrediente saludable que puede ser adicionado en los alimentos funcionales, y a que se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, ha incrementado el interés en estos carbohidratos (Ritsema, 2003). La presencia de fructanos en las plantas, se correlaciona con efectos muy variados, tales como la protección contra condiciones extremas de sequía o de bajas temperaturas, ya que pueden ser sintetizados por debajo de los 12ºC, mientras que a estas temperaturas el metabolismo del almidón es severamente inhibido. Además se pueden almacenar en mayor cantidad, porque se sintetizan en las vacuolas que ocupan alrededor del 70% del volumen de las células (Olvera, 2007). Estructuralmente, constan de oligómeros o polímeros de fructosa y derivan de la molécula de sacarosa. Los fructanos de las plantas tienen diferentes estructuras y longitudes de cadena, aquellos con un grado de polimerización de 2 a 10 son GENERALIDADES 27 comúnmente llamados fructooligosacáridos, y cuando el grado de polimerización es de al menos 30 unidades de fructosa se le conoce como inulina (Vandamme, 1983) Los fructanos de distinto origen pueden diferir por el grado de polimerización, la presencia de ramificaciones, el tipo de enlace entre las unidades de fructosa adyacentes y la posición de los residuos de glucosa. En la naturaleza se distinguen principalmente cinco clases estructurales de fructanos: inulina, levana, mezclas de fructanos ramificados denominados agavinas, neoseries de inulina y neoseries de levana. En los procesos de síntesis de fructanos de origen vegetal, se ha demostrado que estos se llevan a cabo mediante la acción concertada de al menos dos enzimas, la sacarosa-1F-fructosiltransferasa (inulosacarasa), en el caso de la inulina, y la sacarosa- 6F-fructosiltransferasa (levansacarasa) en el caso de la levana. En una primera etapa, la enzima sacarosa-sacarosa fructosiltransferasa (SST) se encarga de iniciar el proceso al incorporar un residuo de fructosa a una molécula de sacarosa formando un trisacárido denominado 1-kestosa. En una segunda etapa, mediante la acción de un segundo grupo de enzimas del tipo fructosiltransferasas, se añaden más residuos de fructosa a los trisacáridos, dando lugar a fructanos de mayor peso molecular (Olvera 2007; Muñoz-Gutiérrez 2009). 3.10 Características de la Inulina La inulina es un fructano polidisperso que consta de una mezcla de polímeros lineales y oligómeros conformados por monómeros de fructosa unidos con enlaces fructosil-fructosa β-(2,1) y en el extremo de cada cadena, se encuentra una molécula de glucosa unida por un enlace α-(1,2), como se muestra en la figura 4 (Nakamura, 1995; Kango, 2008). GENERALIDADES 28 Figura 4. Estructura de la inulina La longitud de las cadenas varía entre cada planta y de acuerdo con la estación del año, por lo cual diferentes grados de polimerización están presentes en los fructanos de la misma planta. Debido a esta variación en la longitud de las cadenas su peso molecular varía entre ± 3500 – 5000 Da. Se encuentra en órganos internos de muchas plantas como carbohidrato de reserva, entrelas que se encuentran; las raíces de dientes de león (Taraxacum officinale) y de achicoria (Cichorium intibus), los tubérculos de la alcachofa de Jerusalén (Helianthus tuberosus) y de dalia, (Dahlia pinnata) los bulbos de iris (Iris sp.) y las piñas de los agaves. No es tóxica, se disuelve fácilmente en agua caliente y una solución de alta concentración de inulina tiene baja viscosidad (Vandamme, 1983; Nakamura, 1995; Pandey, 1998; Bautista, 2001; González-González, 2007; Kango, 2008; Chi 2010). A pesar de la presencia de inulina en una gran variedad de especies vegetales, la principal fuente utilizada a nivel industrial es obtenida de la raíz de achicoria, dicha raíz es parecida al camote y es un cultivo bianual. El cuerpo de la raíz se forma en el primer año y en el segundo se forman las extensiones de la raíz y las flores. Las semillas para reproducir a la achicoria son relativamente pequeñas, anualmente se siembran millones de hectáreas por todo el mundo para extraer aproximadamente un millón de toneladas de inulina que el mundo consume (Praznik, 2004; Olvera, 2007). GENERALIDADES 29 Debido a que este fructano es una materia prima renovable, barata y abundante, últimamente se ha estudiado su potencial uso para obtener otros productos con aplicación en los alimentos funcionales; como los jarabes de fructosa, fructooligosacaridos (FOS) y ácido cítrico. Dichos productos pueden ser sintetizados por algunas cepas de bacterias, levaduras y hongos que pueden degradar a la inulina casi en su totalidad (Pandey, 1998; Kango, 2008; Chi, 2010). Dado que la inulina no es completamente hidrolizada a nivel de intestino delgado, tiene funciones de fibra dietética y se promueve como alimento de bajo contenido calórico (<2 Kcal/g). Además tiene aplicaciones como promotor de la incorporación de calcio al organismo, agente gelificante en formulaciones alimenticias o como prebiótico, al estimular el desarrollo de la flora bacteriana benéfica. Técnicamente, la inulina comercial estabiliza una proporción importante de agua (1 g/g) en formulaciones grasas y genera una textura cremosa lo que permite disminuir el contenido de grasa en la formulación. Arriba de 20 g/día de inulina pueden ser consumidos para evitar efectos gastrointestinales adversos. La inulina no es digestiva y provee 6.3 KJ/g de energía. Es usada como sustituto de grasa y de azúcares en alimentos, tales como pan, galletas, productos lácteos, cereales y dulces (Olvera, 2007; Stewart, 2008). Observando las propiedades tecnológicas, las cadenas de inulina son poco solubles y viscosas, por lo que pueden ser usadas para estructurar alimentos bajos en grasa. Por otra parte, la hidrólisis enzimática de la inulina, parece ser un proceso prometedor para la obtención de fructosa, ya que libera alrededor de (95%) de este monosacárido y una fracción mínima de glucosa (Ricca, 2007; Tárrega, 2011) GENERALIDADES 30 3.11 Importancia de la Inulina, Agavinas y Fructooligosacáridos (FOS) como Prebióticos La importancia en la salud de la microbiota bacteriana es uno de los descubrimientos de mayor impacto en la nutrición de los seres humanos en los últimos años. El intestino grueso contiene más de 500 diferentes tipos de bacterias, las cuales contribuyen a un número importante de funciones biológicas. El mantenimiento de un número balanceado de bacterias benéficas, ayuda a controlar y a disminuir la cantidad de bacterias patógenas en el tracto digestivo entre muchos otros beneficios (Rocha, 2006; Olvera, 2007). Actualmente se ha observado que muchos oligosacáridos y polisacáridos tienen actividad prebiótica, dentro de los que destacan la inulina, las agavinas y los fructooligosacáridos (FOS), los cuales han sido descritos como sustancias prebióticas, sin embargo, no todos los hidratos de carbono son prebióticos. Para considerarlos como tales, dichos ingredientes deben cumplir con algunos criterios, como ser resistentes a la acidez gástrica para llegar intactos al colon y poder ser utilizados como sustrato por la microbiota intestinal para estimular selectivamente el crecimiento de bacterias intestinales “benéficas” (Rocha, 2006; Olvera, 2007; Dandan, 2008). Es así que un prebiótico se define como un ingrediente fermentativo selecto que permite cambios específicos en la composición y/o actividad en la microbiota gastrointestinal y a la vez confieren beneficios sobre la salud y el bienestar del hospedero (Kolinda, 2002) El mayor grupo de prebióticos actualmente en uso para suplementar los alimentos son los fructanos, ya que estimulan el crecimiento de bacterias benéficas para el organismo e inhiben el crecimiento de bacterias patogénicas, éstos fructanos pueden ser utilizados como ingredientes de algunos alimentos, tales como: galletas, cereales, chocolate, cremas de untar y algunos productos lácteos por ejemplo (Urías-Silvas, 2004; OMGE, 2008) GENERALIDADES 31 Los fructooligosacáridos son carbohidratos de bajo peso molecular (grado de polimerización [DP] 2-40) que interactúan entre sí mediante enlaces β-(1,2) y que no pueden ser hidrolizados en el tracto gastrointestinal por lo que han obtenido gran atención en el campo de la nutrición, debido a su capacidad edulcorante que puede sustituir a la sacarosa (Rocha, 2006; Olvera, 2007). Las cadenas de fructosa con 2 a 10 unidades son catalogadas como oligofructanos o fructooligosacáridos (FOS) y se producen por la hidrólisis de la inulina cuando se utilizan endo-inulinasas (Stewart, 2008). El instituto de medicina y la American Association of Cereal Chemists incluyen a los FOS en la definición de fibra basándose en sus efectos fisiológicos, ya que éstos son adicionados para incrementar el contenido de fibra y la absorción de minerales. Pueden ser utilizados para la elaboración de algunos alimentos, tales como: preparados de frutas, postres de leche, yogurt, queso fresco, chocolate, helado, confitería y salsas (Stewart, 2008). Dependiendo del contenido de mono y disacáridos, los fructooligosacáridos además de considerarse prebióticos, conservan un sabor más o menos dulce, contrario a las inulinas y las levanas que poseen un sabor neutro. (Muñoz- Gutiérrez, 2009). En tanto, los fructooligosacáridos proporcionan efectos benéficos en los humanos y han sido caracterizados como edulcorantes funcionales. Se pueden usar como fibra soluble dietética, como edulcorante funcional ó como prebiótico para favorecer la población de las Bifidobacterias (Kango, 2008). Por tal motivo tanto los fructooligosacáridos u oligofructosa (FOS) como la inulina son los fructanos más utilizados y estudiados ya que ambos han demostrado ser resistentes a las enzimas digestivas humanas para ser fermentados en el colon por acción de las bacterias, dando lugar a la producción de ácidos grasos de cadena corta SCFA (por sus siglas en inglés Short-Chain Fatty Acids) como el butírico, el acético, el láctico y el propiónico. También se producen H2, CO2 como GENERALIDADES 32 producto del metabolismo anaeróbico y existe una disminución del pH intestinal <5.0. Esto último, previene el crecimiento de patógenos (clostridios y coliformes entre otros), permitiendo la proliferación de algunas colonias de bacterias asociadas a la salud intestinal, como son: Lactobacillus y Bifidobacterium, quienes pueden metabolizar fácilmente dichos fructanos (Stewart, 2008; Domínguez – Vergara, 2009). Éstos SCFA representan el sustrato energético fundamental y ejercen acciones tanto sistémicas como a nivel local en el colon. El propionato es un precursor gluconeogénico, el acetato pasa a tejidos periféricos y es metabolizado en el músculo. En el colon el butirato es metabolizado y utilizado selectivamente como combustible, y regula el metabolismo de los ácidos nucleicos de algunas bacterias del colon, también promueveel mantenimiento de la barrera intestinal y ha sido implicado en la prevención del cáncer de colon. La regulación del metabolismo de los lípidos también se adjudica a los SCFA. (Domínguez – Vergara, 2009) En estudios in vitro, se demostró que los fructanos de achicoria estimularon el crecimiento bacteriano y produjeron SCFA´s. También se han demostrado beneficios en estudios con animales principalmente en cáncer de colon, absorción de calcio, en estimulación del sistema inmunológico y en el metabolismo de lípidos. Dada la importancia de estos hidratos de carbono, un estudio evaluó el efecto de los fructanos de algunas especies de agaves (agavinas) sobre el crecimiento de Bifidobacterium breve, y también analizó los productos generados de la fermentación de dichos fructanos en el medio. Los resultados mostraron que las agavinas de menor longitud de cadena estimularon mejor el crecimiento de B. breve y también generaron los ácidos acético, propiónico y butírico, reportados como responsables de los efectos positivos en la salud. Por lo tanto, el género Agave en la última década ha sido de gran importancia debido a que se ha encontrado la presencia de fructanos en varias especies y principalmente en A. tequilana. (Urías-Silvas, 2004) GENERALIDADES 33 La principal ventaja del uso de prebióticos es que estimulan el crecimiento de las Lactobacillus y Bifidobacterium nativas del colon, sin necesidad de introducir una especie microbiana en un alimento (como es el caso de los probióticos). Una ventaja adicional es que los oligosacáridos son más fáciles de introducir en la formulación de un alimento, que los microorganismos, ya que estos últimos pueden perder su viabilidad durante el procesamiento y almacenamiento. En consecuencia los prebióticos pueden ser una estrategia más práctica y eficiente para modular la microbiota intestinal, que los probióticos (Domínguez – Vergara, 2009). 3.12 El Potencial de los Fructanos para la Producción de Biocombustibles En la actualidad los combustibles fósiles que son no renovables, son los más consumidos. Sin embargo el mundo se enfrenta al progresivo agotamiento de estos recursos energéticos. La quema de combustibles fósiles representa un gran problema debido a que genera gases contaminantes. Por lo tanto, muchas personas se han interesado en los biocombustibles desarrollados a partir de fuentes renovables (Chi, 2010). La industria del alcohol proporciona combustibles que pueden utilizarse en combinación con derivados del petróleo en motores de gasolina o de gasoil. El empleo de alcohol industrial comenzó a principio del siglo XIX con el surgimiento de la industria de la síntesis química. Sin embargo durante muchos años, todo el etanol exceptuando el utilizado en bebidas se obtenía por medios químicos en lugar de usar la hidratación catalítica del etileno. Con la demanda energética actual, el etanol procedente de la fermentación ha ganado nueva relevancia. En países con grandes excedentes agrícolas como Brasil, Sudáfrica, Canadá y Estados Unidos, se han realizado intensas investigaciones para conseguir producir etanol a partir de materias ricas en carbohidratos (sacarosa, almidón, biomasa vegetal, etc). GENERALIDADES 34 Las materias primas pueden clasificarse en tres grupos principales que se mencionan a continuación: Materiales azucarados como la caña de azúcar, la remolacha azucarera, las melazas y los sumos de fruta. Materiales amiláceos como los cereales, patatas, pataca y mandioca. Materiales celulósicos tales como la madera o el licor de cocción al sulfito. La eficiencia de conversión de etanol por fermentación varía considerablemente dependiendo del material utilizado. En base a la actual demanda energética industrial y comercial de biocombustibles, de dos de los productos finales más importantes de la conversión de carbohidratos son el etanol y el metanol. Sin embargo la producción de etanol es una apuesta más atractiva debido a los usos potenciales de éste como combustible y en la industria química (Lee, 2002). Por lo tanto, como parte de los estudios para producir etanol se han utilizado extractos de vegetales ricos en inulina como materia prima. La levadura Kluyveromyces marxianus además de ser empleada para producir enzimas que degradan a la inulina se ha aprovechado su capacidad para fermentar la fructosa y producir etanol. Es así que se utilizaron extractos de inulina derivados de la achicoria y de dalia para realizar hidrólisis y fermentación simultánea con dicha cepa. Por otra parte, se ha observado que la levadura Saccharomyces cerevisiae es más tolerante al etanol que K. marxianus y en la búsqueda de mejorar el rendimiento en la producción de etanol se han montado sistemas de hidrólisis y fermentación, que consisten en emplear la inulina como sustrato, obtenida de dalia y achicoria, exo y endo – inulinasas de Aspergillus niger para hidrolizar a la inulina de una manera eficiente hasta obtener fructosa y una vez completada la hidrólisis, se empleó una cepa de S. cerevisiae resistente al etanol para fermentar fructosa. GENERALIDADES 35 Así se obtuvieron concentraciones del 20 – 21% (V/V) de etanol, en un periodo de 72 horas. El mismo sistema de producción de fructosa y fermentación alcohólica simultáneas utilizando cepas de A. niger y S. cerevisiae, se ha empleado para hidrolizar inulina en forma de polvo extraída de alcachofas de Jerusalén, que se obtuvo de tubérculos deshidratados y molidos. Por este medio se alcanzaron rendimientos de etanol superiores al 20% (V/V) (Gutiérrez, 2011). JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS 36 CAPÍTULO IV. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS JUSTIFICACIÓN La industria productora del tequila utiliza el Agave tequilana Weber var. Azul para la obtención de azúcares que se usan en los procesos de fermentación para la producción de etanol. Actualmente se han realizado estudios para un aprovechamiento integral de esta planta. Es así que se ha encontrado que el hongo Aspergillus niger CH-A-2010, aislado de materia en descomposición de un campo de agave del estado de Jalisco, es capaz de producir enzimas de interés biotecnológico, tales como: xilanasas, celulasas, exo y endo pectinasas e inulinasas en fermentaciones sumergidas cuando se utilizan pencas de Agave tequilana como fuente de carbono adicionadas con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno. Dichas enzimas producidas por Aspergillus niger CH-A-2010 podrían ser potencialmente útiles para la elaboración de productos de interés biotecnológico con mayor valor agregado. En este estudio se evaluó y mejoró la producción de inulinasas, debido a que se pueden utilizar para la obtención de fructooligosacáridos, los cuales tienen efecto prebiótico, así como también para generar azúcares fermentables para la obtención de etanol y la producción de jarabes (mieles de agave). Por lo que es importante evaluar el efecto del jugo de Agave tequilana como inductor en la producción de inulinasas de esta cepa, asimismo, valorar algunas fuentes de nitrógeno orgánico y establecer las condiciones de cultivo que permitan incrementar la producción enzimática. HIPÓTESIS Debido a que las pencas de Agave tequilana se han utilizado como sustratos para la producción de inulinasas, el jugo de agave por su composición podría ser utilizado como inductor para la producción de las mismas. OBJETIVOS 37 CAPÍTULO V. OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GENERAL Valorar el jugo de agave como fuente de carbono para la producción de inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 en fermentaciones sumergidas, así como evaluar el efecto de algunas fuentes de nitrógeno orgánico. 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Evaluar la producción de inulinasas a partir de la cepa Aspergillus niger CH – A – 2010en fermentaciones sumergidas a nivel de matraz Fernbach, utilizando jugo de agave como fuente de carbono con la adición de sulfato de amonio como fuente de nitrógeno. Determinar el efecto de algunas fuentes de nitrógeno orgánico sobre la producción de inulinasas, empleando jugo de agave como fuente de carbono. Evaluar la producción inulinolítica en fermentador de 2L a partir de las condiciones de cultivo que generen la mejor actividad a nivel de matraz Fernbach. Diseñar un experimento factorial que permita incrementar la actividad inulinolítica con la ó las fuentes de nitrógeno seleccionadas a diferentes condiciones de cultivo. MATERIALES Y MÉTODOS 38 CAPÍTULO VI. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1 Aspergillus niger CH – A – 2010, microorganismo productor de inulinasas En el presente estudio el microorganismo empleado para la producción de inulinasas, fue la cepa CH – A – 2010 de Aspergillus niger, el cual es un hongo saprófito, aislado a partir de hojas secas en descomposición de un campo de cultivo de agave del estado de Jalisco, México. Este microorganismo es capaz de producir enzimas con actividad inulinolítica, cuando se utilizan pencas de Agave tequilana como única fuente de carbono en fermentaciones sumergidas (Huitron, 2008). 6.2 Elaboración de los Medios de cultivo 6.2.1 Reactivos Utilizados Agar papa dextrosa (PDA; Merck), bacto agar (Oxoid), fosfato de potasio monobásico (Baker), fosfato de potasio dibásico (Baker), sulfato de amonio (Baker), extracto de levadura (Bioxon), peptona de caseína (Bioxon), agua de cocimiento de maíz grado industrial, harina de soya grado industrial (Industrial de Alimentos, S.A.), inulina de achicoria (Sigma), ácido acético glacial (Baker), acetato de sodio (Baker), ácido clorhídrico (Baker), hidróxido de sodio (Baker), ácido 3,5-dinitrosalicílico (Sigma), tartrato de sodio y potasio (Merck), metabisulfito de sodio (Baker), fenol (Baker), glicerol (Baker), cloruro de sodio (Baker), ácido sulfúrico concentrado (Baker). 6.2.2 Formulación del Medio de Cultivo para la Propagación de la Cepa La preparación de las placas para la propagación de la cepa se realizó con los siguientes componentes: - Agar papa dextrosa (PDA) al 3.9% - Bacto agar al 2% MATERIALES Y MÉTODOS 39 Se esterilizó durante 15 min. a 121 °C y 15 lb. de presión; posteriormente se llenaron cajas Petri estériles con aproximadamente 25 mL de medio y se realizó prueba de esterilidad incubándolas 24 h a 37 °C. Terminado este periodo se conservaron en refrigeración a 4 °C. 6.2.3 Método para la Conservación de la Cepa Para la construcción del banco de trabajo de la cepa CH – A – 2010 de Aspergillus niger se sembraron esporas en una caja Petri con medio PDA y se incubó a 37 °C durante 5 días para permitir la esporulación. Transcurrido este tiempo se realizó la cosecha de esporas con 20 mL de una solución estéril de glicerol al 30% (V/V) ajustada con solución isotónica al 0.85% (P/V) y se colectó 1 mL del concentrado de esporas en crioviales estériles de 1.5 mL que posteriormente fueron resguardados a una temperatura de – 20 °C. 6.2.4 Medios de cultivo a nivel de matraz Fernbach para la producción de inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 Se prepararon diferentes medios de fermentación para cultivo sumergido a nivel de matraz Fernbach, todos contenían 1L de medio, se agregaron y disolvieron los componentes en agua destilada de acuerdo a las siguientes concentraciones: KH2PO4 0.05%, K2HPO4 0.05% y cada una de las fuentes de nitrógeno (FN) grado analítico (peptona de caseína, extracto de levadura y sulfato de amonio) y grado industrial (extracto de malta, agua de cocimiento de maíz y harina de soya) al 0.4%. Se ajustó el pH de los medios de cultivo a 4.5 con HCl 1 M y se esterilizaron a 121°C y 15 lb de presión, durante 15 min. El jugo de agave se trató por separado mediante un proceso de pasteurización a 75 °C durante 5 min, y se adicionó a los medios de cultivo estériles una vez que alcanzan una temperatura aproximada de 37 °C, en una concentración del 1.0% (V/V), para todos los medios a nivel de matraz Fernbach. MATERIALES Y MÉTODOS 40 6.2.5 Medios de cultivo para fermentaciones de 2, 10 y 12 L para la producción de inulinasas de Aspergillus niger CH – A – 2010 En este caso, se seleccionaron los medios con mayor actividad inulinolítica para evaluar su comportamiento en fermentador con 2, 10 y 12 L. Dichos medios se prepararon bajo las siguientes condiciones: 2 L 10 L 12 L Agitación (RPM) 200 - 350 300 200 Temperatura (°C) 37 37 37 Fuente de carbono (Jugo de agave) 1.0 % 1.0 % 1.0 % Fuente de nitrógeno 1.0 % 1.0 % 1.0 % Aireación (vvm) 1 1 1 Presión (atm) N / A N / A 0.2 6.3 Propagación del hongo Aspergillus niger CH – A – 2010 En dos cajas Petri con medio sólido PDA, se sembraron las esporas del banco de trabajo de la cepa Aspergillus niger CH – A – 2010 mediante la técnica de estría y se incubaron a 37 °C durante 5 días hasta lograr su esporulación. 6.4 Proporción de Inóculo en los Medios de Cultivo Para inocular 1 L de medio de cultivo a nivel de matraz Fernbach, se cosecharon esporas de Aspergillus niger CH – A – 2010 propagadas en una placa Petri de PDA, con 20 mL de solución salina al 0.95% (solución stock) para su arrastre. Posteriormente del stock se realizó una dilución de esporas con una proporción 1:20, a la cual se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a una densidad MATERIALES Y MÉTODOS 41 óptica de 550 nm y se inoculó cada medio de cultivo con un volumen de 0.5 mL de la solución stock, correspondiente a 0.5 en absorbancia. Los fermentadores de 2, 10 y 12 L fueron inoculados al 0.25% de solución stock. 6.5 Tratamiento de la Fuente de Carbono: Jugo de Agave tequilana La piña de A. tequilana se partió en rectángulos de 4 x 10 cm aproximadamente y se extrajo el jugo con un extractor centrífugo de la marca Cafeteras Internacionales, modelo EX – S, posteriormente se filtró en una malla de 0.105 mm de la marca Monti – Lat, para retirar el exceso de fibra. El jugo obtenido se pasteurizó a 75 °C durante 5 min, se envasó en recipientes de plástico estériles y finalmente se conservó a -20 °C. 6.6 Fermentaciones y muestreo Las fermentaciones a nivel de matraz Fernbach se realizaron bajo las siguientes condiciones de cultivo: temperatura de 37 °C y agitación de 200 RPM en una agitadora orbital marca sol – bat durante 120 h. Por otra parte, las condiciones en las fermentaciones realizadas a nivel de fermentador de 2, 10 y 12 L fueron: 37 °C de temperatura, 200 – 350 RPM de agitación y 1 vvm de flujo de aire. Se tomaron muestras cada 24 h, desde el tiempo cero y hasta las 120 h de fermentación en todos los casos. 6.7 Obtención de filtrados enzimáticos Para la obtención de los filtrados enzimáticos, cada muestra se centrifugó a 2500 RPM durante 15 min, posteriormente se decantaron para retirar la biomasa y se conservaron en congelación a – 20 °C hasta su análisis. MATERIALES Y MÉTODOS 42 6.8 Ensayo para la determinación de la actividad inulinolítica Para este ensayo se preparó una solución de inulina de achicoria marca Sigma al 2.5% disuelta en buffer de acetatos 0.1M y con pH= 5.5. La actividad inulinolítica se expresó de acuerdo al incremento de azúcares reductores liberados a partir de una solución de inulina comercial, por el filtrado enzimático en un minuto. Para dicho análisis, se preparó una mezcla de reacción que contenía 1 mL de solución de inulina comercial, 0.5 mL de agua destilada y 0.5 mL de filtrado enzimático, a partir de éste último se determinó la actividad de inulinasas. Adicionalmente se preparó un control negativo para cada muestra, por lo cual se inactivaron 0.5 mL de filtrado enzimático en baño de agua hirviendo durante 5 min.
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