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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO PROGRAMA DE MAESTRIA y DOCTORADO EN CIENCIAS BIOaUIMICAS ESTUDIO SOBRE LA CAPACIDAD DE LA PLANTA ACUATICA LEMNA GIBBA PARA LA DETOXIFICACION DEL 4-NITROFENOL EN CONDICIONES DE LABORATORIO T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRA EN CIENCIAS (BIOQUIMICAS) PRESENTA Q.F.B. AlOA SOTO HERNANDEZ TUTOR, DR. MANUEL JIMENEZ ESTRADA MEXICO, D. F. MAYO 2007 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. RECONOCIMIENTOS Esta tesis se realizó bajo la dirección del Dr. Manuel Jiménez Estrada en el laboratorio 2-10 del Instituto de Química de la UNAM. Se reconoce la asesoría de: • La Ingeniera Agrónoma Ma. Teresa de Jesús Olivera Flores del laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (Conjunto E, Facultad de Quimica, UNAM) en el cultivo de Lemna gibba. • El Dr. Rafael Vázquez Duhalt, y sus Técnicos Rosa Román Miranda y Raunel Tinoco del Instituto de Biotecnología en la utilización del cromatógrafo de líquidos. • El Dr. Javier Espinosa Aguirre y la M. en C. Sandra Giovanna Salamanca Pinzón del Instituto de Investigaciones Biomédicas en el ensayo de actividad nitrorreductasa. El Comité Tutoral que revisó el desarrollo de la tesis, estuvo conformado por: Dr. Manuel Jiménez Estrada Instituto de Química, UNAM Dra. Estela Sánchez Quintanar Facultad de Química, UNAM Dr. Rafael Vázquez Duhalt Instituto de Biotecnología, UNAM El Jurado de Examen de Maestría estuvo constituido por: PRESIDENTE Dra. Estela Sánchez Quintanar Facultad de Química, UNAM VOCAL Dr. Rafael Vázquez Duhalt Instituto de Biotecnología, UNAM SECRETARIIO Dra. Martha Patricia Coello Coutiño Facultad de Química, UNAM SUPLENTE Dr. Arturo Navarro Ocaña Facultad de Química, UNAM SUPLENTE Dr. Guillermo Aguilar Osorio Facultad de Química, UNAM Durante los estudios de maestría, recibí apoyo económico del CONACYT (número de registro 183486) y de la DGEP- UNAM. A mis padres: J. Carmen Soto Carrillo y Clemencia Hernández Olguín por su ejemplo de dedicación y generosidad incondicional AGRADECIMIENTOS A mis padres por impulsarme a seguir luchando. A mis hermanos Patricia, Citlali, Gabriel y Alejandra por expresar el “gen de la locura”. .A mi pequeño sobrino José Manuel por mantener viva la ilusión de viajar por el mundo. Al Dr. Manuel Jiménez Estrada por su confianza, sus enseñanzas y por arriesgarse a desarrollar este proyecto. A la IA. María Teresa de Jesús Olivera Flores y a los integrantes del laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Conjunto E (Innan, Mary, Cris, Rose, Tecui, Ara, Mauricio, Lore, Erick…) por los gratos momentos en el concurrido laboratorio 116. A mis compañeros del laboratorio 2-10 del Instituto de Química (Juan Antonio, Simón, Brenda, Julio, Norma, Paola y Felipe) por las celebraciones acompañadas de pizza. Al Dr. Jesús Espinosa Aguirre, al Dr. Rafael Camacho, a la M. en C. Giovanna Salamanca y a los chicos de su laboratorio, por su ayuda y amistad desde el primer momento. A la M. en C. Donají Velasco Arias por ser una excelente amiga. ~ , ~ , INDICE Página Lista de figuras ......... ………………………………………………………….. I Lista de tablas …….......………………………………………………………... III 1. ANTECEDENTES ...................................................................................... 1 1.1 Usos, fuentes, propiedades fisicoquímicas y toxicológicas del 4-nitrofenol ………………………………………………….................. 1 1.2 Estrategias para el tratamiento de la contaminación por 4-nitrofenol …. 4 1.2.1 Tratamientos químicos .................................................................. 4 1.2.2 Biorremediación por microorganismos ......................................... 5 1.2.2.1 Estudios realizados con bacterias ......................................... 5 1.2.2.2 Estudios realizados con hongos ........................................... 6 1.2.3 Fitorremediación ........................................................................... 12 1.2.3.1 Estudios de transformación de nitroaromáticos en plantas … 14 1.2.3.2 Absorción y transporte de xenobióticos en plantas ............. 19 1.2.3.3 Metabolismo de xenobióticos en plantas ............................ 20 INDICE (continuación) Página 1.2.3.3.1 Reacciones de fase I .................................................... 21 1.2.3.3.2 Reacciones de fase II (Formación de conjugados) ...... 22 1.2.3.3.2.1 Conjugación con glucosa .................................. 22 1.2.3.3.2.2 Conjugación con glutatión ……………............... 23 1.2.3.3.2.3 Conjugación con ácido malónico ………………. 24 1.2.3.3.2.4 Conjugación con péptidos ……………………. 25 1.2.3.3.3 Reacciones de fase III (compartimentalización) …...... 25 1.2.3.3.3.1 Compartimentalización en la vacuola ……….. 25 1.2.3.3.3.2 Residuos unidos …..…………………………… 26 1.2.3.4 Enzimas aisladas de plantas para la transformación de nitroaromáticos……………………………………………… 26 1.3 Generalidades sobre Lemna gibba .......................................................... 29 2. HIPÓTESIS ................................................................................................ 32 OBJETIVO GENERAL .............................................................................. 32 OBJETIVOS PARTICULARES ................................................................. 32 3. OBJETIVOS ................................................................................................. 32 INDICE (continuación) Página 4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 33 4.1 Sustancias ............................................................................................... 33 4.2 Preparación de medios de cultivo ……………………………………… 33 4.3 Condiciones de incubación …………………………………………….. 34 4.4 Colecta y mantenimiento del material vegetal ....................................... 34 4.5 Obtención y mantenimiento de plantas axénicas ................................... 34 4.6 Experimento de biotransformación ....................................................... 35 4.6.1 Determinación de la concentración de 4-nitrofenol en el medio de cultivo .................................................................................... 36 4.6.2 Análisis del material vegetal ...................................................... 36 4.6.2.1 Determinación del peso fresco ......................................... 37 4.6.2.2 Búsqueda de 4-nitrofenol y/o metabolitos en el material vegetal ............................................................................... 37 4.6.2.3 Determinación de clorofilas a y b ..................................... 37 4.6.2.4 Obtención del extracto crudo de Lemna gibba ................. 38 4.6.2.5 Cuantificación de proteínas .............................................. 38 4.6.2.6 Ensayo de actividad nitrorreductasa ................................. 39 INDICE (continuación) Página 5 RESULTADOS..............................................................................................41 5.1 Colecta y crecimiento de Lemna gibba ................................................. 41 5.2 Experimento preliminar de biotransformación ....................................... 42 5.3 Evaluación de los procedimientos de limpieza de Lemna gibba........................................................................................................ 44 5.4 Experimento estandarizado de biotransformación ................................... 46 5.5 Actividad nitrorreductasa ....................................................................... 50 6 DISCUSIÓN ……………………………………………………………….. 54 7 CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS....................................................... 58 8 REFERENCIAS ........................................................................................... 60 9 ANEXOS ..................................................................................................... 64 Lista de figuras Figura Contenido Página 1 Estructuras de algunos nitrofenoles considerados como contaminantes prioritarios …………………………………………………………………. 1 2 Nitrofenoles aislados de partículas de escape de motores a diesel…………. 2 3 Pesticidas que son fuente de 4-nitrofenol ………………………………….. 3 4 Degradación del TNT por P. chrysosporium ………………………………. 8 5 Metabolitos generados durante la degradación de 2,4-dinitrotolueno por P. chrysosporium……………………………………………………………… 9 6 Vías metabólicas propuestas para la degradación del 4-nitrofenol por P. chrysosporium ……………………………………………………………… 10 7 Estrategias de fitorremediación…………………………............................... 13 8 Metabolitos de oxidación del TNT obtenidos por transformación con Myriophyllum aquaticum ………………………………………………….. 16 9 Metabolitos del glicerol trinitrato en plantas de tabaco modificados con el gen de la enzima pentaeritritol tetranitrato (PETN) reductasa aislada de Enterobacter cloacae. …………………………………………………….... 17 10 Sección transversal esquemática de una hoja, indicando el arreglo de varios tipos de células……………………………………………………………… 20 11 Representación esquemática de la detoxificación de xenobióticos en una célula de una planta…………………………………………………………. 21 12 Conjugación enzimática del fluorodifen con glutatión en chícharo ……...... 24 13 Mecanismos para la reducción de grupos nitro en compuestos nitroaromáticos …………………………………………………………….. 27 14 Esquema propuesto para la eliminación de nitrito a partir del tetryl por la ferredoxina NADP oxidorreductasa de hojas de espinaca ………………… 28 - I - Lista de figuras (continuación) Figura Contenido Página 15 Planta de Lemna gibba vista desde la superficie adaxial, lateral y abaxial……………………………………………………………………. 29 16 Plantas de Lemna gibba en fase de reproducción asexual o vegetativa y sexual ……………………………………………………………………. 30 17 Comparación del aspecto de Lemna gibba recién colectada y después de 5 meses de cultivo en el laboratorio……………………………………… 41 18 CCF fase normal del medio de cultivo a los 12 días de incubación .......... 43 19 Etapas de recuperación de Lemna gibba para obtención de plantas axénicas después de 1 día , 3 días, 8 días y 19 días de incubación en medio MS sólido ……………………………………………………….. 45 20 Diagrama de flujo para el tratamiento de las muestras en el ensayo de biotransformación. ………………………………………………………. 46 21 Concentración del 4-nitrofenol en el medio de cultivo en ausencia y presencia de Lemna gibba. ………………………………………………. 47 22 Cantidad de clorofila a y clorofila b en las plantas que crecieron sin 4- nitrofenol y en presencia de 4-nitrofenol ……………………………….. 48 23 Aspecto de las plantas en el experimento de biotransformación a los 6 días de incubación en ausencia y presencia de 4-nitrofenol. 49 24 Variación del peso fresco de las plantas en ausencia y presencia de 4-nitrofenol………………………………………….................................. 49 25 CCF fase normal de los extractos de plantas del sistema C....................... 50 26 Espectros de absorción de la mezcla de reacción al tiempo cero y a los 4 min ………………………………………………………………………. 51 27 Actividad nitrorreductasa de los extractos de la planta Lemna gibba que creció durante 6 días en medio de cultivo y en solución de 4-nitrofenol 50 μM ……………………………………………………………………. 53 28 Conjugados del 4-nitrofenol encontrados en diversos cultivos en suspensión ……………………………………………………………….. 57 - II - Lista de tablas Tabla Contenido Página 1 Concentraciones inhibitorias medias (CI50) en Lemna gibba frente a diferentes compuestos ………………………………………………………. 31 2 Gradiente de elusión para separar y cuantificar el 4-nitrofenol en el medio de cultivo y el material vegetal …………………………………………....... 36 3 Contenido de las mezclas de reacción en el ensayo de actividad nitrorreductasa………………………………………………………………. 39 4 Concentración de 4-nitrofenol en el medio de cultivo en el experimento de biotransformación…………………………………………………………… 43 5 Algunos nitrocompuestos evaluados como sustratos para los componentes A y B de la nitrorreductasa de E. coli ……………………………………. 56 6 Valores de las pendientes (ΔA/seg) para las mezclas de reacción en el ensayo de actividad nitrorreductasa ……………………………………….. 67 - III - RESUMEN El 4-nitrofenol es un producto de degradación de algunos pesticidas como el paratión; también puede formarse por reacción fotoquímica de hidrocarburos aromáticos y óxidos de nitrógeno en fase de vapor (Karim y Gupta, 2003). La fitorremediación es una técnica innovadora, basada en la capacidad de las plantas para acumular o transformar contaminantes (Salt et al, 1998). Estudios realizados en plantas terrestres y acuáticas han demostrado que algunas especies tienen la capacidad de metabolizar compuestos nitroaromáticos. (Schnoor et al,1995). La planta acuática Lemna gibba se encuentra ampliamente distribuida en México. Esta planta se reproduce principalmente de manera vegetativa, acumulando gran cantidad de biomasa en tiempos cortos (Lot et al, 1999), lo que la hace un organismo adecuado para estudios de fitorremediación. En el presente trabajo se describen las condiciones experimentales para la obtención y el mantenimiento de cultivos axénicos de Lemna gibba, con los que se realizaron experimentos sobre la biotransformación del 4-nitrofenol. Se encontró que la cantidad de 4-nitrofenol disminuyó en el medio de cultivo en presencia del material vegetal. No se encontraron metabolitos provenientes del 4-nitrofenol en el medio de cultivo ni en el material vegetal. Sin embargo, en un intento por explicar la disminución de la concentración del 4-nitrofenol en presencia de Lemna gibba, se determinó la actividad de nitrorreductasa en el extracto crudo de las plantas y se encontró una actividad del orden de 5 nmol/min⋅mg proteína. Esta actividad es semejante a la obtenida del extracto de la planta que creció en ausencia de 4-nitrofenol. 1 1. ANTECEDENTES 1.1 Usos, fuentes, propiedades fisicoquímicas y toxicológicas del 4-nitrofenol Los nitrofenoles son compuestos empleados como intermediarios en la producción de explosivos, fármacos, pesticidas, pigmentos y conservadores de madera. Debido al uso indiscriminado de estos compuestos, se encuentran como contaminantes de agua y suelo. El 4-nitrofenol (1), el 2-nitrofenol (2) y el 2,4-dinitrofenol (3) (Fig. 1) se encuentran en la Lista de Contaminantes Prioritarios de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, la cual recomienda restringir la concentración de estos compuestos a 10 ng/L (Karim y Gupta, 2003). NO2 OH OH NO2 NO2 OH NO2 1 2 3 Fig. 1. Estructuras de algunos nitrofenoles considerados como contaminantes prioritarios: 4-nitrofenol (1), 2-nitrofenol (2) y 2,4-dinitrofenol (3). El 4-nitrofenol puede ser producido en la atmósfera mediante la foto-oxidación de hidrocarburos aromáticos tales como el benceno, tolueno,fenantreno y nitrobenceno (Gangolli, 1999; Karim y Gupta, 2003). 2 Patnaik y Khoury (2004) reportaron la formación del 4- y el 2-nitrofenol a partir de la reacción del ión nitrito y del fenol en soluciones acuosas a temperatura ambiente en presencia y ausencia de luz; obteniéndose un rendimiento ligeramente mayor en presencia de luz y soluciones ácidas. El 2-nitrofenol se formó con mayor rapidez y con mayores rendimientos que el 4-nitrofenol en todas las condiciones de reacción. El 4-nitrofenol (1), el 2-metil-4-nitrofenol (4), el 3-metil-4-nitrofenol (5) y el 4- nitro-3-fenilfenol (6) (Fig. 2) fueron aislados a partir de partículas del escape de motores a diesel y presentaron actividad vasodilatadora. Debido a que los alquilfenoles se han asociado con actividad estrogénica, dichos compuestos fueron evaluados como agentes estrogénicos y anti-androgénicos en un modelo de Saccharomyces cerevisiae que expresa receptores de estrógeno y andrógeno humanos. Todos los nitrofenoles mostraron actividad anti-androgénica y únicamente 4 no mostró actividad estrogénica (Taneda et al., 2004) NO2 OH CH3 4 NO2 OH CH3 5 NO2 OH Ph 6 Fig. 2. Nitrofenoles aislados de partículas de escape de motores a diesel El 4-nitrofenol también puede generarse mediante la hidrólisis microbiana o la fotodegradación de varios pesticidas tales como el metilparatión (7), etilparatión (8) y fluorodifen (9) (Fig. 3). 3 NO2 O P RO RO S NO2 OF3C NO2 7 R= CH3 8 R= CH2CH3 9 Fig. 3. Pesticidas que son fuente de 4-nitrofenol: metilparatión (7), etilparatión (8) y fluorodifen (9). En estado sólido, el 4-nitrofenol se presenta como cristales entre incoloros y amarillo pálido de olor característico. En forma de polvo, es posible que explote si se encuentra mezclado con el aire o hidróxido de potasio. Es un oxidante fuerte y reacciona violentamente con materiales combustibles y reductores. Posee un valor de constante de partición octanol/agua log Kow entre 1.87 y 2.04. Su solubilidad en agua es de 16 g l-1 a 25 ºC. En solución acuosa, el 4-nitrofenol es un compuesto altamente colorido y su presencia a concentraciones > 1mg/L produce un color amarillo brillante; esto proporciona un indicador visual de la presencia de 4- nitrofenol, aunque la producción de ácido puede causar la desaparición del color amarillo. También es soluble en acetona, cloroformo, éter dietílico, etanol, tolueno y piridina. (INSHT, ICSC 066; Laha y Petrova, 1998; Gangolli, 1999). Los nitrofenoles han sido ampliamente utilizados como compuestos modelo en los estudios de biodegradación de contaminantes orgánicos (Laha y Petrova, 1998). Estos son altamente tóxicos para el humano y los mamíferos, siendo fácilmente reducidos a los derivados nitroso e hidroxilamina. Estos derivados pueden conducir a la formación de metahemoglobina, la cual es incapaz de unir oxígeno, o de nitrosaminas, las cuales son carcinogénicas. Algunos nitroaromáticos, tales como el nitropireno, son mutagénicos y varios nitrofenoles tienen un efecto desacoplante en la fosforilación oxidativa. La mayoría de los nitroaromáticos son altamente tóxicos también para las bacterias y por tanto pueden inhibir el crecimiento microbiano (Andreoni et al., 1995). 4 1.2 Estrategias para el tratamiento de la contaminación por 4-nitrofenol Las estrategias de remediación deben ser consideradas en base al sitio contaminado y a la concentración del contaminante. Por ejemplo, la toxicidad de los nitroaromáticos limita la aplicabilidad de la biorremediación cuando las concentraciones son altas, o el tratamiento produzca subproductos recalcitrantes. Por el contrario, los tratamientos químicos que consumen energía, tales como la incineración, pueden ser demasiado caros a bajas concentraciones, o pueden causar otros problemas ambientales tales como emisiones de óxidos de nitrógeno (Rodgers y Bunce, 2001). Se encuentra reportado que las aminas aromáticas son 500 veces menos tóxicas que los correspondientes nitroaromáticos (Karim y Gupta, 2001). 1.2.1 Tratamientos químicos Los compuestos nitroaromáticos son resistentes a la oxidación química o biológica y a la hidrólisis debido al efecto de atracción de electrones por parte de los grupos nitro. Debido a esto, son ambientalmente persistentes y la remediación de corrientes de agua y aguas subterráneas contaminadas es difícil (Rodgers y Bunce, 2001). La reducción del 4-nitrofenol ha sido estudiada en presencia de nanopartículas de oro, empleando un exceso de borohidruro. Esumi et al. (2002) sintetizaron nanocompuestos de oro los cuales fueron unidos a dendrímeros de poli(amidoamina) y poli(propileneimina). Los autores encontraron que el 4- nitrofenol fue convertido al 4-aminofenol en presencia de ambos dendrímeros. Por su parte, Praharaj et al. (2004) obtuvieron nanopartículas de oro adheridas a una resina de intercambio aniónico y también encontraron la formación de 4- aminofenol cuando fueron evaluadas para la degradación del 4-nitrofenol. 5 Li et al. (2005) llevaron a cabo la degradación del 4-nitrofenol con TiO2 (10-30 nm) en el cual se había adsorbido previamente el ácido 5-sulfosalicílico. La eficiencia de adsorción del 4-nitrofenol aumentó de 42 a 84%. En condiciones de fotodegradación óptima (pH inicial de 4.0, 4-nitrofenol 5 mg/L, 100 mg de catalizador, tiempo de irradiación de 120 min con lámpara de mercurio de alta potencia de 160 W), la eficiencia de degradación del 4-nitrofenol por el TiO2, incrementó de 40 a 88% después de la modificación en la superficie del TiO2. 1.2.2 Biorremediación por microorganismos Los nitrofenoles en aguas y suelos superficiales son degradados por oxidación fotoquímica. Sin embargo, en suelos más profundos y aguas subterráneas, la degradación de nitrofenoles depende principalmente de la biodegradación y ésta puede ser iniciada por mecanismos de oxidación o reducción (Laha y Petrova, 1998) 1.2.2.1 Estudios realizados con bacterias Blasco y Castillo (1992) describieron la degradación del 4-nitrofenol y 2,4- dinitrofenol por la bacteria fototrófica asimiladora de nitrato y nitrito Rhodobacter capsulatus E1F1. La degradación se llevó a cabo en condiciones microaerobias y fue dependiente de la luz. R. capsulatus utilizó el 2,4-dinitrofenol como aceptor de electrones. En un estudio posterior, Blasco y Castillo (1993), purificaron y caracterizaron la enzima responsable de la foto-reducción del 2,4-dinitrofenol a 2- amino-4-nitrofenol en Rhodobacter capsulatus E1F1. La nitrofenol reductasa purificada es un dímero, con masa molecular de 52 kDa, temperatura óptima de 30°C, pH óptimo de 6; Km aparente para el 2,4-dinitrofenol de 70 μM. La nitrofenol reductasa de Rhodobacter capsulatus E1F1 contiene FMN y probablemente hierro no hemo como grupos prostéticos. Laha y Petrova (1998) realizaron estudios in vitro para evaluar la habilidad de poblaciones microbianas nativas de los Everglades (sur de Florida, EU) para 6 degradar xenobióticos, para lo cual emplearon como compuesto modelo el 4- nitrofenol. Los resultados mostraron que a concentraciones de 10 y 100 μg/g de suelo hubo un grado de mineralización del 18% en una semana. Sin embargo, a una concentración de 10 mg/g de suelo, no hubo mineralización del 4-nitrofenol en un periodo de 4 meses; tal concentración aparentemente produjo un efecto inhibitorio. La velocidad y grado de mineralización del 4-nitrofenol aumentó hasta el 30% por la inoculación con microorganismos (previamente aislados en otros sitios) que degradan el 4-nitrofenol. Takeo et al. (2003) aislaron una bacteria que degrada el 4-nitrofenol a partir de lodos activados. La bacteria, identificada como Rhodococcus sp. y designada como PN1, utilizó el 4-nitrofenol como única fuente de carbono, nitrógeno y energía. Las pruebas de degradación del4-nitrofenol mostraron que ésta fue inducida por el 4-nitrofenol y que el 4-nitrocatecol fue uno de los metabolitos. Además, los autores de este trabajo describen la clonación (en Escherichia coli) de un cluster del gen de la 4-nitrofenol hidroxilasa, la enzima responsable del catabolismo del 4-nitrofenol. 1.2.2.2 Estudios realizados con hongos El basidiomiceto de la pudrición blanca de la madera Phanerochaete chrysosporium degrada diferentes contaminantes entre los que se encuentran el 2,4-dinitrotolueno (Valli et al., 1992), el TNT (Michels et al., 1994; Rieble et al., 1994) y el 4-nitrofenol (Teramoto et al., 2004). En condiciones limitantes de carbono, nitrógeno o azufre, P. chrysosporium lleva a cabo la mineralización de los compuestos aromáticos y los azoxitetranitrotoluenos con ayuda de enzimas del sistema que degrada la lignina (un polímero aromático natural abundante). Dicho sistema contiene lignino peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa (MnP), oxidasas, reductasas, peróxido de hidrógeno, alcohol veratrílico, oxalato y quinol oxidasas. (Rieble et al., 1994; Esteve-Nuñez et al., 2001). 7 Como en otros organismos, los pasos iniciales en la degradación fúngica del TNT (10) involucran la reducción de grupos nitro (Fig. 4). El TNT fue reducido a una mezcla de 4-hidroxilamino-2,6-dinitrotolueno (11) 4-aminodinitrotolueno (12), 2,4-diaminonitrotolueno (13), y azoxitetranitrotoluenos (14). Stahl y Aust (1993) proporcionaron evidencia de que el TNT es reducido por un sistema redox de la membrana plasmática en P. chrysosporium que requiere el micelio vivo e intacto. Los autores sugirieron que la reducción está acoplada al sistema de salida de protones usado por el hongo para mantener el pH fisiológico extracelular a aproximadamente 4.5. En contraste, Rieble et al. (1994) reportaron una actividad reductasa del TNT asociada a la membrana que requirió NADPH como cosustrato y la ausencia de oxígeno molecular. Debido a que la actividad fue detectada en la forma soluble en detergente, donde un potencial de membrana no podía ser mantenido, se asumió que no era necesario un potencial de membrana para esta reacción. Por otro lado, también se ha descrito la actividad reductasa intracelular del TNT dependiente de NAD(P)H. Cuando cultivos ligninolíticos de P. chrysosporium fueron incubados con 4- aminodinitrotolueno (12), se detectó un compuesto identificado como 4-formamida- 2,6-DNT (15). Este intermediario fue transformado a 2-amino-4-formamida-6- nitrotolueno (16), un compuesto que desapareció rápidamente bajo condiciones ligninolíticas. En ambientes no ligninolíticos los metabolitos aminodinitrotolueno fueron reducidos lentamente a diaminonitrotoluenos y la concentración de azoxitetranitrotoluenos incrementó. 8 NO2 CH3 NO2O2N NO CH3 NO2O2N NHOH CH3 NO2O2N N CH3 NO2O2N O N CH3 O2N NO2 O2 NH2 CH3 NO2O2N NH2 CH3 NH2O2N Lignina y Manganeso peroxidasas Oxidación y mineralización Ar-N=N-Ar Ar-NH-NH-Ar NHCOCH3 CH3 NH2O2N NH2 CH3 NH2O2N NHCHO CH3 NO2O2N NHCHO CH3 NH2O2N HO 10 111213 14 1516 Fig. 4. Degradación del TNT por P. chrysosporium (Esteve-Nuñez et al., 2001). En referencia al metabolismo del 2,4-dinitrotolueno (17, Fig. 5), Valli et al. (1992) demostraron que el primer paso en la degradación de este compuesto es su reducción intracelular a 2-amino-4-nitrotolueno (18) o 4-amino-2-nitrotolueno (19). Posteriormente tiene lugar la reducción de los aminonitrotoluenos para formar el 2,4-diaminonitrotolueno (20). La 4-nitro-1,2-benzoquinona (21) se genera por la oxidación extracelular de la amina por la manganeso peroxidasa (MnP); este 9 intermediario sufre un ciclo de reducción y metilación generando 4-nitro-1,2- hidroquinona (22), 1,2-dimetoxi-4-nitrobenceno (23), iones nitrito y metanol. Transcurridos 24 días de la incubación, P. chrysosporium mineraliza el 34% de 2,4-dinitrotolueno únicamente bajo condiciones ligninolíticas. CH3 NO2 NO2 OCH3 OCH3 NO2 O O NO2 OH OH NO2 CH3 NH2 NO2 CH3 NO2 NH2 CH3 NH2 NH2 OH OH OH OH OCH3 OH MnP LiP OH OH HO O O OH OH O OH O CH3OH + + MnP + O OH O + NO2 - MnP O O NO2 + CH3OH 17 18 19 20 21 21 22 23 OH O O + OCH3 21 + NO2- CH3OH+ LiP Fig. 5. Metabolitos generados durante la degradación de 2,4-dinitrotolueno por P. chrysosporium (Valli et al., 1992). 10 Teramoto et al. (2004) examinaron la habilidad de P. chrysosporium para degradar el 4-nitrofenol y la compararon con la degradación del 2,4-dinitrotolueno. Como lo demostraron Valli et al. (1992), en el metabolismo del 2,4-dinitrotolueno por P. chrysosporium se detectaron metabolitos amino, lo cual indica la participación de nitrorreductasas. Para determinar la existencia de dicha actividad en el metabolismo del 4-nitrofenol, este se adicionó junto con el 2,4-dinitrotolueno al medio de cultivo. Los resultados confirmaron que el 2,4-dinitrotolueno fue reducido al 2-amino-4-nitrotolueno (18); sin embargo, como se muestra en la figura 6, el 4-nitrofenol (1) no fue convertido al 4-aminofenol, sino al 1,2-dimetoxi-4- nitrobenceno (23) mediante la formación del intermediario 4-nitroanisol (24); ambos productos fueron detectados en el medio de cultivo cuando el hongo creció bajo condiciones ligninolíticas. Cuando el 4-nitroanisol fue adicionado como sustrato, fue convertido a 1,2-dimetoxi-4-nitrobenceno con formación de cantidades traza de 4-nitrofenol. . OH NO2 OCH3 NO2 OCH3 NO2 OH Vía 1 Vía 2 OH NO2 OH OCH3 NO2 OCH3 LiP O O OCH3 1 24 23 CO2 25 26 Fig. 6. Vías metabólicas propuestas para la degradación del 4-nitrofenol por P. chrysosporium (Teramoto et al., 2004). 11 A pesar de que el 1-hidroxi-2-metoxi-5-nitrobenceno (25) no fue observado durante el metabolismo del 4-nitroanisol, los autores proponen la vía metabólica 1 para la obtención de dimetoxinitrobenceno a partir de 4-nitrofenol. La vía 2 se propuso debido a que cuando el 4-nitrocatecol fue adicionado al medio de cultivo, también se obtuvo el dimetoxinitrobenceno. La adición de piperonil butóxido, un inhibidor del citocromo P-450, inhibió la formación de dimetoxibenceno pero no afectó el metabolismo del 2,4-dinitrotolueno. Los autores también encontraron que, a pesar de su naturaleza fenólica, el 4-nitrofenol y el 4-nitroanisol no fueron oxidados por las peroxidasas ligninolíticas extracelulares. La oxidación del dimetoxinitrobenceno por la LiP libera el grupo nitro para formar la 2-metoxi-1,4-benzoquinona (26), la cual se propone que es mineralizada a CO2. 12 1.2.3 Fitorremediación Recientemente se ha centrado la atención en la fitorremediación -el uso de plantas para remover contaminantes del ambiente o volverlos menos peligrosos (Salt et al., 1998). La fitorremediación puede ser aplicada a contaminantes orgánicos e inorgánicos (presentes en suelo, agua y aire) por medio de diferentes estrategias (Fig. 7). La fitorremediación de metales y otros compuestos inorgánicos puede llevarse a cabo de varias formas: fitoextracción, la absorción y concentración de metales del suelo en las raíces y brotes de la planta; rizofiltración, el uso de las raíces de las plantas para remover los metales de efluentes; fitoestabilización, el uso de plantas para reducir la dispersión de los metales en el ambiente; o la fitovolatilización, la captación y liberación de materiales volátiles tales como los compuestos que contienen mercurio o arsénico. La fitorremediación de compuestos orgánicos puede ocurrir por medio de fitoestabilización; fitoestimulación, la estimulación de biodegradación microbiana en la rizósfera; o por fitotransformación, la absorción y degradación de contaminantes orgánicos por la planta (Glick, 2003). Las diferentes estrategiasde fitorremediación no son mutuamente excluyentes; por ejemplo, en un humedal construído, la acumulación, estabilización y la volatilización pueden ocurrir de manera simultánea (Pilon-Smits, 2005) 13 Entre las ventajas que presenta la fitorremediación se encuentran las siguientes (Macek et al., 2000; Pilon-Smits, 2005): • La fitorremediación puede ser usada para sustratos sólidos, líquidos y gaseosos. • Debido a que este proceso es finalmente mediado por el sol, la fitorremediación es en promedio 10 veces más barata que los métodos de remediación basados en la ingeniería tales como excavación del suelo, lavado o quemado del suelo o sistemas bombeados y tratados. • Las plantas son una fuente renovable y barata. • Las raíces de las plantas promueven el incremento en el número de microorganismos y la actividad en la rizósfera. • El hecho de que la fitorremediación usualmente se realice in situ, contribuye a su costo-efectividad y puede reducir la exposición de los humanos, la vida silvestre y el ambiente al sustrato contaminado. Fig. 7. Estrategias de fitorremediación (modificada de Pilon-Smts, 2005) 14 La fitorremediación también posee algunas limitaciones, como son: • Las plantas que median la limpieza tienen que estar dónde se encuentre el contaminante y tienen que ser capaces de actuar sobre éste. Por tanto, las propiedades del suelo, el nivel de toxicidad y el clima deberán permitir el crecimiento de la planta. • La fitorremediación también puede estar limitada por la profundidad de la raíz debido a que las plantas tienen que ser capaces de alcanzar el contaminante. La profundidad de la raíz es típicamente de 50 cm para especies herbáceas o 3 m para árboles, aunque se han reportados freatofitas que alcanzan profundidades de 15 m o más, especialmente en climas áridos. • Dependiendo del proceso biológico involucrado, la fitorremediación también puede ser más lenta que la mayoría de los métodos de remediación establecidos como la excavación, incineración, bombeo y tratamiento. • La fitorremediación también puede estar limitada por la biodisponibilidad de los contaminantes. No obstante, la biodispobibilidad puede aumentarse al adicionar sustancias al suelo. 1.2.3.1 Estudios de transformación de nitroaromáticos en plantas La mayoría de los estudios relacionados con el metabolismo de compuestos nitroaromáticos están enfocados a la transformación de explosivos tales como el TNT. En éstos emplean plantas terrestres y acuáticas de tipo silvestre o modificadas (por introducción de genes bacterianos), así como cultivos en suspensión. Los estudios que involucran plantas completas no transformadas pueden contener o no su microflora asociada. 15 Schnoor et al. (1995) reportan la actividad nitrorreductasa en la planta acuática Lemna minor. En dicho estudio se indica que las enzimas nitrorreductasa y lacassa son secretadas al medio. Los autores proponen que dichas enzimas degradan el 2,4,6-trinitrotolueno e incorporan los metabolitos (obtenidos por ruptura del anillo) en nuevo material vegetal o detritus orgánico. Con el fin de profundizar más sobre este tema, se hizo una revisión sobre el uso de las plantas para detoxificar los contaminantes nitroaromáticos y los mecanismos que emplean para llevar a cabo las biotransformaciones. Scheidemann et al. (1998) realizaron estudios de biotransformación del TNT en once plantas terrestres. Las plantas fueron cultivadas durante ocho semanas en suelo contaminado con 10, 100 o 500 mg TNT/Kg de suelo. Los principales metabolitos del TNT encontrados en las raíces fueron el 2-aminodinitrotolueno y 4- aminodinitrotolueno. A la concentración de 10 mg TNT/Kg, la alfalfa (Medicago sativa) incorporó la mayor cantidad de nitroaromáticos; sin embargo no creció a una concentración de 100 mg TNT/Kg suelo. Por el contrario, Triticum aestivum y Phaseolus vulgaris pudieron desarrollarse a 100 mg TNT/Kg y sus raíces presentaron altos niveles de metabolitos de TNT. Sólo Phaseolus vulgaris fue capaz de crecer en presencia de 500 mg TNT/Kg de suelo con muy altos niveles de nitroaromáticos en las raíces. Para los suelos contaminados a 10 mg/Kg, más del 95% del nitro aromático original estuvo presente como metabolitos amino, pero no se conoce si esta transformación ocurrió antes o después de la captación por las plantas. En referencia al metabolismo del TNT en plantas acuáticas, Hughes et al. (1997) realizaron estudios sobre el destino del [14C] TNT en tres sistemas: Myriophyllum spicatum nativa con su microflora asociada, Myriophyllum aquaticum axénica y cultivos de tejidos de raíz de Catharanthus roseus. Los productos de reducción 4-amino-2,6-dinitrotolueno y 2-amino-4,6-dinitrotolueno fueron observados fuera de las plantas; sin embargo, los autores no tienen evidencia suficiente para concluir si la transformación ocurrió en la superficie de la planta, o 16 si los productos de transformación pudieron ser intercambiados entre los compartimentos extracelulares e intracelulares. Únicamente en el caso de Myriophyllum nativa el TNT fue detectado a niveles bajos en los extractos de plantas. En otro estudio, Bhadra et al. (1999) se enfocaron al aislamiento y la caracterización de los productos del metabolismo oxidativo del TNT en Myriophyllum aquaticum. Los metabolitos encontrados en el medio de cultivo fueron (Fig. 8): ácido 2-amino-4,6-dinitrobenzoico (27), alcohol 2,4-dinitro-6- hidroxibencílico (28), 2-N-acetoxiamino-4,6-dinitrobenzaldehído (29) y el 2,4- dinitro-6-hidroxitolueno (30). También se observaron los metabolitos azoxi- tetranitrotolueno. La presencia de los metabolitos en el medio de cultivo no excluye que los metabolitos se encuentren dentro de la planta. Se piensa que las enzimas involucradas en el proceso de oxidación son oxigenasas de función mixta. COOH NH2 NO2 O2N 27 CH2OH NO2 NO2 HO 28 H N O CHO NO2 O2N 29 CH3 NO2 NO2 HO 30 Fig. 8. Metabolitos de oxidación del TNT obtenidos por transformación con Myriophyllum aquaticum. French et al. (1999) transformaron plantas de tabaco, por medio de Agrobacterium tumefasciens, para que expresara la enzima pentaeritritol tetranitrato (PETN) reductasa (Fig. 9). Dicha enzima, la cual es dependiente de NADPH, fue aislada de Enterobacter cloacae PB2, una cepa que es capaz de utilizar el PETN y el glicerol trinitrato (31) como única fuente de nitrógeno. Las 17 semillas de las plantas transgénicas fueron capaces de germinar y crecer en presencia de glicerol trinitrato a una concentración 1 mM ó TNT 0.05 M, tales concentraciones inhibieron la germinación y el crecimiento de las semillas tipo silvestre. Las plántulas transgénicas crecieron en medio líquido con 1 mM de glicerol trinitrato y mostraron una eliminación más rápida y completa del grupo nitro que las plántulas no transformadas. O O O NO2NO2 NO2 O O NO2NO2 OH O OH NO2 OH 31 Fig. 9. Metabolitos del glicerol trinitrato (31) en plantas de tabaco modificados con el gen de la enzima pentaeritritol tetranitrato (PETN) reductasa aislada de Enterobacter cloacae PB2. Hannink et al. (2001) demostraron que las plantas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) transformadas con Agrobacterium, las cuales expresan la nitrorreductasa de Enterobacter cloacae, son capaces de tolerar y detoxificar el TNT a niveles que son comúnmente encontrados en los sitios contaminados. Los estudios se llevaron a cabo en plantas T2. Las semillas fueron germinadas en placas que contenían 0.25 mM de TNT. La línea transgénica más tolerante al TNT (designada NR 3-2) presentó signos moderados de fitotoxicidad. No se observó una disminución considerable en la germinación de semillas transgénicas comparadas con las semillas tipo silvestre y ambas líneas deplantas desarrollaron raíces similares en longitud y forma. En un ensayo con plántulas crecidas en medio líquido que contenía TNT, Los resultados mostraron que las plantas tipo silvestre ganaron 48% en peso fresco y removieron 78% del TNT a 0.1 mM al final del estudio (168 h), por su parte, la línea NR 3-2 ganó 52% y removió 71% del 18 TNT en las primeras 6 horas. Todo el TNT fue removido por las plantas NR 3-2 en 20 horas. A la concentración de 0.25 mM, las plantas tipo silvestre removieron cantidades insignificantes de TNT y las plantas transgénicas removieron 50% del TNT en las primeras 6 horas y todo el TNT en 72 horas. Se produjeron cantidades insignificantes de metabolitos aminodinitrotolueno en el medio de cultivo por ambas líneas de plantas a ambas concentraciones de TNT. Nepovím et al. (2004) evaluaron la transformación del TNT en cultivos en suspensión de Rheum palmatum y Solanum aviculare. La concentración inicial de TNT disminuyó hasta 50 % en el transcurso de 1 hora en presencia de R. palmatum y el 100% después de 6 horas En presencia de S. aviculare, la mayor parte de TNT fue captada en 10 horas. La concentración de TNT que inhibió el 50% del crecimiento de los cultivos celulares fue del orden de 38 mg/L (0.167 mM). En el estudio realizado por Adamia et al. (2006) se evaluó la capacidad de plántulas de soya (Glycine max), cebada (Hordeum sativum), alfalfa (Medicago sativum), garbanzo (Cicer arietinum), chícharo (Pisum sativum), zacate italiano (Lolium multiflorum), girasol (Helianthus annuus) y maíz (Zea mays) para absorber y detoxificar el TNT. De estas plantas, la soya fue el mejor candidato, por lo cual se evaluó la actividad nitrorreductasa en homogenados de raíz de soya. La actividad nitrorreductasa aumentó de manera significativa en todos los organelos (principalmente en los microsomas) durante el cultivo de las plantas de soya en un medio que contenía TNT; sin embargo, aun después de la inducción, la actividad de la nitrorreductasa microsomal permanece más baja que la de otras fracciones y la más alta se encuentra en el citosol. También se encontró que a mayor actividad nitrorreductasa, la asimilación del TNT por la planta era más rápida. 19 Por otra parte, las enzimas fenoloxidasa y peroxidasa oxidaron el [C3H3]TNT. Después de comparar los resultados de la oxidación enzimática con los de la inducción de la nitrorreductasa, la cual se activa más significativamente bajo la acción del TNT, los autores postulan que la vía principal de la transformación del TNT en células de plantas involucra la reducción de los grupos nitro. 1.2.3.2 Absorción y transporte de xenobióticos en plantas Aunque las plantas pueden tomar las sustancias a partir de las fases de vapor, líquido y sólido, el movimiento de los compuestos dentro de la planta usualmente ocurre en solución. Los compuestos que tienen mayor probabilidad de ser absorbidos son aquellos con coeficientes de partición octanol/agua (log Kow) entre 0.5 y 3.0. La eficiencia de entrada de las sustancias orgánicas también depende de su pKa, su masa molecular, su concentración, la temperatura y el pH del medio, el contenido de agua y material orgánico en el suelo y la fisiología de la planta. (Alkorta y Garbisu, 2001). De acuerdo a Korte et al. (2000) existen dos vías de entrada de los xenobióticos a las plantas: las raíces y las hojas. Para entrar a través de las raíces las sustancias deben penetrar únicamente a través de paredes celulares no subesterificadas libres de cutícula. Por otra parte, las sustancias entran a las hojas a través de los estomas si son moléculas gaseosas, o a través de la cutícula de la epidermis si son sustancias orgánicas lipofílicas (Fig. 10). Debido a esto, las hojas poseen mayor selectividad que las raíces para absorber las sustancias. 20 Fig. 10. Sección transversal esquemática de una hoja, indicando el arreglo de varios tipos de células (tomado de Nobel, 1999). 1.2.3.3 Metabolismo de xenobióticos en plantas Existen tres fases del metabolismo de xenobióticos en plantas (Fig. 11). La mayoría de los xenobióticos sufre una reacción metabólica de fase I, la cual es oxidativa, reductiva o hidrolítica; en esta fase se forman grupos amino, hidroxilo o ácido carboxílico libres. En el metabolismo de fase II, ocurre una adición enzimática de una molécula de azúcar, aminoácido o glutatión a un grupo funcional recién formado durante la fase I. Finalmente, el metabolismo de fase III convierte los conjugados de fase II en residuos insolubles o los conjuga con una molécula adicional y los metabolitos son compartimentalizados en la vacuola. Cloroplastos T lOO/1m 1 Poro del estoma Célula guarda Cutícula Epidermis superior Células del mes6filo empalizada Células esponjosas de mes6filo Ep idermis inferior 21 Fig. 11. Representación esquemática de la detoxificación de xenobióticos en una célula de una planta. P450 = Cyt P450 mono oxigenasa; GT = glucosiltransferasa. X y X- Z son los xenobióticos, y Z es la parte nucleofílica desplazada en la reacción catalizada por glutatión transferasa (GST). (Adaptado de Kreuz et al., 1996) 1.2.3.3.1 Reacciones de fase I Estas reacciones generalmente se llevan a cabo mediante enzimas tipo citocromo P450 (Cyt P450). La reacción general es: XH + O2 + NADPH → XOH + H2O + NADP+ donde XH es el sustrato y XOH es el producto oxidado. Las reacciones más comunes mediadas por Cyt P450 con xenobióticos son hidroxilaciones de anillos aromáticos o grupos alquilo y liberación de heteroátomos (O- y N- desalquilación). La introducción de un grupo hidroxilo en una molécula de xenobiótico incrementa su polaridad e hidrofilicidad. Las monooxigenasas Cyt P450 encontradas en plantas son proteínas microsomales (masa molecular ≈ 55 kD) que requieren O2, NADPH, y NADPH- Cyt P450 reductasa para su actividad catalítica. Las enzimas Cyt P450s están involucradas en la biosíntesis de metabolitos tales como fenilpropanoides, terpenos, ácidos grasos, glucósidos cianogénicos, etc. (Kreuz et al., 1996; Korte et al., 2000; Werck-Reichhart et al., 2000) RE """'" . - 22 1.2.3.3.2 Reacciones de fase II (Formación de conjugados) La formación de conjugados es un proceso metabólico en donde las sustancias endógenas o exógenas son convertidas a componentes polares para facilitar su remoción de el (los) sitio(s) de procesos metabólicos continuos (Dorough, 1976, citado por Hall et al., 2001). Las reacciones de conjugación se llevan a cabo mediante la adición de sustancias que están presentes dentro de las células de las plantas a los grupos -OH, -NH2 y -SH de los xenobióticos. La adición de un azúcar, un aminoácido o glutatión al xenobiótico produce un conjugado con un peso molecular más alto, que es más soluble en agua, menos móvil y usualmente más susceptible a un proceso posterior en la planta; todo lo cual los vuelve no disponibles para el metabolismo primario y por tanto que alcancen su sitio blanco (Hall et al., 2001). 1.2.3.3.2.1 Conjugación con glucosa En plantas, la glucosa es adicionada a los xenobióticos para formar diferentes tipos de conjugados mediante la acción de enzimas conocidas como glucosiltransferasas. La reacción general de formación de conjugados con glucosa se muestra a continuación: UDP-Glc + HO-X (H2N-X, HOOC-X) → Glc-O-X (Glc-NH-X, Glc-O-CO-X) + UDP Los xenobióticos con anillos aromáticos hidroxilados pueden ser conjugados con azúcares para formar los O-glucósidos. Los N-glucósidos se forman por la adición de azúcares en grupos amino del anillo aromático de los xenobióticos. Las reacciones de conjugación que ocurren en los grupos sulfhidrilo producen S- glucósidos, los cuales son menos comunes. 23 Algunos ésteres de glucosa pueden sufrir una segunda conjugación con otro monosacáridopara producir un gentiobiosido; en donde, el segundo azúcar que es transferido al conjugado no tiene que ser glucosa (Hall et al., 2001). Las glucosiltransferasas, han sido descritas como enzimas solubles o unidas a membrana con masas moleculares nativas de 40 a 62 kD y compuestas de uno o dos polipéptidos (Kreuz et al., 1996). Estas enzimas, las cuales son codificadas por grandes familias multigénicas, están involucradas en la biosíntesis de una variedad de productos secundarios de plantas tales como flavonoides, glucósidos cianogénicos, glucosinolatos, glicoalcaloides, glucósidos de ácido salicílico y glucósidos de ácido indolacético (Gachon et al., 2005). 1.2.3.3.2.2 Conjugación con glutatión El glutatión (GSH) es un tripéptido (γ-glutamilcisteinil-β-glicina) encontrado en organismos aerobios, y que está involucrado en la conjugación de xenobióticos y en la detoxificación de radicales libres (Coleman et al., 1997; Hall et al, 2001). Esta reacción ocurre por el ataque del anión GSH tiolato a un sustrato electrofílico (X-Z) con el desplazamiento simultáneo de un nucleófilo (Z) para formar moléculas menos tóxicas y más polares (Kreuz et al., 1996): X-Z + GSH → X-SG + HZ La conjugación de los xenobióticos con glutatión puede ocurrir enzimáticamente por la acción de glutatión-S-transferasas (GSTs), o no enzimáticamente (aunque en el último caso la reacción es más lenta). En plantas, las GSTs están localizadas en el citosol, son enzimas homo- o heterodiméricas (masa molecular en el rango de 23-30 kD) y existen como múltiples isoenzimas con actividades especie-específicas para un amplio espectro de compuestos electrofílicos. Las plantas con altas concentraciones de GSTs son 24 más tolerantes a ciertos herbicidas que las plantas con cantidades más bajas (Coleman et al., 1997; Hatzios, 2001). En la figura 12, se muestra la obtención del 4-nitrofenol como producto de la adición del glutatión al fluoridifen mediante la acción de una glutatión transferasa. NO2 OF3C NO2 + Glutatión (GSH) Glutatión-S-transferasa NO2 GSHF3C Conjugado GSH + HO NO2 9 1 Fig. 12. Conjugación enzimática del fluorodifen (9) con glutatión en chícharo (citado en Hall et al., 2001) 1.2.3.3.2.3 Conjugación con ácido malónico En esta reacción, los conjugados con glucosa de los xenobióticos se unen a hemi- ésteres de ácido malónico en presencia de malonil-CoA. En algunos casos, los xenobióticos son conjugados con glutatión, el cual es degradado a cisteína antes de su conjugación con malonato. Por ejemplo, el fluorodifen-GSH es metabolizado a un conjugado de cisteína y posteriormente es N-acilado con ácido malónico (Kreuz et al., 1996; Coleman et al., 1997). 25 1.2.3.3.2.4 Conjugación con péptidos En la revisión de Korte et al. (2000) se indica que el fenol no es glicosilado en plantas intactas. Un estudio sobre el metabolismo del [1,6-14C]fenol en plántulas estériles de maíz, chícharo y calabaza demostró que los fenoles forman conjugados con péptidos de bajo peso molecular. Otros fenoles también forman conjugados con péptidos en plantas: el α-naftol en plántulas de maíz, chícharo y calabaza; el o-nitrofenol en plántulas de chícharo; el 2,4-dinitrofenol en plántulas de maíz, calabaza y chícharo. Los fenoles se unen covalentemente a péptidos por medio de grupos hidroxilo. La composición de aminoácidos de los péptidos que participan en la conjugación con fenoles varía. 1.2.3.3.3 Reacciones de fase III (compartimentalización) Las plantas no tienen un sistema excretor, de manera que sus productos tóxicos usualmente son compartimentalizados en vacuolas o embebidos en polímeros estructurales para prevenir la toxicidad del xenobiótico. Sin embargo, en algunos casos, pueden ser exudadas pequeñas cantidades de xenobióticos de las raíces (Coleman et al.,1997; Hall et al., 2001). 1.2.3.3.3.1 Compartimentalización en la vacuola La vacuola es el organelo involucrado en el almacenamiento de los compuestos y la osmorregulación; está rodeada por la membrana del tonoplasto producida por el Golgi. Respecto a la vía de entrada de conjugados a la vacuola, se han reportado transportadores que reconocen los conjugados de glutatión; dichos transportadores son dependientes de ATP y están localizados en el tonoplasto (Coleman et al., 1997). Aun no se han caracterizado transportadores de glucosa o 26 aminoácidos aunque se ha establecido la hipótesis de que existen debido a que el transporte requiere magnesio y es inhibida por vanadato (Kreuz et al., 1996). 1.2.3.3.3.2 Residuos unidos Los metabolitos de xenobióticos, derivados de conjugación con glucosa y GSH pueden ser depositados como “residuos unidos” en la matriz extracelular (Kreuz et al., 1996, Coleman et al, 1997). 1.2.3.4 Enzimas aisladas de plantas para la transformación de nitroaromáticos La nitrorreducción es un paso inicial en el metabolismo de una variedad de compuestos estructuralmente diversos, incluyendo los nitrofuranos, nitropirenos y nitrobencenos. Las enzimas que catalizan este proceso son llamadas nitrorreductasas. Las enzimas nitrorreductasas son ubicuas y pueden ser obtenidas de plantas, microorganismos y animales. Estas enzimas, a diferencia de las nitrato/nitrito reductasas, no reducen el nitrato o el nitrito, no son parte de ninguna cadena respiratoria y no proveen una fuente de nitrógeno reducido para el crecimiento celular. Se piensa que las nitrorreductasas se expresan constitutivamente, y sus funciones fisiológicas no son claras (Kitts et al., 2000). Estas enzimas se clasifican en dos grupos: sensibles al oxígeno e insensibles al oxígeno (Fig. 13). 27 Las nitrorreductasas insensibles al oxígeno o Tipo I, usan un mecanismo de reducción de dos electrones y son capaces de reducir los grupos nitro bajo condiciones aerobias (Kitts et al., 2000; Esteve-Nuñez et al., 2001). Ejemplos de estas enzimas, son la NAD(P)H- quinona oxidorreductasa (anteriormente llamada DT-diaforasa, EC 1.6.99.2) y las nitrorreductasas de las bacterias entéricas (Watanabe et al., 1998). Por otra parte, las nitrorreductasas sensibles al oxígeno, o Tipo II, reducen los grupos nitro en un proceso de un solo electrón, formando un anión radical nitro. En presencia de O2, el anión radical nitro puede ser oxidado nuevamente a un grupo nitro, y se produce el anión radical superóxido. Mientras el oxígeno esté presente, opera un ciclo que consume equivalentes reductores sin la reducción neta del grupo nitro. De esta manera, las nitrorreductasas tipo II sólo son capaces de la reducción neta del grupo nitro en ambientes anaerobios (Kitts et al., 2000; Esteve-Nuñez et al., 2001). Ejemplos de nitrorreductasas tipo II son la NADPH- citocromo P-450 oxidorreductasa (EC. 1.6.2.4) y la NADPH-b5 oxidorreductasa (EC 1.6.2.2), (Watanabe et al., 1998). Fig. 13. Mecanismos para la reducción de grupos nitro en compuestos nitroaromáticos. El primer paso en la reducción del grupo nitro puede ser lograda a través de la transferencia de un electrón (línea sólida) o la transferencia de dos electrones (línea discontinua). El primer mecanismo produce un radical nitroanión que podría reaccionar con el oxígeno para formar radical superóxido y el compuesto nitroaromático original a través de un ciclo (línea punteada). Si el mecanismo ocurre mediante la transferencia de dos electrones, el derivado nitroso formado es el primer intermediario; siguiendo dos transferencias de electrones consecutivas, se producen la hidroxilamina y la amina aromática. (Esquema adaptado por Esteve-Nuñez et al., 2001 a partir de Spain, 1995). , • ro, o· , u.. p' ~r ~, .. ~ . ¿A. o •• H OH H H 1I >0 1;' " / Ji'"' ,,/ ~ ---- .... ~ -:OH-'- N --" ' ----- - ------~'------. OH' Ar Ar Ar 28 Las nitrorreductasas son flavoproteínas solubles que usan NADH o NADPH como donadoresde electrones. Hasta la fecha, no se ha identificado la (s) enzima (s) que lleva a cabo la transformación de compuestos nitroaromáticos en plantas. Existen sólo dos estudios que emplean enzimas purificadas de plantas. Shah y Spain (1996) encontraron que la ferredoxina NADP oxidorreductasa (una enzima sensible al oxígeno) de hoja de espinaca, transformó el explosivo 2,4,6-trinitrofenilmetilnitramina (tetryl, 32) por liberación de nitrito, para formar el metabolito N-metil-2,4,6-trinitrobencenamina (33), como se esquematiza en la figura 14. e H e NO2 O2O2 N NO2 NO2 O2N H3C NO2 N NO2 NO2 O2N H3C NO2 N NO2 NO2 O2N H3C H 32 33 Fig. 14. Esquema propuesto para la eliminación de nitrito a partir del tetryl por la ferredoxina NADP oxidorreductasa de hojas de espinaca (Shah y Spain, 1996). En otro estudio, Shah y Campbell (1997) reportaron la reducción del nitrobenceno a fenilhidroxilamina por la ferredoxina NADP oxidorreductasa. Los autores encontraron que se forma aproximadamente un mol de fenilhidroxilamina por cada mol de nitrobenceno. El metabolito no fue observado bajo condiciones aerobias. 29 1.3 Generalidades sobre Lemna gibba Lemna gibba es una planta monocotiledónea perteneciente a la familia Lemnaceae. Las lemnáceas son las plantas más pequeñas con flores. Las hojas de las lemnáceas comúnmente son llamadas frondas (Fig. 15A). A diferencia de las hojas de la mayoría de las plantas, la fronda de Lemna es una estructura propagativa (www.mobot.org/jwcross/duckweed/).Las frondas hijas se originan del tejido meristemático en el interior de dos sacos laterales de la fronda madre y pueden permanecer unidas a ella hasta que maduran; cada fronda hija que emerge de una bolsa ya contiene dos o más generaciones de frondas hijas (Li et al., 2004). Fig. 15. Planta de Lemna gibba vista desde la superficie adaxial (A), lateral (B) y abaxial (C), en la cual se observan las frondas (f), la raíz (r) y las bolsas de aerénquima (a). Las fotos B y C fueron obtenidas de http://de.wikipedia.org/wiki/Bucklinge_Wasserlinse El tejido debajo de la epidermis consiste de un parénquima fotosintetizador, parcialmente interrumpido por grandes espacios de aire intercelulares (aerénquima), mientras que la raíz está localizada en la cara abaxial (Fig. 15 B y C). Lemna minor y Lemna gibba presentan una sola raíz, mientras que otros géneros dentro de la misma familia no presentan raíz (Wolfia y Wolfiella) o presentan más de una raíz (Spirodella). Aunque las lemnáceas pueden presentar flores y frutos (Fig. 16 B y C, respectivamente), su forma de multiplicación es predominantemente vegetativa (Fig. 16A). A B C f a r r r a 30 Fig. 16. Plantas de Lemna gibba en fase de reproducción asexual o vegetativa (A) y sexual (B y C). La figura B muestra plantas con flores y la figura C muestra el fruto. La foto B se obtuvo en http://botit.botany.wisc.edu/.../Lemnaceae/Lemna y la foto C en www.mobot.org/jwcross/duckweed/ . Las propiedades de las plantas que son favorables para la fitorremediación son: crecimiento rápido, alta biomasa, competitiva, robusta y tolerante a la contaminación (Pilon-Smits, 2005). En condiciones naturales, el crecimiento más intenso de Lemna gibba se presenta desde Junio hasta Agosto. Las plantas duplican su biomasa en 1-6 días, y la duplicación del número de frondas ocurre en 2-3 días (Wang, 1990). Las lemnáceas cultivadas en el laboratorio pueden crecer indefinidamente si se proveen los nutrientes, la luz y el agua. Slovin y Cohen (1988) reportan que la cepa G-3 de Lemna gibba cultivada en medio E, crece a velocidad logarítmica durante 45 días, sin fase lag aparente. Cada fronda produce aproximadamente 15 frondas hijas y después la fronda madre senesce. En estos cultivos, las primeras frondas senescentes (amarillas) aparecen después de 20 días de crecimiento y representan una pequeña fracción respecto a la población total. De acuerdo a Li et al (2004), estas plantas poseen un alto contenido de proteína (45 % del peso seco). Las lemnáceas están adaptadas a una amplia variedad de zonas climáticas y geográficas, con excepción de los desiertos y las regiones polares. En México, se encuentra en los estados de Aguascalientes, Baja California, Chihuahua, Coahuila, Distrito Federal, Durango, Guanajuato, Hidalgo, Jalisco, Michoacán, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Sonora, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz y Zacatecas (Lot et al., 1999). A B C 31 Estas plantas se encuentran flotando libremente en estanques eutroficados formando una capa; su tamaño (aproximadamente 1 cm de diámetro) permite tener una cantidad abundante de biomasa en espacios reducidos. Lemna gibba se encontró creciendo de manera natural en humedales de sitios dedicados previamente a la minería de uranio en el estado de Sajonia, Alemania; en donde se observó que la planta es capaz de acumular relativamente grandes cantidades de este elemento. Debido a que durante la extracción de uranio también hubo exposición hacia otros elementos como el arsénico, Mkandawire y Dudel (2005) evaluaron la capacidad de Lemna gibba para acumular arsénico (en forma de arsenato) y encontraron que su acumulación incrementó con la concentración de arsénico en el medio pero disminuyó con la concentración de fosfato. Las especies Lemna gibba y Lemna minor han sido consideradas como especies de prueba estándar para la evaluación de toxicidad de agroquímicos. En la tabla 1, se muestran valores de concentración inhibitoria media (CI50) en Lemna gibba frente a algunos compuestos orgánicos y un compuesto inorgánico. De acuerdo a los autores, las lemnáceas se pueden adaptar y/o desarrollar resistencia rápidamente debido a su rápida tasa de crecimiento. Tabla 1. Concentraciones inhibitorias medias (CI50) en Lemna gibba frente a diferentes compuestos (adaptada de Wang, 1990) Sustancia CI5o (mg/L) CuSO4 2.21 o-cresol 246 di(2-etilhexil)ftalato 2,060 Etilenglicol 17,159 2,4,6-triclorofenol 0.13 Los experimentos tuvieron una duración de 7 días y se evaluó la velocidad de crecimiento. 32 2. HIPÓTESIS En base a que se ha encontrado que la planta acuática Lemna minor presenta actividad nitrorreductasa y al hecho de que las plantas presentan la capacidad de detoxificar compuestos xenobióticos, se espera que la planta acuática Lemna gibba lleve a cabo la biodegradación del contaminante 4-nitrofenol. 3. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Evaluar la transformación del 4-nitrofenol en plantas axénicas de Lemna gibba (silvestre) en condiciones de laboratorio. OBJETIVOS PARTICULARES • Obtener plantas axénicas de Lemna gibba y mantenerlas en condiciones de laboratorio. • Determinar la cinética de degradación del 4-nitrofenol. • Determinar la existencia de actividad nitrorreductasa en el extracto crudo de la planta. 33 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 Sustancias El 4-nitrofenol (98% de pureza), el NADPH (N6505), la nitrofurantoína y el DMSO se obtuvieron de Sigma. En el proceso de desinfección de las plantas se empleó hipoclorito de sodio (Cloralex, 6% de cloro activo), peróxido de hidrógeno al 30 % (Hycel de México), Promyl (Benomyl al 50%), Agri-mycin 500 (Pfizer, ANEXO 1), Cefotaxima (Kendrick). Los disolventes tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo (ACN), acetato de etilo (AcOEt) y hexano fueron grado HPLC y se obtuvieron de Baker. El agua desionizada empleada para la fase móvil en el HPLC fue obtenida por un sistema MilliQ. La nitrorreductasa B de Salmonella fue proporcionada por el Dr. Jesús Espinosa Aguirre (Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM). 4.2 Preparación de medios de cultivo Los medios de cultivo se prepararon a partir de soluciones stock 100 veces concentradas (100x). El agua utilizada para su preparación fue agua desionizada (Aqua Tec). Losreactivos fueron Grado Analítico o Grado Cultivo de Tejidos Vegetales. Medio Hoagland. El medio Hoagland líquido diluido 2.5 veces se preparó a partir de las soluciones stock indicadas en el ANEXO 2 (cuatro mililitros de cada solución 100 veces concentrada por litro de medio), se adicionó agua (c.b.p 1L) y la solución se ajustó a pH 7.0 (Sánchez-Villavicencio, 2003) con hidróxido de potasio empleando un pH metro Hanna pH209. El medio empleado en el cultivo de Lemna gibba axénica y los experimentos de biotransformación, se esterilizó por filtración con ayuda de filtros Millipore 0.45 μm. Medio MS. En la preparación de un litro de medio MS sólido se emplearon 10 mL de cada una de las soluciones stock (ANEXO 3), se adicionó sacarosa a una concentración final de 1% (p/v) y agua desionizada estéril (c.b.p. 1L). Después de 34 homogeneizar la solución, se ajustó el pH a 5.8 (Li et al. 2004) con hidróxido de potasio 1 N y 0.1 N y finalmente se adicionó Gelrite (Sigma) al 0.26% (p/v). El medio se calentó a ebullición (1 min/100 mL de medio) hasta la incorporación del agente gelificante y se colocó en frascos de vidrio con tapa. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave durante 18 minutos a 120 ºC y a 1.2 kg/cm2. 4.3 Condiciones de incubación Las plantas fueron mantenidas en incubación a una temperatura de 25 ± 2 °C, intensidad luminosa de 50 μmol/m2s (proporcionada por lámparas de luz blanca fluorescente), con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. 4.4 Colecta y mantenimiento del material vegetal La colecta se realizó en un estanque ubicado en las afueras de la ciudad de Amealco, Querétaro. El pH del agua de colecta fue de 7 (papel pH- Fix 0-14, CRISA). Con el fin de eliminar el material que acompaña a Lemna gibba, las plantas de interés se enjuagaron con agua corriente y después se colocaron en medio Hoagland líquido (ANEXO 2) diluido 2.5 veces y ajustado a pH 7.0. Las plantas se incubaron en las condiciones descritas en recipientes abiertos. 4.5 Obtención y mantenimiento de plantas axénicas. Las plantas obtenidas a partir del cultivo en el laboratorio, fueron sometidas a una serie de soluciones de agentes antimicrobianos durante un determinado tiempo y en agitación magnética (con excepción del tratamiento con cefotaxima). Antes de colocar las plantas en una nueva solución, éstas fueron enjuagadas con agua desionizada estéril. En primer lugar se pusieron en contacto por 60 minutos con 35 H2O2 al 3%; posteriormente se transfirieron a una solución de Promyl (1 g/L) y permanecieron en esta solución por 10 minutos, seguido del tratamiento con Agri- mycin 500 (1 g/L) durante 10 minutos. Finalmente se colocaron en una solución de Cefotaxima (0.5 g/L) durante 30 minutos sin agitación. Las plantas tratadas (a las cuales se les cortó la raíz para facilitar la manipulación) se colocaron en medio MS sólido (ANEXO 3) pH 5.8 con la superficie adaxial en contacto con el medio (Li et al., 2004) y se mantuvieron en incubación en las condiciones descritas (sección 4.3). Después de transcurridas 48 horas de incubación, se buscó la presencia de hongos, bacterias y algas. Las plantas que no presentaban organismos asociados, se mantuvieron en incubación durante aproximadamente 20 días y posteriormente se transfirieron a medio Hoagland líquido diluido 2.5 veces. La transferencia de las plantas axénicas a medio de cultivo nuevo, se realizó cada 7 días. 4.6 Experimento de biotransformación En el experimento de biotransformación se emplearon tres sistemas: (A) 4- nitrofenol disuelto en medio de cultivo, (B) Lemna gibba axénica en medio de cultivo. (C) 4-nitrofenol y Lemna gibba en medio de cultivo. Los experimentos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 125 mL los cuales contenían 50 mL de medio Hoagland diluido 2.5 veces. A los sistemas A y C, les fue adicionado el 4-nitrofenol (solución acuosa [1mg/mL]) de manera que se obtuviera una concentración final de 2.5 mg/L (19.92 μM). A los matraces de los sistemas B y C se les agregaron aproximadamente 0.4 g de plantas axénicas. Durante el experimento se monitoreó el medio de cultivo (concentración de 4- nitrofenol) y el material vegetal (aspecto, peso fresco, cantidad de proteína, presencia de 4-nitrofenol y/o metabolitos de éste y la actividad nitrorreductasa). Tal monitoreo se llevó a cabo al inicio del experimento y posteriormente a las 48, 96 y 144 horas de incubación. 36 4.6.1 Determinación de la concentración de 4-nitrofenol en el medio de cultivo En cada día de muestreo, se filtró el contenido de los matraces a través de papel Whatman No. 2, se registró el volumen de medio y le fueron agregados 25 mL de THF; de esta solución se tomó una alícuota y se guardó en refrigeración hasta su análisis. El análisis por HPLC se llevó a cabo en un cromatógrafo de líquidos Perkin-Elmer con detector de arreglo de diodos, a 320 nm, equipado con una columna de fase reversa C18 EC 250/4 NUCLEOSIL 120-5 (Macherey-Nagel). La elusión se realizó con un gradiente de agua-acetonitrilo (ACN) como se muestra en la tabla 2, con una velocidad de flujo de 0.5 mL/min. Cincuenta microlitros del medio de cultivo adicionado con THF, fueron inyectados a los 5.5 min del inicio de la corrida (paso cero). La concentración del 4-nitrofenol se calculó mediante interpolación con una curva patrón de 4-nitrofenol disuelto en medio Hoagland y THF (1:1, v/v) y se corrigió respecto al volumen de medio de cultivo obtenido en cada día de muestreo. Tabla 2. Gradiente de elusión para separar y cuantificar el 4-nitrofenol en el medio de cultivo y el material vegetal. Paso Tiempo (min) Flujo (mL/min) % ACN % H2O 0 0.0 0.5 0 100 1 2.0 0.5 0 100 2 10.0 0.5 100 0 3 2.0 0.5 100 0 4.6.2 Análisis del material vegetal El material vegetal obtenido después de filtrar el contenido de cada uno de los matraces, fue utilizado para realizar las siguientes determinaciones: peso fresco, presencia de 4-nitrofenol y/o sus metabolitos, cuantificación de clorofilas a y b. 37 La cantidad de proteínas y la actividad nitrorreductasa se realizaron con muestras de planta que permanecieron en incubación durante 144 horas. 4.6.2.1 Determinación del peso fresco Las plantas recién filtradas obtenidas en cada día de muestreo, se enjuagaron con agua desionizada estéril, se transfirieron a papel absorbente estéril para eliminar el agua superficial y se registró el peso de las plantas. 4.6.2.2 Búsqueda de 4-nitrofenol y/o metabolitos en el material vegetal El material vegetal, previamente pesado, se colocó en un mortero frío y se molió con ayuda de hielo seco. El sólido obtenido se extrajo con una mezcla de MeOH: CH2Cl2 (2:1, v/v). Veinte microlitros de extracto se aplicaron a una placa de silica gel (Alugram Sil G/UV254, Macherey Nagel) la cual fue eluída con una mezcla de Hex-AcOEt (1:1, v/v); al evaporarse el eluyente la cromatoplaca se visualizó en una cámara de luz ultravioleta de onda corta (254 nm). La mezcla de disolventes del extracto se evaporó a sequedad y el sólido se resuspendió en 1 mL de ACN, esta solución se centrífugo a 3500 x g durante 5 minutos y 50 μL del sobrenadante se inyectaron en el HPLC. Las condiciones de elusión son las mismas que se utilizaron para el análisis del medio de cultivo (sección 4.6.1). 4.6.2.3 Determinación de clorofilas a y b Al finalizar el periodo de incubación correspondiente, se sacaron las plantas del medio de cultivo, se eliminó el agua superficial y se colocaron en 25 mL de una mezcla MeOH:CH2Cl2 (2:1, v/v). Las plantas permanecieron en contacto con el disolvente durante 12 h, después de lo cual se filtró la solución y se registró la 38 absorbancia de la solución a 647 nm y 664 nm (espectrofotómetro UV-Vis Shimadzu U160). La cantidad de clorofilas a y b se determinómediante las siguientes ecuaciones: Clorofila a = 11.93 A664nm – 1.93 A647nm Clorofila b = 20.36 A647nm – 5.50 A664nm 4.6.2.4 Obtención del extracto crudo de Lemna gibba Las plantas previamente pesadas (las cuales fueron independientes de las extraídas con solventes orgánicos), se trituraron en un mortero con ayuda de hielo seco. Las plantas molidas se transfirieron a tubos eppendorf y se les adicionaron 1.5 mL de buffer de fosfatos 50 mM pH 7.0. La suspensión se agitó en vortex y posteriormente se centrifugó a 100,000 g durante 60 minutos (ultracentrífuga Beckman L8-55) y se recuperó el sobrenadante, al cual se le determinó la cantidad de proteínas y la actividad nitrorreductasa. 4.6.2.5 Cuantificación de proteínas La cuantificación de proteínas se llevó a cabo por el método de Bio-Rad (basado en el método de Bradford, 1976). El reactivo se preparó diluyendo 1 parte del colorante concentrado por 4 partes de agua destilada y desionizada. Esta solución se filtró a través de papel filtro Whatman No. 1 para eliminar las partículas. Las muestras se prepararon con 20 μL de extracto crudo y 980 μL de reactivo, posteriormente se registró la absorbancia a 595 nm. La concentración de proteína en las muestras, se calculó por interpolación de la absorbancia en una curva patrón de albúmina sérica bovina. 39 4.6.2.6 Ensayo de actividad nitrorreductasa La evaluación de la actividad nitrorreductasa de los extractos crudos obtenidos de las plantas de los sistemas B y C se realizó de acuerdo al protocolo establecido por el grupo de trabajo del Dr. Jesús Espinosa Aguirre (modificado de Liochev et al., 1999). La determinación se basa en la oxidación del NADPH por un sustrato nitroaromático en presencia de una enzima con actividad nitrorreductasa para formar el compuesto aminoaromático y NADP+. A diferencia de su forma oxidada (NADP+), el NADPH absorbe a 340 nm. Se espera que al transcurrir la reacción, se consuma el NADPH y por tanto disminuya la absorbancia a dicha longitud de onda. Para descartar los factores que provoquen la disminución del NADPH (consumo por el extracto o por interacción con el nitroaromático sin el extracto), se emplearon varios controles, los cuales se muestran en la tabla 3 (mezclas de reacción 2 a 4). Tabla 3. Contenido de las mezclas de reacción en el ensayo de actividad nitrorreductasa. a Equivalente a 50 μg de proteína. b 4-nitrofenol o nitrofurantoína c Se adicionó justo antes de iniciar la reacción Mezcla de reacción Extracto crudoa Nitroaromáticob NADPHc 1 + + + 2 + - + 3 - + + 4 - - + 5 + + - 6 + - - 7 - + - 40 Como se muestra en la tabla 2, los controles de reacción consistieron de buffer de fosfatos 50 mM (pH 7.0), al cual se adicionó extracto crudo (equivalente a 50 μg de proteína), compuesto nitroaromático (4-nitrofenol o nitrofurantoína) y/o NADPH. El procedimiento que se describe a continuación, se refiere a la mezcla de reacción 1 pero se aplica, con las modificaciones necesarias, a todas las mezclas de reacción. En un volumen final de reacción (1.0 mL), se mezcló buffer de fosfatos 50 mM (pH 7.0), extracto crudo equivalente a 50 µg de proteína y 10 μL de solución stock 2.5 mM de nitroaromático (nitrofenol o nitrofurantoìna) disuelto en DMSO. La mezcla se incubó 10 minutos a 25 °C evitando el contacto con la luz. Para comenzar la reacción, luego de la incubación se adicionaron 10μL de solución stock 10 mM de NADPH y se leyó inmediatamente a 340 nm durante 4 minutos en un espectrofotómetro Camspec M350 Double Beam. La velocidad de consumo del NADPH en presencia de extracto crudo y nitroaromático se determinó en base a los resultados de absorbancia de la mezcla 1 menos las mezclas que contienen NADPH (mezclas 2, 3 y 4). Para calcular la concentración de NADPH se consideró un coeficiente extinción molar de 6.22 mM1cm-1 a 340 nm, como se muestra en el ANEXO 4. En el caso del control positivo se empleó 1 µL de nitrorreductasa B de Salmonella sp (actividad específica de 195 nmol/min mg proteína) en lugar del extracto crudo. 41 5. RESULTADOS 5.1 Colecta y crecimiento de Lemna gibba El material vegetal fue colectado en estanques ubicados en las afueras de la ciudad de Amealco, Qro. Estas plantas fueron identificadas como Lemna gibba por el Dr. Antonio Lot Helgueras. Debido a que la planta de interés cohabita con otros organismos, fue necesario eliminarlos. Las plantas adultas de Lemna gibba presentaron cuatro o más frondas, las cuales forman un diámetro de aproximadamente 1 cm (figura 17). Las frondas poseen bolsas de aire (aerénquima) que son características de esta especie. También se presenta un tallo-raíz que varía de tamaño (se observaron raíces de hasta 5 cm de longitud). Como se observa en la figura 17, las plantas que permanecieron en cultivo en el laboratorio durante 5 meses, perdieron las zonas de aerénquima. Fig. 17. Comparación del aspecto de Lemna gibba recién colectada (izquierda) y después de 5 meses de cultivo en el laboratorio (derecha). A=Vista frontal, B=Vista lateral. A B 42 5.2 Experimento preliminar de biotransformación Con el fin de estandarizar las condiciones de experimentación para evaluar la interacción de Lemna gibba y el 4-nitrofenol en condiciones de laboratorio, se realizaron una serie de experimentos. Para tal efecto se establecieron tres sistemas: el sistema A contenía 2.5 mg/L (19.92 μM) de 4-nitrofenol en medio de cultivo Hoagland diluido 2.5 veces (pH 7.0); el sistema B se empleó como control de crecimiento de Lemna gibba en medio de cultivo y en el sistema C, Lemna gibba se encontraba creciendo en solución de 4-nitrofenol a la misma concentración que el sistema A. Los experimentos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 125 mL con tapón de gasa y algodón. Cada sistema se evaluó por triplicado. En los primeros experimentos, las plantas de los sistemas B y C habían sido tratadas con una solución de hipoclorito de sodio comercial al 1% (v/v) durante 2 minutos. Al transcurrir cuatro, ocho y doce días de incubación, se determinó la absorbancia del medio de cultivo a 400 nm, tomando 3 réplicas de cada sistema para cada día de muestreo y posteriormente se correlacionó con la concentración de 4-nitrofenol. Los resultados (tabla 4) mostraron que la concentración de 4-nitrofenol en el medio de cultivo en ausencia de planta (sistema A), se mantuvo constante durante el periodo de incubación. En el caso del sistema C, la concentración disminuyó en un 83% a los 4 días de incubación; sin embargo, la absorbancia aumenta a los 8 y 12 días de incubación. Es importante mencionar que a partir del día 7, se comenzaron a observar algas en el medio de cultivo, por lo que la absorbancia registrada, no se pudo correlacionar con la concentración de 4-nitrofenol. La extracción con acetato de etilo del medio de cultivo de los tres sistemas a los 12 días de incubación y su análisis por cromatografía en capa fina de fase normal (Fig. 18), reveló que la cantidad de 4-nitrofenol en el medio de cultivo que 43 había estado en contacto con Lemna gibba (sistema C), era menor en relación al sistema que no contiene la planta (sistema A), confirmando la participación de Lemna gibba en la disminución de la cantidad de 4-nitrofenol en el medio de cultivo. La cromatografía no mostró la presencia del metabolito 4-aminofenol en los extractos del medio de cultivo. En el medio extraído a partir del sistema B no se observó ningún metabolito proveniente del material vegetal. Tabla 4. Concentración de 4-nitrofenol en el medio de cultivo en el experimento de biotransformación * Los datos de absorbancia correspondientes a los 8 y 12 días de incubación en presencia de Lemna gibba son 0.060 ± 0.002 y 0.204 ± 0.020;
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