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Universidad de Buenos Aires 
Facultad de Farmacia y Bioquímica 
 
Citogenética Humana y Genética Toxicológica 
Departamento de Bioquímica Clínica 
 
 
Evaluación de la actividad biológica y protectora de la rúcula (Eruca 
sativa y Diplotaxis tenuifolia) en modelo in vivo 
 
 
Bioq. Iván Ayllón Cabrera 
 
 
Director: Dra. Marta Carballo 
Director Adjunto: Dra. Marcela M. López Nigro 
 
 
2018 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A todos los que me brindaron su alegría 
 y cariño en el desarrollo de 
esta aventura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nada beneficiará tanto la salud humana e incrementará las posibilidades de supervivencia 
de la vida sobre la Tierra, como la evolución hacia una dieta de vegetales. 
Albert Einstein 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
I INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 1 
I.1. Alimento funcional y la relación entre dieta y salud ................................................ 2 
I.2. Las crucíferas .......................................................................................................... 3 
I.3.Rúcula ..................................................................................................................... 5 
I.3.1. Reseña histórica .................................................................................................................... 5 
I.3.2. Taxonomía y procedencia...................................................................................................... 6 
I.4. Fitoquímicos presentes en Crucíferas ...................................................................... 7 
I.4.1. Glucosinolatos. ...................................................................................................................... 8 
I.4.2. Isotiocianatos ...................................................................................................................... 11 
I.4.3. Compuestos fenólicos ......................................................................................................... 12 
I.4.4. Carotenoides ....................................................................................................................... 13 
I.4.5. Los minerales ....................................................................................................................... 14 
I.5. Genética toxicológica ........................................................................................... 15 
I.6. Test de micronúcleos ............................................................................................ 18 
I.6.1. Antecedentes....................................................................................................................... 18 
I.6.2. Ensayo de formación de micronúcleos y modelos experimentales .................................... 21 
I.6.3. El Ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón ......................................................... 22 
I.7.Ensayo Cometa o Electroforesis De Una Sola Célula ............................................... 24 
I.7.1. Desarrollo histórico del ensayo ........................................................................................... 24 
I.7.2. La electroforesis de una célula en los estudios de genotoxicidad ...................................... 27 
I.7.3. Ensayo cometa en la evaluación de la protección/reparación del daño al ADN ................ 27 
I.7.4. Ventajas e inconvenientes en el ensayo ............................................................................. 29 
I.7.5. Aplicaciones ......................................................................................................................... 30 
II OBJETIVOS ................................................................................................................ 32 
II.1. Hipótesis de trabajo y objetivos ........................................................................... 33 
II.1.1. Objetivo general ................................................................................................................. 33 
II.2.2 Hipótesis de Trabajo ............................................................................................................ 33 
II.2.3. Objetivos Específicos .......................................................................................................... 34 
 
 
 
 
III MATERIALES Y MÉTODOS. ........................................................................................ 35 
III.1. MATERIALES ....................................................................................................... 36 
III.1.1. Material vegetal y preparación del jugo de rúcula............................................................ 36 
III.1.2. Selección de dosis .............................................................................................................. 36 
III.1.3. Material biológico .............................................................................................................. 36 
III.2 MÉTODOS ........................................................................................................... 37 
III.2.1. Diseño experimental ......................................................................................................... 37 
III.2.2. Ensayo cometa en sangre periférica ................................................................................. 39 
III.2.3. Test del micronúcleo en médula ósea ............................................................................... 40 
III.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................ 41 
IV. RESULTADOS .......................................................................................................... 42 
IV.1. DIPLOTAXIS TENUIFOLIA ..................................................................................... 43 
IV.1.1. Peso corporal .................................................................................................................... 43 
IV.1.2. Evaluación Genotóxica y Antigenotóxica .......................................................................... 44 
IV.2. ERUCA VESICARIA............................................................................................... 51 
IV.2.1. Peso corporal .................................................................................................................... 51 
IV.2.2. Evaluación Genotóxica y Antigenotóxica .......................................................................... 52 
V. DISCUSIÓN ............................................................................................................... 59 
V.1. Genotoxicidad/Antigenotoxicidad ....................................................................... 64 
V.2. Diplotaxis tenuifolia ............................................................................................ 69 
V.3. Eruca vesicaria .................................................................................................... 71 
V.4. Evaluación Comparativa ...................................................................................... 75 
VI. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 78 
VII. RESUMEN .............................................................................................................. 80 
VIII Referencias ............................................................................................................ 82 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
I INTRODUCCIÓN 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
2 
I.1. Alimento funcional y la relación entre dieta y salud 
Idealmente una dieta variada, equilibrada y adecuada debe garantizaruna salud 
óptima, reduciendo los riesgos de enfermedades carenciales y enfermedades crónico-
degenerativas, sin dejar de ser satisfactoria para el paladar (Gonzalvo-Heras y col., 2006). 
Los estilos de vida actuales tan cambiantes como el desarrollo del hombre exigen que los 
hábitos de consumo alimentario tengan una mayor calidad en los productos naturales. 
Debido a esta demanda, surge la creación de nuevos alimentos aplicando nuevos 
conocimientos científicos y tecnológicos que permitan desarrollar productos destinados a 
mejorar la salud. 
Según el Internacional Life Science Institute (ILSI), se establece que un alimento 
puede ser considerado funcional si se demuestra satisfactoriamente que ejerce un efecto 
beneficioso sobre una o más funciones selectivas del organismo, además de sus efectos 
nutritivos intrínsecos, de modo tal que resulte apropiado para mejorar el estado de salud y 
bienestar, reducir el riesgo de enfermedad, o ambas cosas. Los alimentos funcionales deben 
seguir siendo alimentos, no son comprimidos ni capsulas, sino alimentos que deben 
demostrar sus efectos en las cantidades en que normalmente se consumen en la dieta (ILSI, 
2004). 
Algunos ejemplos de alimentos funcionales son los enriquecidos con determinados 
minerales, vitaminas, fibra alimenticia o ácidos grasos y los alimentos a los que se les ha 
añadido sustancias biológicamente activas, como fitoquímicos y otros antioxidantes. 
Actualmente, la industria alimentaria, puede proveer alimentos con composición físico-
química controlada o modificada, según el objetivo que se desea obtener con su ingesta, 
basada en el principio del beneficio para la salud. Esto nos abre grandes perspectivas tanto 
en investigación respecto a la prevención de ciertas enfermedades, y el impacto de diversos 
nutrientes en patologías como el cáncer, enfermedades neurológicas y cardiovasculares, 
como para la industria farmacéutica en la utilización de fitoquímicos para el desarrollo de 
nuevos fármacos (Villatoro Pulido, 2011). 
La prevención y protección del daño genético constituyen estrategias claves en la 
disminución del riesgo de padecer diversas patologías crónicas, como el cáncer. Ambos 
escenarios implican una menor exposición a xenobióticos que puedan interaccionar con el 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
3 
ácido desoxirribonucleico (ADN) u otros blancos biológicos y estimular mecanismos propios 
del organismo que permitan reducir el impacto de estos xenobióticos. En este contexto, el 
consumo de vegetales y frutas son un componente fundamental ya que son fuente de 
nutrientes que resguardan la salud y probablemente reducen el riesgo de cáncer. 
(Casanova, 2014). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) una dieta poco 
saludable es uno de los principales factores de riesgo para una serie de enfermedades 
crónicas, como las enfermedades cardiovasculares, el cáncer, la diabetes y otras condiciones 
relacionadas con la obesidad; por lo tanto, recomienda el consumo de vegetales y frutas 
para reducir estas enfermedades crónicas. 
 
I.2. Las crucíferas 
La familia de las crucíferas (Brassicaceae) presenta 390 géneros y 3000 especies, de 
éstos 108 géneros con especies silvestres en Europa (Herbario Virtual del Mediterráneo 
Occidental). En Argentina según el catálogo de plantas vasculares de nuestro país, la familia 
Brassicaceae tiene 59 géneros y 216 especies de las cuales 65 son especies endémicas 
(Herbario Virtual Flora Argentina). 
Las crucíferas son plantas herbáceas, presentan hojas alternas, simples, enteras o 
dentadas y a veces en roseta basal, y su inflorescencia es en racimo con flores 
hermafroditas, actinomorfas. El cáliz presenta 4 sépalos libres, corola con 4 pétalos libres, 6 
estambres libres en 2 verticilos, 4 largos estambres interiores y 2 más pequeños exteriores. 
El gineceo con ovario súpero de 2 carpelos y 1 estilo, de fruto una silicua o silícula. 
La familia de las crucíferas es llamada así porque las flores de estas plantas poseen 
cuatro sépalos y cuatro pétalos, y éstas están colocadas en forma de cruz. Casi todas las 
especies viven en campos y huertos, muchas de ellas son plantas arvenses. Esta familia 
contiene especies bien conocidas, utilizadas muy tradicionalmente por el hombre como 
hortícolas forrajeras, o como fuente de condimentos y aceites. También, tienen mucha 
importancia económica y hay especies que presentan un aprovechamiento agrícola 
destacado como: nabos, nabizas, col china y grelos (Brassica rapa), mostaza negra (Brassica 
nigra), berza, brócoli, coliflor, col asa de cántaro (Brassica oleracea), mostaza india (Brassica 
juncea), colza (Brassica napus), mostaza etíope (Brassica carinata), rábano común 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
4 
(Raphanus sativus), rábano picante (Rusticana armoracia) y muchos otros. Asimismo, 
muchas de estas especies presentan propiedades medicinales como la rúcula (Eruca 
vesicaria), la bolsa de pastor (Capsella bursa-pastoris), la mostaza silvestre (Sinapis arvensis) 
y la mostaza blanca (Sinapis alba) entre otras. Además de estos usos, con las crucíferas se 
puede producir biodiesel, como por ejemplo con la colza (Brassica napus); también son 
usadas en biofumigación y se han reportado en la literatura distintos estudios realizados 
sobre crucíferas en fitorremediación de metales pesados (Bauddh K y col., 2012). 
En las últimas décadas las publicaciones sobre las crucíferas se han incrementado. 
Debido a su relación con la dieta y la salud (figura1; fuente Pubmed cruciferae marzo del 
2018) las crucíferas han tomado un importante rol como plantas medicinales 
experimentando un fuerte aumento en la venta y la producción, ya que se reconocen sus 
importantes efectos beneficiosos en la salud de las poblaciones que las consumen. Estos 
vegetales son de gran importancia debido al contenido de compuestos bioactivos con 
propiedades quimioprotectores incluyendo los glucosinolatos, isotiocianatos (ITCs), 
flavonoides, compuestos fenólicos, minerales, fibra, ácido fólico y carotenoides (Podsedek, 
2005; Jing Jin, 2009). 
 
Figura 1. Número de publicaciones por año sobre las crucíferas 
 
Fuente Pubmed marzo del 2018 
 
0 
500 
1000 
1500 
2000 
2500 
3000 
3500 
4000 
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2
 
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9
1
 
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bauddh%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22908643
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
5 
Según datos de la literatura, los glucosinolatos (GSL) son los principales responsables 
de las cualidades nutritivas, organolépticas y medicinales de las crucíferas, destacándose 
éstas por ser la única fuente de estos fitonutrientes en la dieta (Mithen, 2001). Estos 
compuestos que contienen azufre son los responsables del fuerte sabor de estas verduras y 
son sintetizados principalmente por la planta, como parte de un mecanismo de defensa 
contra los depredadores (insectos). Sus productos de degradación, los ITCs han demostrado 
ser buenos inhibidores del crecimiento de ciertas células tumorales. Uno de los más 
estudiados es el sulforafano, ITC derivado de la glucorafanina, presente tanto en rúcula 
como en otras crucíferas como el brócoli, al que se le adjudica un marcado efecto protector 
y vinculación con procesos anticarcinogénicos (Gibbs, 2009). 
 
I.3.Rúcula 
I.3.1. Reseña histórica 
El nombre de la rúcula está bien documentado en la antigua literatura de tierra 
santa. Distintos estudios en la literatura mencionan que este vegetal ya había sido 
mencionadoen la Biblia como “Oroth” y que fue usado en el periodo helenístico en comidas 
y medicina (Yaniv y col., 1998). 
Griegos y Romanos conocían a la rúcula por su propiedades medicinales y 
afrodisiacas (Morales y Janick, 2002). En la antigua Roma era consagrada a Priapo, 
plantándose a los pies de las estatuas de esta deidad consagrada al potencial procreador de 
los machos. Dioscórides (siglo V a.C.), en su obra De Materia Libre Quinqué, cita a la rúcula 
recomendándola para problemas digestivos y advierte que ingerir el vegetal crudo y sus 
semillas estimulan la lujuria. 
Agrónomos hispanoárabes, entre ellos, Ibn Hayyay (siglo XI), Ibn Wafid (siglos XI-XII) 
y, Ibn al-Awwam (siglo XII), también hablan del cultivo de la rúcula. Ibn al-Awwam comenta 
el uso de la planta como aromatizante de mostos y arropes, moliendo la semilla y cubriendo 
con ellas la superficie de las orzas en las que éstos se conservan. También menciona el 
empleo de sus flores en forma parecida (Nuez y Hernández-Bermejo, 2009). 
 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
6 
I.3.2. Taxonomía y procedencia 
Se denomina rúcula a diferentes especies de plantas pertenecientes a la familia de 
las crucíferas, dentro de las cuales los géneros más comunes son Eruca y Diplotaxis; también 
podría incluirse dentro del grupo a las Bunias orientalis (Fuentes y col 2014). La rúcula es 
una planta anual alógama (2n = 2x = 22) que incluye a Diplotaxis tenuifolia (n=11), Diplotaxis 
muralis (n=10+11), Diplotaxis viminea (n=10) y Eruca spp. (n=11) (incluye E. vesicaria, E. 
sativa, E.longirostris y E. pinnatifida). 
La región del Mediterráneo y Asia occidental son acreditadas como centros de origen 
y domesticación de la rúcula. Estas se pueden encontrar de forma silvestre, aunque de 
todas las especies la que ocupa un área geográfica más amplia en el mundo es la Eruca 
sativa (Padulosi, 1994). 
 
Figura 2. Fotografías, a la izquierda rúcula selvática y a la derecha rúcula común 
 
 
 
 
 
 
 
 
La rúcula es un vegetal ampliamente conocido. Esta denominación proviene del latín 
“uro” que significa “quemo”, debido al sabor pungente que presenta. Tiene mucha 
importancia como cultivo de hoja en diferentes países mediterráneos, entre los que se 
encuentran España, Italia, Grecia, Turquía, Egipto y Sudán (Pimpini y Enzo, 1997). En 
Argentina fue introducida en la región pampeana como planta melífera, pero se difundió 
haciéndose una de las especies invasoras más abundantes (Fernández, 2009). En concreto, 
en Buenos Aires es producida y comercializada como hortaliza de hoja por varias empresas 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
7 
desde hace algunos años, como Finca Pilar, Sueño Verde, Song y Buy Eat, constituyéndose 
como un producto gourmet. Se ha asilvestrado también en América del Norte, sur de África 
y Australia. En India, China y Pakistán es cultivada por el aceite de sus semillas (Sun-Ju y 
Gensho, 2006). En el resto del mundo, el órgano de consumo lo constituyen las hojas y tallos 
jóvenes, que se ingieren crudos en ensaladas (Stephens, 2006). Además, es considerada 
como planta medicinal y puede ser empleada en el control biológico de plagas (D’Antuono y 
col., 2009). Así como otras crucíferas, contiene fitoquímicos promotores de la salud, 
incluidos los carotenoides, vitamina C, fibra, flavonoides y glucosinolatos (Bell y col.-2014). 
 
I.4. Fitoquímicos presentes en Crucíferas 
Dado que el término "fito" de la palabra fitoquímicos deriva de la palabra griega 
φυτόν (fito) que significa planta o vegetal, los fitoquímicos son sustancias químicas 
presentes en las plantas. Se definen como compuestos bioactivos de origen vegetal que se 
encuentran en frutas, verduras, granos y otros alimentos vegetales y que han sido 
vinculados a la reducción del riesgo de las principales enfermedades crónicas. Se estima que 
más de 5000 sustancias fitoquímicas individuales han sido identificadas, pero un gran 
porcentaje todavía sigue siendo desconocido y necesita ser identificado a fin de comprender 
cabalmente los beneficios que los mismos aportan para la salud. Presentan estructuras 
químicas diversas, entre las cuales podemos citar los carotenos, polifenoles, alcaloides, 
compuestos nitrogenados y organosulfurados (Liu, 2004). 
El contenido nutricional de las crucíferas es variable y depende de las condiciones 
ambientales donde se desarrolla, las estaciones del año en la que se desarrolla, la edad de la 
misma, el tiempo en que se cosecha (primera o segunda cosecha), las propiedades del 
cultivo, y el método de conservación, procesamiento y preparación. Por lo general, las 
partes verdes de las crucíferas poseen un bajo contenido de agua, como también un bajo 
contenido de ácidos grasos y carbohidratos; esto lo convierte en productos de bajo nivel 
calórico. También son una buena fuente de minerales, vitamina C y aminoácidos. Además, 
contienen un gran número de nutrientes y fitoquímicos a los que se les atribuye un potente 
efecto antioxidante, los cuales se describen a continuación (Juge y col., 2007; Azarenko y 
col., 2014). 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
8 
I.4.1. Glucosinolatos. 
Estos vegetales son la fuente principal de los glucosinolatos (GSL), también llamados 
tioglicósidos. Estos metabolitos secundarios, sintetizados por las plantas como defensa ante 
la depredación, son aniones solubles en agua, responsables del sabor y aroma característico 
de las crucíferas (Villatoro Pulido, 2011). Están formados por un grupo β-tioglucósido, una 
oxima sulfonada y una cadena lateral variable (R) derivada de un aminoácido (alanina, 
valina, leucina, fenilalanina, tirosina, entre otros) (figura 3). 
 
Figura 3. Estructura general de los glucosinolatos 
 
 
 
 
 
La estructura química variable de la cadena lateral es la que determina la existencia 
de más de 120 glucosinolatos. Hay especies de crucíferas que presentan solo un GSL en su 
composición, mientras que otras poseen más de 30 diferentes, siendo una característica 
propia de cada especie y de cada tejido de la planta (raíz, tallo, hojas y semillas). Se 
clasifican en base a tres estructuras de diferente precursor de aminoácidos: glucosinolatos 
alifáticos, glucosinolatos indólicos, y glucosinolatos aromáticos. Estos tres subtipos de GSLs 
tienen sus correspondientes precursores: así los GSLs alifáticos son derivados de alanina, 
leucina, isoleucina, valina, y metionina; los GSLs indólicos son derivados de triptófano y los 
GSLs aromáticos son derivados de la fenilalanina o tirosina (Ishida y col., 2014). 
La composición y el contenido de glucosinolatos se ven influenciados por el 
genotipo, las condiciones del clima y del cultivo, incluyendo la fertilización y tiempo de 
cosecha (Ishida y col., 2014 y Verkerk y col., 2009). 
 
 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
9 
Figura 4. Ejemplos de glucosinolatos que se encuentran en las crucíferas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tomado de Ishida y col. 2014 
 
Los glucosinolatos se encuentran en el líquido intersticial celular, son sintetizados en 
la planta como precursores inactivos, que cuando éstas se rompen por efectos de la 
cosecha, cocción, congelamiento, y masticación del vegetal se ponen en contacto con 
tioglucosidasas glucohidrolasas (mirosinasas) que se encuentran en los idioblastos. Estas 
enzimas hidrolizan los glucosinolatos produciendo productos como isotiocianatos (ITCs), 
nitrilos, tiocianatos, epitionitrilos y oxazolidinas. La proporción y el tipo de estos productos 
de hidrólisis dependen de la especie vegetal estudiada, el pH, temperatura, iones metálicos 
y la presencia de proteínas epitioespecíficas (Bones y Rossiter, 2006). Sobre este aspecto, se 
sabe que la proteína epitioespecífica (ESP) es un cofactor de la mirosinasa, y su presencia 
condiciona los productos de hidrólisis generados (epitionitrilo o nitrilo)(Matusheski y col., 
2006). Por otro lado, la temperatura de cocción también es un factor condicionante. Una 
cocción de esta crucífera a bajas temperaturas, desnaturaliza a la proteína ESP y conserva a 
la mirosinasa, por lo que el producto de hidrólisis será ITCs. Y aunque una cocción a 
temperatura elevada desnaturaliza a la mirosinasa, los glucosinolatos intactos ingeridos 
también pueden ser convertidos en ITCs por la mirosinasa presente en el colon, gracias a la 
actividad de la tioglucosidasas de la flora intestinal (Juge y col., 2007). 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click on image to zoom&p=PMC3&id=40311
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10 
Diversos estudios epidemiológicos indican una asociación inversa entre una dieta 
con alto contenido de crucíferas y el riesgo a padecer diversos tipos de cáncer (Abdull Razis 
y Noor, 2013). En general se cree que la actividad quimiopreventiva de las crucíferas es 
exclusivamente el resultado de la exposición a productos de degradación de glucosinolatos, 
tales como ITCs e índoles. Sin embargo, algunos autores consideran a los glucosinolatos 
intactos como partícipes de este efecto beneficioso de las crucíferas (Abdull Razis y Noor, 
2013) 
 
Figura 5. Hidrólisis de los glucosinolatos. 
 
 
Tomado de Bell y Wagstaff, 2014. 
 
Hasta la fecha en la literatura se han publicado diferentes estudios sobre el 
contenido en glucosinolatos de Eruca y Diplotaxis, los cuales se han centrado 
principalmente en el contenido de glucosativina, glucorrafanina y glucoerucina (Sun-Ju y 
Gensho, 2006; Bennett y col., 2007; Villatoro Pulido y col., 2013; y Bell y col., 2015). 
 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
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I.4.2. Isotiocianatos 
Los isotiocianatos (ITCs) son un grupo funcional –N=C=S, que confiere sabor amargo, 
amostazado y picante, tanto en las semillas como las partes verdes de las crucíferas 
(Mandiki y col., 2000). Se especula que los ITCs, son los responsables de los efectos 
protectores de las crucíferas (Traka y col., 2010; Abdull Razis; y Noor 2013). Como ya se 
mencionó anteriormente, los ITCs son productos de hidrólisis de los glucosinolatos, por 
efecto de la β tioglucosidasa. Estos ITCs son absorbidos en forma pasiva por las células 
epiteliales del tracto gastrointestinal donde son rápidamente conjugados con glutatión. Las 
moléculas conjugadas son enviadas a circulación sistémica posiblemente a través de un 
transportador de la familia ABC (Casanova, 2014). 
En general, los ITCs más estudiados son el 1-ITC-4-(metilsulfinil)-butano o 
sulforafano (SF), el 4-(metiltio) butil ITC o erucina (ER) y el 3-metilsulfinilpropil-ITC o iberina 
(IB) (Jadhav y col., 2007), los cuales provienen de la hidrólisis de la glucorafanina, 
glucoerucina y glucoiberina, respectivamente. En otros trabajos también se hace mención 
que la erucina, puede obtenerse a través de la reducción in vivo del sulforafano (Melchini y 
col., 2009). 
Numerosos estudios demuestran que los ITCs serían los responsables del efecto 
protector de las crucíferas a través de diferentes mecanismos. Por ejemplo, el ITCs 
sulforafano (SF) ejercería su acción anticarcinogénica por arresto del ciclo celular en 
diferentes etapas de su progresión, a partir de la regulación de la inhibición de CDKs, así 
como la disrupción de microtúbulos y modificación de histonas (Juge y col., 2007). Por otro 
lado, se ha reportado que afectaría la proliferación de células de cáncer de próstata 
mediante la inhibición de histonas desacetilasas, las cuales están sobre-reguladas en este 
tipo de cáncer (Gibbs y col., 2009). 
Otro ITCs, la erucina (ER), presenta actividad antigenotóxica en células de hepatoma 
humano (HepG2) (Lamy y col., 2008). Asimismo, en otros estudios se ha observado que 
inhibe la proliferación de células de cáncer de mama MCF7 (Michigan Cancer Foundation-7), 
conjuntamente con la detención del ciclo celular en mitosis e inducción de apoptosis. Estos 
efectos estarían asociados a una disfunción en la dinámica de los microtúbulos, por lo que 
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12 
se verían afectadas funciones celulares importantes como la mitosis, la migración celular y 
el transporte a través de estas estructuras celulares (Azarenko y col., 2014). 
Respecto a otro ITC, la Iberina (IB), un sulfóxido análogo del SF, estudios realizados 
por Jadhav y col. (2007) indican que este compuesto ejercería una inhibición del crecimiento 
e induciría a la apoptosis en células de glioblastoma humano, mientras que en células de 
neuroblastoma se observa que induce el arresto del ciclo celular, efecto asociado a la 
inhibición de expresión de las proteínas kinasas dependientes de ciclinas Cdk2, Cdk4, y Cdk6 
(Jadhav y col., 2007). 
 
I.4.3. Compuestos fenólicos 
En las crucíferas también se encuentran compuestos fenólicos. Estos compuestos 
son sintetizados en las plantas como respuesta a las presiones ecológicas y fisiológicas de 
los patógenos, como por ejemplo el ataque de insectos, la radiación UV entre otros. La 
característica estructural básica de los compuestos fenólicos es un anillo aromático que 
lleva uno o más grupos hidroxilo, y según en el número de unidades de fenol en su molécula 
se clasifican como fenoles simples o polifenoles. Por lo tanto, los fenoles de las plantas 
comprenden fenoles simples, cumarinas, ligninas, lignanos, taninos condensados e 
hidrolizables, ácidos fenólicos y flavonoides (Khoddami y col., 2013). Se ha reportado en la 
literatura que algunos de ellos han mostrado propiedades saludables (Prasain y col., 2010); 
ejemplo de ello son los polifenoles los cuales pueden actuar como antioxidantes in vivo 
(Halliwell, 2008). 
Los flavonoides, importantes metabolitos secundarios, son los polifenoles más 
comunes de la dieta humana y presentan un amplio espectro de actividades biológicas, 
incluyendo antioxidantes y anticancerígenas. Los flavonoides químicamente, presentan una 
estructura general de un esqueleto básico de 15 carbonos, que constan de dos anillos 
fenilos y un anillo heterocíclico (C6-C3-C6). Ellos se subdividen en muchos otros grupos 
incluyendo flavonas, flavonoles, flavanonas, e isoflavanonas. En las plantas son muy 
importantes en la protección contra el daño oxidativo. 
Recientes investigaciones sugieren que en humanos, estos polifenoles aportan 
beneficios importantes para la salud vinculados a la salud del cerebro y del sistema 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
13 
inmunológico, como así también frente al síndrome metabólico y cáncer (Prasain y col., 
2010). En este sentido, es evidente que estos componentes de los alimentos serían capaces 
de modular una variedad de eventos biológicos asociados con la progresión y el desarrollo 
del cáncer, tales como la proliferación celular, apoptosis, diferenciación celular y 
neovascularización (Kandaswami y col., 2005; y Maggioni y col., 2014). 
Distintos estudios presentes en la literatura permiten establecer el perfil de 
flavonoides presentes en Eruca sativa y Diplotaxis tenuifolia siendo mayoritaria la presencia 
de kaempferol-3-glucósido, kaempferol-3,4- diglucósido e Isorhamnetina- 3,4-diglucósido, a 
la vez que se encuentran en menor medida quercetina-3,3,4- triglucósido, quercetina-3- 
glucósido y myricetina (Bell y col., 2015; Villatoro-Pulido y col., 2013; y Pasini y col., 2012). 
 
I.4.4. Carotenoides 
Siendo abundantes en frutas y vegetales, los carotenoides son una de las clases más 
importantes de pigmentos vegetales (Edge y col., 1997). Se les atribuye dos funciones clave 
en plantas y algas: absorben energía de la luz para su uso en la fotosíntesis, y protegen la 
clorofila del daño solar (Armstrong y col., 1996). 
Los carotenoides son el grupo más representativo de los tetraterpenos, compuestos 
que se caracterizan por unaestructura con 40 átomos de carbono que forman una cadena 
que constituye la “espina dorsal” de la molécula, aunque no todos los carotenoides se 
ajustan estrictamente a esta regla. Estos átomos de carbono se encuentran ordenados 
formando cadenas poliénicas conjugadas, pudiendo presentar estructuras cíclicas (anillos) 
en los extremos, algunas de los cuales se complementan con grupos funcionales que 
contienen oxígeno. Los carotenoides se pueden dividir en dos clases; los que son derivados 
oxigenados de estos hidrocarburos se conocen como xantofilas (luteína, violaxantina, 
zeaxantina), mientras los que contienen exclusivamente carbono e hidrógeno en su 
estructura se conocen como carotenos (Rodríguez-Bernaldo de Quirós y Costa, 2006). 
Los carotenoides han mostrado actividad como antioxidantes biológicos, 
protegiendo las células y los tejidos de los efectos perjudiciales de radicales libres y del 
oxígeno singulete. Su actividad antioxidante depende de la concentración y localización en 
las células diana, así como de otros factores (Van den Berg y col., 2000). 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
14 
En la literatura se ha reportado sobre la concentración de carotenoides en Eruca. Se 
observó que los principales carotenoides encontrados del grupo de las xantofilas son 
luteína, zeaxanthina, violaxanthina y neoxantina, y mientras que del grupo de carotenos el  
caroteno (Villatori-Pulido y col., 2013). 
 
I.4.5. Los minerales 
Los minerales son elementos imprescindibles para la nutrición humana que apoyan 
los procesos biológicos durante las diferentes etapas de crecimiento y desarrollo. Los 
humanos requerimos más de 22 elementos minerales para cubrir nuestras necesidades 
fisiológicas alimentarias. Los elementos que son requeridos en cantidades elevadas son el 
Calcio (Ca) y el Fósforo (P) y hay otros que son requeridos en pequeñas cantidades como el 
Hierro (Fe), Zinc (Zn) y Cobre (Cu) (Welch y Graham, 2004; White y Broadley, 2005). 
A pesar de ser éstos los nutrientes esenciales requeridos en menor cantidad en la 
dieta humana actual, se observa que existen deficiencias de dichos elementos. Así se estima 
que de 6 billones de personas, entre el 60-80% son deficientes en Fe, más del 30 % son 
deficientes en Zn, y más del 15% son deficientes en Ca, Mg y Cu (White y Broadley, 2005). 
Las Crucíferas son fuente de los principales elementos minerales esenciales para el ser 
humano. Así lo han demostrado en estudios realizados de hojas en especies de Brassica, 
como Brassica juncea (Elles y col., 2000) y Brassica oleracea var. capitata (Glew y col., 2005), 
los cuáles indicaron su potencial uso como suplementos nutricionales de minerales 
concentrados en forma de cápsulas o tabletas (Villatoro-Pulido, 2011). 
En el caso particular de la rúcula, estudios realizados por Kawashima y Valente-
Soares (2003), así como Cavarianni y colaboradores (2008), indican que las hojas de esta 
especie poseen concentraciones significativas de los minerales principales. En este sentido 
Barlas y colaboradores (2011) analizaron el contenido mineral de la Eruca, reportando 
principalmente K, Na, Fe, Mn, Cu y Zn. Sin embargo otro estudio reveló principalmente la 
presencia de Fe, Na, K, Mn, Ca, y Mg (Villatoro y col., 2012). 
 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
15 
I.5. Genética toxicológica 
La genética toxicológica surge de la integración de una rama de la genética y una 
especialidad de la toxicología que participan en la identificación y el análisis de la actividad 
de agentes sobre el material hereditario de los organismos vivos. Se ocupa esencialmente 
en identificar y analizar el efecto mutagénico de los agentes químicos, físicos y/o biológicos, 
así como las consecuencias sobre los ecosistemas, el ambiente y los seres vivos. También 
provee información precisa de exposición y asesoramiento de riesgo de agentes 
xenobióticos para una efectiva protección de la salud humana (Carballo, 2006). 
Como ya es bien conocido, el daño genético puede tener efectos graves en la salud 
humana, incluyendo un amplio rango de enfermedades hereditarias, cáncer, anomalías 
congénitas y también asociado a procesos de senescencia en general. El rol que juega la 
genética toxicológica es muy importante ya que nos permite conocer los mecanismos por 
los cuales se producen el daño genético y la protección contra éste, y por lo tanto llegar a 
establecer una adecuada relación riesgo- beneficio del agente en estudio. 
Los estudios en genética toxicológica se orientan fundamentalmente a la 
implementación de métodos para ensayos y evaluación de riesgo, definiendo la relación de 
los agentes genotóxicos (lesión inicial inducida sobre el material genético) con la iniciación 
de un proceso neoplásico. Por lo tanto se lograría elucidar el impacto de los agentes 
genotóxicos presentes en el ambiente que alteren la integridad del patrimonio genético. 
Para poner en evidencia a los agentes genotóxicos se diseñan sistemas de ensayos 
que emplean diversos biomarcadores mesurables en sistemas biológicos tales como el ser 
humano. Un biomarcador no es una prueba de diagnóstico, sino un indicador de que se ha 
producido un cambio temprano, que más tarde podría conducir a la enfermedad clínica 
(Grandjean, 1995). Por lo tanto, son elementos intermedios que permiten establecer una 
correlación entre los factores de riesgo y sus posibles efectos. 
Los biomarcadores son utilizados para detectar una exposición, determinar las 
consecuencias biológicas de la exposición, detectar los estados iniciales e intermedios 
de un proceso patológico, identificar a los individuos sensibles de una población y 
fundamentar la decisión de intervenir de forma individual como también ambiental. Por 
lo tanto constituyen una herramienta valiosa para prevenir, diagnosticar y tratar 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
16 
enfermedades basadas en anomalías del genoma (Natarajan, 2002). Los biomarcadores 
usualmente son clasificados en tres tipos: los de exposición, susceptibilidad y efecto. 
Un biomarcador de exposición indica la presencia de un agente xenobiótico o de sus 
metabolitos, o del producto de la interacción de la sustancia con algún blanco que puede 
ser medido en el organismo o después de la excreción del organismo para determinar las 
diferentes características de exposición de este organismo. Por lo general, son evaluados 
por la medición de sus concentraciones en las muestras apropiadas tales como sangre, 
suero u orina (WHO, 1993). Algunos marcadores se unen específicamente a moléculas 
biológicas, como en el caso de aductos de ADN y aductos de hemoglobina, señalando la 
presencia de la sustancia xenobiótica y su interacción con una macromolécula crítica. 
Aunque tales aductos son el resultado de un efecto biológico, suelen considerarse 
biomarcadores de exposición (Perera y col., 1992; Grandjean, 1995). 
Un marcador de la susceptibilidad, ya sea heredada o inducida, es un indicador de 
que el individuo es particularmente sensible a los efectos de un xenobiótico o a los efectos 
de un grupo de los componentes del mismo (Grandjean, 1995). También puede ayudar a 
definir los momentos críticos cuando las exposiciones son más perjudiciales. 
Los individuos con mayor susceptibilidad sufrirán un efecto tóxico con exposiciones 
menores que la población general, incrementando el riesgo de sufrir procesos patológicos. 
La hipersusceptibilidad es un fenómeno epidemiológico muy conocido que puede ser 
debido a factores hereditarios (polimorfismos genéticos de numerosas enzimas que 
metabolizan compuestos extraños), constitucionales (el sexo y la edad son factores 
determinantes a las respuestas a la exposición química), y factores ambientales (dieta y el 
estilo de vida) (Grandjean, 1992). 
Un marcador de efecto es un indicador de alteración bioquímica, fisiológica o 
genética, resultadode la exposición a un agente xenobiótico, que dependiendo de la 
magnitud puede ser reconocido e indica un potencial deterioro de la salud o una posible 
enfermedad (NRC, 1987). 
Tales marcadores de efectos generalmente son indicadores preclínicos de 
anormalidades. Estos biomarcadores pueden ser específicos o inespecíficos. Los 
biomarcadores específicos son útiles porque indican un efecto biológico de una exposición 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
17 
particular, proporcionando así evidencia de que potencialmente se puede utilizar para fines 
preventivos. Los biomarcadores inespecíficos proveen evidencias de un efecto integral que 
puede ser debido a exposiciones múltiples (Grandjean, 1995). De este modo se logra la 
identificación de una alteración cuando su magnitud es aún menor, es decir una advertencia 
temprana de intoxicación, permitiendo determinar si un grupo de signos o síntomas 
conducen a un proceso patológico temprano, para así intervenir prudente y 
oportunamente, y por lo tanto evitar la aparición de un daño irreversible. 
Un marcador de efecto biológico temprano es aquel marcador que nos permite 
detectar un nivel de daño que todavía es reversible (Bonassi y Au, 2002) y representa un 
evento que puede correlacionarse con el daño de la salud y tiene una posibilidad predictiva, 
mientras que un marcador alteración estructural y/o funcional se origina con cambios 
biológicos más estrechamente relacionados con el desarrollo de la enfermedad. Los 
marcadores de efecto temprano que caracterizan el daño genético, tienen relevancia 
particular dentro de la epidemiologia ya que permiten establecer el riesgo potencial de una 
exposición. 
Con la vigilancia integrada de la exposición, los biomarcadores de efecto temprano y 
los biomarcadores genéticos, se puede reflejar el riesgo de susceptibilidad y la salud del 
individuo (Bonefeld-Jørgensen y col., 2014). 
A partir del uso de una batería de ensayos donde se combinen las metodologías 
citogenéticas, moleculares y bioquímicas es posible la caracterización más estricta del daño 
inducido, detectar cambios o alteraciones que servirían como señal de alarma en procesos 
oncogénicos y la progresión a estos procesos. Entonces para evaluar y caracterizar el 
alcance del efecto adverso se realizan estudios de genotoxicidad utilizando determinaciones 
tales como aberraciones cromosómicas, intercambio de cromátides hermanas, formación 
de micronúcleos (MNs), electroforesis de una sola cadena (ensayo cometa), entre otras. 
Para evaluar el daño celular se emplean marcadores tempranos como la cinética de 
proliferación celular y el índice mitótico, considerados como marcadores de citostaticidad y 
citotoxicidad respectivamente (Rojas y col., 1993). 
A continuación se describirán los biomarcadores usados en este trabajo de tesis. 
 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
18 
I.6. Test de micronúcleos 
Como fue mencionado previamente, para evaluar potencial genotóxico son 
ampliamente utilizados diferentes ensayos de corto plazo (ECP). Entre ellos la 
determinación de actividad genotóxica de diferentes sustancias físicas, químicas o biológicas 
que provocan retraso mitótico, roturas cromosómicas, pérdida cromosómica y/o apoptosis, 
puede realizarse mediante el test de micronúcleos (MNs). 
Un MN es literalmente un núcleo pequeño. Como ya es bien conocido, el núcleo es 
la organela portadora del material genético y al entrar en división celular este material 
genético debe experimentar su replicación, para luego dividirse de manera equitativa y 
equilibrada en los dos núcleos de cada célula hija respectivamente. Si este proceso es 
interrumpido o los cromosomas son el blanco del ataque de agentes físicos, químicos o 
biológicos, puede suceder alguna ruptura cromosómica o que un cromosoma quede 
rezagado, y de este modo se dificulte su inclusión en los núcleos de las células resultantes. 
Cuando esto ocurre, el material genético que no se incorpora al nuevo núcleo sería 
recubierto por la membrana nuclear al igual que un núcleo, y debido a que presenta la 
misma condensación cromatínica que el núcleo principal con un tamaño considerablemente 
menor es que el mismo se denomina MN (Schmid, 1975). Los MN se pueden reconocer 
utilizando un microscopio óptico por su tamaño, forma, coloración y por estar cerca del 
núcleo principal. 
Sabemos que los MN se forman durante la transición de metafase a anafase en la 
mitosis, y pueden estar constituidos por cromosomas rezagados o por fragmentos 
acéntricos que se alejan del cromosoma de origen después de la ruptura del mismo. Por lo 
tanto, el test de MNs es un biomarcador de efecto que permite censar inequívocamente 
daños producidos por agentes aneunógenos y/o clastógenos respectivamente. 
 
I.6.1. Antecedentes 
Los MNs fueron descritos hace más de un siglo por W. H. Howell en 1891, y J. Jolly en 
1907. Estas estructuras fueron nombradas por Howell como “fragmento de materia 
nuclear” y por Jolly “corpúsculos intralobulares”, hoy conocidas por los hematólogos como 
cuerpos de Howell-Jolly. Posteriormente Discombe en 1948 observó que estos cuerpos de 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
19 
Howell-Jolly se presentaban frecuentemente desde cromosomas retrasados durante la 
telofase. Similares estructuras fueron descritas en otros tipos de células como en embriones 
de ratón y ratas por Brenneke (1937), o en Vicia faba por Thoday (1952) y los llamaron 
“fragmento nucleico” y “micronúcleo” respectivamente (Müller y Streffer, 1994). 
El ensayo de MN fue usado por primera vez en experimentos de radiaciones in vivo 
en raíces de Vicia faba para cuantificación de daño cromosómico por Evans y col. en 1959. 
Posteriormente se dio el paso decisivo como ensayo de MNs para la evaluación de agentes 
potencialmente genotóxicos con el trabajo de Boller y Schmid en 1970 en el cual emplea 
estudios in vivo en médula ósea de ratón y sugieren el nombre de test de MNs. 
En 1976 Countryman y Heddle introducen cultivos de linfocitos humanos como 
ensayo para detección de daño cromosómico con la determinación de la producción de 
MNs. Aunque esta metodología no podía ser aplicada eficientemente porque los MNs 
requieren de división celular, y no se lograba reconocer a células que habían cursado una 
sola división de aquellas células que habían tenido más de una división mitótica, esto fue 
resuelto por Feneche y Morley en 1985 bloqueando la citocinesis con citocalasina B. 
Los primeros trabajos publicados empleando el ensayo de MN para biomonitoreo de 
genotoxicidad en humanos se deben a Stich y col. (1982), cuando utilizó células exfoliadas 
de mucosa bucal, si bien postularon que el ensayo podía aplicarse en cualquier otro tejido 
que permitiera exfoliar las células (mucosa nasal, vejiga urinaria o cérvix), ya que los MN en 
células exfoliadas aparecen en las mitosis de la capa basal del epitelio (Majer y col., 2001). 
En la década del 80 se difundieron científicamente monitoreos de trabajadores expuestos a 
mezclas complejas de solventes orgánicos en el caso de la industria de las pinturas, también 
casos que ilustraban propiedades potencialmente mutagénicas de metales pesados, 
clorofenoles o ácidos donde la genotoxicidad se observaba por la formación de MN como 
efecto de daño en el aparato mitótico o por roturas cromosómicas detectables en linfocitos 
y en células de mucosa oral (Mudry y Abrevaya, 2006). 
En el año 1997 se divulgaron las guías para la evaluación de químicos mediante el 
ensayo de MN en eritrocitos y en médula ósea de mamíferos (OECD, 1997) que, un año más 
tarde la EPA publicaría como OPPTS 870.5395 en el caso de eritrocitos de mamífero, 
estableciendo detalladamente: su aplicabilidad; el origen del material para realizar la 
evaluación de daño; el propósito de este tipo de ensayo; un glosario que permitiría 
Iván Ayllón ActividadBiológica Y Protectora De La Rúcula 
20 
homogenizar los criterios de reconocimiento de las aberraciones estructurales y numéricas 
que el ensayo lleva a evaluar; los principios del método que contempla este ensayo; la 
descripción, preparación y selección de las especies animales así como las condiciones de 
alimentación y mantenimiento de las mismas para darle validez universal a los hallazgos 
realizables con este ensayo; la preparación de las dosis de prueba, los niveles de las mismas 
y la administración, los tipos de controles a emplear; el procedimiento, número y sexo de 
los animales a utilizar; el diseño experimental y los límites de este ensayo (Mudry y 
Abrevaya, 2006). 
En ambos documentos se considera que la formación de MN es inducida por 
sustancias que rompen los cromosomas (clastógenos) como por agentes que afectan el 
aparato mitótico (aneunógenos). Ante esto, diferentes autores pusieron en evidencia que 
no habría diferencias significativas entre las frecuencias de MN de individuos expuestos a 
clastógenos por un período breve de tiempo o por varios años, por lo cual la cinética de 
formación y duración de los MN causados por exposiciones agudas y crónicas a genotóxicos, 
así como los mecanismos de exfoliación celular de tejidos epiteliales, requerirían de un 
estudio particular (Mudry y Abrevaya, 2006). 
Así mismo en 1997 se establece un programa colaborativo a nivel internacional 
destinado a estudiar la frecuencia de MNs en poblaciones humanas HUMN (del inglés: 
HUman MicroNucleus) a partir de linfocitos de sangre periférica y en 2007 HUMNxL (Human 
MN assay in exfoliated cells) empleando células de descamación. En dichos programas se ha 
trabajado en la validación y estandarización de los procedimientos, así como también el 
establecimiento de pautas para el recuento de los MNs y otras anomalías nucleares. Este 
emprendimiento facilitó la adopción de esta metodología como herramienta valiosa en la 
investigación de patologías relacionadas al daño sobre el genoma humano (Fenech y col., 
2011). La evidencia experimental que existe hasta el momento sugiere que la frecuencia de 
MNs en linfocitos de sangre periférica sería indicador de la probabilidad de padecer cáncer a 
largo plazo (Bonassi y col., 2011). 
 En 1986 Vig y Swearngin demostraron que los centrómeros en los MN podían ser 
inmunológicamente detectados empleando anticuerpos específicos anti-cinetocoro 
obtenidos a partir del suero de pacientes CREST (de las siglas en inglés, calcinosis, 
Fenómeno de Raynaud, Dismotilidad Esofágica, Esclerodactilia y Telangiectasia). Cabe 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
21 
mencionar que con este ensayo puede haber falsos negativos, ya que, si el posible 
mutágeno induce cromosomas rezagados por inhibición o inactivación de formación de las 
proteínas de cinetocoro, con el método de CREST no será detectable. Tal es el caso de la 5-
azacitidina, del diazepam o de la hidroquinona en células LUC2 en cultivo (Lynch y Parry, 
1993). En 1992 Van Hummelen y col. usaron una metodología para estudiar la presencia de 
MN asociados al área de ADN que contienen y la presencia de centrómero, análisis de 
imágenes o por citometría de flujo. 
Asimismo, con esta metodología no solo se pueden evaluar efectos deletéreos sino 
también se emplea para estudiar el impacto de la dieta y estilo de vida sobre el material 
genético (Fenech y Bonassi, 2011). Por lo tanto en estos últimos años también el ensayo de 
MNs viene siendo empleado en estudios sobre los efectos beneficiosos de los fitoquímicos 
para la salud humana. 
 
I.6.2. Ensayo de formación de micronúcleos y modelos experimentales 
Para evaluar el potencial genotóxico, el ensayo de MN puede llevarse a cabo en 
diferentes modelos animales y vegetales, así como en distintas líneas celulares, 
dependiendo del modo de acción del agente en estudio. 
-Modelos vegetales: Mayormente es usado en el monitoreo de contaminantes 
ambientales; así la detección de frecuencias de MN tomó como tipo celular de análisis las 
raíces de Allium cepa y de Vicia faba junto a las células madres del polen de Tradescantia. El 
empleo de modelos vegetales en condiciones ambientales ha sido muy exitoso por su 
sensibilidad elevada y bajo costo, para analizar polutantes ambientales y contaminación de 
suelos. 
-Modelos animales: para el Test MN in vivo se utilizan mamíferos de bioterio o 
salvajes, así como algunos modelos de reptiles, aves y más recientemente en una notable 
diversidad de especies de peces de cuerpos de agua naturales tanto de aguas frías como 
templadas. En el caso de animales en estado natural, el ensayo de MN es empleado para 
monitoreo ambiental como biomarcador en poblaciones expuestas a determinados 
contaminantes, detectando la frecuencia de MN alteradas en organismos centinelas o 
sensores ambientales naturales. En animales de laboratorio se analizó la genotoxicidad de 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
22 
distintos tipos de mutágenos químicos desde antibióticos, herbicidas, metales pesados o 
químicos de uso industrial, incluyendo inhibidores de corrosión y otros con diferentes 
aplicaciones domésticas como componentes de propelentes, fungicidas y antihelmínticos 
(Mudry y Abrevaya, 2006). 
-Modelos in vitro: Cuando se introdujo en el cultivo de linfocitos humanos el método 
de bloqueo de la citocinesis se hizo posible llevar a cabo los estudios de MN en células 
binucleadas de manera notablemente restringida a una única división celular, situación 
óptima para registrar la expresión de los MN. Así el Ensayo de MN se convirtió en una nueva 
herramienta, sumamente eficiente para estudiar tanto la dinámica de ciclo celular como la 
posible clastogenicidad de agentes en el sustrato de sangre periférica. Desde entonces fue 
posible trabajar in vitro utilizando líneas celulares establecidas como CHO (células de ovario 
de hámster chino) o HeLa, además del cultivo de linfocitos de sangre periférica de 
mamíferos a fin de caracterizar este tipo de daño en el genoma (Mudry y Abrevaya, 2006). 
 
I.6.3. El Ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón 
El ensayo de MN en eritrocitos policromatófilos de médula ósea de roedores (rata o 
ratón) es utilizado para determinar los efectos genotóxicos y citotóxicos causados por 
agentes xenobióticos. Es un ensayo in vivo, emplea animales enteros y tiene las ventajas de 
considerar factores como la absorción, distribución y metabolismo de las sustancias 
químicas en evaluación (Sato y Tomita, 2001). Además, otros aspectos atractivos de esta 
prueba son su sencillez y fácil ejecución, siendo entre los ensayos in vivo uno de los ensayos 
más utilizados y ampliamente aceptado por agencias tales como la Organización para la 
Cooperación y el Desarrollo (OECD) y la agencia estadounidense para la Protección del 
Medio Ambiente (EPA), como parte de la batería de ensayos recomendados para establecer 
la validación y/o registro de nuevos productos químicos y farmacéuticos. 
En la maduración de la serie eritroide, el eritroblasto se convierte en policromático o 
eritrocito inmaduro (EPC) al perder el núcleo celular manteniendo el ARN en el citoplasma y 
la basofilia. En ese estadio, la visualización de un posible MN resulta más fácil. Cuando el 
EPC pierde su contenido de ARN se convierte en normocromático o eritrocito maduro (ENC) 
con características acidófilas. Utilizando tinciones sencillas como Giemsa o May Grünwald es 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
23 
posible diferenciar los dos tipos celulares: los EPC se observan de color azul violáceo y los 
ENC de color rojo anaranjado (Figura 6). Por lo tanto, si un agente xenobiótico produce un 
daño en la célula madre tal que genere un MN, éste permanecerá en el citoplasma luego 
que el núcleo haya sido expulsado y será fácilmente observable al microscopio óptico. 
 
Figura 6. Micronúcleosen médula ósea. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
a: eritrocito normocromático, b: eritrocito policromatófilo, c: eritrocito policromatófilo con MN. 
 
La frecuencia de MN de eritrocitos policromatófilos (MNEPCs) es el principal punto 
de análisis para el ensayo de MN. El aumento de la frecuencia MNEPCs es indicador de daño 
cromosómico o daño del aparato mitótico del eritroblasto, así como el incremento de la 
frecuencia de estas células (EPCs) respecto del total (EPC + ENC) es índice de toxicidad 
celular (Índice de Citotoxicidad) (OECD, 1997; Ribeiro y col., 2003). 
 
 
 
 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
24 
I.7.Ensayo Cometa o Electroforesis De Una Sola Célula 
I.7.1. Desarrollo histórico del ensayo 
El ensayo cometa fue descrito como un nuevo método para la detección del daño al 
ADN a mediados de 1980, pero la detección del mismo en células embebidas con agarosa ya 
se había descrito anteriormente. 
En 1976, Cook y colaboradores publicaron un artículo donde se investigaba la 
estructura nuclear basándose en lisis de células con detergentes no iónicos y una alta 
molaridad de cloruro de sodio. Estos investigadores propusieron un modelo en el cual el 
ADN estaba anclado a la matriz, organizado con una serie de lazos. Cuando estos nucleoides 
fueron sometidos a la acción de un agente intercalante (bromuro de etidio), se relajó el 
súper enrollamiento negativo y los lazos de ADN se expandieron fuera del nucleoide, 
lográndose visualizar mediante la formación de halos alrededor de los mismos. 
 En 1978 Rydberg y Johanson describieron un método para el análisis de células 
individuales basado en la lisis alcalina de células previamente irradiadas. Posteriormente 
esta técnica fue adaptada por Rydberg (1984) a la metodología de citometría de flujo 
mediante encapsulación de las células de agarosa antes de la irradiación, seguido de la lisis 
alcalina. 
Posteriormente, en 1984 Östling y Johanson desarrollaron una técnica nueva que 
consistía en la utilización de electroforesis en microgel de agarosa para evaluar el daño del 
ADN a nivel de células aisladas, el cual se conoce como ensayo de cometa. La técnica 
descrita por ellos consistía en embeber células en agarosa en un portaobjetos, lisarlas por 
acción de detergentes y sales, y como consecuencia el material genético es liberado. 
Posteriormente los portaobjetos son sometidos a electroforesis en condiciones de pH 
neutro de modo que en las células en las que se produjo roturas de doble cadena del ADN 
(rdc) se incremente la migración de los fragmentos de ADN hacia el ánodo. La migración del 
ADN se evalúa realizando una coloración con bromuro de etidio (BrEt) y empleando un 
microscopio de fluorescencia. Sin embargo, en este caso el único daño observado eran las 
rupturas de doble cadena, dado de que las uniones nucleotídicas no se alteran a pH neutro, 
siendo un limitante considerable para el ensayo. 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
25 
Finalmente, Singh y colaboradores (1988) modificaron el procedimiento en microgel 
de agarosa utilizando electroforesis en condiciones alcalinas (pH>13), hecho que mejora la 
eficiencia ya que permite detectar no solo rupturas de doble cadena sino también rupturas 
de simple cadena, sitios álcali lábiles, sitios en reparación y enlaces cruzados ADN-ADN y 
ADN- proteínas (cross link), y por lo tanto aumenta la sensibilidad del ensayo para identificar 
agentes genotóxicos. Es en este trabajo en donde se denomina formalmente a la técnica 
como “electroforesis de geles de células individuales” (SCGE del inglés Single Cell Gel 
Electrophoresis), popularmente llamado ensayo cometa por el parecido que tiene la 
migración del ADN después de la coloración a un cometa (Figura 7). Este método ha sido 
recomendado como la versión óptima del ensayo para la identificación de agentes 
potencialmente con actividad genotóxica en el “International Workshop On Genotoxicity 
Test Procedures” (IWGTP) (Tice y col., 2000). 
 
Figura 7. Fotografía del ensayo cometa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Por su parte, Olive (1989) introdujo otra modificación en el ensayo. En él la 
electroforesis del DNA se realiza pH 12,3 y las células son lisadas en un medio débilmente 
alcalino, siendo así esta versión exitosa para detectar subpoblaciones de células con 
diferente sensibilidad a los compuestos genotóxicos o la radiación. 
El ensayo cometa tradicional detecta distintos tipos de daño al ADN; sin embargo 
éstos no son los únicos cambios que puede sufrir la hélice. La oxidación de bases puede ser 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
26 
consecuencia de la exposición a tóxicos ambientales, radiación, disminución de defensas 
antioxidantes, enfermedades degenerativas y alteraciones en el sistema de reparación de 
bases. A fines del siglo pasado, las investigaciones permitieron explicar los efectos de las 
modificaciones químicas en las estructuras de las bases y sus precursores, que son 
probablemente tan importantes como las roturas para la función celular y su supervivencia, 
especialmente bajo condiciones normales de estrés oxidativo endógeno (Klauning y col. 
2010). 
 
Figura 8. Principios generales para un ensayo cometa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Existen enzimas bacterianas de reparación que se han incorporado al protocolo 
estándar del ensayo cometa aumentado su especificidad. Estas enzimas presentan una 
actividad específica frente a un tipo de lesión particular introduciendo una ruptura en la 
hebra en el sitio donde se encuentra la base modificada. Por ejemplo la enzima 
formamidopirimidina glicosilasa (FPG) reconoce a la base modificada 8-oxo-Guanina y a dos 
productos de degradación de purinas; la enzima AlkA reconoce bases alquiladas y la 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
27 
endonucleasa III (Endo III) detecta dímeros de timina, pirimidinas oxidadas, entre ellas 
timina-glicol y uracil-glicol (Collins y col., 1993; Dusinska y Collins, 1996). 
 
I.7.2. La electroforesis de una célula en los estudios de genotoxicidad 
El ensayo de electroforesis de una sola célula ha logrado posicionarse de forma 
privilegiada dentro de las baterías de ensayos utilizadas para evaluar la seguridad de nuevos 
productos farmacéuticos u otros agentes (Hartman y col., 2003). Se han realizado muchos 
estudios en este ámbito utilizando células tanto animales como vegetales, ya que en 
principio, se puede utilizar células de cualquier tejido u organismo. Los tejidos más 
utilizados de animales son: sangre, medula ósea, tejido cerebral, mucosa gastrointestinal, 
hígado, pulmón, riñón, mucosa nasal, piel, bazo, gónadas y gametos. En plantas, se utiliza 
principalmente las células de hojas, tallos y raíces. 
El primer estudio de genotoxicidad que utilizó la electroforesis de una sola célula 
evaluó el potencial mutagénico de agentes generados por el tratamiento del permanganato 
de potasio con soluciones ácidas (De Méo y col., 1991). Desde ese primer estudio hasta la 
actualidad, se ha evaluado numerosos compuestos tales como: metales pesados, pesticidas, 
nitrosaminas, fármacos antineoplásicos, hidrocarburos aromáticos policíclicos, peróxidos, 
etc. 
La gran mayoría de estudios in vivo para evaluar genotoxicidad utilizando el ensayo 
de electroforesis de una sola célula se han llevado a cabo en ratones. Los resultados 
obtenidos aportan información acerca de la distribución del daño en los tejidos. 
En la última década, se ha elevado el creciente interés por el ensayo cometa, y su uso en 
plantas para detectar el efecto genotóxico de los contaminantes y para controlar el medio 
ambiente (Pourrut y col., 2015). 
 
I.7.3. Ensayo cometa en la evaluación de la protección/reparación del daño al ADN 
La electroforesis de una sola célula, puede ser adaptada para investigar los efectos 
benéficos de un xenobiótico dado. La característica oacción de una sustancia para proteger, 
disminuir, reparar o evitar el daño del material genético y celular es denominado 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
28 
antigenotoxicidad. La diferencia entre proteger y reparar dependerá del orden temporal en 
que suceda el daño y la exposición al agente a evaluar (Casanova, 2014). 
 
Figura 9. Representación de los caminos de antigenotoxicidad. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La reparación del ADN es la segunda línea de defensa contra la oxidación del ADN y 
la mayoría de los daños son eliminados antes que la célula entre en el proceso de 
replicación, estado en el que los daños producidos pueden ser fijados como una mutación. 
Es evidente que la capacidad de reparación puede influir en el riesgo de cáncer y en algunas 
enfermedades raras con defectos en los genes que codifican para proteínas de reparación 
como en el caso de Xeroderma pigmentosa que se caracterizan por poseer elevada 
incidencia en el desarrollo del cáncer. El ensayo cometa es uno de los ensayos más 
utilizados para evaluar reparación del ADN en enfermedades crónicas como el cáncer, como 
también para evaluar reparación y protección del ADN por consumo de frutas y vegetales 
(Collins y Horvathova, 2001). 
 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
29 
I.7.4. Ventajas e inconvenientes en el ensayo 
 Un ensayo para la evaluación del daño del ADN debe ser sensible y cuantitativo, nos 
debe proporcionar datos a nivel individual y debe ser aplicable a diversas poblaciones 
celulares. 
El ensayo cometa es un método rápido, sensible y relativamente simple para medir 
el daño del ADN en una amplia variedad de células. Nos permite establecer relaciones dosis-
respuesta a bajas dosis y a bajos niveles de daño. Con respecto a otras técnicas 
genotoxicológicas como el de las aberraciones cromosómicas (CA), intercambio de 
cromátides hermanas (SCE), elución alcalina (AE) y MN, el ensayo cometa es altamente 
sensible es decir, puede detectar entre 50 y 15 000 roturas por célula (Piperakis, 2009). 
Es un sistema potencialmente sensible para evidenciar daño genotóxico inducido y 
reparación del ADN. La capacidad que tiene de detectar daño en células individualizadas y 
que se pueda medir en un gran número de ellas de diferentes tejidos, constituye una de las 
ventajas principales del mismo (Lovell y Omori, 2008). Por lo tanto, estos datos analizados 
de forma individual pueden aportar información sobre la heterogeneidad de una muestra 
(Strauss y col 1994). Entonces el ensayo cometa permite detectar diferencias intercelulares, 
tanto de la respuesta al daño como de su reparación. Además, requiere un bajo número de 
células (<10,000 células) para el análisis. En biomonitorización humana sería muy 
importante, ya que se puede aplicar a células que son el primer sitio de contacto (células de 
mucosa oral y nasal) con sustancias mutagénica/ carcinogénicas (Andem y col., 2013). 
Otra de las ventajas del ensayo es que no necesita de células en proliferación en 
comparación con otras técnicas citogenéticas, también se puede aplicar a diversos tipos 
celulares (in vivo e in vitro) (Collins, 2004; Speit y Hartman, 2005), tanto procariota como 
eucariota, solo se requiere que las células en estudio estén suspendidas y aisladas. También 
se puede realizar con células recién obtenidas (frescas) o con células criopreservadas por un 
largo periodo de tiempo. 
Como ya se comentó, el ensayo es capaz de detectar una amplia variedad de 
lesiones en el ADN como rupturas de doble cadena, rupturas de simple cadena, sitios álcali 
lábiles, sitios en reparación, aductos y enlaces cruzados ADN-ADN y ADN- proteínas (cross 
link). La muerte celular inducida o espontánea también produce diferentes tipos de 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
30 
fragmentación del ADN lo cual puede interferir en el ensayo generando falsos positivos, por 
lo tanto se debe de tomar en cuenta al realizar la técnica. 
Aunque la sensibilidad es una gran ventaja del ensayo, puede tornarse en una 
desventaja, ya que está ligada a su gran variabilidad. Por lo tanto pequeñas variaciones en 
las condiciones utilizadas pueden verse reflejadas en los resultados, es por esta razón que el 
ensayo de electroforesis de una célula no se encuentra validado. Entre las variables que son 
más afectadas en la técnica se encuentran la concentración de agarosa y de soluciones, el 
pH, la duración de cada etapa, el uso de enzimas, procesos de obtención de resultados, el 
observador, etc. 
El ensayo cometa no puede detectar agentes aneunógenos y rupturas de hebra de 
rápida reparación. Esta limitación es importante ya que los efectos aneunógenos pueden ser 
eventos claves en el desarrollo de un proceso carcinogénico (COM, 2000). 
Otra desventaja de la técnica es la introducción de sesgos, por ejemplo el que se 
cuente con una cantidad determinada de células en una área de la muestra aumenta la 
probabilidad de sesgo y por lo tanto, la variabilidad de los observadores (Zúñiga, 2009). Para 
minimizar los sesgos de selección en el recuento y ofrecer una mayor reproductibilidad 
entre usuarios, algunos investigadores recomiendan utilizar el método de muestreo 
aleatorio sistemático (SRS)( McArt y col., 2009). 
Aunque el ensayo presenta una serie de desventajas, ha sido ampliamente valorada 
y adoptada por muchos investigadores, lográndose aplicar en numerosas áreas desde la 
genética toxicológica a la epidemiología molecular en humanos (Dhawan y col., 2009). 
 
I.7.5. Aplicaciones 
Como ya se ha mencionado anteriormente en las ventajas que el ensayo cometa 
posee, éste se puede aplicar a una amplia gama de tipos celulares. Gracias a esta ventaja el 
ensayo cometa ha sido utilizado ampliamente en la toxicología ambiental para lo cual se han 
utilizado un gran número de modelos biológicos, como se esquematiza en la Figura 10. Con 
estos modelos biológicos se pudo evaluar in vivo como in vitro, el daño basal e inducido, 
como también la cinética de reparación del mismo. 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
31 
Figura 10. Diagrama esquematizado de la aplicación del ensayo de electroforesis de una 
célula para la evaluación del daño del DNA, en modelos desde bacterias a humanos 
(adaptada de Dhawan y col 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aire 
Aves 
(Cigϋeña –Ciconia; 
Kite-Milvus) 
Sangre, esperma 
Agua 
Bacteria 
(Escherichia coli) 
In vivo 
Erizo de mar 
(Strongylocentrotus) 
coelomocyte 
Peces marinos 
(flounder-Paralichthys) 
Eritrocitos, branquias, 
hepatocitos 
Mejillones marinos (Mytilus) 
Ostra(Crassostrea) 
Almeja(Mya/Tapes) hemocitos, 
branquias 
Estanque 
Lagos 
Ríos 
Mejillón de agua dulce 
(Dreissena) 
hemocitos, branquias 
Peces 
(pez dorado-Carassius 
carpa-Cyprinus) 
Eritrocitos, branquias, 
hepatocitos 
Anfibios 
(Toad-Bufos; 
Rana-Xenopus) 
eritrocitos 
Suelo 
Alga 
(Chlayidomonas; 
Euglena) In vivo 
Planta de 
humedales 
(Bacopa) Hojas, 
tallos y raices 
Planta 
terrestre 
(Tabacum) 
Hojas y 
núcleo de 
raíz 
Mosca de la fruta 
(Drosophila) 
Intestino, cerebro 
Roedores 
(Ratón, rata) 
Sangre, hígado, 
baso, cerebro, 
medula, esperma, 
Humanos 
Sangre, células 
nasales, bucales, 
esperma. 
Lombriz 
(Eisenia) 
coelornocytes 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
32 
 
 
 
 
 
 
 
 
II OBJETIVOS 
 
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33 
II.1. Hipótesis de trabajo y objetivos 
Todo organismo se encuentra expuesto a xenobióticos naturales y/o antropogénicos 
los cuales pueden ejercer sobre el mismo diversos efectos tanto perjudiciales o como 
benéficos. 
En la actualidad existe un gran interés en el aumento del consumo de alimentos y 
plantas medicinales basado en la posibilidad de disminuir o prevenir el posible impacto 
negativo a nivel celular y genéticoproducido por sustancias ajenas al individuo. La rúcula es 
ampliamente consumida en Europa especialmente en Italia, sur de Francia y Grecia, y 
últimamente se ha vuelto muy popular en América. En los últimos años se ha observado una 
demanda creciente de esta hortaliza, sobre todo en las grandes capitales (Buenos Aires, 
Córdoba y Rosario) y en aquellos lugares donde hay una fuerte presencia de descendientes 
italianos o del Norte de Europa. Las diferencias en la composición de las plantas, que surgen 
del clima, la tierra, el agua y demás condiciones de cultivo y manipulación, justifican el 
estudio de la variedad local empleando distintas metodologías que posibiliten evidenciar su 
capacidad como agente promotor de salud. 
 
II.1.1. Objetivo general 
Este plan de trabajo tiene como objetivo general estudiar las dos rúculas más 
consumidas en Argentina conocidas como rúcula común y rúcula selvática, y desde el área 
de la tóxico-genética evaluar geno-antigenotoxicidad in vivo empleando dos biomarcadores 
de efecto: Ensayo Cometa y Test de MN, en sangre de corazón y en médula ósea de ratón 
respectivamente. 
 
II.2.2 Hipótesis de Trabajo 
Hipótesis 1: La ingesta diaria de ambas especies de rúcula no induce toxicidad y daño al 
material genético. 
Hipótesis 2: El hábito de la ingesta diaria de rúcula podrían proteger contra el daño genético 
inducido por agentes químicos específicos (antigenotoxicidad). 
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34 
Hipótesis 3: Eruca sativa (Eruca vesicaria (L.) Cav.) y Diplotaxis tenuifolia podrían ejercer un 
efecto protector diferente asociado a su composición fitoquímica. 
 
II.2.3. Objetivos Específicos 
a. Estudiar la capacidad de los jugos de rúcula para inducir daño al material genético en 
modelo in vivo mediante el uso de dos biomarcadores de efecto, test del cometa y 
test de MN, en sangre y médula ósea de ratón. 
b. Evaluar la posible capacidad protectora de estos jugos frente al daño inducido por un 
agente alquilante como la ciclofosfamida (CF) utilizado en quimioterapia. 
c. Analizar la composición fitoquímica de Eruca vesicaria y Diplotaxis tenuifolia con el 
objeto de establecer si existe capacidad protectora diferencial. 
 
 
 
 
 
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35 
 
 
 
 
 
 
 
 
III MATERIALES Y MÉTODOS. 
 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
36 
III.1. MATERIALES 
III.1.1. Material vegetal y preparación del jugo de rúcula 
La Rúcula (Eruca y Diplotaxis) se adquirió en una huerta orgánica de la provincia de 
Buenos Aires. Una vez lavado y secado, se pesó el material que sería empleado en la 
preparación del jugo. El vegetal fue triturado utilizando una juguera comercial, siendo el 
producto obtenido centrifugado (14000 r.p.m. - 20 minutos – 4 °C); el sobrenadante fue 
clarificado y esterilizado por filtración (membrana con poro de 0,45 μm y 0,22 μm de 
diámetro, respectivamente). El jugo resultante (3.9g/ml y 3.4g/ml tanto para Eruca y 
Diplotaxis respectivamente) fue fraccionado y se conservó en frío (-20 °C) hasta su 
utilización. Todos los procedimientos descritos fueron realizados en oscuridad para 
preservar el material. 
 
III.1.2. Selección de dosis 
La selección de las dosis del jugo de rúcula evaluada fue siguiendo el criterio de dosis 
límite según figura en las especificaciones de los protocolos guías de los ensayos de 
genotoxicidad (Hartmann y col., 2003; Mac Gregor y col., 1987). El mismo describe que es 
posible administrar hasta 2 gramos/ kilo de peso/ día de una sustancia a estudiar si el 
esquema de tratamiento tiene una duración menor o igual a 14 días. 
En el presente diseño experimental se evaluaron tres dosis: 1, 1,40 y 2 g/kg de peso 
corporal, siendo la tercera y la primera la dosis límite y la mitad de la misma 
respectivamente; por su parte la segunda representaría la ingesta promedio del vegetal, 
considerando absorción completa para un individuo de 70 kg. Cabe destacar que las dosis 
evaluadas podrían ser fácilmente alcanzadas debido a la buena disponibilidad que presenta 
el vegetal. 
 
III.1.3. Material biológico 
Se utilizaron ratones Swiss Webster Albino machos y hembras de 7 - 8 semanas 
provistos por la empresa BIOSERMA y se empleó el bioterio del Instituto de Investigaciones 
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37 
Farmacológicas de la Universidad de Buenos Aires (ININFA). Los ratones estuvieron en jaulas 
de plástico a una temperatura de 18 a 24°C, con 50 a 75 % de humedad, con ciclos de luz - 
oscuridad de 12 por 12 horas y recibieron agua y alimentos en todo el periodo del 
tratamiento. Todos los ensayos fueron realizados de acuerdo con las leyes éticas de 
manipulación animal y de acuerdo a los principios internacionales aceptados con tales 
propósitos. 
 
III.2 MÉTODOS 
III.2.1. Diseño experimental 
En el presente esquema, los ratones fueron divididos en 8 grupos de 8 ejemplares de 
ambos sexos (n=64), dos de los cuales fueron los controles negativo y positivo. 
La vía oral fue elegida como ruta de administración para el jugo de rúcula y la 
solución fisiológica debido a que es la forma de ingreso habitual del vegetal al organismo. 
Además se utilizó la vía intraperitoneal (i.p.) como vía de administración para la solución 
fisiológica y la ciclofosfamida (CF; Sigma Aldrich) ya que ésta no presenta factores 
modificadores del compuesto. 
El tratamiento comprendió 14 días en total durante los cuales los grupos controles 
recibieron solución fisiológica vía sonda gástrica, mientras que a los grupos restantes se les 
administró el jugo acuoso por la misma vía. En el día 15, el grupo control positivo y los 
grupos en los que se determinó actividad antigenotóxica recibieron una dosis única de CF 
(50 mg/kg, vía i.p.), mientras que los otros grupos fueron tratados con solución fisiológica 
con la misma forma de administración. En el día 16 del experimental (24-30 horas después 
del tratamiento intraperitoneal), los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical con 
el fin de extraer sangre del ventrículo derecho cardíaco y los fémures para realizar el ensayo 
cometa y el test de MN en médula ósea respectivamente (Figura 11). 
 
 
 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
38 
Figura 11. Esquema del diseño experimental para la evaluación de geno y 
antigenotoxicidad de la rúcula 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Referencias 
 
 Solución Fisiológica (0.01ml/g de peso del ratón vía gavage) 
 
 Jugo de rúcula 0,01ml/g de peso del ratón (vía gavage). 
1g/kg (3 y 6), 1.4g/kg (4 y 7) y 2g/kg (5 y 8) peso. 
 
 Dislocación cervical. Ensayo Cometa en sangre de corazón y 
Test de Micronúcleo en médula ósea. 
 
 SF: NaCl 0,9%, intraperitoneal (i.p.). 
 
 CF: Ciclofosfamida 50mg/kg i.p. 
Grupo 1: control negativo 
Grupo 2: control positivo 
Grupo 3, 4 y 5: genotoxicidad 
Grupo 6, 7 y 8: antigenotoxicidad 
1 
1 
1 
1 
14 15 .16 
14 15 .16 
14 15 .16 
14 15 .16 
Día 
Iván Ayllón Actividad Biológica Y Protectora De La Rúcula 
39 
III.2.2. Ensayo cometa en sangre periférica 
Se empleó la técnica descripta por Casanova y col. 2012 con modificaciones. 50 μl de 
sangre de ventrículo derecho se resuspendieron en una solución de agarosa de bajo punto 
de fusión al 0,5% a 37 °C. Se colocaron 100 μl de esta suspensión sobre un portaobjeto 
previamente tratado con agarosa regular al 1% (por duplicado). Los geles se almacenaron a 
4 °C hasta su solidificación para luego agregar una capa protectora de agarosa de bajo punto 
de fusión al 0,5%. Posteriormente los portaobjetos fueron sumergidos en una solución de 
lisis (2.5M NaCl, 100mM Na2EDTA, 10mM Trizma, 1% de Triton X-100 y 10% DMSO, pH 10) 
por 2 horas a 4°C y luego fueron colocados en buffer de electroforesis frío (10N NaOH, 
200m Na2EDTA, pH>13) durante 20 minutos