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Universidad pedagogica y tecnologica de Colombia
Facultad de Ciencias Básicas – Escuela de Biología
BIOQUÍMICA
Informe PRESENCIA, PROPIEDADES DE LA ENZIMA CATALASA Y CINÉTICA
ENZIMÁTICA EN ALIMENTOS - BIOQUÍMICA
1. OBJETIVOS
1.1. Poner de manifiesto la presencia de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales.
1.2. Demostrar que las enzimas son proteínas y se pueden desnaturalizar.
1.3. Determinar la cinética enzimática con relación a la concentración de sustrato
MARCO TEÓRICO.
● Catalasa: La catalasa es una enzima antioxidante presente en la mayoría de los
organismos aerobios. Cataliza la dismutación del peróxido de hidrógeno
(H2O2) en agua y oxígeno. La mayoría de estas enzimas son
homotetrámeros con un grupo hemo en cada subunidad. Se ha
determinado la estructura cristalográfica de nueve
catalasas. Algunas catalasas tienen subunidades pequeñas
(masa molecular ≈ 60 kDa) y otras grandes (masa molecular >
80 kDa). Entre estos dos tipos de catalasas existen
diferencias estructurales importantes. Las catalasas
pequeñas son menos resistentes a la desnaturalización, unen
NADPH, tienen hemo b y se inhiben e inactivan por sustrato. En
cambio, las catalasas grandes tienen un dominio extra en el
C-terminal que es semejante a la flavodoxina, son muy
resistentes a la desnaturalización, tienen hemo d, presentan
enlaces covalentes inusuales cercanos al sitio activo y son
resistentes a concentraciones molares de H2O2. (Díaz, 2003)
● Cinética enzimática: Estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.
Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción
catalítica y de la especificidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada
por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es
necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones
óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan
concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción
observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien
midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.
(Universidad Complutense de Madrid, 2010)
● Desnaturalizar: Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las
estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena
polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional
fija. Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente
disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la
desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas
eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno facilitará la
agregación intermolecular y provocará la precipitación. La precipitación suele ser
consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización y se dice entonces que la
proteína se encuentra desnaturalizada. (Universidad del País Vasco/Euskal Herriko
Unibertsitatea, s.f)
● Proteína: Las proteínas son una clase importante de moléculas que se encuentran en
todas las células vivas. Una proteína se compone de una o más cadenas largas de
aminoácidos, cuya secuencia corresponde a la secuencia de ADN del gen que la
codifica. Las proteínas desempeñan gran variedad de funciones en la célula, incluidas
estructurales (citoesqueleto), mecánicas (músculo), bioquímicas (enzimas), y de
señalización celular (hormonas). Las proteínas son también parte esencial de la dieta.
(Lawrence C. Brody, s.f)
● Estructura terciaria: Se llama estructura terciaria a la disposición tridimensional de
todos los átomos que componen la proteína, concepto equiparable al de conformación
absoluta en otras moléculas. La estructura terciaria de una proteína es la responsable
directa de sus propiedades biológicas, ya que la disposición espacial de los distintos
grupos funcionales determina su interacción con los diversos ligandos. Para las
proteínas que constan de una sola cadena polipeptídica (carecen de estructura
cuaternaria), la estructura terciaria es la máxima información estructural que se puede
obtener. (Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea, s.f)
2. INTRODUCCIÓN
La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales.
La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque el metabolismo celular, se
forma una molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada). Esta
enzima, lo descompone en agua y oxígeno, por lo que se soluciona el problema. La reacción
de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente:
2 H2O2 2 H2O + O2
catalasa
No obstante, la existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el
agua oxigenada como desinfectante cuando se agrega sobre una herida. Como muchas de las
bacterias patógenas son anaerobias (no pueden vivir con oxígeno), mueren con el
desprendimiento de oxígeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre el
agua oxigenada.
2.1. Desnaturalización de la catalasa
Mediante esta experiencia, vamos a demostrar que las enzimas son proteínas y por lo tanto
sufren desnaturalización. Ya que la catalasa químicamente es una proteína, podemos
desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perderá
también la función, particularmente su función catalítica, por lo que no podrá descomponer el
agua oxigenada y no se observará ningún tipo de reacción con muestras de tejidos hervidos.
2.2. Cinética enzimática
Asegurando la presencia de enzima, se puede efectuar la cinética de la reacción enzimática
con relación a la concentración del sustrato. Una forma de calcular la velocidad de una
reacción enzimática es determinando la cantidad de sustrato transformado por 1 ml de enzima
en un minuto; esta es una forma de indicar la actividad específica de la enzima en donde
además es posible conocer el comportamiento Micheliano de la reacción y los valores de Km
constante de michelis mendi indica la afinidad que tiene la enzima por el sustrato y Vmax.
3. PRELABORATORIO
a.Cuál es el significado Bioquímico de KMy Vmax?
b. Cuál es la importancia de las enzimas con su participación en las reacciones bioquímicas
de los seres vivos. Explique máximo en 10 renglones
c. En el laboratorio de hoy para que se utiliza ácido sulfúrico, 6N
d. En el laboratorio de hoy para que se utiliza KMnO4
4. MATERIALES Y REACTIVOS
Cantidad de sustrato descompuesto x 1 ml de catalasa en 1 minuto
Agua oxigenada, peróxido de hidrógeno 0.1 M, Permanganato de potasio 0.01 M, ácido
sulfúrico 6 N, almidón, buffer fosfato pH 7.4, trocitos de hígado, tomate y papa.
Gradilla, 3 pipetas, 5 tubos de ensayo, gradilla, estufa, baño de Maria, mortero, espátula,
bureta, agitador de vidrio, centrífuga.
Permanganato de potasio
H272 Puede agravar un incendio; comburente
H302 Nocivo en caso de ingestión
H314 Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves
H361d Se sospecha que daña al feto
H373 Puede provocar daños en los órganos (cerebro) tras exposiciones prolongadas
o repetidas (en caso de inhalación)
H410 Muy tóxico para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos
P220 Mantener alejado de la ropa y otros materiales combustibles
P273 Evitar su liberación al medio ambiente
P280 Llevar guantes/gafas de protección
Estado físico sólido
Forma cristalinas
Color violeta
Olor inodoro
Punto de fusión/punto de congelación >240 °C (descomposición lenta)
Temperatura de descomposición >240 °C (ECHA)
pH (valor) 7 – 9 (en solución acuosa: 20 g/l, 20 °C)
Densidad 2,7 g /cm³ a 20 °C
Peróxido de Hidrógeno
H314-Causa severas quemaduras en piel y daños en los ojos.
H302-Nocivo por ingestión.
H332-Nocivo por inhalación.
H335-Puede irritar las vías respiratorias.
H272-Puede intensificar un incendio; es oxidante.
P271-Usar solamente en exteriores o en áreas bien ventiladas.
P260-Norespire los vapores, niebla o rocío.
P280-Usar guantes de protección/ropa de protección/protección ocular/careta de protección.
P210-Mantenerse lejos de las fuentes de calor/chispas/llamas abiertas/superficies calientes.-
No fumar.
P220-Mantener o almacenar alejado de la ropa o materiales inflamables/combustibles.
P221-Tomar todas las precauciones necesarias posibles para no mezclarse con combustibles
Apariencia: Claro, incoloro
Estado Físico: Líquido
Color: Incoloro
Olor: Inodoro
Olor límite: No aplica
pH: <= 3.0
Punto de fusión/Punto de Congelamiento -52 °C
Punto de ebullición: 114°C
Flash point: No inflamable
Taza de evaporación: > 1 (N-Butil Acetato =1)
Inflamabilidad (sólido, gas) No inflamable
Inflamabilidad límite en aire No aplica
Límite superior de inflamabilidad:
Límite inferior de inflamabilidad:
Presión de vapor: 18 mmHg @ 30°C
Densidad de vapor: Información no disponible
Densidad 1.2 g/cm3 @20°C
Gravedad específica: 1.2
Solubilidad en agua: Completamente Soluble.
ácido sulfúrico 6 N
H290 Puede ser corrosivo para los metales
H314 Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves
P280 Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección.
Estado físico líquido (fluído)
Color incolor
Olor inodoro
Umbral olfativo No existen datos disponibles
pH (valor) <1 (20 °C)
Punto de fusión/punto de congelación -15 °C
Punto inicial de ebullición e intervalo de ebullición 295 – 315 °C
Punto de inflamación no determinado
Tasa de evaporación no existen datos disponibles
Inflamabilidad (sólido, gas) no relevantes (fluído)
Límites de explosividad
Límites de explosividad de nubes de polvo no relevantes
Presión de vapor <0,01 hPa a 20 °C
Densidad 1,81 g/cm³ a 20 °C
buffer fosfato
Forma líquido
Color incoloro
Olor inodoro
Umbral olfativo No aplicable
pH 7,4
Densidad 1,08 g/cm3 a 20 °C
4. RESULTADOS
Demostración de la existencia de la enzima
Coloque en tres tubos de ensayo trocitos de hígado, tomate y papa.
Añada 5 mL. de agua oxigenada en cada tubo.
Se observará un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxígeno
a. Indique el aspecto final en los tubos de ensayo
b. Complete la tabla en la que indique cualitativamente el orden de actividad
Tejido Orden de actividad
Hígado Orden cero
Tomate Primer orden
Papa Primer orden
c. Qué puede concluir respecto del orden de actividad. ¿Explique?
Se puede concluir, por la velocidad y fuerza de la reacción, que la concentración de sustrato
en el hígado es elevada, por consiguiente, tiene un orden de actividad cero. La presencia de
catalasa en el hígado es mayor. Dado que la reacción en el tomate, que fue similar a la de la
papa, fue mucho más lenta que la del hígado podemos concluir que es de primer orden y por
consiguiente su concentración de sustrato es reducida. El tomate y la papa tienen menor
proporción de catalasa que el hígado.
5.2. Desnaturalización de la catalasa
Coloque en tres tubos de ensayo trocitos de hígado, tomate y papa.
Añada agua para hervir las muestras. Hierva durante unos minutos.
Después de este tiempo, retire el agua sobrante.
Añada 5 mL de agua oxigenada en cada tubo.
a. Observe el resultado y dibuje el aspecto de los tubos de ensayo
b. ¿Qué puede concluir respecto de la actividad de la enzima, después de someterla a
temperatura?
En contraste con los resultados que se pudieron observar en el numeral anterior, aquí entran
en juego las propiedades de las enzimas que al ser desnaturalizadas mediante el sometimiento
de las mismas a temperaturas elevadas (al ser hervidas durante un tiempo) las estructuras de
carácter terciario de la enzima catalasa pierden sus prioridades; por lo tanto la reacción no
puede llevarse a cabo como normalmente se llevaría a cabo sin la presencia de tal estructura
terciaria, perdió también su función catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua
oxigenada y no se observará ningún tipo de reacción con muestras de tejidos hervidos; ni la
presencia de burbujas o alguna especie de precipitado.
5.3. Cinética enzimática
Obtención de una solución que contiene la enzima CATALASA.
Triture una porción de hígado (2 gramos) en un mortero hasta obtener una pasta fina.
Añádale 8 ml de solución de buffer fosfato pH= 7,4 y continué moliendo hasta homogeneizar
la pasta.
Diluya la pasta con otros 8 ml de buffer fosfato pH = 7,4
Centrifugue la preparación a 2500 rpm durante 5 minutos
Decante el sobrenadante que contiene a la enzima en un tubo de ensayo e incúbelo por
espacio de 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar los sustratos preexistentes
Actividad y cinética enzimática
Tome en un tubo de ensayo 4 ml de solución de enzima obtenida anteriormente, y hiérvala
durante 5 minutos. Esta será la solución de enzima hervida (rotúlela).
Enumere, seis tubos de ensayo y añádales las siguientes cantidades (en mL.) de los reactivos
indicados:
Tubos
Reactivos
1
mL.
2
mL.
3
mL.
4
mL.
5
mL.
6
mL.
Peroxido de hidrogeno 0,1 M 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 2,5
Agua destilada 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,5
Enzima no hervida 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 -
Enzima hervida - - - - - 1,0
No olvide que es fundamental controlar con mucho cuidado el tiempo de reacción de forma
tal que la enzima actúe en igual cantidad de tiempo en cada tubo, por lo cual no adicione la
enzima hasta no tener preparado y agitado todos los tubos de ensayo.
Añada al tubo N°. 1 la solución de enzima y agite, mida el tiempo.
Transcurridos 30 segundos añada enzima al tubo N°.2 y así sucesivamente hasta completar el
tubo N°. 6
Después de transcurrir 5 minutos de reacción en cada tubo agregue a cada uno 2 mL. de ácido
sulfúrico, 6N (Agite bien). Recuerde que cada tubo debe reaccionar durante 5 minutos.
Terminada la reacción pase el contenido de cada tubo a vasos de precipitados y titule con
permanganato de potasio 0,01 M. El punto final es un color rosa pálido.
a. Indique el aspecto de los tubos:
El permanganato titula el H2O2 que no ha sido descompuesto por la catalasa, y que permanece
en el vaso de precipitados. Tome el dato del volumen de permanganato utilizado para cada
vaso.
La actividad específica de la catalasa es la cantidad de H2O2 descompuesto por 1 ml de
catalasa en un minuto.
Si se tiene en cuenta que en este experimento se utilizó H2O2 0,1 M, el número de m-moles
iniciales será en cada uno de los tubos: 50, 100, 150, 200, 250 y 250, ¿por qué?.
Haga los cálculos para explicar.
Como se dijo previamente al titular con permanganato de potasio se está determinando la
cantidad de H2O2 que no ha sido descompuesto por la catalasa durante los 5 minutos de
reacción, y de acuerdo a la ecuación:
5 H2O2 + 3 H2SO4 + 2 KMnO4 ® 8 H2O + 2MnSO4 + 5 O2 + K2SO4
Peróxido de Ácido Permanganato Agua Sulfato de Oxígeno Sulfato de
Hidrógeno sulfúrico de potasio Manganeso molecular potasio
Por cada 2 moles de permanganato de potasio utilizado se descomponen (titulan) 5 moles de
H2O2, para calcular los micromoles de H2O2 no descompuestos por la enzima, se multiplican
los micromoles de permanganato utilizados en cada caso por 2,5.
Suponga que Vol. (mL) de KMnO4utilizados en la titulación del peróxido para cada tubo:
Tubos 1 2 3 4 5 6
Vol (mL) 0,8 1,8 2,9 4,3 6,2 10
Calcule los micromoles de H2O2no descompuesto utilizados:
m = 8 micromol X 2.5 = 20 micromol no descompuesto
m = 18 micromol X 2.5 = 45 micromol no descompuesto
m = 29 micromol X 2.5 = 72.5 micromol no descompuesto
m = 43 micromol X 2.5 = 107.5 micromol no descompuesto
m = 62 micromol X 2.5 = 155 micromol no descompuesto
m = 100 micromol X 2.5 = 250 micromol no descompuesto
Tubos 1 2 3 4 5 6
(m moles de
H2O2 no
descompuesto)
20 45 72.5 107.5 155 250
Posteriormente se restan los micromoles de H2O2 no descompuestos en cada tubo de los
micromoles de H2O2 presentes al comienzo, se obtienen los micromoles de H2O2
descompuestos por 1,0 ml de enzima durante los 5 minutos. Así, para calcular los micromoles
de H2O2 descompuestos por 1,0 ml de enzima, y por minuto de reacción, se divide por 5. Esta
será entonces lavelocidad de la reacción o actividad específica de la enzima en cada tubo.
Haga cálculos y llene el cuadro siguiente con los datos obtenidos
Tubos
Reactivos
1
mL.
2
mL.
3
mL.
4
mL.
5
mL.
6
mL.
H2O2no descompuesta en 5
minutos
20 45 72.5 107.5 155 250
H2O2 descompuesta por 1,0
ml de enzima en 5 minutos
(m moles)
30 55 75.5 92.5 95 0
Actividad específica de la
catalasa
6 11 15.1 18.5 19 0
Con base en los datos anteriores y en uno de los papeles para gráficos que se adjunta:
a. Haga una representación gráfica de Michaeles y Menten, coloque velocidad de la reacción
en las ordenadas y concentraciones iniciales de sustrato en las abscisas.
b. Calcule en ella Vmax y Km
c. En otro gráfico realice la representación de la reacción de acuerdo a Lineweaver y burk.
Coloque 1/v en ordenadas y 1/[S] en las abscisas.
d. Calcule a partir de ella Vmax. y Km
¿Qué diferencia hay entre calcular Vmax y Km en los dos casos (Michaelis Menten respecto
de Lineweaver y burk)? ¿Cuál método es más exacto, por qué?
R: las diferencias más notables que encuentro además del valor de Km ya que en el gráfico de
michaelis-menten el valor de Km es de 12.5 aproximadamente mientras que en el de
lineweaver y burk es de 0.11 podemos ver la diferencia de escala y también, como en el
gráfico de michaelis-menten el valor de cero es el que termina la gráfica mientras que en la
de lineweaver y burk es el que lo empieza por lo cual la forma es diferente aun así para mí el
grafico más preciso es el de michaelis-menten debido a que la Vmax se expresa de mejor
forma y es mucho más preciso ya que el km también es mas claro.
5.DISCUSIÓN
La relevancia de la catalasa en los alimentos se manifiesta en su capacidad para mantener la
frescura y la calidad de los productos. Esta enzima, presente en una amplia gama de
organismos, desempeña un papel vital al neutralizar el peróxido de hidrógeno, un compuesto
que puede resultar perjudicial para las células. Más allá de su papel biológico, su aplicación
en la conservación alimentaria ha despertado un interés significativo en la ciencia de la
alimentación.
Las propiedades únicas de la catalasa son clave para su efectividad en entornos alimentarios
variables. Su estructura tridimensional específica contiene un sitio activo que facilita la
descomposición del peróxido de hidrógeno en componentes menos dañinos. Además, su
capacidad para resistir condiciones adversas, como cambios de pH y temperaturas extremas,
asegura su estabilidad y funcionalidad en una amplia gama de alimentos, proporcionando así
una herramienta valiosa para la industria alimentaria en la conservación y prolongación de la
vida útil de los productos.
La cinética enzimática de la catalasa en alimentos refleja su comportamiento dinámico y su
sensibilidad a diversos factores ambientales. La velocidad de reacción de esta enzima muestra
una relación directa con la concentración de sustrato, y factores como la temperatura y el pH
influyen significativamente en su actividad enzimática. Esta comprensión de su cinética
enzimática es esencial para su aplicación práctica en la industria alimentaria, ya que permite
ajustar condiciones específicas para maximizar su eficiencia en la conservación de alimentos.
En resumen, la presencia de la enzima catalasa en alimentos va más allá de su función
biológica; sus propiedades excepcionales y su cinética enzimática determinan su papel crucial
en la conservación de alimentos, ofreciendo oportunidades para mejorar la calidad y
durabilidad de los productos alimenticios en diversas condiciones de almacenamiento y
procesamiento.
6. CONCLUSIONES
- La catalasa emerge como una herramienta invaluable en la conservación de alimentos.
Su presencia y estabilidad en diferentes condiciones ambientales la convierten en un
componente crucial para prolongar la vida útil de los productos alimenticios,
manteniendo su frescura y calidad.
- Las propiedades únicas de la catalasa, como su resistencia a cambios extremos de pH
y temperatura, la hacen altamente adaptable a diversos entornos alimentarios. Esta
versatilidad la convierte en una opción prometedora para múltiples aplicaciones en la
industria alimentaria.
- La comprensión de la cinética enzimática de la catalasa es fundamental para su uso
efectivo en la industria alimentaria. Conocer cómo factores como la concentración del
sustrato, la temperatura y el pH influyen en su actividad enzimática permite optimizar
su rendimiento en la conservación de alimentos.
7. BIBLIOGRAFÍA
● Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, ADELAIDA DÍAZ (2003)LA
ESTRUCTURA DE LAS CATALASAS, disponible en línea:
http://www3.uacj.mx/ICB/redcib/Documents/REB_DOC/2003/06/2003-2_LA%2
0ESTRUC_.pdf
● Universidad Complutense de Madrid, Parque Científico de Madrid, Servicio de
Biotransformaciones Digitales (2010) Cinética Enzimática, Disponible en línea:
https://webs.ucm.es/info/btg/personales/jvsgago/fundaments%20de%20biocatali
s3%20%5bModo%20de%20compatibilidad%5d.pdf
● Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea, (s,f) Biomoléculas,
DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS, Disponible en línea:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm
● National Human Genome Research Institute, Lawrence C. Brody, (s.f) Proteína,
Disponible en línea: https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Proteina
● Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea, (s,f) Biomoléculas,
ESTRUCTURA TERCIARIA DE LAS PROTEÍNAS, Disponible en línea:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/proteinas/prot43.htm#top
http://www3.uacj.mx/ICB/redcib/Documents/REB_DOC/2003/06/2003-2_LA%20ESTRUC_.pdf
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