Temas de Microbiologia

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UROCULTIVO
· 
· La finalidad del urocultivo es detectar y cuantificar los microorganismos causantes de infección urinaria (IU).
· Se efectúa para demostrar la presencia significativa de bacterias.
· Es el único cultivo en dónde se cuantifica la cantidad de bacterias presentes en la muestra.
· La presencia de bacterias en la orina (bacteriuria) y la presencia de leucocitos polimorfonucleares en el sedimento urinario (piuria) son factores importantes para el establecimiento del diagnóstico de una infección urinaria.
· También se realiza cuando hay signos o síntomas de insuficiencia renal o hipertensión.
· Debe hacerse siempre en personas en que se sospecha infección general o tenga fiebre de origen desconocido.
· También se recomienda en todas las mujeres en el primer trimestre de embarazo.
· Las vías urinarias normalmente son estériles por encima del nivel de la uretra distal.
· En condiciones normales, la orina dentro del organismo es estéril, pero atraviesa zonas (uretra) que poseen una microbiota bacteriana normal.
En hombres:
· En esta microbiota normal predominan cocos Gram positivos
En mujeres:
· En la microbiota vaginal normal predominan Lactobacillus, Streptococcus spp. Y levaduras
 - Estos microorganismos pueden contaminar la orina, multiplicarse en ella y dar lugar a falsas interpretaciones.
· Los microorganismos que infectan las vías urinarias altas son comensales localizadas en áreas vecinas.
· En esta colonización intervienen varios factores predisponentes que pueden ser de orígenes local o general.
· Los primeros incluyen la contaminación fecal del meato urinario, el cateterismo, la patología urinaria congénita o adquirida y el reflujo vesical.
· Entre los factores están la diabetes mellitus, el embarazo y la terapia con fármacos de amplio espectro.
Las principales bacterias que infectan el sistema urinario son: 
 - Las enterobacterias Gram Negativo
 - Escherichia coli es la bacteria que se aísla con mayor frecuencia en urocultivos positivos.
· Otras enterobacterias causantes de infecciones urinarias por orden de importancia y frecuencia son:
· Klebsiella spp
· Enterobacter spp.
· Pseudomona aeruginosa (no es enterobacteria)
· Proteus spp.
· Citrobacter spp.
· Serratia spp.
Otras bacterias Gram Positivo de menor importancia son:
· Enterococcus spp.
· Staphylococcus aureus
· Streptococcus pyogenes
· 
· Staphylococcus epidermidis
· Staphylococcus saprophyticus
Puede ser contaminación.
Debido a que es necesario distinguir los microorganismos contaminantes de los etiológicamente importantes, se debe de efectuar un examen cuantitativo de orina para que los resultados puedan ser significativos.
Consideraciones generales
· Toma de muestra:
· La toma de muestra de orina es muy importante, pues la veracidad de los resultados depende casi en un 100% de la forma correcta en la cual se recolecta la muestra,
· La muestra ideal es la primera orina de la mañana:
· Más concentrada
· Más representativa
· Se utiliza la orina obtenida por el método de orina al vuelo o al aire, se descartará la primera porción de la micción para evitar la contaminación con los microrganismos de la zona, se recolecta la porción intermedia (chorro medio= en un recipiente estéril)
Consideraciones generales:
Recolección:
· 
· Frascos estériles
· Bolsas colectoras de orina para uso pediátrico
· El personal de la salud debe instruir al usuario o paciente respecto a la técnica adecuada para recolección de la muestra.
· Debe llevarse al laboratorio lo más pronto posible (NO mayor de 2 horas desde su recolección)
· Si no se analiza inmediatamente la muestra se puede refrigerar (4° -8°C) durante 2 horas.
Recepción de muestra:
· Las muestras deben estar correctamente identificadas
 Es importante incluir los siguientes datos en la solicitud o ficha del usuario o paciente:
· Nombre completo
· Edad
· Sexo
· Historia clínica
· Tipo de muestra
Tipos de muestra: 
· Orina
· Sonda Uretral
· Catéter
· Punción suprapúbica
Procedimiento: 
· Color 
· Aspecto (turbidez)
· Olor (Presencia de nitritos, indicativo de tiempo de emisión de la muestra)
Inoculación de la muestra: 
· 
· Agitar la muestra
· Destapar el recipiente cerca del mechero
· Utilizar asa calibrada estéril de 0.001mL
· Flamear y dejar enfriar el asa calibrada
· Introducir el asa en posición vertical por debajo de la superficie
· Colocar la muestra (cantidad de orina en asa calibrada) deslizando el asa una sola vez, en una sola dirección a lo largo del centro de una caja Petri con agar sangre de carnero al 5% (ASC 5%)
· Flamear el asa calibrada, tomar nuevamente muestra de orina 
y colocarla en el centro de una caja Petri con agar MacConkey (MK) u otro agar selectivo (Cled o medios cromógenicos como UTI agar, CHROMagar
· Flamear el asa calibrada y guardarla.
Estriar o dispersar la muestra:
· Con un asa en argolla dispersar la muestra, estriar sobre la primera descarga en forma perpendicular, en forma de zigzag o tapete en toda la caja de ASC 5% y MK
· Flamear el asa entre cada caja
 
Interpretación de Resultados:
· 
· Incubar el agar sangre, MK, Cled o utilizar un medio cromógénico a 36° - 37°C durante 18-24horas.
· Revisar las cajas en busca de crecimiento, contar el número de colonias presentes.
· Reportar el recuento bacteriano de la siguiente manera:
 - UFC/mL = número de colonias contadas X 1,000
 - Si se utilizó un asa calibrada de 0.001mL
· Identificar la bacteria patógena realizando pruebas bioquímicas 
· Incubar a 36°-37°C durante 18-24 horas
· Interpretar resultados
 
Interpretación de resultados:
· Cultivos sin crecimiento
 - Reportar
 * Negativo a las 48 horas de incubación a 36°-37°C
· OJO Debe tomarse en cuenta las frecuentes contaminaciones. En general menor de 50,000UFC/mL de orina y más de tres gérmenes encontrados indican que la orina está contaminada
 
COPROCULTIVO
NORMAS GENERALES
· 
· Elegir el material que refleje el proceso patológico.
· Evitar contaminación con la flora del paciente.
· Obtener volumen suficiente para observación microscópica y cultivo.
· Obtener la muestra, si es posible, antes de iniciar la terapia antimicrobiana
Demostrar por medio de cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa.
COPROCULTIVO MUESTRA
Tipo de muestra:
· Heces frescas (la mejor muestra)
· Hisopo rectal (cuando no se obtienen heces).
· Biopsia de mucosa intestinal
Recomendaciones:
· Deben tomarse antes de iniciar el tratamiento con antibióticos.
· Deberá ser procesada lo más pronto posible por el cambio de pH
Coprocultivo muestra:
· Si se necesita transportar el mejor medio es Cary Blair	Selenito
· Shigella	
· Salmonella
· La Coloración de gram nunca debe practicarse por carecer de significado clínico (excepto SAU, Calb)
Principales especies enteropatógenas que se buscan en coprocultivo en orden de importancia en Guatemala
1. 
2. Shigella flexneri	(Shigella del grupo B)
3. Salmonella typhi	(fiebre tifoidea)
4. Shigella sonnei	(Shigella grupo D) 
5. Salmonella enteritidis
6. Shigella dysenteriae tipo 1 (Shigella A-1
o Bacilo de Shiga causa disentería epidémica.
7. Salmonella choleraesuis
8. Arizona hinshawii
9. Edwardsiella tarda
10. Yersinia enterocolitica
 (rara) (muy rara) (muy rara)
 
 
AGARES
 
 
DIFERENCIACION DE LAS ESPECIES DEL GENERO SALMONELLA:
Salmomella typhi. 
· Causa fiebre tifoidea con diseminación generalizada de la bacteria (puede aislarse de heces, médula ósea, sangre, orina etc.
Salmonella enteritidis. 
· Causa infección intestinal y puede diseminarse en la sangre.
Salmonella choleraesuis. 
· Rara, causa infección en animales y rara vez en el hombre.
Salmonella typhi
· Presentan en TSI dos características muy importantes para su identificación, las que se complementan con LIA, citrato de Simmons y aglutinación:
1. 
2. No produce gas
3. Produce poco ácido sulfhídrico (una pequeña mancha negra,a veces difícil de apreciarse en el área del tubo donde empieza el inclinado).
4. Generalmente, el LIA en todo morado (K/K, g-, h- (+)
5. Es Citrato negativo
Aglutina con el antígeno Vi
Para diferenciar e identificar Salmonella: 
1. Identificar las reacciones sospechosas en TSI/LIA de Salmonella typhi y Salmonella spp. Es importante notar la reacción toda morada- violeta en el LIA (K/K), es decir el medio no cambia de color lo cual es típico del género Salmonella. Observar la cantidad de ácido sulfhídrico en el TSI.
2. Aglutinar con antisuero polivalente, de preferencia del TSI
3. Si la reacción es positiva inocular citrato de Simmons e incubar simultáneamente con los ATB.
Aglutinar con otros antisueros, si la aglutinación polivalente da aglutinación franca de la manera siguiente.
· Antisueros B, G y C1. 
· Salmonella typhi pertenece al grupo D.
S. typhi
· Se aíslan con mayor frecuencia de la sangre durante la primera semana de la enfermedad, pero también puede encontrarse en la segunda y tercer semanas y durante recaídas clínicas.
· Los cultivos fecales son positivos en aprox. La mitad de los casos durante la primera semana con fiebre, pero el mayor número de cultivos positivos se obtiene en la segunda y tercera semanas de la enfermedad.
· Los cultivos de la MO positivos (90%)
Aglutinación para Shigella
1. Shigella flexneri, grupo B ---------------- Las más frecuentes en Guatemala
2. Shigella sonnei, grupo D. ---------------- La segunda más frecuente en Guatemala
3. Shigella dysenteriae, grupo A. ---------- Rara pero grave y epidémica debe darse alerta al médico
4. Shigella boydii, grupo C. ----------------- Muy rara
CULTIVO DE GARGANTA O
OROCULTIVO
· La faringitis es una enfermedad inflamatoria de la mucosa que reviste la faringe y que se manifiesta por enrojecimiento e hinchazón de la misma.
· Esta afección a menudo se extiende también en las amígdalas.
· Se efectúa para demostrar la presencia de Streptococcus pyogenes (Streptococcus betahemolítico del grupo “A” de Lancefield)
Los síntomas frecuentemente asociados a infecciones de la faringe son:
· 
· Dolor de garganta
· Dolor de cabeza
· Náusea
· Vómitos 
· Dolor abdominal
Las infecciones causadas por virus provocan:
· Tos 
· Secreción nasal 
· Nariz tapada
Los síntomas frecuentemente asociados a infecciones de la faringe son:
· 
· Dolor de garganta
· Dolor de cabeza
· Náusea
· Vómitos 
· Dolor abdominal
Las infecciones causadas por virus provocan:
· Tos 
· Secreción nasal 
· Nariz tapada
Los síntomas frecuentemente asociados a infecciones de la faringe son:
· 
· Dolor de garganta
· Dolor de cabeza
· Náusea
· Vómitos 
· Dolor abdominal
Las infecciones causadas por virus provocan:
· Tos 
· Secreción nasal 
· Nariz tapada
Toma de muestra adecuada
· Con un baja lengua estéril presionar fuertemente la lengua hacia abajo y simultáneamente iluminar el fondo de la garganta (detrás de la úvula o campanilla) y examinar lesiones
· Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones, no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de las mejillas, ni los labios al retirar el hisopo
Toma de muestra adecuada: 
 * Que lesiones debo buscar:
· 
· Inflamación (enrojecimiento) 
· Pus (secreción blanquecina o amarillenta)
· Ulceras blanquecinas	
 
	
Procedimiento en el laboratorio:
· 
· Inoculación de la muestra: 
· Inocular inmediatamente una caja de agar sangre de carnero al 5% con el hisopo que contiene la muestra.
· Diseminación de la muestra: 
· Con un asa en argolla estéril, se disemina la muestra realizando una primera estría, sin flamear el asa realizar un corte al agar de 1 cm. de profundidad de la orilla de la caja al centro del medio.
· Realizar una segunda estría, un segundo corte y una última estría sin flamear entre cada estría y cortada. 
· El propósito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para alejarlos del oxígeno atmosférico y así incrementar la hemólisis tipo Beta.
· Estriar adecuadamente es esencial para recuperar y aislar la bacteria que nos interesa (S. pyogenes)
· Incubar en jarra GasPak con candela y humedad (ambiente microaerofílico) a 36°- 37ºC. 
· Después de 18-24 horas de incubación. 
· Identificar beta hemólisis en las cortadas y colonias transparentes beta hemolíticas pequeñas y brillantes, sospechosas de S. pyogenes.
· ¿Qué vamos a encontrar?
· Beta hemólisis
¿Qué vamos a encontrar?
· El microbiota de la faringe es sumamente variada, predominan Streptococcus sp. alfa hemolíticos del grupo Viridans y Neisserias spp. no patógenas. 
· Estos grupos de bacterias nunca deben reportarse.
· Diferentes tipos de hemólisis
Tipo de hemólisis 
· ALFA = Verde (hemólisis incompleta o parcial) 
· BETA = Claro, transparente (hemólisis completa o total) 
· GAMA = No hay presencia de ningún tipo de hemolisis (no existe hemolisis)
Prueba de hemólisis en agar sangre de carnero al 5%
· Detecta la presencia de hemolisina
· Hemoliisina: Enzima que permite la clasificación de los Streptococcus en alfa, beta y gamma hemolíticos
¿Qué hacer si tenemos …?
· Colonias Beta hemolíticas en agar sangre de carnero al 5% 
· Cocos Gram positivos en cadena en el frote de Gram
Identificación de S. pyogenes
· 
· Con un asa estéril, trasladar una sola colonia típica a otra caja con agar sangre de carnero al 5% 
· Diseminar la colonia en varias direcciones tratando de abarcar toda la caja
· Colocar el disco de Bacitracina 0.04 unidades (TAXO “A”) en un extremo de la caja y en el otro extremo, un disco de SXT (Trimetoprim sulfametoxazole)
· Identificación de S. Pyogenes
· Inhibición por disco de Bacitracina: 
· Positivo (+) Si produce halo de inhibición 
· Negativo (-) No produce halo de inhibición
· Se considera un cultivo positivo para S. pyogenes si es: 
 - Bacitracina (Taxo A) (+) Positivo 
 - SXT (R) Resistente
Identificación de S. Pyogenes
· 
· Inhibición por disco de Bacitracina: 
· Positivo (+) Si produce halo de inhibición 
· Negativo (-) No produce halo de inhibición
· Se considera un cultivo positivo para S. pyogenes si es: 
· Bacitracina (Taxo A) (+) Positivo 
· SXT (R) Resistente
Como Reportar
· Si no se observa presencia de colonias Beta hemolíticas. 
· No se observa beta hemólisis en las cortadas. 
· No predomina ninguna bacteria sobre el microbiota normal.
Se reporta:
· No se aíslan patógenos, se desarrollan bacterias del microbiota normal.
· 
· Positivo para S. pyogenes: Se aisló Streptococcus pyogenes Beta hemolítico del grupo “A” de Lancefield 
· Negativo para S. pyogenes: Se aisló Streptococcus sp. Beta hemolítico no del grupo “A” de Lancefield (hacer prueba de CAMP)
Prueba de CAMP
· 
· Identificación presuntiva de S. agalactiae (Grupo B): 
· S. agalactiae es resistente al disco de 0.04 unidades de bacitracina (taxo A) 
· En una caja de agar sangre al 5% colocar una estría recta de S. aureus productor de doble zona de beta hemólisis
· Hacer una estría con el Streptococcus sp. beta hemolítico a identificar, perpendicular a la estría de S. aureus 
· Incubar en ambiente microaerofílico (jarra con candela y humedad) de 18 a 24 hrs. a 36º - 37ºC. 
· Interpretar
· Los estreptococos del grupo B (S. agalactiae) producen una proteína difusible y termoestable (factor CAMP) que aumenta la beta-hemólisis del Staphylococcus aureus 
· S. aureus (sembrado desde la parte superior hasta la parte inferior de la caja) produce esfingomielinasa C que se puede unir a las membranas de los eritrocitos. Cuando son expuestas al factor CAMP del grupo B, las células sufren hemólisis
La prueba es positiva: 
· Si se produce una “flecha” de intensa beta hemólisis 
que apunta hacia la estría del S. aureus
· • Reportar como: 
· Se aisló Streptococcus agalactiae Beta hemolítico del Grupo “B” de Lancefield
CAMP Negativo 
· Reportar como: 
· Se aisló Streptococcus sp. Beta hemolítico no del 
Grupo “A”, no del Grupo “B” de Lancefield.
HEMOCULTIVO
Definición
· Extracción de sangre con técnica aséptica para determinar la presencia de algún agente en la sangrea través de un cultivo de esta.
Objetivo Hemocultivo
· Determinar la presencia de microorganismos en sangre a través de una muestra obtenida por una punción diferente y de manera aséptica
· El hemocultivo o cultivo microbiológico de la sangre constituye en los casos de septicemia, el único examen que permite su	confirmación.
· En caso de bacteremia permite aislar el agente causal.
Indicaciones
· Sospecha de bacteremia en pacientes con o sin foco de infección, de origen desconocido
· Para la identificación del agente causal de alguna patología:
· Septicemia severa
· Meningitis
· Osteomielitis
· Artritis
· Neumonía
· Endocarditis infecciosa
· Episodios febriles
· Otros
Materiales
· Frascos de hemocultivo
· Jeringas de 10 cc (variable, dependiendo de cantidad de hemocultivos)
· Guantes estériles y de procedimiento
· Torundas estériles
· Bolsa de desecho (roja)
· Corto punzante (guardián)
· Clorhexidina 2-4%
· Mascarilla (dependiendo de las normas del hospital)
· Liga
Procedimiento
1. 
2. Revisión orden médica e identificar paciente correcto (brazalete o preguntar nombre al px)
3. Lavado de manos (riguroso)
4. Reunir material
5. Valoración de vena a puncionar (periférica)
6. Lavado con agua y jabón de la zona a puncionar, secar con toalla desechable (si es necesario, evaluar)
7. Colocarse mascarilla (según norma)
8. Lavado de manos (riguroso)
9. Colocarse guantes estériles
10. Ayudante presenta material estéril
11. Operador arma jeringas
12. Ayudante vierte clorhexidina 2-4% (Esperar a que el antiséptico se seque para que ejerza su acción residual)
13. Operador pincela la zona de punción con el antiséptico (puede ser hisopos con yodo)
14. Ayudante liga al paciente 10 cm sobre sitio de punción cuidando de no contaminar
15. Realiza punción venosa extrayendo la cantidad de sangre requerida
16. Ayudante suelta ligadura
17. Operador retira jeringa e inocula la sangre en el frasco (s) de hemocultivo (s) previamente aseptizado
18. Botar aguja en corto punzante y ordenar el resto del material
19. Rotular frasco de hemocultivo (nombre del paciente, servicio y pieza del paciente completo, hora, T°, iniciales del operador)
20. Lavado de manos
21. Mantener botellas a T° ambiente y enviar rápidamente a laboratorio, nunca refrigerar)
22. Registro
Recomendaciones
· 
· Preparación de la piel es esencial para evitar contaminación de la muestra
· Vaciar la muestra suavemente, evita la hemólisis, ya que podría interpretarse como hemocultivo +
· Si requieren varios hemocultivos seriados, se deben tomar
· muestras de diferente punción
· Si tiene que tomar varios exámenes, el hemocultivo debe ser
· la primera muestra.
· Si no se logra obtener sangre en la 1era punción, debe cambiar la aguja
· Volumen de muestra: 10 ml en adultos y variable en niños: Recién nacidos 1-2ml, 1mes a dos años 2-3ml, mayores de 2 años 3-5ml, adolescentes 10ml
· Se ha comprobado que el mejor momento para obtener la muestra es 2-3 horas antes del pico febril, lo que es muy difícil de predecir. Para esto se recomienda obtener 3-4 muestras tomadas con un lapso de 30 minutos, en diferentes sitios de punción.
· Las muestras deben obtenerse antes de la administración de ATB. Cuando el paciente ya está recibiendo Antimicrobianos la probabilidad de aislar el agente disminuye (Carbón activado en frascos del Bactalert inhibe el ATB).
· Sí el paciente está con antibiótico terapia, el hemocultivo debe tomarse antes de corresponder la siguiente dosis y consignarlo en la orden, medicamento, dosis, hora de administración de la última dosis.
ANTIBIOGRAMA
Conceptos
· 
· Antibiograma: son métodos in Vitro que determinan la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio específica y estandarizada.
· Concentración Mínima Inhibitoria (CIM): Es la menor concentración de una gama de diluciones de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible.
· Antibióticos: Son sustancias químicas producidas por organismos vivientes, o sintetizados en el laboratorio capaces de inhibir en pequeñas cantidades los procesos vitales de microorganismos, destruyendo e impidiendo su desarrollo y reproducción.
Clasificación de los Antibióticos
· 
· ß-lactámicos: Penicilinas, Monobactam.
· Glicopéptidos: Vancomicina.
· Aminoglicòsidos: Gentamicina, Amikacina.
· Macrólidos: Eritromicina, Azitromicina, Claritromicina.
· Quinolonas: Ciprofloxacino, Levofloxacino.
· Tetraciclinas
· Sulfonamidas y trimetoprim: bactrin, exazol.
Método de Difusión en Disco (Baeur-Kirby)
· Es el más difundido.
· Prueba la inhibición o resistencia de los microorganismos, enfrentándolos con los medicamentos que se encuentran impregnados en pequeños discos.
 
Medio de cultivo utilizado
Mueller Hinton
· 
· Su reproducibilidad aceptable.
· Baja concentración de inhibidores, condición crítica para evaluar sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclina.
· El crecimiento satisfactorio de patógenos no exigentes.
· Existir ya gran experiencia en estudios de susceptibilidad.
Factores que influyen en el Agar
· pH: El rango de pH va de 7,2 a 7,4. variación de cationes divalentes:
· Ca y Mg: Afectan los halos de inhibición para aminoglucósidos y tetraciclinas en Pseudomonas aeruginosa.
· Profundidad del Agar: La profundidad recomendada de la capa de agar es de 3 a 5 mm.
Preparación del Inóculo
· Se prepara el inóculo con ajuste a la	turbidez McFarland 0,5 que corresponde aun diámetro de1.5 x10 UFC/ML, directo en caldo de colonias frescas en agar no selectivo.
Inoculación de la placa
· Con un hisopo estéril en tres direcciones inocule toda la placa (giros de 60°).
Aplicación de sensidiscos
· separación: los discos deben de estar separados24 mm (del centro de un sensidisco al otro más cercano).
· Cantidad: 12 unidades en placas de 150mm y 5 unidades en placas se 100mm.
	
Lectura e interpretación de los resultados
· 
· Categorías de interpretaron: Sensible: El microorganismo presenta un gran área de inhibición causada por el fármaco. 95% éxito
· Intermedio: Se presenta un halo de inhibición mas reducido.
· Resistente: Presenta muy poco o casi nada de halo.
Medición de los halos
· 
· Después de incuba las placas del antibiograma se procederá a la lectura de este.
· Se usa una regla y se mide el radio del halo de inhibición partiendo de desde donde está el disco de antibiótico hasta donde se inhibió el crecimiento.
· La longitud obtenida después se compararán con estándares que nos dirán si el medicamento será efectivo o no en el tratamiento. 
Otros métodos
· Dilución en Caldo: En el método de dilución en caldo, base de casi todos los métodos utilizados en la actualidad, se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que sostendrá el desarrollo del microorganismo
	 
	
Método de E-test:
· Consiste en aplicar sobre un medio de cultivo, donde se encuentra el microorganismo a ensayar, tiras plásticas que llevan incluidas un gradiente de concentración de un determinado ATB. Luego se incuba adecuadamente y se observa la formación de una elipse de inhibición de crecimiento.
	
Método Automatizado:
· 
· Este método se basa en micro diluciones sobre micro tubos. El crecimiento bacteriano se va a observar por la turbidez o fluorescencia de los micro tubos.
· Es útil para examinar una gran cantidad de muestras
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