SH2 2020 - Seminario 2 Tecnica Histologica

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Seminario de Histología
1UA de Histología, Embriología, Biología Celular y Genética
Técnicas Histológicas
Algunas definiciones:
Célula: es la mínima porción de materia que posee vida independiente.
Tejido: es el conjunto de las células y sus materiales extracelulares que contribuyen a cumplir 
una(s) función(es) común(es).
Órgano: es el conjunto de tejidos que comparten una forma y un grupo de funciones comunes y 
más o menos independientes.
Aparato: es el conjunto de órganos que contribuye a un grupo de funciones comunes.
Sistema: el es el conjunto de órganos que contribuye a un grupo de funciones comunes y se 
distribuye en todo el organismo.
Fibrae (fibra) Texturae (tejido) HISTOLOGÍA
Técnica Histológica
Técnica de rutina
Técnicas especiales
Como los tejidos animales contienen mucha agua, en cortes delgados, translúcidos, 
tienen poco contraste. Sólo se ven las estructuras que tienen color de por sí.
Hay que crear contraste donde no lo hay para poder distinguir estructuras. 
Por eso se colorean los tejidos.
Pasos de la técnica histológica de rutina
1) Obtención de la muestra
2) Fijación
3) Inclusión:
a) Deshidratación
b) Aclaración
c) Inclusión propiamente dicha
4) Corte
5) Montaje preliminar 
6) Coloración:
a) Aclaración
b) Rehidratación
c) Coloración propiamente dicha
7) Montaje final
a) Deshidratación
b) Aclaración
c) Montaje final propiamente dicho
Obtención de la muestra
Para observación mediata 
(post-mortem) = AUTOPSIA
Para observación inmediata (in 
vivo) = BIOPSIA
Puesto este órgano en un microscopio, 
¿veríamos algo?... ¿lo atraviesa la luz?...
…entonces hay que seccionarlo en rebanadas 
delgadas, muy delgadas (5-10 milésimas de 
milímetro)… para poder observarlo a trasluz con 
un microscopio…
Fijación
• Métodos de fijación
• Físico: frío, calor
• Químico: paraformaldehído, formol, formalina, glutaraldehído.
• Inmersión
• Perfusión
Hay que indurar al órgano con sus tejidos, incluyéndolo en un material 
más duro que se pueda cortar más delgado
Inclusión
50% 70% 96% 100%
Post-fijación por 
inmersión
Deshidratación en concentraciones 
crecientes de ETANOL
Aclaración con XILOL
Etanol 100%
XILOL
Inclusión
Distintos tipos de parafinas se 
funden (son líquidas) a 45º-58º…
…se sumerge la 
muestra de tejido en 
parafina líquida…
…se incuba en estufa a 60º 
para que la parafina 
impregne todo el tejido 
Inclusión propiamente dicha
Moldes de inclusión
Taco de inclusión
Se obtiene un taco de inclusión, 
sólido, con el tejido incluido en 
parafina. El taco se talla y se pasa 
al…
Charles Sedgwick Minot (1852-
1914)
Corte
¿Con qué se corta el taco de inclusión?...
…con un MICRÓTOMO
Corte
Micrótomo rotatorio tipo 
Minot
Taco
Platina
Taco
Cuchilla Tira de cortes Grosor: 
5-10 μm
Montaje preliminar
Portaobjetos de vidrio Corte de tejido
Coloración
Aclaración (desparafinización) con 
XILOL
Rehidratación en concentraciones 
decrecientes de ETANOL
Coloración propiamente dicha 
HEMATOXILINA + virado + EOSINA
Deshidratación en concentraciones 
crecientes de ETANOL
Aclaración con XILOL
Montaje final propiamente 
dicho con Bálsamo de 
Canadá o similar
Montaje final
Corte sin colorear
Corte coloreado sólo con 
EOSINA
Corte coloreado con 
EOSINA y HEMATOXILINA
Acidofilia y Basofilia con H-E
Acidofilia y Basofilia con H-E
Técnica de rutina: HE
Hematoxilina Eosina
Colorante básico  Colorante ácico
 Azul metileno, azul toluidina,
verde metilo, hematoxilina
 Azul de anilina, naranja G, eosina, 
fucsina ácida
 Tiñen componentes ácidos de la célula  Tiñen componentes básicos de la célula
 Permiten visualizar núcleos, 
polirribosomas.
 Permiten visualizar componentes 
citoplasmáticos como organelas.
 Los componentes celulares afines con 
este colorante se llaman BASOFILOS.
 Los componentes celulares afines con 
este colorante se llaman ACIDOFILOS.
Resumiendo…
Pasos de la técnica histológica de rutina
1) Obtención de la muestra
2) Fijación
3) Inclusión:
a) Deshidratación
b) Aclaración
c) Inclusión propiamente dicha
4) Corte
5) Montaje preliminar 
6) Coloración:
a) Aclaración
b) Rehidratación
c) Coloración propiamente dicha
7) Montaje final
a) Deshidratación
b) Aclaración
c) Montaje final propiamente dicho
CONCEPTOS
ORTOCROMASIA: es la capacidad que tienen los colorantes básicos o ácidos de mantener 
invariable su espectro de absorción electromagnética al formar uniones salinas o 
electrostáticas con los componentes celulares y extracelulares.
METACROMASIA: es la capacidad que tienen ciertos colorantes básicos o catiónicos derivados 
de las tiazinas de virar su espectro de absorción electromagnética al formar uniones salinas o 
electrostáticas con ciertos componentes celulares y extracelulares que son polímeros 
polianiónicos.
Colorantes metacromáticos: azul de metileno, azul de toluidina, violeta de 
metilo, azul de tionina, azur A
Metacromasia
Es una propiedad de los colorantes básicos derivados de las tiazinas (Azul de metileno; Azul de toluidina; Azur; 
Violeta de cresilo; Gallocianina)
Características del tejido: poseer polímeros polianiónicos (ej: heparina) que hacen “virar” el azul original del 
colorante a un púrpura-violáceo = metacromasia
Metacromasia (mastocitos; oreja de ratón)
H&E Azul de toluidina
Coloraciones tricrómicas:
Tricrómico de Mallory (azul de anilina + 
naranja G + fucsina ácida; todos ácidos; se 
desconoce el fundamento)
Frank Burr Mallory
(1862-1941)
Cirrosis
Tricrómico de Mallory
Azul de Anilina + Naranja G + Fucsina ácida
Coloraciones tricrómicas:
Tricrómico de van Giesson (ácido pícrico 
+ fucsina ácida + hematoxilina férrica de 
Weigert)
Tricrómico de Masson-Lillie (fucsina Ponceau + verde luz + hematoxilina de Mayer)
Tricrómico de Masson (fucsina Ponceau + azul 
de anilina + hematoxilina de Mayer)
Técnicas histoquímicas: Localización de polisacáridos 
Técnica de PAS (peryodic acid-Schiff)
1) El ácido peryódico (HIO4) oxida a los glúcidos (sobre grupos 1-2 glicol de las hexosas) y expone grupos aldehídos.
2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por 
anhídrido sulfuroso)
H&E PAS
Células caliciformes
Técnicas histoquímicas: Localización de ADN
Técnica de Feulgen
1) Hidrólisis ácida débil con HCl que elimina bases purínicas del ADN (A y G) y expone 
grupos aldehído.
2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la unión del reactivo de 
Schiff (fucsina ácida decolorada por anhídrido sulfuroso)
Ácidos nucleicos (raíz 
de cebolla)
H&E
Feulgen
Técnicas histoquímicas: Localización de lípidos
Nervio, mielina (OsO4)
Tinción por solubilidad diferencial (método físico, no químico)
Sudán III grasas (naranja)
Sudán IV (rojo escarlata) grasas neutras (rojo vivo), ést. de colest. (rosa)
Sudán negro B fosfolípidos
Aceite rojo O triacilglicéridos
Azul de Nilo fosfolípidos
Tetróxido de osmio (OsO4) mielina (marrón o negro)
Adipocitos (H&E) Adipocitos (Sudán rojo)
Glándula mamaria (OsO4-
verde de metilo)
Técnicas histoquímicas: Localización de enzimas
Fosfatasa alcalina (bazo; 
técnica de Gomori)
Demostración de lectina PNA que se une a 
galactosil-N-acetilgalactosamina de 
glucoproteínas por reacción de la 
peroxidasa-DAB (epitelio respiratorio)
Fundamento: localización de la reacción enzimática por demostración del 
lugar en el que se encuentra una enzima que transforma un sustrato en 
un producto; el producto, con un reactivo agregado, forma un compuesto 
insoluble y coloreado
Demostración de NADPH-diaforasa (deshidrogenasa; corteza frontal, 
neuronas nitrérgicas) (Boccoli, Loidl, López-Costa, Pistone Creydt, Ibarra, 
Goldstein (2008) Brain Res)
Técnicas de impregnación argéntica:
Depósito de sales de plata metálica
Método de del Río 
Hortega (microgliocito)
Método de Cajal para 
neurofibrillas (neurona)
Impregnación argéntica de Gomori para 
fibras reticulares (hígado)
Método deGolgi (neurona)
Técnica de de Olmos (amino-
cupro-argéntica; neuronas en 
degeneración)Aparato de Golgi (enterocitos)
Inmunohistoquímica:
Se basa en: la detección de reacciones antígeno-anticuerpo por medio 
de la marcación de los anticuerpos.
Sirve para: detectar sustancias (principalmente proteínas), muy 
específicamente, que pueden estar en muy bajas concentracioens en 
el tejido en estudio.
Métodos: existen dos grupos, el directo y el indirecto.
Tipos de anticuerpos: policlonales y monoclonales
Ludwig A. Sternberger
Albert H. Coons
(1912-1978)
Ac. con fluoresceína (1941) Técnica de PAP (1970)
César Milstein (1927-2002) Georges Köhler (1946-1995)
Ac. monoclonales (1975)
Inmunohistoquímica:
Inmunohistoquímica:
Nf-200 (neurona, c. frontal; Evrard, 
Duhalde-Vega, Tagliaferro, Mirochnic, Caltana, 
Brusco (2006) Exp Neurol)
MTCO2, marcador de
mitocondrias humanas 
(glioblastoma humano)
Células en cultivo marcadas para 
actina, tubulina y núcleo
GluR4 
(neurona glutamatérgica, hipocampo)
SMI 131
(neurona, corteza motora)