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Ciencias de la Salud Biológicas y Ambientales | Ingeniería en Biotecnología Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana U1 Programa de la asignatura: Universidad Abierta y a Distancia de México 1 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Índice Presentación .............................................................................................................................. 2 Propósitos ................................................................................................................................. 3 Competencia específica ........................................................................................................... 3 Ruta de aprendizaje .................................................................................................................. 4 1.1. Microbiología ...................................................................................................................... 5 1.1.1. Campo de estudio de la microbiología ............................................................................ 6 1.1.2. Taxonomía ...................................................................................................................... 7 1.1.3. Concepto de especie ..................................................................................................... 17 1.2. Nomenclatura de microorganismos ................................................................................. 18 1.2.1. Caracterización fenética ................................................................................................ 19 1.2.2. Pruebas bioquímicas y tinciones ................................................................................... 20 1.2.3. Caracterización genotípica ............................................................................................ 26 1.2.4. Filogenia microbiana ..................................................................................................... 28 1.2.5. Árboles filogenéticos ..................................................................................................... 29 1.3. Virus ................................................................................................................................. 31 1.3.1. Características y estructura de los virus ....................................................................... 34 1.3.2. Replicación viral ............................................................................................................ 36 1.3.3. Cultivo de virus .............................................................................................................. 39 Actividades .............................................................................................................................. 42 Autorreflexiones....................................................................................................................... 42 Cierre de la unidad .................................................................................................................. 42 Para saber más ....................................................................................................................... 44 Fuentes de consulta ................................................................................................................ 45 Universidad Abierta y a Distancia de México 2 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Presentación La microbiología es una ciencia de estudio básica para el biotecnólogo, ya que los microorganismos son de gran importancia tanto benéfica como perjudicial en todas las áreas de desarrollo humano. Es por ello que en esta unidad nos adentraremos en el mundo de los microorganismos y revisaremos algunas definiciones que son importantes para comprender en esta área del conocimiento. En esta unidad estudiaremos a la microbiología desde el punto de vista taxonómico, por lo que aprenderemos cuáles son las herramientas que se emplean para poder identificar y nombrar a los microorganismos. La taxonomía es una herramienta muy importante en todas las ciencias biológicas, pero nosotros nos centraremos en la taxonomía microbiana, aprenderemos cuales son las herramientas que utiliza y en base a qué se han realizado las diferentes clasificaciones a lo largo de la historia. También nos adentraremos en el mundo de la microbiología estudiando a los virus, los cuales son considerados microorganismos aunque todavía no se ha llegado a un consenso acerca de si son seres vivos o no, es por ello que no entran dentro de ninguna clasificación taxonómica. Vamos a estudiar las características de los virus, cómo es su replicación y las distintas técnicas que se pueden emplear para cultivarlos y estudiarlos ya que éstos tienen gran importancia no solamente porque causan graves enfermedades en los humanos sino porque también causan grandes daños en la agricultura y ganadería, además de que actualmente son uno de los principales vectores empleados para la modificación genética de organismos. Universidad Abierta y a Distancia de México 3 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Propósitos Esta unidad tiene el propósito de: • Definir a la microbiología y su campo de estudio. • Aplicar las bases de la taxonomía en la nomenclatura de microorganismos. • Identificar la utilidad de los árboles filogenéticos. • Describir las características y mecanismo de acción de los virus. Competencia específica Identificar el área de estudio y clasificación de la microbiología con el fin de diferenciar el objeto de estudio de la taxonomía microbiana y la virología mediante la aplicación de sus características diferenciales y el estudio de los árboles filogenéticos. Universidad Abierta y a Distancia de México 4 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Universidad Abierta y a Distancia de México 5 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana 1.1. Microbiología Antes de sumergirnos en el contenido de la asignatura, revisa la infografía que se muestra en la página anterior y que te permitirá tener un panorama completo de los contenidos que revisaremos en esta unidad, en caso de que tengas alguna pregunta o inquietud, consúltalo con tu docente en línea. La importancia de la Microbiología deriva de la necesidad biológica de estudiar los organismos que no son visibles a simple vista, y que sólo con ayuda de un microscopio se pueden observar, pero que su presencia en diferentes ambientes naturales o en la industria es indispensable, ya sea participando dentro de los ciclos de incorporación de nitrógeno, azufre y carbono, como aportando sus propiedades metabólicas dentro de algún proceso. Una de sus características importantes es que poseen la propiedad de adaptar su medio encontrando rápidamente las condiciones óptimas para crecer y colonizar lugares y ambientes tan variados e inimaginables que puedan existir, como la superficie de una prótesis ya implantada en el cuerpo de un paciente, un geiser a altas temperaturas, aguas con alto contenido en sales, las cavidades corporales de animales una herida, un reactor, entre muchos otros. Los primeros en visualizar la abundancia y diversidad de microorganismos a pesar de lo rudimentario de sus instrumentos fueron Robert Hooke y Antonie van Leeuwenhoek, observaron diferentes formas de vida microscópicas como levaduras, algunas bacterias entre otros microorganismos presentes en el agua de lluvia encharcada, fluidos corporales, superficies como suelos y rocas, entre otras. Etimológicamente proviene de los vocablos griegos micro que significa pequeño, bios que significa vida y logos que quiere decirestudio o tratado; por lo que es la ciencia que estudia la diversidad y evolución de los seres vivos microscópicos. Microbiología Universidad Abierta y a Distancia de México 6 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana El estudio de la microbiología abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonómicos: desde partículas no celulares como los virus y hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los protozoos y parte de las algas y de los hongos. 1.1.1. Campo de estudio de la microbiología Las características estructurales de los microorganismos, su fisiología, bioquímica, genética, taxonomía, ecología, entre otros aspectos, son del estudio de la microbiología. También se ocupa del estudio de las diferentes actividades microbianas y su relación con el ser humano, ya que pueden acarrear consecuencias tanto benéficas, como perjudiciales; por esta razón se estudian los nichos ecológicos de los correspondientes agentes, sus modos de transmisión, los diversos aspectos de la microbiota patógena en sus interacciones con el hospedador, los mecanismos de defensa de éste, así como los métodos desarrollados para combatirlos y controlarlos, no olvidándose de aquellas que reportan beneficios por medio de los procesos microbianos para la obtención de materias primas o elaboradas, y de su modificación y mejora racional con vistas a su imbricación en los flujos productivos de las sociedades. Figura 1. Pinturas de los pioneros de la microbiología. A la izquierda Robert Hooke (1635-1703) y a la derecha Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723). Tomado de http://www.vwmin.org/hooke-about-robert-hooke-hooke-laboratories.html y http://www.history-of-the-microscope.org/anton-van-leeuwenhoek-microscope-history.php http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/48/17_Robert_Hooke_En Universidad Abierta y a Distancia de México 7 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Finalmente, la Microbiología se ocupa de todas las técnicas y metodologías destinadas al estudio experimental, manejo y control de los microorganismos. En el siglo XX, se han desarrollado muchas subdisciplinas a partir de la microbiología como ciencia básica, de las cuales se mencionan algunas a continuación: • Taxonomía o sistemática microbiana que permite la agrupación y clasificación de los microorganismos. • Fisiología microbiana que estudia los nutrientes que requieren los microorganismos y los productos que originan. • Bioquímica microbiana que estudia los avances en el conocimiento de la estructura física y química de las células y las enzimas microbianas, junto a las reacciones que llevan a cabo. • Genética microbiana que se ocupa del estudio de la herencia y la variación en el genoma de las bacterias 1.1.2. Taxonomía Para poder comprender la gran diversidad de organismos existentes es preciso agruparlos y organizarlos en una estructura jerárquica. De ello se encarga la taxonomía, la cual se compone de tres partes independientes pero interrelacionadas: Son seres de tamaño microscópico dotados de individualidad, con una organización biológica sencilla, y que necesitan para su estudio una metodología propia y adecuada a sus pequeñas dimensiones. Microorganismos Etimológicamente proviene del griego taxis, "ordenamiento", y nomos, "norma" o "regla", se define como la ciencia encargada de la clasificación y denominación de especies. Taxonomía Universidad Abierta y a Distancia de México 8 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Para llevar a cabo la clasificación de las bacterias los taxónomos bacterianos se vieron forzados a buscar además de las características estructurales, diferentes tipos de propiedades como las bioquímicas, fisiológicas, ecológicas. Dicha clasificación se basa en atributos funcionales, la mayor parte de las bacterias sólo pueden identificarse por lo que hacen y no simplemente por su apariencia. Esto representa un problema adicional para el taxónomo bacteriano, el estudio de estas propiedades funcionales conlleva a la realización de experimentos. Sin embargo, está tomando auge una nueva alternativa biotecnológica que podría resolver pronto el problema, son las técnicas moleculares para la caracterización genotípica bacteriana, que proporcionan una posible base objetiva para la definición de especie bacteriana (Tórtora, 2008). En el siglo XVII Carlos Linneo desarrollo un sistema de clasificación para nombrar a los microorganismos como una forma de facilitar la comunicación eficaz entre los microbiólogos, a Linneo se le conoce como el Padre de la Taxonomía (Solomon et al., 2008). Clasificación Es el agrupamiento ordenado de unidades en grupos dentro de unidades mayores. Nomenclatura Es la denominación de las unidades definidas por la clasificación. Identificación Hace uso de los criterios establecidos por la clasificación y nomenclatura mencionados, los microorganismos se identifican comparando las características de las unidades desconocidas y las conocidas. Partes que integran la taxonomía Universidad Abierta y a Distancia de México 9 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Figura 2. Dibujo de FCarl Von Linneo. (1707-1778). Tomado de: http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:C arl_von_Linn%C3%A9.jpg Universidad Abierta y a Distancia de México 10 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Durante mucho tiempo, los taxónomos microbianos contaron exclusivamente con un sistema fenético de clasificación, pero actualmente la determinación del género y la especie de un procariota se basa en una taxonomía polifásica, donde se incluyen características, fenotípicas, filogenéticas y genotípicas, tomando en cuenta en primer lugar los componentes individuales para posteriormente determinar cómo se evalúan cuantitativamente mediante la taxonomía numérica. Cada uno de estos criterios o técnicas permite la diferenciación de los microorganismos en especies distintas, como se muestra en la figura 3. La identificación de un microorganismo es importante en diferentes áreas, como en la medicina, donde se debe conocer cuál es la especie microbiana que está causando cierta patología para poder dar un tratamiento efectivo; en el área de alimentos e industria Fenética Las agrupaciones se realizan en función de la semejanza en sus características fenotípicas. Se toman en cuenta propiedades bioquímicas, fisiológicas, ecológicas y estructurales de los microorganismos. Genotípica Compara las semejanzas genéticas entre los organismos, ya sea de genes individuales o de genomas completos y existen múltiples técnicas por las que pueden ser evaluados. Filogenética Los agrupamientos se basan en las relaciones evolutivas que actualmente pueden determinarse por la similitud entre la secuencia del DNA, RNA y proteínas. Numérica El agrupamiento se realiza empleando métodos numéricos de unidades taxonómicas basadas en la semejanza general determinada por comparación de numerosas características, recibiendo cada una de las cuales el mismo valor. Después de realizado el análisis de caracteres se calcula un coeficiente de variación entre cada par de cepas del grupo, que determina la concordancia de los caracteres que presentan ambas bacterias. Tipos de clasificaciones Universidad Abierta y a Distancia de México 11 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana farmacéutica debemos identificar cuáles son los posibles contaminantes presentes en los productos para poder realizar acciones correctivas y preventivas. La clasificación de los microorganismosimplica su disposición en niveles taxonómicos jerárquicos. Los microorganismos situados en cada rango o nivel comparten una serie común de rasgos específicos. Los rasgos se agrupan en una estructura jerárquica sin superposiciones, de tal forma que cada nivel incluye no sólo los rasgos que definen al rango que se encuentra por encima, sino además una nueva serie de rasgos más restrictivos. A lo largo de los años han existido distintas clasificaciones de los seres vivos, en el sistema de clasificación actual basado en la relación evolutiva de la secuencia 16S del rDNA se ha reconocido una clasificación con tres dominios mayores, de los cuales dos comprenden a las bacterias y arqueas (procariotes) y el tercer dominio a eucariotes (Sarethy y Danquah, 2014) como se muestra en la figura 4: Figura 3. Diferentes criterios empleados en la diferenciación de bacterias, arqueas y hongos. Se muestra el grado de diferenciación que logran las pruebas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas y las moleculares. Modificado de: Sharma et al., 2015. Universidad Abierta y a Distancia de México 12 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana A) Archaea. Incluye las bacterias que pueden crecer en condiciones extremas B) Bacteria. Comprende las cianobacterias, los micoplasmas y las llamadas bacterias verdaderas. C) Eucarya. Constituido por todos los animales, hongos y plantas. Figura 4. Árbol filogenético de la vida. Tomado de: http://ocw.unican.es/ciencias-sociales-y- juridicas/biogeografia/materiales/tema-1/1.2.3-evolucion-y-diversificacion-de-las-formas- de Universidad Abierta y a Distancia de México 13 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Todos los procariotas pertenecen al domino Bacteria o Archaea. Dentro de cada dominio, cada microorganismo está asignado (en orden descendente) a un phylum, clase, orden, familia, género y especie. Algunos procariotas también tienen una denominación de Característica Bacteria Archaea Eukarya - Estructura celular procariótica - DNA circular - Histonas - Núcleo rodeado de membrana Sí Sí No Ausente Sí Sí Sí Ausente No No Sí Presente - Pared celular de peptidoglicano - Lípidos de membrana - Ribosomas - Intrones Sí Enlaces éster 70S No No Enlaces éter 70S No No Enlaces éster 80S Sí - Plásmidos - Sensibilidad de ribosomas a la toxina diftérica - Sensibilidad a cloranfenicol, estreptomicina y kanamicina Si No Sí Sí Sí No Raro Sí No - Metanogénesis - Reducción desasimilativa de sulfatos y férrico - Nitrificación - Desnitrificación No Sí Sí Sí Sí Sí No Sí No No No No - Fijación de nitrógeno - Fotosíntesis oxigénica - Quimiolitotrofía - Vesículas de gas - Síntesis de gránulos de reserva de carbono (β-hidroxialcanoatos) - Crecimiento por encima de 80º Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí No Sí Sí Sí Sí No Sí (en cloroplastos) No No No No Tabla 1. Características diferenciales de los dominios Universidad Abierta y a Distancia de México 14 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana subespecie. Los grupos microbianos de cada nivel tienen un sufijo indicativo específico de ese rango o nivel. La tabla 2 muestra un ejemplo de la descripción completa taxonómica del microorganismo fototrófico Allochromatium warmingii. (Madigan, et al. 2009). Para poder realizar una identificación microbiana es necesario analizar sus caracteres morfológicos, fisiológicos, serológicos y químicos, que son los que nos van a dar pauta para poder diferenciar entre una especie y otra, o bien identificarlos. El estudio de tales propiedades conlleva a la realización de experimentos, pruebas y técnicas para identificar a las bacterias. Universidad Abierta y a Distancia de México 15 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Taxonomía Nombre Propiedades Método de confirmación Dominio Bacteria Células bacterianas; secuencias de RNA ribosómico típicas de bacterias Microscopía; análisis de la secuencia de RNA ribosómico 16S; presencia de biomarcadores únicos, por ejemplo el peptidoglicano Filum Proteobacteria Secuencias de RNA ribosómico típicas de Proteobacterias Análisis de la secuencia del RNA ribosómico 16S Clase Gammaproteobacteria Bacterias gram negativas; secuencias de ARN ribosómico típicas de Gammaproteobacteria Tinción de Gram, microscopia Orden Chromatiales Bacterias fotótrofas purpura Pigmentos característicos Género Allochromatium Bacterias púrpura del azufre con forma de bastón Microscopia Especie warmingii Células de 3,5-4,0 µm X 5-11 µm; almacenan azufre principalmente en los polos de la célula Medida de las células en el microscopio usando un micrómetro; determinando la posición de los glóbulos de S0 dentro de la célula Tabla 2. Jerarquía taxonómica para la bacteria púrpura del azufre Allochromatium warmingii Universidad Abierta y a Distancia de México 16 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Existen bases de datos microbianas en internet que se han vuelto herramientas importantes ya que ayudan en la identificación de especies microbianas, como las que se mencionan a continuación: NCBI (por sus siglas en inglés: National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov), UNITE (http://unite.ut.ee/index.php), CBS (por sus siglas en inglés: Central Bureau Schimmelcultures), ITIS (por sus siglas en inglés: Integrated Taxonomic Information System, http://www.itis.gov/). Estas bases de datos se enriquecen todos los días gracias a las secuencias identificadas en diferentes regiones del mundo (Figura 5 y 6). Todas las clasificaciones taxonómicas de bacterias y arqueas, así como las nuevas especies identificadas, deben ser aprobadas y publicadas primero por la IJSEM (por sus siglas en inglés: International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology). Figura 5. Base de datos del NCBI. Se muestra la taxonomía descrita de Bacillus subtilis. Tomado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/index.cgi?chapter=resources http://www.itis.gov/ Universidad Abierta y a Distancia de México 17 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana 1.1.3. Concepto de especie El término especie en el aspecto microbiológico es muy ambiguo, porque no existe un concepto aceptado universalmente para los organismos procariotas. Figura 6. Base de datos del ITIS. Se muestra la taxonomía descrita de Bacillus subtilis. Tomado de: http://www.itis.gov/. Universidad Abierta y a Distancia de México 18 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Las cepas dentro de una especie pueden clasificarse en: A) Biovariedades Variantes de cepas bacterianas caracterizadas por diferencias bioquímicas y fisiológicas. B) Morfovariedades Se diferencian desde el punto de vista morfológico. C) Serovariedades Presentan propiedades antigénicas diferentes. D) Patovariedad Se diferencían por el proceso y grado de patogenicidad. E) Fagovariedad. Presentan diferente especificidad por los fagos. F) Ecotipo. Se han adaptado a ocupar un mismo nicho ecológico. 1.2. Nomenclatura de microorganismos Para nombrar a los microorganismos se emplea el sistema de clasificación de Linneo, el cual se denomina “sistema binomial de nomenclatura” donde a cada especie se le asigna un nombre latinizado compuesto de dos palabras: la primera designa el género, y la segunda, la especie (Solomon et al., 2008). El nombre científico de los microorganismos se debe escribir con letra cursiva, completo y la primeraletra del género debe ir en mayúscula. La segunda vez que es nombrado un microorganismo en el mismo texto puede Especie Es la unidad fundamental de la diversidad biológica que tomando en cuenta datos fenotípicos, genotípicos y de filogenia conforma una colección de cepas que presentan un alto grado de similitud en una serie de rasgos independientes. Cepa Se define como una población de organismos que desciende de un único organismo o de un aislamiento en cultivo puro. Especie y cepa Universidad Abierta y a Distancia de México 19 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana comprimirse, escribiendo únicamente la primera letra del género y el nombre completo de la especie. La principal referencia que existe para la clasificación, identificación y nomenclatura de las bacterias es el Manual Bergey de Bacteriología Sistemática, en donde en las últimas versiones ya se adiciona la información obtenida por medio de los análisis filogenéticos, en él se clasifican a los microorganismos con base en la secuencia del rRNA, DNA y proteínas. 1.2.1. Caracterización fenética Los enfoques clásicos de la taxonomía hacen uso de características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas, ecológicas y genéticas. Estas características se han utilizado en taxonomía microbiana durante muchos años. Son muy útiles en la identificación rutinaria y además pueden proporcionar información filogenética. Las características morfológicas son importantes debido a que son fáciles de estudiar y analizar, además, las características estructurales dependen de la expresión de muchos genes y suelen ser estables desde el punto de vista genético. Este tipo de características normalmente no varían de forma sustancial con los cambios ambientales, por lo tanto, la semejanza morfológica a menudo es un buen indicador del parentesco filogenético. Las características fisiológicas y metabólicas son de gran utilidad, ya que están directamente relacionadas con la naturaleza y la actividad de las enzimas microbianas y las proteínas de transporte. Puesto que las proteínas son productos genéticos, el análisis de estas características proporciona una comparación indirecta de los genomas microbianos. Las características ecológicas como la capacidad de un microorganismo para colonizar un ambiente concreto es una propiedad valiosa en taxonomía. Algunos microorganismos pueden ser muy similares en muchos otros aspectos pero habitan nichos ecológicos diferentes, lo que sugiere que podrían no estar tan estrechamente relacionados (Willey et al., 2009). Universidad Abierta y a Distancia de México 20 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana En la siguiente tabla se muestran algunos ejemplos de características fenotípicas que son utilizadas para la clasificación de microorganismos. 1.2.2. Pruebas bioquímicas y tinciones El primer paso para la identificación morfológica de los microorganismos es la observación microscópica, para lo cual empleamos distintas tinciones que nos permiten visualizar mejor las características de las células que estamos observando. Categoría principal Componentes Morfología Morfología colonial; reacción a tinción de Gram; tamaño y forma de la célula; patrón de distribución flagelar; presencia de esporas; cuerpos de inclusión; pedúnculos o apéndices. Movilidad No móvil, movilidad por deslizamiento; movilidad natatoria por flagelos; en enjambre (Swarming); movilidad por vesículas gaseosas. Metabolismo Mecanismos de conservación de la energía (fotótrofo, quimioorganótrofo, quimiolitótrofo); utilización de compuestos de carbono, nitrógeno, o azufre; fermentación de azúcares; fijación de nitrógeno; requerimiento de factores de crecimiento. Fisiología Rangos de temperatura, pH y sales para su crecimiento respuesta al oxígeno (aeróbico, facultativo, anaeróbico); presencia de catalasa y oxidasa; producción de enzimas extracelulares. Química celular Ácidos grasos; lípidos polares; quinonas respiratorias. Otros aspectos Pigmentos; luminiscencia; sensibilidad a antibióticos. Tabla 3. Características fenotípicas con valor taxonómico Universidad Abierta y a Distancia de México 21 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Para la tinción de las preparaciones se emplean colorantes, los cuales son compuestos orgánicos que tiene afinidad por determinados componentes celulares. Algunos colorantes presentan moléculas cargadas positivamente, es decir son básicos o catiónicos. Para poder realizar una tinción es necesario primero realizar un frotis (Figura 7) en un portaobjetos y fijarlo para posteriormente teñirlo con el proceso específico de cada tinción y observarlo al microscopio. Existen muchos tipos de tinciones que se emplean de forma general en el laboratorio, a continuación se mencionan sólo algunos de ellos: • Tinción de Gram: este tipo de tinción es el más empleado de forma rutinaria, revela la forma de la célula bacteriana, su agrupación y grupo taxonómico al que pertenece, ya sea Gram positivo o Gram negativo. Consiste en teñir primero con cristal violeta, lavar, agregar lugol, lavar, decolorar con alcohol acetona, teñir con safranina y lavar nuevamente. Las bacterias que retienen el cristal violeta se llaman Gram positivas (Gram +) y las que se decoloran y se tiñen en rojo por el colorante de contraste son Gram negativa (Gram -). Figura 7. Metodología para realizar un frotis. Primero se esteriliza el asa, se toma una pequeña muestra de la colonia y se coloca sobre un portaobjetos que contiene una gota de agua para posteriormente mezclarlo y expandirlo. Tomado de: http://www.geocities.ws/urtis_micro/sesiones/Gram.htm http://www.google.com.mx/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjRxqFQoTCO6SuoyeoscCFcV8kgodFXYLHA&url=http://www.geocities.ws/urtis_micro/sesiones/Gram.htm&ei=L4zKVa6_GcX5yQSV7K3gAQ&bvm=bv.99804247,d.aWw&psig=AFQjCNH8scL7FrvKsfQDDxi5LF6vvp9moQ&ust=1439423870576723 Universidad Abierta y a Distancia de México 22 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana • Tinción de Ziehl-Neelsen: este tipo de tinción es esencial para aquellas bacterias ácido-alcohol-resistentes como el bacilo que causa la tuberculosis. Se realiza tiñendo con fuscina fenicada a emisión de vapor por 3 minutos, para después decolorar con alcohol-ácido y lavar, posteriormente se tiñe con azul de metileno y se lava nuevamente. Las bacterias que son capaces de resistir la decoloración del alcohol-ácido, por las características de su membrana rica en lípidos, se observan de color rojo (BAAR = bacilo ácido alcohol resistente), mientras que las bacterias que son susceptibles a la decoloración se ven de color azul. Figura 8. Tinción de Gram. (a) Proceso de tinción y (b) observación microscópica de la tinción. Modificado de http://estudiantesenlaboratoristaquimico.blogspot.mx/2014/12/tincion-de- gram.html Figura 9. Tinción de Ziehl- Neelsen. Se observa de rojo el bacilo causante de la tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis. Tomado de: http://www.auxiliaresenfermeria.net/201 1/07/la-tincion-para-micobacterias.html Universidad Abierta y a Distancia de México 23 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana • Tinción de cápsula: las capsulas de las bacterias son frágiles, por lo que no se tiñen con los métodos comunes. Se utiliza una solución de colorante cristal violeta que se calienta y después se realiza un lavado con sulfato de cobre. La capsula bacteriana se tiñe de color azul pálido, mientras que la célula y su interior aparecen teñidas de color azul obscuro. • Tinción de Schaeffer y Fulton: algunas especies de bacterias producen intracelularmente estructuras especiales llamadas endosporas, que son célulasdiferenciadas resistentes al calor, agentes químicos y radiación. Para teñir estas estructuras se cubre el frotis con verde de malaquita y se calienta hasta observar vapores durante medio minuto, el colorante se elimina con agua y por último se agrega safranina. Las esporas retienen el color verde y las partes vegetativas se tiñen de rojo. • Tinción de flagelos: los flagelos de las bacterias son invisibles en las preparaciones comunes, por lo que solo pueden visualizarse con tinciones especiales. Los flagelos se observan en cultivos bacterianos recientes (12-18 horas) en caldo nutritivo. Se colocan 2 o 3 gotas de la muestra sin extenderlas, se fijan y se deja secar al aire, posteriormente se agrega una mezcla de agua destilada, fucsina básica, alcohol etílico, ácido tánico y cloruro de sodio, durante 5 a 15 minutos hasta observar un precipitado y se lava para finalmente Figura 10. Tinción de Shaeffer y Fulton. Del lado izquierdo se muestra el proceso de la tinción y del lado derecho la observación microscópica de Bacillus subtilis, con las esporas teñidas de verde. Tomado de http://bacillus8.blogspot.com/ http://www.google.com.mx/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjRxqFQoTCL2ClPmdoscCFUV_kgodDQgMFw&url=http://html.rincondelvago.com/bacterias_6.html&ei=BozKVb3nOcX-yQSNkLC4AQ&bvm=bv.99804247,d.aWw&psig=AFQjCNH8scL7FrvKsfQDDxi5LF6vvp9moQ&ust=1439423870576723 http://2.bp.blogspot.com/_r1GOyVmkVIw/S8EvLuMESAI/AAAAAAAAABI/DeiFi8Dp0jE/s1600/Bacillus+subtilis+spores+fig1 Universidad Abierta y a Distancia de México 24 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana observarse al microscopio electrónico. Observándose los flagelos de color rosa o rojo y el resto de la célula se observa de color rosa tenue o bien sin color. Otra herramienta que se emplea de forma cotidiana en el laboratorio para lograr la identificación de los microorganismos, es el empleo de pruebas bioquímicas, las cuales hay en una gran diversidad y ponen en evidencia distintas propiedades fisiológicas y bioquímicas, como se muestra en la tabla 4. Para realizar estas pruebas es necesario conocer detalladamente qué cambios sufren las bacterias durante los procesos metabólicos, cómo es que se llevan a cabo las reacciones bioquímicas, qué enzimas intervienen y cuáles son los productos intermedios que se generan. Para poder realizar las pruebas bioquímicas requerimos de un cultivo de microorganismos que sea puro para posteriormente inocularlo en medios de cultivo o caldos con sustancias nutritivas específicas e indicadores que van a poner en evidencia los cambios bioquímicos generados por los microorganismos. Figura 11. Tinción de flagelos. Se muestra la observación microscópica de una preparación de Salmonella thypi con tinción de flagelos que se observan en rosa claro. Tomado de http://salmonellathypi.blogspot.mx/ Universidad Abierta y a Distancia de México 25 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Prueba bioquímica Descripción Catalasa Detecta la presencia de catalasa, que convierte el peróxido de hidrógeno en agua y O2 Coagulasa Detecta la presencia de la coagulasa que provoca la coagulación del plasma. Fermentación de carbohidratos Se produce ácido y/o gas durante el crecimiento fermentador con azúcares y alcoholes de azúcares. Hidrólisis de caseína Detecta la presencia de la caseinasa, una enzima capaz de hidrolizar la proteína de la leche formando colonias en el medio con un halo claro. Hidrólisis de lípidos Detecta la presencia de lipasa, que rompe los lípidos en ácidos grasos simples y glicerol. Licuefacción de gelatina Detecta si la bacteria puede o no producir proteasas que hidrolizan la gelatina y licuan el medio sólido. Oxidasa Detecta la presencia de la citocromo c oxidasa que es capaz de reducir el O2 y aceptores de electrones artificiales. Reducción de nitratos Detecta si la bacteria puede usar nitrato como aceptor de electrones. Sulfuro de hidrógeno Detecta la formación de sulfuro de hidrógeno (H2S) a partir del aminoácido cisteína mediante la cisteina desulfurasa. Ureasa Detecta la enzima que rompe la urea en NH3 y CO2 Utilización de citrato Cuando se utiliza el citrato como única fuente de carbono, esto resulta en una alcalinización del medio. Modificado de Willey et al., 2009. Tabla 4. Algunas pruebas bioquímicas comunes empleadas para la identificación de bacterias Universidad Abierta y a Distancia de México 26 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana 1.2.3. Caracterización genotípica El análisis comparativo de genomas también proporciona numerosos rasgos que permiten discriminar distintas especies bacterianas. El análisis genotípico presenta un especial atractivo para la taxonomía microbiana porque proporciona una visión a nivel del DNA. A continuación se muestran en la tabla 5 las técnicas más empleadas para realizar la caracterización genotípica y en la figura 12 la resolución taxonómica de algunas de ellas. Cuando la secuencia del gen 16S del rDNA tiene una similitud entre organismos ≤ 98.7% los miembros son de diferentes especies. Los microorganismos no cultivables no pueden ser asignados a una especie definitiva puesto que su fenotipo no se conoce, pero pueden ser asignados a una designación “Candidata” provista de la secuencia del gen 16S, dependiendo de la similitud que presente con otras especies conocidas (Sarethy y Danquah, 2014). Universidad Abierta y a Distancia de México 27 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Método Descripción/Aplicación Hibridación DNA- DNA Comparación de similitud de genomas. Útil para diferenciar especies dentro de un género Huella genómica Ribotipado, RFLP, rep-PCR. Métodos rápidos para diferenciar entre especies y entre cepas dentro de una misma especie. MLST Tipado de cepas utilizando las secuencias de DNA de múltiples genes. Alta resolución, útil para diferenciar cepas muy cercanas dentro de una misma especie. Contenido GC Porcentaje de pares de bases de guaninas más citosinas en el genoma. Es menos común en taxonomía porque tiene una resolución pobre. Si el porcentaje de GC de dos organismos difiere en más de un 5%, estos no pueden estar muy emparentados, pero organismos con porcentajes GC muy similares o incluso idénticos pueden no tener relación alguna. Secuenciación de ácidos nucleicos Secuenciación del rRNA de la subunidad pequeña (SSU rRNA). Estas secuencias desempeñan la misma función en todos los microorganismos ya que es necesario para la supervivencia y no soportan grandes mutaciones. Comparación de proteínas Movilidad electroforética, secuenciación de proteínas. Se basan en estudiar proteínas que son el reflejo del mRNA y por lo tanto de los genes que las codifican. Tabla 5. Métodos genotípicos utilizados en taxonomía bacteriana Universidad Abierta y a Distancia de México 28 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana 1.2.4. Filogenia microbiana Los datos filogenéticos se usan cada vez más en la taxonomía bacteriana para complementar la información fenotípica y genotípica. Además el análisis filogenético permite encuadrar a los organismos en un sistema de clasificación estructurado conforme a sus relaciones evolutivas, lo que constituye un objetivo esencial de la sistemática microbiana. La taxonomía microbiana está cambiando con rapidez. Esto se debe a los conocimientos crecientes sobre la biología de los microorganismos, a los avances notables realizados en el mundo de la informática y al uso de las características moleculares para determinar relaciones filogenéticas entre microorganismos (Willey et al., 2009). Algunas de lastécnicas que se emplean para estudiar la filogenia microbiana son: A) Cronómetros moleculares. Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas cambian con el tiempo por lo que se les consideran cronómetros moleculares dentro Figura 12. Resolución taxonómica relativa de diversas técnicas moleculares. Se muestra el alcance de diferenciación para cada una de las técnicas moleculares empleadas en taxonomía y filogenia. Modificado de: Willey et al., 2009. Universidad Abierta y a Distancia de México 29 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana del reloj evolutivo. La secuencia de muchos rRNA y proteínas cambian gradualmente con el tiempo sin destruir ni alterar gravemente sus funciones, además ocurren de forma aleatoria y se van acumulando linealmente con el tiempo. Cuando las secuencias de moléculas similares son bastantes diferentes en dos grupos de organismos, los grupos divergieron mucho tiempo atrás B) Árboles filogenéticos. Las relaciones filogenéticas se representan en diagramas ramificados o árboles. 1.2.5. Árboles filogenéticos Un árbol filogenético muestra las relaciones evolutivas entre varias especies u otras entidades que se cree que tienen un ancestro en común y está representado por ramas y nodos (Solomon et al 2008). Los nodos internos representan a los ancestros, los nodos intermedios representan los puntos en el curso de la evolución donde se produjo la divergencia del ancestro en las nuevas entidades, y las ramas representan las nuevas especies evolutivas. La longitud de cada rama corresponde al número de cambios que se han sucedido a lo largo de dicha rama. Los árboles filogenéticos pueden tener raíz o estar desprovistos de ella, como se observa en la siguiente imagen: Es la representación gráfica de la relación existente entre secuencias de diferentes organismos que muestra una historia evolutiva a partir de diferencias en la secuencia de nucleótidos en un formato de tipo árbol genealógico. Árbol filogenético Universidad Abierta y a Distancia de México 30 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana En los árboles filogenéticos se pueden diferenciar varios grupos de especies dependiendo del origen evolutivo de las especies (Figura 14): A) Monofilético: Es un grupo de organismos que presentan un antepasado común con todos y cada uno de sus descendientes. B) Parafilético: Se forma en el caso de que falten algunos de los descendientes, los cuales han sido incluidos en otros grupos. C) Polifilético: Se construye cuando hay organismos de varios clados, es decir, que no proceden de un antepasado común cercano; simplemente, se han reunido por conveniencia de los investigadores. Los árboles filogenéticos se desarrollan comparando secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Para comparar dos moléculas, primero sus secuencias deben estar alineadas de tal forma que las partes similares coincidan. El objetivo es alinear y comparar secuencias homólogas, que son aquellas que son similares porque tuvieron un origen común en el pasado. Ésta no es una tarea sencilla, y deben emplearse ordenadores y procesos matemáticos bastante complejos para reducir al mínimo el número de huecos y apareamientos incorrectos de las secuencias que se comparan. Figura 13. Ejemplos de árboles filogenéticos. A) Árbol sin raíz que une cuatro unidades taxonómicas. B) Árbol con raíz. Modificado de Willey et al., 2009. Figura 14. Diferentes grupos identificados en un árbol filogenético. De azul se ejemplifica un grupo monofilético, de verde uno parafilético y de rojo uno polifilético. Tomado de: Cavalier-Smith, 2010. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Taxonomy_-_monophyletic,_paraphyletic_and_poliphyletic_groups.svg Universidad Abierta y a Distancia de México 31 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Una vez que se han alineado las moléculas, se determina el número de posiciones que varían en las secuencias. Estos datos se utilizan para calcular una medida de la diferencia entre las mismas, la cual la podemos expresar en forma de distancia evolutiva (Willey et al., 2009). La divergencia de los organismos representa las diferencias en las secuencias genéticas que pueden ser cambiadas en cada grupo dependiendo de su evolución. El fenómeno de transferencia genético juega un rol clave en el paso de genes entre organismos en la historia evolutiva más temprana. Esto ocurre como respuesta a cualquier cambio en el ambiente y provee una mejor adaptación (Sarethy y Danquah, 2014). 1.3. Virus Los virus son los microorganismos más numerosos de nuestro planeta y sin embargo todavía no pueden ser introducidos en la clasificación del gran árbol de la vida, debido a que existe el gran dilema de si clasificarlos como seres vivos o no. Es por ello que vamos a analizar diferentes características de ellos para intentar responder esta gran interrogante. Los virus infectan todo tipo de organismos celulares, además de que son herramientas importantes en el área de la genética microbiana y la ingeniería genética. Estos organismos son estudiados por la virología. Es importante que recuerdes el significado y utilidad de los árboles filogenéticos, ya que en la asignatura de “Bioinformática” construirás distintos árboles empleando diversos fundamentos matemáticos. Enlace Son elementos genéticos que no pueden replicarse independientemente de una célula viva, llamada célula hospedadora. Virus Universidad Abierta y a Distancia de México 32 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Los virus son parásitos intracelulares obligados que tienen que introducirse en una célula viva adecuada para llevar a cabo su ciclo de replicación, sin embargo, los virus poseen su propia información genética y una forma extracelular denominada partícula vírica que les permite existir fuera del hospedador durante largos periodos y que facilita la transmisión entre una célula y otra (Madigan et al., 2009). Después de que los virus se introducen en la célula, explotan su maquinaria metabólica y le confiere nuevas propiedades que son heredables en el proceso de división celular. Los virus se pueden clasificar con base en los hospedadores que infectan: en virus bacterianos (bacteriófagos), animales o vegetales; aunque también pueden clasificarse por el genoma que presentan: si están formados por DNA o RNA, de una o dos cadenas o si su estructura es lineal o circular (Tabla 6 y figura 15). Proceso mediante el cual los virus entran en una célula hospedera para poder replicarse. Transfección Universidad Abierta y a Distancia de México 33 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Clase Descripción del genoma y estrategia de replicación Ejemplos Virus bacterianos Virus animales I Genoma de DNA bicatenario Labda, T4 Herpesvirus, viruela II Genoma de DNA monocatenario ϕX174 Virus de anemia aviar III Genoma de RNA bicatenario ϕ6 Reovirus IV Genoma de RNA monocatenario positivo MS2 Poliovirus V Genoma de RNA monocatenario negativo Virus de la gripe, virus de la rabia VI Genoma de RNA monocatenario que se replica con un intermediario de DNA Retrovirus VII Genoma de DNA monocatenario que se replica con un intermediario de RNA Virus de la hepatitis B Modificado de Madigan et al., 2009. Tabla 6. Sistema de clasificación de Baltimore para los virus Universidad Abierta y a Distancia de México 34 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana 1.3.1. Características y estructura de los virus Cuando los virus se encuentra en su forma extracelular se llaman viriones y son una partícula microscópica que contiene ácido nucleico rodeadopor proteínas y otras macromoléculas, pero no realizan ninguna actividad metabólica. Los viriones pueden tener muchos tamaños y formas diferentes. La mayoría de ellos presentan un tamaño entre los 20 y 300 nm. El ácido nucleico del virión siempre está localizado en el interior de la partícula, rodeado por una cubierta proteica llamada cápside (Figura 16). Esta cubierta está compuesta por una serie de moléculas proteicas individuales llamadas capsómeros, que siguen un patrón preciso y altamente repetitivo alrededor del ácido Figura 15. Representación de la clasificación de Baltimore para los virus. Se muestra en la parte superior la forma del DNA que presentan los distintos grupos y en la parte de abajo el proceso que requieren para transformarlo a mRNA en la célula huésped. Modificado de: http://seramix.blogs.uv.es/2013/02/28/david-baltimore-creando-orden-en- el-caos/ Universidad Abierta y a Distancia de México 35 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana nucleico. Los capsómeros son las unidades morfológicas más pequeñas que se pueden ver en un microscopio óptico. Los distintos tipos morfológicos de virus resultan principalmente de la combinación de un tipo particular de simetría de la cápside, con la presencia o ausencia de una envoltura. Existen tres tipos de simetría de la cápside: helicoidal, icosaédrica y compleja (Willey et al., 2009) (Figura 17). Al complejo completo de ácido nucleico y proteínas empaquetado en el virión se le da el nombre de nucleocápside, y en algunos casos puede contener también enzimas específicas del virus que ayudan en los procesos de infección y replicación. Algunos virus están desnudos, mientras que otros poseen una membrana alrededor de la nucleocápside, que forman lo que se conoce como envoltura. Esta envoltura consiste en una bicapa lipídica con proteínas, normalmente glicoproteínas, integradas en ella. Los lípidos de la membrana vírica son derivados de las membranas de la célula hospedadora, pero las proteínas están codificadas por genes del virus (Madigan et al., 2009). Las proteínas víricas se clasifican en dos categorías: A) Proteínas tempranas. Son aquellas que son sintetizadas inmediatamente después de la infección y que son necesarias para la replicación del ácido nucleico del virus. B) Proteínas tardías. Son aquellas que se sintetizan más tarde e incluyen las proteínas de cubierta del virus. Figura 16. Estructura viral. En la parte izquierda se muestra un virus desnudo, en medio uno con envoltura y en el extremo derecho se observa la estructura de un bacteriófago. Tomado de: https://askabiologist.asu.edu/ataque-viral-virus y http://recursos.cnice.mec.es/biologia/bachillerato/segundo/biologia/ud07/02_07_04_02_0 21.html http://recursos.cnice.mec.es/biologia/bachillerato/segundo/biologia/ud07/02_07_04_02_021.html Universidad Abierta y a Distancia de México 36 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana 1.3.2. Replicación viral Para que un virus pueda replicarse, debe inducir a una célula hospedadora a sintetizar todos los componentes esenciales necesarios para producir más viriones. Luego, estos componentes deberán ensamblarse en nuevos viriones que escaparán de la célula. La replicación vírica se divide en cinco etapas (Figura 18): Figura 17. Principales familias de virus que infectan vertebrados. Del lado izquierdo se muestran virus sin envoltura con diferente estructura de cápside y DNA o RNA, del lado derecho se observan virus con envoltura con diferente forma y DNA o RNA. Tomado de http://datateca.unad.edu.co/contenidos/203016/Modulo_EXE/leccin_2_clasificacin_de_los_vir us.html Universidad Abierta y a Distancia de México 37 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana 1. Unión (adsorción) Es la etapa inicial donde el virión se une a la célula hospedadora susceptible a través de receptores. 2. Penetración (entrada o inyección) En esta etapa el material genético del virus o el virión completo son introducidos en la célula. 3. Síntesis Se sintetizan los ácidos nucleicos y las proteínas del virus por el metabolismo celular redirigido por el virus. 4. Ensamblaje Se unen las cápsides y los componentes de la membrana del virus (en caso de que sea envuelto) y se empaquetan junto con el genoma vírico formando nuevos viriones. 5. Liberación En esta última fase los viriones maduros son liberados de la célula hospedera. Replicación viral Figura 18. Esquema de la replicación viral. 1) Unión del virus a la célula hospedera, 2) penetración a la célula, 3) síntesis y ensamblaje de componentes virales, 4) liberación de la progenie viral. Tomado de https://eduardosetti.wordpress.com/2014/04/04/sobre-virus-malos-y-buenos/ https://eduardosetti.files.wordpress.com/2014/04/replicacion-del-virus.jpg Universidad Abierta y a Distancia de México 38 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Todos los ácidos nucleicos virales, sin importar cuál sea su condición deben ser transformados a mRNA para poder ser traducidos por la maquinaria celular, y en algunos casos este proceso es único de los virus, como la retrotranscripción o la transcripción inversa, donde el RNA monocatenario pasa a DNA por medio de una enzima llamada transcriptasa inversa o retrotranscriptasa (Ej. Retrovirus). Los virus pueden infectar de diferentes maneras en las células: A) Infección lítica, que provoca la destrucción de la célula hospedadora cuando se liberan los virus. En algunos casos, con los virus recubiertos, la liberación de los viriones, que se produce por una especie de proceso de gemación, puede ser lenta y es posible que no se lise la célula hospedadora; así pues la célula infectada puede seguir viva y continuar produciendo virus indefinidamente, estas infecciones se llaman infecciones persistentes. B) Infección latente, donde existe una demora entre la infección por el virus y los sucesos de lisis. La etapa latente en la infección vírica de una célula animal se debe a que los virus existen en un estado relativamente inactivo en el interior de las células, donde sigue produciéndose la transcripción a un bajo nivel pero el DNA viral no se replica. C) Vía lisogénica, ocurre en el caso de los bacteriófagos, donde el virus denominado atemperado no expresa sus genes pero su genoma (profago) se replica en sincronía con el cromosoma del hospedador, pasando esa información durante la división celular a las células de la siguiente generación. En ciertas condiciones los virus lisógenos pueden revertir a la vía lítica y empezar a producir viriones (Figura 19). Figura 19. Ciclo de vida de un bacteriófago. Una vez introducido a la célula el virus puede entrar en vía lítica (a) o lisogénica (b). Tomado de http://biologocalentano.blogspot.mx/2 012/06/91-mecanismos-de- transferencia-natural.html http://1.bp.blogspot.com/-7nHxxvXGIZI/T8udhXygauI/AAAAAAAAArg/lbLLUIYS_Hg/s1600/DD.jpg Universidad Abierta y a Distancia de México 39 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Algunos virus son parásitos de otros virus, conocidos como virus auxiliares. Algunos de estos virus llamados defectivos dependen de virus intactos del mismo tipo para que les proporcionen las funciones necesarias. Otro tipo de virus auxiliares son los satélite que dependen de virus que no están emparentados con ellos para que actúen como auxiliares. Existen otras estructuras muy similares a los virus como los viroides que ocasionan muchos problemas en plantas y los priones que ocasionan enfermedades en animales (encefalopatía espongiforme bovina o enfermedad de las vacas locas) y en humano (enfermedad de Creutzfeldt-Jakob) (Madigan et al., 2009).1.3.3. Cultivo de virus Como los virus se replican únicamente en el interior de las células vivas, su cultivo requiere el uso de hospederos adecuados. Para el estudio de los bacteriófagos se utilizan cultivos puros en medios líquidos o semisólidos. La mayoría de los virus animales y algunos vegetales pueden crecer en cultivos tisulares o celulares, lo que ha facilitado la investigación sobre ellos. Los virus vegetales, son los más difíciles de trabajar, porque su estudio requiere el uso de la planta completa en muchas ocasiones, lo que lo hace un proceso lento. Durante muchos años, los investigadores han cultivado virus de animales inoculando huéspedes animales adecuados o huevos embrionados. Para ello se emplean huevos de gallina fertilizados incubados durante aproximadamente 6 a 8 días después de la puesta y posteriormente se sigue el procedimiento que se muestra a continuación (Willey et al., 2009) (Figura 20): Viroides Se definen como moléculas infecciosas de RNA que se diferencian de los virus en que carecen de cubierta proteica. Priones Son partículas cuya forma extracelular diferenciada está formada únicamente por proteínas y que no contienen material genético. Viroides y priones Universidad Abierta y a Distancia de México 40 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Más recientemente se han cultivado virus de animales en cultivos de tejidos en monocapas de células animales. Este tipo de cultivos derivan de células tomadas inicialmente de un órgano de un animal experimental. A menos que se utilicen células sanguíneas, los cultivos celulares suelen obtenerse eliminando asépticamente fragmentos de tejido, disociando las células mediante tratamiento con un enzima que rompa el cemento intercelular y esparciendo la suspensión resultante en una superficie plana como la base de un matraz de cultivo o una placa de Petri. La fina capa de células que se adhieren al cristal o a la placa de plástico, llamada monocapa, se cubre con un medio de cultivo adecuado y se incuba a 1. Desinfectar la cáscara del huevo con yodo. 2. Perforar con una pequeña taladradora estéril uno de los extremos del huevo. 3. Inocular la muestra de virus en el embrión, en la región adecuada donde se reproduzca el mismo. 4. Sellar con gelatina la abertura. 5. Incubar el huevo. Cultivo en embrión de pollo Figura 20. Cultivo de virus en embrión de pollo. Se observa la inoculación del virus en el embrión a través de una opturación en condiciones asépticas. Tomado de: http://www.actualidadavipecuaria.com/alfabiol/productos/servicios/analisisdelaborato rio/diagnostico-virologico.html Universidad Abierta y a Distancia de México 41 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana la temperatura adecuada. El medio de cultivo empleado es muy complejo, ya que contiene toda una serie de aminoácidos y vitaminas, sales, glucosa y un sistema regulador de pH. Para obtener el mejor crecimiento suele ser necesaria la adición de una pequeña cantidad de suero sanguíneo y varios antibióticos para evitar la contaminación bacteriana. Como resultado de la infección viral en las células se forman áreas localizadas de destrucción celular y lisis denominadas placas o calvas que se pueden detectar si se tiñen con colorantes como el rojo neutro o el azul tripano, que permiten distinguir las células vivas de las muertas. El crecimiento vírico no siempre resulta en la lisis de las células para formar una placa, en ocasiones se generan cambios o anomalías degenerativas microscópicas o macroscópicas en las células huésped y en los tejidos denominado efecto citopático, los cuales pueden ser letales en ocasiones (Figura 21). Los virus de bacterias y de arqueas se cultivan en cultivos sólidos o líquidos de células jóvenes. En algunos cultivos infectados se destruyen tantas células huésped que los cultivos turbios se clarifican rápidamente por la lisis celular. Figura 21. Cultivo de virus en células eucarióticas. Se muestra en color blanco las placas formadas por la infección de las células con diferentes concentraciones de virus. Tomado de http://ticotal.cr/boletin-informativo/ticotal-boletin-informativo-n19- setiembre-2014.html Universidad Abierta y a Distancia de México 42 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Los cultivos con agar se preparan de la siguiente manera: Las células en la capa de agar superior crecerán formando una capa continua, opaca, o “césped”. En el lugar donde caiga un virión se producirá la lisis de las células y por lo tanto una placa o zona clara en el césped en el agar debido a la infección de las células por el virus (Willey et al., 2009). Actividades La elaboración de las actividades y evidencias de aprendizaje estarán guiadas por tu docente en línea, mismo que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como la fecha de entrega de tus productos. Para el envío de tus trabajos utilizarás la siguiente nomenclatura: BMTM_U1_A1_XXYZ, donde BMTM corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir considerando la actividad que se realices, en el caso de la evidencia de aprendizaje se deberá colocar EA; asimismo, XX son las primeras letras de tu nombre y la primera letra de tu apellido paterno y Z corresponde a la primera letra de tu apellido materno. Autorreflexiones Para la parte de autorreflexiones debes de consultar el foro Preguntas de Autorreflexión para realizar la actividad correspondiente y enviarlo a la herramienta de Autorreflexiones. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. 1. Mezclar los virus con agar líquido atemperado y un cultivo de las células huésped adecuadas. 2. Verter la mezcla rápidamente en una placa de Petri que contenga una capa de agar estéril. 3. Dejar solidificar. 4. Incubar. Cultivo de virus en agar Universidad Abierta y a Distancia de México 43 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BMTM_U2_ATR _XXYZ, donde BMTM corresponde a las siglas de la asignatura, U1 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno. Cierre de la unidad En esta primera unidad vimos una introducción al mundo de la microbiología, con el estudio de la taxonomía, filogenia. Conociste en qué se basan y cuáles son las grandes clasificaciones de los seres vivos, además de conocer los fundamentos de la nomenclatura microbiana, que es tan importante para el biotecnólogo. También nos introdujimos al mundo de la virología, conociendo las principales características de estos organismos que son tan útiles en las nuevas herramientas de la biología molecular y que además afectan muchas áreas de la industria en el mundo. Ahora te invitamos a conocer más sobre el mundo microscópico en la segunda unidad de esta asignatura para comprender mejor los procesos de crecimiento y cómo sacarles provecho a nivel industrial y médico. Universidad Abierta y a Distancia de México 44 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Para saber más Consulta los siguientes videos: https://www.youtube.com/watch?v=7RGlBQlEY2w https://www.youtube.com/watch?v=W-TvFouJhrM https://www.youtube.com/watch?v=2vz9YcXAMoI https://www.youtube.com/watch?v=57UKFLnYpFM https://www.youtube.com/watch?v=GmWR8_62F1I https://www.youtube.com/watch?v=HuPmUk842wQ https://www.youtube.com/watch?v=1a0l5FcQQJw https://www.youtube.com/watch?v=aO4V_LpcEJohttps://www.youtube.com/watch?v=KyI8cu-nzRc https://www.youtube.com/watch?v=fNS9eHPXoRY Universidad Abierta y a Distancia de México 45 U1 Microbiología y taxonomía microbiana Taxonomía microbiana Fuentes de consulta 1. Cavalier-Smith T. (2010). "Deep phylogeny, ancestral groups and the four ages of life". Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365(1537): 111–132. 2. Madigan M. T., Martinko J.M., Dunlap P.V., Clark D.P. (2009). Brock. Biología de los microorganismos. Pearson Educación. Doceava edición. 3. Sarethy I.P., Pan S., Danquah D.K. (2014). Biodiversity - The Dynamic Balance of the Planet. Intech. 4. Sharma R, Polkade A.V., Shouche Y.S. (2015). ‘Species concept’ in microbial taxonomy and systematics. Current Science. 108(10): 1804-1814. 5. Willey,J.M., Sherwood L. M., Woolverton C.J. (2009). Microbiología. Mc. Graw Hill / Interamericana. Séptima edición.
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