57916060005

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Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas
ISSN: 1870-0195
rmcf@afmac.org.mx
Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C.
México
Mariel Cárdenas, Jairo; Martínez Saldaña, Ma. Consolación; Jaramillo Juárez, Fernando; Rodríguez-
Vázquez, María Luisa; Gutiérrez-Cantú, Francisco Javier; Posadas del Río, Francisco A.; Avelar-
González, Francisco Javier; Guerrero Barrera, Alma Lilián
Efecto protector del Ginkgo biloba en el daño inducido por paratión metílico en células de la capa
granulosa de cerebelo en rata
Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, vol. 41, núm. 4, octubre-diciembre, 2010, pp. 37-42
Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C.
Distrito Federal, México
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37
Efecto protector del Ginkgo biloba en el daño 
inducido por paratión metílico en células de la capa 
granulosa de cerebelo en rata
The protective effect of Ginkgo biloba on the damage induced
by methyl parathion in cerebellar granule cells of rat
Jairo Mariel Cárdenas1,2, Ma. Consolación Martínez Saldaña2, Fernando Jaramillo Juárez2,
María Luisa Rodríguez-Vázquez2, Francisco Javier Gutiérrez-Cantú1,2, Francisco A. Posadas del Río2, 
Francisco Javier Avelar-González2, Alma Lilián Guerrero Barrera2
1Facultad de Estomatología, Universidad Autónoma de San Luis Potosí
2Centro de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de Aguascalientes
Resumen
El paratión metílico en dosis única (12 mg/kg, v.o.) o por tratamiento crónico (1 mg/kg/día v.o. durante 30 días) provocó daño 
estructural y pérdida de células en la capa granular del cerebelo de ratas macho Wistar adultas (275g ± 25g de peso), registrado 
a través de análisis histológico semicuantitativo. El extracto estandarizado de Ginkgo biloba (69.8 µg/kg/día i.p., cada tercer 
día durante 30 días) o N-acetil cisteína (150 mg/kg/día i.p., cada tercer día durante 30 días) administrados como antioxidantes, 
registraron un efecto neuroprotector significativo (P < 0.05) en las células de la capa granulosa en el tratamiento crónico. Los 
resultados demuestran el efecto neuroprotector de los antioxidantes empleados que revirtieron el daño causado por paratión 
metílico en cerebelo de rata.
Abstract
The administration of methyl parathion as a single dose (12 mg / kg, p.o.) or chronic treatment (1 mg/kg/ day p.o. for 30 days) 
caused structural damage and loss of cells in the granular layer of cerebellum from adult Wistar male rats (weight 275g ± 25g), 
recorded by semiquantitative histological analysis. When we administered the standardized extract of Ginkgo biloba (69.8 µg/kg/
day i.p., every other day for 30 days) or N-acetylcysteine (150 mg/kg/day i.p., every other day for 30 days) as antioxidants, there was 
a significant neuroprotective effect (P <0.05) in the granular layer cells of rat cerebellum, only during chronic treatment. The results 
demonstrate the antioxidant neuroprotective effect that revert the damage caused by methyl parathion in the rat cerebellum.
Palabras clave: paratión metílico, Ginkgo biloba, cerebelo, 
estrés oxidativo.
Keywords: methyl parathion, Ginkgo biloba, cerebellum, 
oxidative stress.
Correspondencia
Dra. Alma Lilián Guerrero-Barrera
Centro de Ciencias Básicas, UAA.
Av. Universidad 940
C. U. Aguascalientes, Ags., México. CP. 20100
Tel. 52 449 910 7400 Ext. 342
Fax. 52 449 910 8401
e-mail: alguerre@correo.uaa.mx
Fecha de recepción: 15 de abril de 2010
Fecha de recepción de modificaciones: 28 de octubre de 2010
Fecha de aceptación: 12 de noviembre de 2010
Trabajo Científico
Volumen 41 • Número 4 • Octubre - Diciembre 2010
38
Introducción
El paratión metílico (PM) y otros compuestos organofosforados 
(COF) son usados comúnmente en la agricultura como insecticidas 
y, en menor grado, como helminticidas, acaricidas, nematocidas 
y fungicidas.1,2,3,4 El PM posee un alto grado de absorción 
por diferentes vías (oral, cutánea, inhalación) y se distribuye 
rápidamente a los tejidos del cuerpo depositándose con mayor 
facilidad en los tejidos adiposo y nervioso. La conversión de PM 
a su metabolito activo paraoxón ocurre dentro de los primeros 
minutos de absorción.5 Las intoxicaciones por COF son comunes 
y su daño se debe principalmente a la inhibición de la enzima 
acetilcolinesterasa en el Sistema Nervioso Central (SNC) y 
Periférico (SNP), con la subsecuente acumulación de acetilcolina 
en las sinapsis colinérgicas,6 así como la sobre estimulación de 
los receptores colinérgicos muscarínicos y nicotínicos en ambos 
sistemas.7,8,9 Estudios recientes indican que las manifestaciones 
tóxicas inducidas por los COF pueden tener efecto no colinérgico 
asociado con un aumento en la producción de especies reactivas de 
oxígeno (ROS).10,11 Los valores agudos de toxicidad del PM a dosis 
letal son de 11.7-14 mg/kg del peso corporal en ratas macho.12,13
Los COF pueden inducir estrés oxidativo conduciendo a la 
generación de ROS que disminuyen las actividades de enzimas 
antioxidantes. In vivo, la peroxidación lipídica es uno de los 
daños principales de los ROS en los tejidos, incluyendo al 
SNC según lo descrito para el malatión14,15,16 y para el paratión 
metílico.17 Por otra parte, los efectos tóxicos de los COF también 
son asociados a un aumento en ROS durante la desulfuración 
oxidativa de estos pesticidas, por el sistema de la enzima 
citocromo P450, al inducir la formación de paraoxón metílico en 
SNC de rata.18,19,20,21,22 Los efectos antes descritos causan daño 
estructural al cerebro de rata en cultivos celulares de células de 
la capa granulosa de cerebelo.23
El daño ocasionado por los ROS puede ser atenuado por 
antioxidantes naturales o sintéticos. El extracto estandarizado 
de Ginkgo biloba (EGb) contiene dos componentes bioactivos 
principales: f lavonoides y terpenoides. Los f lavonoides 
neutralizan los radicales libres de oxígeno e hidroxilo, 24, 25 y 
poseen un efecto inhibidor de la lipoperoxidación.26 El efecto 
neuroprotector del EGb ha sido demostrado en varios modelos 
in vitro e in vivo.27,28 Por ello, el EGb ha sido usado de manera 
terapéutica durante décadas para incrementar el flujo de sangre 
periférica y cerebral.29,30 Otros mecanismos que se pueden 
implicar en el efecto neuroprotector del EGb son la modulación 
de la homeostasis iónica, niveles de glucocorticoides y síntesis 
de los factores de crecimiento.31
Uno de los antioxidantes cuyo efecto ha sido estudiado 
ampliamente en modelos animales de experimentación es la 
N-acetil-cisteína,32 especialmente relacionado con el estrés 
oxidativo generado por pesticidas.33,34,35,36
Como se mencionó anteriormente, los ROS causan daño 
estructural al cerebro de rata en cultivos celulares de células de la 
capa granulosa de cerebelo.23 El daño ocasionado sobre el cerebelo 
puede afectar directamente el tono muscular y la coordinación 
motriz del organismo.37 Por lo anterior, el objetivo de este trabajo 
fue investigar el efecto protector del EGb sobre el daño inducido 
por PM en el tejido cerebelar de ratas Wistar macho adultos, 
analizando los cambios en organización y población celular, 
usando como antioxidante control la N-acetil cisteína.
Material y método
Se usó paratión metílico grado técnico (95% de pureza) 
(Cheminova Agro de México S. A) que fue disuelto en aceite 
de maíz libre de antioxidantes. El EGb (Vasodil, Nicomed, 
México) se usó como solución concentrada que fue diluidacon 
agua bidestilada (1:1) para alcanzar la concentración apropiada. 
La N-acetil cisteína (NAC) fue obtenida de INC Biomedicals 
Inc. Todos los demás reactivos empleados fueron grado analítico 
(JT Baker).
Se trabajó con ratas Wistar machos adultos (275 g ± 25 g). Los 
animales se colocaron en jaulas limpias y tuvieron acceso libre 
al agua y al alimento para roedores (Ralston Rations-Kansas, 
KA). La temperatura ambiente fue de 24±2 °C, con ciclos de 
luz/oscuridad de 12 h. El cuidado y manejo de los animales se 
hizo de acuerdo a las normas internacionales establecidas para 
ello (Guiding Principles in the Use of Animals in Toxicology).
I. Protocolos experimentales
Ochenta ratas Wistar machos adultos fueron divididos en dos 
lotes: a) intoxicación aguda y b) intoxicación crónica. En cada 
tratamiento se usaron cuatro grupos de ratas (10/grupo): control 
(1) y tratados con PM (3).
a) Intoxicación aguda.
Cuatro grupos de ratas (n=10) fueron usadas para evaluar los 
efectos del EGb y NAC: 1) control a las que se les administró 
aceite de maíz (0.25 mL/día, v.o. por cinco días); 2) tratados 
con PM (12 mg/kg, v.o., dosis única); 3) EGb (69.8 µg/kg/día, 
i.p. por cinco días) y posteriormente PM (12 mg/kg, v.o., dosis 
única); 4) tratados NAC (150 mg/kg/día, i.p.) de manera previa 
al PM (12 mg/kg, v.o., dosis única).
b) Intoxicación crónica.
Cuatro grupos de ratas fueron usados para evaluar los efectos 
del EGb y de NAC, durante 30 días como sigue: 1) control a 
las que se les administró aceite de maíz (0.25 mL/día, v.o.); 2) 
tratados con PM (1 mg/kg/día v.o.); 3) EGb (69.8 µg/kg/día, 
i.p. cada tercer día) más la dosis diaria de PM (1 mg/kg/día v.o.); 
4) NAC (50 mg/kg/día, i.p. cada tercer) más la dosis diaria de 
PM (1 mg/kg/día v.o.).
39
II. Fijación y perfusión
Luego de recibir los tratamientos respectivos, cinco animales 
de cada grupo (controles y experimentales) fueron anestesiados 
con pentobarbital sódico (25 mg/kg, v.i.). La caja torácica fue 
expuesta y se perfundió en el ventrículo izquierdo del corazón 
solución buffer de fosfato (pH7.4) con heparina (1000 U) y 
procaína (1g/L), con una bomba peristáltica (25 mL/min), para 
eliminar los residuos de sangre; posteriormente se administró 
la solución fijadora que contiene solución buffer de fosfato (pH 
7.4) y formalina (10%).38
III. Análisis histológico y conteo celular
Los especímenes fueron procesados por la técnica de inclusión 
en parafina para su evaluación en el microscopio óptico. Se 
realizaron cortes seriados de 5 µm en la vermis cerebelar y se 
tiñeron con Hematoxilina y Eosina (H&E).39 Se obtuvieron 
las imágenes con un microscopio Zeiss Axioscope 40 equipado 
con un analizador de imágenes (Image Pro Plus, Cybernetics). 
Cinco campos de diferentes muestras al azar fueron analizadas 
para cada tratamiento. En cada uno de los campos se calcularon 
la media aritmética de la población celular y se comparó con los 
otros tratamientos.
IV. Análisis estadístico
El cálculo de tamaño de muestra se realizó de acuerdo a la 
formula de Hulley y Cummins.40 En cada tratamiento se 
analizaron 15 muestras. Se aplicó la prueba de Tukey para hacer 
las comparaciones estadísticas, con intervalos de confianza al 
95% y un margen de error de 5%.
Resultados y discusión
El PM ha sido utilizado ampliamente en todo el mundo.4 Produce 
alteraciones neuropatológicas que van desde la intoxicación leve 
hasta la muerte por falla respiratoria.9 En este trabajo, se tuvo 
una mortalidad de animales de experimentación del 20% (24 
horas después de la administración del PM).
Efecto protector del EGb contra el daño estructural de 
tejido nervioso inducido por PM
Como se expuso anteriormente, el PM inhibe a la enzima 
acetilcolinesterasa6-9 y también induce la producción de 
ROS.10,11,17 Guo-Ross4 y cols., reportaron que en cerebelo 
el efecto inhibidor del PM es insignificante. En el presente 
trabajo se observó que el tratamiento agudo y crónico del PM 
altera la estructura celular de vermis cerebelar, disminuyendo 
y desorganizando las células de la capa granulosa (Figuras 1B 
y 2B, respectivamente). La estructura normal se observa en la 
figura 1A. A su vez, la administración previa de EGb (Figura 
1C) y NAC (Figura 1 D) producen una ligera atenuación en 
estos cambios celulares.
En la intoxicación crónica, la estructura normal se observa 
en la figura 2A. El tratamiento con los antioxidantes usados 
disminuyó la magnitud del daño y mostró una tendencia a 
preservar la organización celular: EGb + PM (Figura 2C) y 
NAC + PM (Figura 2D). Los resultados obtenidos sobre el 
daño estructural a las neuronas concuerdan con los resultados 
de otros estudios realizados con paraoxón,18-22 así como en los 
cultivos celulares de neuronas de cerebelo.23
Conteo Celular. Acción antioxidante para preservar la 
población celular contra el PM
Estudios anteriores han demostrado los efectos antioxidantes 
del EGb,24,25,26,29,30 su protección al sistema nervioso,27,28 así 
como su efecto en la rápida recuperación del tejido nervioso. 
Por otra parte, se ha demostrado que la NAC contrarresta la 
tensión oxidativa32,35,36 generada por el carbofurano,33 y por el 
diazinón.34
El conteo celular se presenta en las figuras 3 y 4. La intoxicación 
aguda con PM produjo 45.8 ± 1.6% (media ± DE) de pérdida 
celular comparada con el grupo control. El pretratamiento con 
Figura 1. Imágenes representativas con microscopia de luz 
(técnica de H & E) del tratamiento agudo. La flecha señala 
las células de la capa granulosa de cerebelo. A) Muestra la 
estructura normal de cerebelo (Grupo control), B) Muestra 
la estructura de las ratas tratadas con PM: existe evidencia de 
pérdida de organización y población celular. C y D) Muestran 
las células de las ratas tratadas con EGb y NAC respectivamente. 
Magnificación = 40x.
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EGb mostró 27.5 ± 2.4% de pérdida celular, mientras que el 
pretratamiento con NAC mostró 29.9 ± 2.2% de pérdida celular 
(Figura 3).
En el tratamiento crónico, la pérdida celular fue de 37.2 ± 1.8% 
para el PM (Figura 4) y se observó menor pérdida de células 
con la administración de EGb (1.8 ± 1.6%) y de NAC (2.5 ± 
1.8%). Estas diferencias fueron estadísticamente significativas 
(p<0.05).
Estos resultados muestran que los efectos antioxidantes del EGb 
y de la NAC protegen contra el daño neuronal (células de la capa 
granulosa del cerebelo) producido por el PM.
Figura 2. Imágenes representativas con microscopia de luz 
(técnica de H & E) del tratamiento crónico. La flecha señala las 
células de la capa granulosa de cerebelo. A) Muestra la estructura 
normal de cerebelo (Grupo control), B) Muestra la estructura 
de las ratas tratadas con PM: existe evidencia de pérdida de 
organización y población celular. C y D) Muestran las células de 
las ratas tratadas con EGb y NAC respectivamente, se observa 
una tendencia a preservar la organización y la población celular. 
Magnificación = 40x.
Figura 4. Se observa los efectos de dosis diarias por 30 días 
de PM (0.25 mL /día) sobre las células de la capa granulosa 
de cerebelo de rata, y los efectos del EGb (69.8 µg/kg/día, 
i.p. cada tercer día) y NAC (50 mg/kg, i.p. cada tercer día) 
sobre el tejido nervioso. Los valores representan la media 
± error estándar (ES) con n = 10. El nivel de significancia 
estadística es * = P < 0.05 versus las ratas control.
Figura 3. Se observan los efectos de una sola dosis de PM 
(12 mg/día, v.o.) sobre las células de la capa granulosa de 
cerebelo de rata, y los efectos del EGb (69.8 µg/kg/día, i.p. 
por cinco días) y NAC (150 mg/kg/día, i.p. por cinco días) 
sobre el tejido nervioso. Los valores representan la media 
± error estándar (ES) con n = 10.
41
Conclusiones
El Paratión metílico afecta las células de la capa granulosa del 
cerebelo produciendo disminución del número de células así 
como desorganización de las mismas. El uso de antioxidantes 
como el EGb o NAC produce la atenuación del daño neuronal. 
Los resultadosde este trabajo fundamentan el desarrollo de 
futuras investigaciones para prevenir y tratar el daño neuronal 
de seres humanos expuestos laboralmente a los plaguicidas con 
antioxidantes. En resumen, postulamos que ambos antioxidantes 
(EGb y NAC) atenúan el daño estructural en las neuronas 
del cerebelo de rata producido por las intoxicaciones agudas y 
crónicas con el PM.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo económico al Consejo Nacional 
de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca No. 173011 
otorgada al M.C. Jairo Mariel Cárdenas para realizar estudios 
Doctorales, en el área de Morfología y Toxicología.
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