Optimizacion_DAD

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1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity
3.-Posibilidades y 
Optimización 
Condiciones de 
los Detectores 
“Diode Array” 
Isidre Masana
Agilent Technologies
Especialista Productos UHPLC/MS
U/HPLC MasterClass
Orientado a Laboratorios 
de Control de Calidad. 
Capítulo 3 
Objetivo: 
Mostrar Cómo extraer todo el 
rendimiento/potencial a un 
detector DAD
3.- Posibilidades y Optimización Condiciones de los 
Detectores “Diode Array” (DAD):
3.1.- Introducción a la Tecnología DAD 
• Aportaciones de la Tecnología y Optimización 
Condiciones Detección.
• Optimización sensibilidad y resolución espectral 
con rendija programable.
• Elección de la celda de trabajo.
3.2/3.3.- Consideraciones en la:
• Creación de Bibliotecas y Comparación de Espectros.
• Determinación de la Pureza Espectral de un Pico.
Página: 2
Capítulo 3
Agenda Detallada Curso U/HPLC 
Orientado a Laboratorios de Control de Calidad (3/3)
12:30h
Cap. 3
3.- Posibilidades y Optimización Condiciones de los 
Detectores “Diode Array” (DAD):
3.1.- Introducción a la Tecnología DAD 
• Aportaciones de la Tecnología y Optimización 
Condiciones Detección.
• Optimización sensibilidad y resolución espectral 
con rendija programable.
• Elección de la celda de trabajo.
3.2/3.3.- Consideraciones en la:
• Creación de Bibliotecas y Comparación de Espectros.
• Determinación de la Pureza Espectral de un Pico.
Página: 3
Capítulo 3
Agenda Detallada Curso U/HPLC 
Orientado a Laboratorios de Control de Calidad (3/3)
Cap. 3
Diseño de la Óptica Convencional
frente a la de "Diode-Array“ (DAD) 
Detector de Barrido Convencional
Fuente
Rendija
de Salida
Detector 
Único
Red 
Holográfica 
Móvil
Rendija 
de Entrada
Celda 
de 
Flujo
Radiación 
monocromática
Detector "Diode-Array"
"Diode-Array"
Rendija de 
Entrada
Fuente
Celda 
de 
Flujo
Red 
Holográfica 
Fija
Detector 
Múltiple
Fijo
Radiación 
Policromática
•1979 HP-8450: Primer Espectrofotómetro UV/VIS “Diode Array” del mercado.
•1982 HP-1040: Primer Detector “Diode Array” para HPLC del mercado.
Página: 4
Cap. 3
Excelente Resolución 
Espectral
Lámpara de 
Tungsteno
(dependiendo modelo 
DAD)
Lámpara de 
Deuterio
Lentes Filtro de Óxido 
de Holmio
Celda de 
Flujo
Rendija 
Programable
1 a 8 nm (ó16)
Red 
Holográfica
"Diode-Array" de 
1024 Elementos
190 nm
950nm*
(640 modelos 
Con 1 lámpara) 
Amplio Rango 
de Longitudes 
de Onda 
Verificación 
Automática de 
Longitudes de Onda
Optimización Rápida 
de la Sensibilidad y 
Resolución
Tecnología compartida con 
Espectrofotómetro UV/VIS Agilent-8453/8454
Diseño Óptica DAD Agilent Series 1100/1200/1220/1260*
Optimizado para una excelente Sensibilidad y Flexibilidad
*Versiones DAD y MWD. En 1260 sólo modelos G1315C y G1315D. 
En modelos de otras series con 1 sola lámpara (deuterio) el rango es 190-640nm
Página: 5
Cap. 3
Lámpara de Deuterio
Celda de flujo “Max-Light cartridge“
Rendija Programable
1024 fotodiodos 
“Diode-Array”
Monocromador
Espejo
160 Hz
CELDA Estandard:
De 10 mm de camino óptico y tan solo 1 µl de volumen σ 
CELDA de Alta Sensibilidad:
De 60 mm de camino óptico y tan solo 4 µl de volumen σ 
Diseño Óptica Agilent 1290-DAD
Optimizado para la Máxima Sensibilidad
Página: 6
Cap. 3
100
Programación de la Señal del DAD 
Ancho de banda (240/80--> detecta de 200-280nm.). 
Al variarlo cambia el nº de diodos que se promedian
Long. onda de REFERENCIA 
(400/100-->RESTA promedio 300-400nm.)
Ancho Rendija (define la anchura del 
haz de luz incidente)
Es importante ajustar adecuadamente la 
FRECUENCIA DE ADQUSICION DE DATOS
Programación de eventos en el tiempo ( long. 
onda/ manera almacenar espectros/ threshold/ 
frecuencia adquisición/ balance).
El Ancho de Banda deber ser igual o 
superior al Ancho de Rendija
Ancho Incorrecto
Altura mínima que debe tener el pico para 
guardar espectros selectivamente (desactivado si 
se guardan todos los espectros)
Resolución con la que se guardan 
los espectros en el disco
Página: 7
Cap. 3
Análisis Cualitativo:
Explorando el Campo Espectral
Modos de Adquisición Espectral Agilent 
1100/1200 (programable en el tiempo)
 Todos los Espectros
 Cada 2 Espectros
 Todos los del Pico
 Espectros en la línea de base más 3 en el pico.
 Solamente en el máximo
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia
Los DAD de Agilent Tech. además de poder extraer 
“a posteriori” cualquier cromatograma a cualquier long. onda, permiten directamente guardar varios 
cromatogramas (señal 2D) programables en el tiempo e independientes del fichero espectral-3D
Página: 8
Cap. 3
Evaluación Longuitud Onda Óptima:
Extracción de Cualquier Cromatograma del 3D
min5 10 15 20 25
mAU
0
10
20
30
40
50
1
.9
2
9
2
.4
1
7
2
.7
4
3
3
.4
7
0
3
.9
0
2
4
.7
4
7
6
.3
4
3
7
.5
5
1
8
.3
6
4
1
2
.8
3
5
1
4
.0
4
0
1
6
.3
6
8
1
8
.5
2
8
1
9
.0
5
8
2
1
.4
2
9
2
2
.5
7
1 2
3
.5
0
9
.Si previamente no se ha adquirido una determinada señal, “a posteriori” se podrá 
extraer del 3D cualquier cromatograma a cualquier long. Onda (en el rango espectral 
almacenado).
1.- Adquirir todos los espectros
2.- Seleccionar fichero
3.- Abrir “Isoabsorbance Plot”
4.- Seleccionar “Cursor: Signal”
*DAD1, Sig=257.00, 32.00 Ref=376.00, 34.00 
, EXT of DEMODADN.D
5.- Seleccionar “Long. Onda”
6.- Pulsar “COPY”
7.- Evaluar Cromatograma desde 
pantalla de “Data Analysis”
Para poder disponer de toda 
la información en “Set up 
DAD parameters / Spectrum” 
seleccionar: “Store: All”
Página: 9
Cap. 3
3.- Posibilidades y Optimización Condiciones de los 
Detectores “Diode Array” (DAD):
3.1.- Introducción a la Tecnología DAD 
• Aportaciones de la Tecnología y Optimización 
Condiciones Detección.
• Optimización sensibilidad y resolución espectral 
con rendija programable.
• Elección de la celda de trabajo.
3.2/3.3.- Consideraciones en la:
• Creación de Bibliotecas y Comparación de Espectros.
• Determinación de la Pureza Espectral de un Pico.
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Capítulo 3
Agenda Detallada Curso U/HPLC 
Orientado a Laboratorios de Control de Calidad (3/3)
11-49min
Cap. 3
Aportaciones Tecnología "Diode-Array“
Ventajas Sistema Óptica Reversa
 Espectros en tiempo real de alta calidad y sensibilidad
 Posibilidad de identificación por búsqueda en bibliotecas
 Múltiples longitudes de onda simultáneas
 Ancho de banda y rendija variables para optimizar: 
Sensibilidad/Linealidad/Selectividad/Resolución Espectral
 Referencia óptica interna (long. Onda de Referencia):
 Minimizar los efectos del ruido de “muestra y del sistema”
 Posibilidad de resolver espectroscópicamente, picos 
cromatográficamente solapados
 Óptica sin partes móviles
 Reproducibilidad de longitud de onda virtualmente absoluta
 Gran fiabilidad
 Bajo coste de mantenimiento
Página: 11
Cap. 3
Sensibilidad Detectores Agilent 1100/1200 
DAD "versus" VWD
Laboratorio Aplicaciones Agilent - BCN
Bifenilo o-Terfenilo
min2 3 4 5 6
mAU
-0.06
-0.04
-0.02
0
0.02
0.04
0.06
min2 3 4 5 6
mAU 
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
Agilent 1100 DAD
Agilent 1100 VWD
Equipo: Agilent 1100
Columna: Lichrospher RP-18 125x4mm 5um
Flujo: 1.5mL/min.
Eluyente: Acetonitrilo/Agua (75/25)
Temperatura: 25º C
Detección: peak width (adquis.: >0.2min)
DAD: 254 nm/30nm Ref: 360nm/100nm 
slit ópico: 8nm 
VWD: 254 nm. 
Volumen Inyección: 0.1µL.
Muestra: A: 1ppm Bifenilo
B: 3ppm o-Terfenilo
(10µl solución => 10-30 ppb - 100-300pg. iny.)
Página: 12
Cap. 3
Agilent - DAD: Espectros de Alta Calidad a 
Nivel de Trazas
Laboratorio Aplicaciones Agilent - BCN
Espectro Pico 1
Bifenilo
nm220 240 260 280 300 320 340 360
mAU
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
Espectro Pico 2
o-Terfenilonm220 240 260 280 300 320 340 360
mAU
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16 ¡¡Sólo 0.07mUA !!
min2 3 4 5 6
mAU
0
0.02
0.04
0.06
0.08
 DAD1 B, Sig=254,30 Ref=360,100 (TESB110B\001-0501.D)
 Area: 0.442383 2
.1
29
 Area: 0.894019 3
.3
46
1
2
¡¡Sólo 0.06-0.08 mUA !!
Columna: Lichrospher RP-18 125mmx4mm 5um
Flujo: 1.5mL/min.
Eluyente: Acetonitrilo/Agua (75/25) isocrático
Detección: peak width (adquis.: >0.2min) / slit óptico: 8nm
DAD 1100: 254 nm/30nm Ref: 360nm/100nm 
Temperatura: 25º C
Volumen Inyección: 0.1µL.
Muestra: A: 1ppm Bifenilo
B: 3ppm o-Terfenilo
(10µl solución => 10-30 ppb - 100-300pg. iny.)
Página: 13
Cap. 3
Aportaciones Tecnología "Diode-Array“
Ventajas Sistema Óptica Reversa
 Espectros en tiempo real de alta calidad y sensibilidad
 Posibilidad de identificación por búsqueda en bibliotecas
 Múltiples longitudes de onda simultáneas
 Ancho de banda y rendija variables para optimizar: 
Sensibilidad/Linealidad/Selectividad/Resolución Espectral
 Referencia óptica interna (long. Onda de Referencia):
 Minimizar los efectos del ruido de “muestra y del sistema”
 Posibilidad de resolver espectroscópicamente, picos 
cromatográficamente solapados
 Óptica sin partes móviles
 Reproducibilidad de longitud de onda virtualmente absoluta
 Gran fiabilidad
 Bajo coste de mantenimiento
Página: 14
Cap. 3
Análisis Cuantitativo: Detección a Múltiples 
Longitudes de Onda.
1. Metronidazol
2. Meticlorpindol
3. Sulfapiridina
4. Furazolidina
5. Pyrazona
6. Ipronidazol
7. Cloramfenicol
8. N-Acetilsulfapiridina
9. Etopabat
10. Benzotiazuron
11. Nicarbazina
Muestra Antibióticos
Columna 250 x 4.6 mm ODS Spherisorb
Fase Móvil 0.02 mM NaAc/ACN
Gradiente 8 a 90% B
Meticlorpindol Metronidazol Nicarbazina
0
240
100
280 320 360 400
N
o
rm
a
liz
a
d
o
100
120
80
60
40
20
0
2010 30
1
2
3
4
5
11
8
9,10
6,7
275 nm
315 nm
360 nm
Longitud de Onda (nm) Tiempo (min)
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia
 (
m
A
U
)
La adquisición simultanea de múltiples cromatogramas permite no tener que programar en el 
tiempo cambios de longitud de onda en zonas críticas (picos próximos) del cromatograma.
Página: 15
Cap. 3
Aportaciones Tecnología "Diode-Array“
Ventajas Sistema Óptica Reversa
 Espectros en tiempo real de alta calidad y sensibilidad
 Posibilidad de identificación por búsqueda en bibliotecas
 Múltiples longitudes de onda simultáneas
 Ancho de banda y rendija variables para optimizar: 
Sensibilidad/ Linealidad/ Selectividad/ Resolución Espectral
 Referencia óptica interna (long. Onda de Referencia):
 Minimizar los efectos del ruido de “muestra y del sistema”
 Posibilidad de resolver espectroscópicamente, picos 
cromatográficamente solapados
 Óptica sin partes móviles
 Reproducibilidad de longitud de onda virtualmente absoluta
 Gran fiabilidad
 Bajo coste de mantenimiento
Página: 16 18-42min
Cap. 3
Optimización de Sensibilidad / Resolución 
Espectral con Rendija Programable 
Ruído < 1x10-5AU
rendija 1 nm 
"promediando" 2nm de 
longitud de onda 
nm230 240 250 260 270 280
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7 mAU
1 nm
8 nm
2 nm
4 nm
Rendijas más gruesas proporcionan mayor intensidad de luz, y en consecuencia mejor 
sensibilidad, pero una menor resolución espectral. No obstante la anchura típica de las bandas 
espectrales en disolución (30-60nm) se ve poco afectada por la utilización de p.e. rendijas de 8 nm.
Rendija 
“slit”slit
DAD-1100
 DAD’s-1050 /1090
4nm 8nm
1nm
benceno
Página: 17
Rendija 
programable:
1100/1200/1220
/1260/1290
Cap. 3
DAD’s Antiguos: Influencia del Ancho de 
Banda en la Relación S/N. 
• En DAD’s antiguos Anchos de Banda de 10/30 nm suele 
mejorar la sensibilidad. 
• El óptimo está alrededor del ancho de la banda 
espectroscópica al 50% de su altura.
• En DAD’s modernos el ruido electrónico es casi 
despreciable NO mejora la sensibilidad
Ancho de Banda
32 nm
12 nm
4 nm
S/N= 2.1
S/N=1.0
S/N= 0.7
0.1 maU
1
n
n = número de puntos 
promediados
Ruido α
ANCHO BANDA
Página: 18
Ejemplo con datos DAD-1090
Cap. 3
12904nm
30nm
80nm
DAD’s Modernos: Influencia del Ancho de Banda 
en la Relación S/N. 
Página: 19
Cap. 3
ANCHO BANDA
4nm
250nm
30nm
80nm
• En DAD’s MODERNOS Anchos de Banda de 4-8 nm CENTRADOS en el máximo de absorbancia 
suelen mejorar la sensibilidad. (Al aumentar la señal sin que aumente el ruido).
4nm
30nm
80nm
1290
Detección UV "Universal“
Detección con Banda Ancha
WL 260 nm, BW 80 nm
WL 250 nm, BW 4 nm
WL 280 nm, BW 4 nm
4 5 6
Tiempo (min)
Anchos de banda de 80-100 nm permiten disponer de un detector "Universal”
- Muy útil en optimización composición del eluyente
- Detección de compuestos no esperados
(Debe ser > ó = anchura de la rendija seleccionada)
BANDA ANCHA
80nm.
BANDA ESTRECHA 4nm
Página: 20
Ejemplo con datos DAD-1090
Cap. 3
Laboratorio Aplicaciones Agilent - BCN
min3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
50
100
150
200
250
 DAD1 A, Sig=525,250 Ref=800,100, TT (COLO0219\001-2801.D)
 3
.0
5
7
 4
.2
8
9
 5
.5
2
7
 5
.9
0
3
 8
.4
1
2
 9
.0
8
1
min3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
50
100
150
200
250
 DAD1 C, Sig=430,50 Ref=570,100, TT (COLO0219\001-2801.D)
 3
.0
5
7
 5
.5
2
7
min3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
50
100
150
200
250
 DAD1 D, Sig=512,50 Ref=650,100, TT (COLO0219\001-2801.D)
 5
.9
0
3
 8
.4
1
2
min3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
50
100
150
200
250
 DAD1 E, Sig=620,60 Ref=750,100, TT (COLO0219\001-2801.D)
 4
.2
8
9 9
.0
8
1
430/50 nm
512/50 nm
620/60 nm
Universalidad Agilent DAD’s:
Detección con Banda Ancha 
nm400 500 600 700 800 900
Norm.
0
1
2
3
4
*DAD1, 9.059 (4.7 mAU,Apx) Ref=8.926 & 9.232 of 001-3001.D
*DAD1, 8.406 (2.9 mAU, - ) Ref=8.345 & 8.505 of 001-3001.D
*DAD1, 5.912 (1.2 mAU, - ) Ref=5.806 & 6.066 of 001-3001.D
*DAD1, 5.532 (1.4 mAU, - ) Ref=5.445 & 5.659 of 001-3001.D
*DAD1, 4.299 (1.1 mAU, - ) Ref=4.219 & 4.412 of 001-3001.D
*DAD1, 3.065 (1.5 mAU, - ) Ref=2.959 & 3.212 of 001-3001.D
E-132E-104/102 E-124/129 E-133
400nm 650nm
E-102:Tartrazina
E-104: Amarillo Quinolina
E-124: Ponceau 4R
E-132: Carmín Índigo
DAD-1100
525/250 nm: detecta todo lo que absorba entre 400 y 650 nm.
Página: 21
Cap. 3
Ventajas Sistema Óptica Reversa
Aportaciones Tecnología "Diode-Array"
 Espectros en tiempo real de alta calidad y sensibilidad
 Posibilidad de identificación por búsqueda en bibliotecas
 Múltiples longitudes de onda simultáneas
 Ancho de banda y rendija variables para optimizar: 
Sensibilidad/Linealidad/Selectividad/Resolución Espectral
 Referencia óptica interna (long. Onda de Referencia):
 Minimizar los efectos del ruido de “muestra y del sistema”
 Posibilidad de resolver espectroscópicamente, picos 
cromatográficamente solapados
 Óptica sin partes móviles
 Reproducibilidad de longitud de onda virtualmente absoluta
 Gran fiabilidad
 Bajo coste de mantenimiento
Página: 22 24-36min
Cap. 3
Longitud de Onda de Referencia Interna
Longitud de onda de 
Referencia
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
220 230 250 260 280 290 300 310 320270240
Longitud de onda
Analítica
A 1
a
A 2
a
=
A 1
a
A 2
a
A 1
r
A 2
r
=
A 1
r
A 2
r
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia
 (
A
U
)
Longitud Onda 
(nm)
1.- REDUCCIÓN DEL RUIDO DE MUESTRA por
 Partículas en suspensión.
 Cambios de índice de refracción trabajando con 
gradientes de concentración.
 Turbulencias en corrientes de flujo.
2.- REDUCCIÓN DE LA DERIVA INSTRUMENTAL
 Envejecimiento de la lámpara.
MEJORA LA PRECISIÓN Y EXACTITUD
Longitudes Onda 
Analítica Referencia
Posibilidad de restar la 
absorbancia de una zona en la 
que el compuesto de interés 
deja de absorber
Página: 23
Cap. 3
Longitud de Onda de Referencia Interna: reducción 
interferencias por presencia de partículas en suspensión
Laboratorio Aplicaciones Agilent - BCN
Tampón: 20mM Borato pH= 9.2, sin microfiltrar, preparado 3 meses antes
Capilar: 56 cm de longitud efectiva y 50µm de diámetro interno. BF3
"SPIKES" 
(partículas)
EOF
PICOS 
MUESTRA
PICOS MUESTRA
Productos de degradación 
de un fármaco irradiado con 
luz UV
CON Referencia
DAD1 B. Sig: 275/,20 Ref: 350,80
Sin Referencia
DAD1 A. Sig: 275,20 Ref: off
Ejemplo con Electroforesis Capilar
(capilar de separación sin relleno)
En las condiciones empleadas la Long. Onda de Referencia permite eliminar los “spikes” 
producidos por el paso de las partículas del tampón por la celda de detección.
Página: 24
Cap. 3
Empleo de Referencia Interna con DAD
Página: 25
Con Referencia Interna: 360/100
(más próxima a la long. de trabajo)
Con Referencia Interna: 550/100
(más alejada a la long. de trabajo)
Sin Referencia Interna
min2 3 4 5 6
mAU
0
0.025
0.05
0.075
0.1
0.125
mAU
0
0.025
0.05
0.075
0.1
0.125
min2 3 4 5 6
0.075
mAU
0.025
0.1
0
0.05
0.125
min2 3 4 5 6
DAD-1100
Cap. 3
SIN referencia interna
DAD-1290
CON referencia interna
Ref.: 350/100nm
• En DAD’s más antiguos (p.e. 
1090-1050-1100), una 
referencia interna próxima a la 
analítica reduce el nivel de 
ruido.
• En DAD’s modernos (p.e. 
1290), la referencia interna NO 
reduce el nivel de ruido 
“electrónico”, pero sí el de 
“muestra”. 1ª inyección con Gradiente a 5mL/min
Resolución Espectral de 
Picos Cromatográficamente Solapados
A
B
A
SUPRESIÓN ESPECTRAL
DEL PICO B
285 nm sin Ref. 
285 nm con Ref. 325Abs
Abs
tR
tR
285 325
Longitud de Onda 
Analítica
Longitud de Onda 
Referencia
Longitud de Onda (nm)
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia A
BB
260)
(Referencia
alternativa
Página: 26
Cap. 3
Laboratorio Aplicaciones Agilent - BCN
nm450 500 550 600 650 700
Norm.
0
200
400
600
800
1000
*DAD1, 4.292 (203 mAU,Apx) Ref=4.152 & 4.592 of 001-2801.D
*DAD1, 9.079 (1162 mAU, - ) Ref=8.706 & 10.952 of 001-2801.D
min4 6 8 10
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
 DAD1 B, Sig=430,50 Ref=570,100, TT (COLO0219\001-2801.D)
 E
-1
3
2
 E
-1
0
4
 E
-1
2
4
 E
-1
2
9
 E
-1
3
3
min4 6 8 10
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
*DAD1, Sig=630.00, 30.00 Ref=590.00, 38.00 , EXT of 001-2801.D
min4 6 8 10
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
*DAD1, Sig=612.00, 30.00 Ref=645.00, 20.00 , EXT of 001-2801.D
Selectividad Agilent DAD’s: Supresión Espectral de 
Picos Utilizando Longitud de Onda de Referencia
Esta opción permite Resolver 
Espectroscópicamente Picos 
Cromatográficamente Solapados.
E-132
E-133
630612
Ref: 590 Ref: 645
: 612/30 nm ref: 645/20 nm
: 630/30 nm ref: 590/38 nm
E-133 
Suprimido 
Espectralmente
E-132 
Suprimido
Espectralmente
Página: 27
Cap. 3
Ventajas Sistema Óptica Reversa
Aportaciones Tecnología "Diode-Array"
 Espectros en tiempo real de alta calidad y sensibilidad
 Posibilidad de identificación por búsqueda en bibliotecas
 Múltiples longitudes de onda simultáneas
 Ancho de banda y rendija variables para optimizar: 
Sensibilidad/Linealidad/Selectividad/Resolución Espectral
 Referencia óptica interna (long. Onda de Referencia):
 Minimizar los efectos del ruido de “muestra y del sistema”
 Posibilidad de resolver espectroscópicamente, picos 
cromatográficamente solapados
 Óptica sin partes móviles
 Reproducibilidad de longitud de onda virtualmente absoluta  permite para 
cuantificar seleccionar cualquier long. onda de la banda espectral (no 
necesariamente la del máximo); es útil para poder cuantificar espectros saturados, 
cuantificando a longitudes de onda en la base de la banda espectral (en una zona no 
saturada).
 Gran fiabilidad
 Bajo coste de mantenimiento
Página: 28
Cap. 3
3.- Posibilidades y Optimización Condiciones de los 
Detectores “Diode Array” (DAD):
3.1.- Introducción a la Tecnología DAD 
• Aportaciones de la Tecnología y Optimización 
Condiciones Detección.
• Optimización sensibilidad y resolución 
espectral con rendija programable.
• Elección de la celda de trabajo.
3.2/3.3.- Consideraciones en la:
• Creación de Bibliotecas y Comparación de Espectros.
• Determinación de la Pureza Espectral de un Pico.
Página: 29
Capítulo 3
Agenda Detallada Curso U/HPLC 
Orientado a Laboratorios de Control de Calidad (3/3)
33-27min
Cap. 3
Optimización Sensibilidad en DAD’s Agilent
Longitud de 
Onda 
 Seleccionar la longitud de onda del máximo de absorbancia.
 Programar cambios de long. de onda en el tiempo.
 Incrementar el ancho de rendija.
 Más luz
 Mejor sensibilidad 
 Menor linealidad
 Menor resolución espectral
 Los espectros en fase líquida suelen dar bandas con anchos de más de 30 nm.
4-8 nm buen compromiso resolución espectral/ sensibilidad
 DAD’s Antiguos: Usar un promedio de longitudes de onda 
(típico 20-40 nm). DAD’s Modernos usar 4-8nm.
 DAD’s Antiguos: Reduce el ruido./Mejora sensibilidad.
 proporcionalmente a la raíz cuadrada del número de datos.
No afecta a la linealidad o a la resolución espectral. 
 los espectros son independientes del cromatograma.
 Emplear referencia interna.
 Reduce ruido de muestra  mejora robustez.
 partículas en suspensión / cambios índice refracción.
λ analítica
λ referencia
Página: 30
Cap. 3
Resumen Optimización de Sensibilidad
con DAD’s Agilent Antiguos
Ácido Anisídico
Ancho de Banda
al 50% de la altura
(DAD’s antiguos)
30 nm
Longitud de onda (nm)
m
A
U
Longitud de Onda
Analítica
Ancho de Banda de Referencia
340 nm
100 nm
Longitud de Onda de Referencia
(lo más próxima posible a la analítica)
OPTIMO: - Rendija: 8nm (16)
- Señal: 255/30 Ref. 340/100
Página: 31
Cap. 3
DAD’s Modernos usar 4-8nm
Válido para cualquier tipo de detector HPLC / GC / CE
Influencia de la Frecuencia de Adquisición
de Datos
Ruido estadístico Detector α
1
n
n = número de puntos 
promediados
Ventajas optimización: - Mejora sensibilidad sin pérdida resolución
- Ahorro de espacio de disco duro
- Reprocesado más rápido de los datos.
Tiempo de 
Respuesta
2.3 sec
1.0 sec
0.3 sec
0.1 sec
PeakWidth
(min) *
S/N
0.1
0.05
0.01
0.005
6.1
3.7
1.8
1
Tiempo (min)
2.3 
seg
1.0 
seg
0.3 
seg
0.1 
seg
0.1 mAU
* Utilizar un PK WD de adquisición 
del orden del WIDTH (integración) 
del pico más fino de interés 
-Valores Típicos en HPLC (“convencional”: 10-25cm long. 5μm ) 
“Peak Width: >0.1min ó >0.2min
Página: 32
Nº puntos/pico:
• Máx. resolución: ≥30-40
• Resol.+sensibil.: 15-25
• Máx. sensibilid.: 8-12
Cap. 3
Ejemplo Influencia Frecuencia Adquisición en la 
Resolución en Cromatografía Ultra-Rápìda
20Hz es suficiente para picos con PW > 0.01min (0.6seg) 
(peakwidth al 50% de su altura) 
min0.1 0.2 0.3 0.4 0.50
80Hz
PW=0.30sec
40Hz
PW=0.33sec
20Hz
PW=0.42sec
10Hz
PW=0.67sec
5Hz
PW=1.24sec
DAD standard 
20Hz
Agilent SL Fast 
DAD
20Hz “versus” 80Hz
+ 40% Ancho pico
– 40% Capacidad de separación de picos
– 30% Resolución 
– 70% Eficiencia aparente de la columna
10Hz “versus” 80Hz
+ 120% Ancho pico
– 120% Capacidad de separación de picos
– 90% Resolución
– 260% Eficiencia aparente de la columna
Muestra: Mezcla de Fenonas
Columna: Zorbax SB-C18, 4.6x30, 1.8um
Gradiente: 50-100% ACN in 0.3min
Celda det.: 5ul 
Página: 33
Cap. 3
3.- Posibilidades Detectores “Diode Array” (DAD) de Agilent:
Introducción a la Tecnología DAD 
• Aportaciones de la Tecnología y Optimización 
Condiciones Detección.
• Optimización sensibilidad y resolución espectral con 
rendija programable.
• Elección de la celda de trabajo.
• Consideraciones en la:
– Creación de Bibliotecas y Comparación de Espectros.
– Determinación de la Pureza Espectral de un Pico.
Página: 34
Agenda Detallada Curso U/HPLC 
(4/4)
38-22min
Cap. 3
Optimización de las Dimensiones de la Celda
¿Cómo lograr celdas de menor volumen? 
10 mm camino óptico
13 µL volumen
4.6 mm id column
+ =
Columna corta 
d.i. 2.1 mm
?
Dispersión pico
• Pérdida de resolución
• Menor señal (S/N)
Camino óptico Corto (3 mm, 2 µL)  menor señal
Altatransmisión de luz => bajo ruido Baja S/N Baja transm. de luz  elevado ruido Baja S/N
Camino óptico Largo (10 mm, 0.5 µL)
Absorbancia = € x b x C (b= camino óptico)
Página: 35
Celda Flujo
Convencional 
Guía de ondas optofluídica
Reflexión interna total de la luz
Diseño de Celda: 
“Max-Light High Sensitivity cell“
Cap. 3
La Solución: Fibra no recubierta (sílice fundida)
1290 Infinity Diode-Array Detector 
Mejora Sensibilidad x10 “versus” Detectores 1200-VWD/DAD
- Comparación celdas “Max-Light High Sensitivity vs 1200-VWD“
1200-VWD (10 mm x σ Vol.: 14 µL)
S/N: 253
Muestra: Antraceno, 835 pg/µL
Col.:: 4.6x150mm ZORBAX SB C18, 5 µm
Fase móvil: Agua/Acetonitrilo = 20/80
Flujo: 1.5ml/min
Detección 251nm, PW >0.1min,
Volumen inyección : 5µl
Temp. columna: 40°C
Celda “Max-Light High Sensitivity“ (60 mm x σ Vol.: 4 µL) 
S/N: 2944 
Technical Note: 5990-5326EN 
mD
LFr



24
4
2 

V2
V
Mayor Sensibilidad: hasta x10 veces*. Sin aumento de la dispersión del pico
*Celda 6cm picos intensos/eluyentes que absorban mucho saturarán el detector más fácilmente, al incrementar la señal .
Cap. 3
Página: 36
Elección de la Celda de Trabajo en DAD.
• Una celda con mayor camino óptico mejorará la sensibilidad pero su mayor 
volumen puede hacer perder resolución.
• Las dimensiones (/flujo) de la columna definirán la celda a utilizar.
• En UHPLC y especialmente si se reduce el diámetro de la columna a 2.1 (3) 
mm convendrá reducir el volumen de la celda utilizada.
• Max-Light High Sensitivity cells:
• Máx. resolución: 10mm y 1 µL vol. σ
• Máx. sensibilidad: 60mm y 4 µL vol. σ
hasta 60 bars
MWD & DAD STANDARD FLOW CELLS
Column length Typical peak width Recommended flow cell
<= 5 cm 0.025 min Nano 
10 cm 0.05 min flow cell Semimicro flow cell
20 cm 0.1 min Standard flow cell
>= 40 cm 0.2 min
Typical flow rate 1-2 ml/min
Internal column diameter 2.1mm 4.6 mm
0.2- 0.4 ml/min 0.4- 0.8 ml/min
3.0 mm
0.01-0.2 ml/min
0.5- 1.0 mm
CELDAS 
ESTANDARD
Micro SemiMicro Standard
MWD/DAD MWD/DAD MWD/DAD
Max pressure (bar) 400 120 120
Path Length (mm) 6 6 10
Volume (µl) 1.7 5 13
Página: 37
Cap. 3
Dispersión Max-Light Flow cell 10 mm vs 60 mm 
Columna UHPLC: 2.1 mm x 50mm x 1.8µm
10 mm Max-Light cell
Fenonas
Celda 60mm mejora x4 la sensibilidad, pero
pierde resolución con columnas/picos de muy
pequeño volumen
1µL4µL Vol. σ  50 % pérdida de la capacidad de 
separar picos de muy pequeño volumen
60 mm Max-Light High Sensitivity cell 
mAU/cm
1.5min
TS
TS
Cap. 3
Página: 38
3.- Posibilidades y Optimización Condiciones de los 
Detectores “Diode Array” (DAD):
3.1.- Introducción a la Tecnología DAD 
• Aportaciones de la Tecnología y Optimización 
Condiciones Detección.
• Optimización sensibilidad y resolución espectral 
con rendija programable.
• Elección de la celda de trabajo.
3.2/3.3.- Consideraciones en la:
• Creación de Bibliotecas y Comparación de Espectros.
• Determinación de la Pureza Espectral de un Pico.
Página: 39
Capítulo 3
Agenda Detallada Curso U/HPLC 
Orientado a Laboratorios de Control de Calidad (3/3)
45-15min
Cap. 3
Biblioteca de Espectros- Confirmación 
Identificación por Comparación Espectral
Atrazina
Biblioteca de Espectros
Clortoluron
Clortoluron
?
Factor de
Similitud
999
100
80
60
40
20
0
300250200
Longitud de Onda (nm)
Tiempo (min)
20
15
10
5
0
25 30 35 40 45
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia
 (
m
A
U
)
N
o
rm
a
li
z
a
d
a
Los espectros de UV/VIS pueden variar con cambios en el pH y composición 
de la fase móvil. Se recomienda asociar las bibliotecas con los métodos de trabajo
Página: 40
Cap. 3
Comparación Espectros: Fiabilidad Espectral
La absorbancia máxima de los espectros de UV/VIS comparados debe estar 
dentro del rango de linealidad de la ley de Lambert y Beer en todo el rango
de longitudes comparadas.
Benzo(g,h,i)perileno
Muestra: 1.1 mAU FS
Archivo de biblioteca: 680 mAU FS 
Absorbancia en el máximo del espectro
240 260 280 300 320 340 360 380
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
*DAD1, 21.801 (1.1 mAU, - ) Ref=22.374 de PNA5.D
*Benzo(g,h,i)perileno
Longitud de Onda (nm)
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia
 (
m
A
U
)
-En espectros a nivel de trazas es útil la función 
“Smooth ” (con p.e. factores 5-15).
- Para disponer de mayor precisión espectral
puede recurrirse a la función “Spline” (con factor 5 y 
adquisición 1nm se obtiene una precisión 1nm/5= 0.2nm.) 
- Para superponer espectros basta pulsar tecla
“CTRL” al solicitarlos.
Página: 41
TS
Cap. 3
Supresión Influencia Cambio Composición Eluyente
Si se trabaja con gradientes de concentración, y los eluyentes utilizados absorben dentro del rango 
de longitudes de onda empleado, se debería restar el espectro promedio de inicio y final del pico 
(especialmente en el análisis de trazas)
min0 5 10 15 20 25
mAU
0
10
20
30
40
50
 DAD1 A, Sig=254,20 Ref=500,100 (DEMO\DEMODADN.D)
 2
.4
2
6
 2
.7
4
3
 3
.4
6
9
 3
.9
0
1
 4
.7
4
8
 6
.3
4
4
 7
.5
5
1
 8
.3
6
4
 1
2
.8
3
5
 1
4
.0
4
1
 1
6
.3
6
9
 1
8
.5
2
9
 1
9
.0
6
0
 2
1
.4
3
3
 2
2
.5
7
0
 2
3
.5
1
0
Automáticamente 
resta espectros de 
referencia
1.- Espectro 
Referencia 
Inicio pico
SELECCIÓN MANUAL Espectros Referencia
2.- Espectro
Referencia 
Final pico3.- Esp. 
Máximo
Automáticamente toma el espectro en el máximo del pico
SELECCIÓN AUTOMATICA
Página: 42
Cap. 3
Cálculo del Factor de Similitud
N
o
rm
a
li
z
a
d
o
Longitud de Onda (nm)
100
80
60
40
20
0
300250
Patrón
Desconocido
220 280
83
Ajuste de regresión lineal
Coeficiente de correlación = 0.92399
Factor de Similitud = 923.99
Desconocido
0 10080604020
210
230
240
250260
270
330
320
310
280nm
P
a
tr
ó
n
100
80
60
40
20
0
+
220nm
+
300
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+83
Página: 43
Cap. 3
Ejemplos Comparación Espectral:
El Factor de Similitud 
Coef. Correlación = 0.999963
Factor de Similitud = 999.963
P
a
tr
ó
n
 (
m
A
U
)
300
200
100
0
0 10050 150
Desconocido (mAU)
300
200
100
0
0 10 20 30
Desconocido (mAU)
Coef. Correlación = 0.056
Factor de Similitud = 56
P
a
tr
ó
n
 (
m
a
U
)
0
20
40
60
80
100
N
o
rm
a
li
z
a
d
o
300250
Longitud de Onda (nm)
Desconocido
Patrón
0
20
40
60
80
100
N
o
rm
a
li
z
a
d
o
250 300 350 400
Longitud de Onda (nm)
Desconocido
Patrón
Página: 44
Cap. 3
Laboratorio Aplicaciones Agilent - BCN
Cuantificación por Identificación Espectral
(no por Tiempos de Tabla Calibración)
Los Nombres en la Biblioteca y en 
la Tabla de Calibración deben de 
coincidir exactamente
(los tiempos de retención no hace falta que 
coincidan)
Página: 45
Muy útil cuando la identificación por 
tiempos de retención resulta poco fiable.
Cap. 3
3.- Posibilidades y Optimización Condiciones de los 
Detectores “Diode Array” (DAD):
3.1.- Introducción a la Tecnología DAD 
• Aportaciones de la Tecnología y Optimización 
Condiciones Detección.
• Optimización sensibilidad y resolución espectral 
con rendija programable.
• Elección de la celda de trabajo.
3.2/3.3.- Consideraciones en la:
• Creación de Bibliotecas y Comparación de Espectros.
• Determinación de la Pureza Espectral de un Pico.
Página: 46
Capítulo 3
Agenda Detallada Curso U/HPLC 
Orientado a Laboratorios de Control de Calidad (3/3)
52-8min
Cap. 3
Pureza Espectral de Picos
Pico 
puro Pico 
impuro
7.6 7.8 8.0 8.2 8.4
Tiempo (min)
200 400Longitud de Onda (nm)200 400Longitud de Onda (nm)
Factor similitud o 
pureza 999
A
b
s
o
rb
a
n
c
i
a
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia
N
O
R
M
A
L
IZ
A
D
A
Factor similitud o 
pureza 764
Los espectros comparados deben estar dentro del rango de linealidad y no 
incluir espectros de línea de base. Convendrá ajustar correctamente el umbral de 
absorbancia mínima, la integración o la zona del pico a evaluar (mediante arrastre icono pureza).
Icono PurezaPico
“Spectral Options”
Múltiples Espectros del Pico
(según “Spectra per Peak” y 
“Threshold”)
Página: 47
Cap. 3
curva definida por sistema
(calculado a partir relación s/n)
 Definir uno o más espectros de 
referencia dentro de un pico.
 Compara todos los demás 
espectros con el espectro (o 
espectros) de referencia y calcula el 
factor de similitud.
 Dibuja los resultados del factor de 
similitud frente al tiempo de 
retención para obtener la curva de 
similitud (curva negra).
 Calcular e imprimir el % de puntos 
por debajo del umbral de pureza 
(curva roja) definidos por el sistema 
o el usuario. 
Curva de Similitud:
Umbrales de pureza
global definido por usuario
global definido por sistema
Señales
Máximo (Espectro tomado 
como referencia)
Menor similitud (990)
Similitud ideal (1000)
Curva Similitud
Curva Umbral de Pureza
impuropuro Icono Pureza Pico
“arrastrando con el botón 
izquierdo apretado” en el 
cromatograma calcula la 
pureza de todos los picos 
(o de 1 sólo) en el rango 
de tiempo escogido.
Página: 48
Pureza de Pico - Curva de Similitud:
Pureza Espectral a lo largo del pico
Cap. 3
Pureza de Pico: ejemplo pico Impuro
Página: 49
Cap. 3
Pureza de Pico: ejemplo pico Puro
Página: 50
TS
Cap. 3
Ajuste Umbral para Pureza de Pico: ejemplo 
pico Puro Incorrectamente Analizado
• En un pico mal integrado y 
con un “Threshold” espectral 
excesivamente bajo es 
habitual obtener “falsos picos 
impuros” 
0 10080604020
2
1
0
2
3
0
2
4
0
2
5
0
2
6
0
2
7
0
3
3
0
3
2
0
3
1
0
280nm
100
80
60
40
20
0
300250
P
a
tr
ó
n
100
80
60
40
20
0
+220n
m
+3
0
0
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Patrón
Desconocido
Ajuste de regresión 
lineal
Coeficiente de correlación = 0.92399
Factor de Similitud = 923.99
+
220 280
83
83
Página: 51
TS
TS
Cap. 3
Opciones Espectrales
Selección del espectro/s de 
referencia para el cálculo de la 
pureza de pico
Selección de presentación de 
multiples espectros en pantalla
Página: 52
Cap. 3
Opciones de Control de la Pureza de Pico
Página: 53
Cap. 3
• Absorbancia excesiva a bajas long. onda: en “Spectral Options/Spectra” 
subir la long. onda mínima para estar en rango lineal de absorbancia.
• Picos mal integrados, se pueden corregir mediante 3 opciones:
• Arrastrar el icono de pureza para definir la franja de tiempo del pico para calcular su pureza.
• En “Spectral Options/Spectra/Spectra per peak” subir “threshold (mUA)”.
• Reintegrar para no tomar demasiada base del pico.
• Excesiva “sensibilidad” en la detección de impurezas espectrales, se puede 
corregir mediante múltiples opciones:
• Arrastrar el icono de pureza para definir la franja de tiempo del pico para calcular su pureza.
• En “Spectral Options/Spectra/Spectra per peak” subir “threshold (mUA)”.
• Reintegrar para no tomar demasiada base del pico.
• En “Spectral Options/Purity” definir el “Threshold o Fixed Threshold” que interese (p.e. 990 o 995), 
en lugar de que lo calcule automáticamente el propio software.
• Cambiar donde o cómo el software calcula el ruido espectral en “Spectral
Options/Advanced/Noise Calculations”: 
– Definir en “Calcúlate standard deviation….” el tiempo donde calcular el ruido de línea 
de base, una zona libre de picos próxima a la zona de interés que interese.
– Definir en “Take default standard….” el valor de ruido que nos interese. Si se pulsa sobre 
el icono con la “i” (“Information on the LC peak purity”), en al lado derecho de “Calculations” 
se podrá ver el “Noise Threshold” calculado por el software, y pulsando sobre “advanced” 
cambiarlo al valor definido por usuario que interese en “Take default standard….”. 
Agilent Serie 1200 Infinity LC
Muchas 
Gracias 
por su 
Atención
Estamos a su disposición en
tel.: 901.11.6890 isidre_masana@agilent.com
customercare_spain@agilent.com www.agilent.com/chem 
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customercare_spain@agilent.com www.agilent.com/chem 
¿Preguntas?
Logística Comida: Restaurante: “Take East Easy” 
(a la izquierda de la Farmacia)
• Grupo de mesas reservadas
56
ZONA 1:
3.- Fruta natural
2.- Nevera con 
Bebidas. +…
1.-Bandejas + 
Vasos +PanENTRADA
ZONA 3:
Postres Fríos 
Vistas Maremagnum/ mar
CAJA 
(dan los 
cubiertos)
ZONA 2A:
Plancha
WOK
Pasta/Pizzas
Ensaladas
ZONA 2B:
1ºs y 2ºs
CALIENTES