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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química Química Analítica Instrumental II Técnicas Cromatográficas Diciembre de 2007 Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 1 Capítulo 1. Introducción a los métodos de separación 1.1 Introducción a la cromatografía En 1906, el botánico Ruso M. Tswett realizó un experimento que condujo al descubrimiento de lo que hoy conocemos como cromatografía. Colocó un extracto de pigmentos vegetales en la parte superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar éter, observó que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendían a través de la columna a diferentes velocidades. Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de él (fase móvil). La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). En el experimento de Tswett, la separación de los pigmentos vegetales se logró gracias a que cada uno de ellos tenía una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes más afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso de un detector, su caracterización química. Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los métodos cromatográficos según el estado físico de la fase móvil: Cromatografía líquida. La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido), o bien un líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquido- líquido). Esta forma de cromatografía puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor uniforme; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografía líquido- líquido. Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 2 Cromatografía de gases. En este caso la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase estacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte (cromatografía gas-líquido). Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo (hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor capacidad de separación. De acuerdo con el mecanismo de retención, la cromatografía se puede clasificar en los siguientes tipos: adsorción (normal, de fase reversa) partición líquido-líquido intercambio iónico permeación sobre gel de afinidad Las áreas de aplicación son muy diversas y abarcan prácticamente todas las actividades en las que interviene la química, por ejemplo: se emplea en: El análisis de drogas y fármacos en fluidos biológicos como la saliva, la sangre, la orina; Seguir la transformación de las sustancias responsables de la transmisión neurológica; Determinar la presencia de contaminantes en el medio ambiente; Descifrar la composición de los combustibles fósiles; Realizar el control de calidad de los productos químicos y farmacéuticos manufacturados; en fin, la lista de ejemplos es interminable. 1.2 Cromatografía en papel La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica potente no requiere de ningún tipo de equipamiento. La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la disolución y evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. La separación se realiza en función de la afinidad de los solutos con las dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se aplicó la muestra, y las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos. Las sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos físicos o químicos http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=An%C3%A1lisis_cualitativo&action=edit http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=An%C3%A1lisis_cualitativo&action=edit http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=An%C3%A1lisis_cualitativo&action=edit http://es.wikipedia.org/wiki/Disolvente http://es.wikipedia.org/wiki/Capilaridad Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 3 La cromatografía en papel es una técnica utilizada para análisis inorgánico cualitativo, permite llevar a cabo la separación e identificación de iones, trabajando con cantidades mínimas de sustancia. Pertenece al tipo de “Cromatografía de partición” se fundamenta en que las sustancias problema, pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno permanece fijo en la superficie del papel “fase estacionaria” generalmente en agua, la fase móvil constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tipos de cromatografía, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y de separación de zonas y sectores. Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas manchas características sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con una lámpara fluorescente, los contornos se marcan con lápiz. Como medida en cromatografía sobre papel se emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia por el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por la distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S). 𝑅𝑓 = 𝑋 𝑆 [1] En la cromatografía en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa de elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase móvil, en la que irá disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en función de los componentes que se pretenden separar. 1.3 Cromatografía en capa fina La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro para Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 4 aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionariaserá un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente: hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían el cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos. Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también se le puede añadir un adherente. En la elección del eluyente influyen varios factores: Precio. Pureza. No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad). No utilizar compuestos muy volátiles. Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores). La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares. Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 5 Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que el tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado. 1.4 Cromatografía de permeación en gel La cromatografía de permeación en gel, también conocida como cromatografía de exclusión es una variante de la CLAE que consiste en una columna cromatográfica empacada de tal manera que las partículas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaños de poros o de redes de poros con el fin de que las moléculas de soluto sean retenidas o excluidas basándose en su forma y tamaño y no en el peso molecular. Bajo este entendido, las moléculas de mayor tamaño no caben dentro de los poros y son arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de “cama de vacío” de la fase móvil. Por el contrario, las partículas de menor tamaño eluyen hasta el final porque tiene más espacio de columna que recorrer debido a un fenómeno de difusión hacía los poros que tienen accesibles. Las moléculas de tamaños intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la cantidad de poros por los que puedan pasar. Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos columna. Entre ellos están los polímeros macromoleculares semirígidos, los entrecruzados, las sílices rígidas ó las de “poro controlado”. Los materiales semirígidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso ya que se limitan a una presión de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienen un tamaño usual de 5µm, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados son compatibles con sistemas no acosos. Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 6 Otro tipo de empacamiento hidrofílico poroso es preparado mediante una polimerización por suspensión de metacrilato de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resisten presiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de disolventes orgánicos polares. Disolventes. La cromatografía de exclusión requiere un solo disolvente durante el análisis en el cual se pueda disolver la muestra. El único inconveniente que pude presentarse con los disolventes es la relación de viscosidades. Cuando la viscosidad de la muestra inyectada difiere mucho con la viscosidad de la fase móvil se pueden dar, una distorsión en los picos cromatográficos y cambios anómalos en los tiempos de retención. 1.5 Cromatografía de exclusión de iones Una variante de la cromatografía de permeación en gel o cromatografía de exclusión, es cuando se realiza para la exclusión de iones. Mediante esta modificación, se tienen separaciones que dependen de factores como tamaño de partícula de la resina, forma iónica e incluso distribución de isómeros. Esto permite separar especies que de otra forma eluirían al mismo tiempo. Las separaciones se llevan a cabo en resinas de intercambio con base en poliestireno de alta capacidad como eluyentes, ácidos minerales diluidos. Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o de muestras fisiológicas en donde la mayoría de los ácidos del ciclo de Krebs están presentes, puede ser hecho fácilmente mediante el uso de una columna de exclusión aniónica. El uso de las columnas de exclusión aniónica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la separación de oligosacáridos usando agua como eluyente a una temperatura de 90ºC, aplicando también la separación por exclusión estérica. 1.6 Cromatografía de intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo con empaques de columna que tiene grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimérica. Los grupos funcionales enlazados permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retención más común es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase móvil con el grupo cargado de la fase estacionaria. En el caso de empaques cargados negativamente sirven para intercambiar especies catiónicas. Los más comunes son los sulfónicos, los cuales son fuertemente ácidos y tiene las propiedades de los Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 7 ácidos fuertes cuando está en la forma H. los empaques cargados positivamente se utilizan para el intercambio con especies aniónicas. Los más comunes son las aminas cuaternarias, las cuales son fuertemente básicas y en su forma OH presentan las propiedades de una base fuerte. Ambos grupos funcionales están totalmente disociados. Así, sus propiedades de intercambio son independientes del pH de la fase móvil. La cromatografía de intercambio iónico puede efectuarse con alguno de los varios tipos de empaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de resina, alrededor de 1-2m de espesor, sobre una cuenta de vidrio con diámetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienen recubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de sílice en el que se impregna o enlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos de empaques la capacidad de intercambio es baja: 0.01- 0.1 meq/g. El intercambiador puede también estar enlazado a macropartículas de sílice por medio de reacciones de sililación o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso. El proceso primario en la cromatografía de intercambio iónico involucra la adsorción/desorción de materiales iónicos cargados en la fase móvil con una fase estacionara permanentemente cargadas (de signo contrario). Ejemplo, una resina ionizada, inicialmente en forma H, en contacto con una solución que contiene iones K+, existe un equilibrio: resina, H + K+ resina, K+ + H+ Las diferencias de retención están gobernadas esencialmente por las propiedades físicas de los iones solvatados. La fase de resina presenta preferencia por: 1. El ion de carga mayor. 2. El ion conmenor radio solvatado. 3. El ion que tenga mayor polarizabilidad. Aplicaciones de intercambio catiónico: Los cationes inorgánicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietéticos bajos en sodio, y en muestras de orina. Aplicaciones de intercambio aniónico: Se pueden separar los ácidos HCN, carbónico, silícico y bórico de los ácidos fosfórico, sulfúrico y clorhídrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro. Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 8 1.7 Cromatografía de fluidos supercríticos La temperatura crítica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede existir en la fase líquida independientemente de la presión. La presión crítica es la presión de vapor de una sustancia a su temperatura crítica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su temperatura y de su presión crítica (punto crítico) se denomina fluido supercrítico. Los fluidos supercríticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entre las características de esa sustancia en estado gaseoso y en estado líquido. Comparación de las propiedades de los fluidos supercríticos con las de gases y líquidos. (Los datos sólo indican el grado de magnitud). GAS FLUIDO SUPERCRÍTICO LÍQUIDO Densidad (g/cm 3 ) (0,6-2)*10 -3 0,2- 0,5 0,6- 2 Coeficiente de difusión (cm 2 /s) (1-4) * 10 -1 10 -3 – 10 -4 (0,2 – 2)* 10 -5 Viscosidad (g cm- 1 s- 1 ) (1-3)* 10 -4 (1-3) * 10 -4 (0,2- 3)* 10 -2 Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografía de gases, líquidos y fluidos supercríticos, así como la extracción de fluidos supercríticos. Una propiedad importante de los fluidos supercríticos, que está relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su notable capacidad para disolver moléculas grandes no volátiles. Por ejemplo, el dióxido de carbono supercrítico disuelve fácilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 átomos de carbono. Una segunda propiedad notable de los fluidos supercríticos es que los analitos disueltos en ellos pueden ser fácilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con la atmósfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercríticos es que son baratos, inocuos y no son sustancias tóxicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en la atmósfera sin efectos ambientales dañinos. La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una modalidad híbrida entre la cromatografía de gases y de líquidos que combina algunas características de cada una de ellas. Esta técnica es una de los tres tipos importantes de cromatografía en columna, ésta permite la separación y determinación de compuestos que no son manipulados ni por la cromatografía de gases ni por la de líquidos: compuestos no volátiles o térmicamente lábiles para los que la cromatografía de gases es inaplicable y (2) los Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 9 compuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las técnicas espectroscópicas o electroquímicas empleadas en cromatografía de líquidos. Los equipos instrumentales para la cromatografía de fluidos supercríticos son bastante parecidos en lo referente a los componentes instrumentales a los equipos de HPLC. Existen, sin embargo, dos diferencias importantes: (1) Es necesario un horno, similar para mantener la columna termostatizada y además proporcionar un control preciso de la temperatura de la fase móvil; (2) un restrictor o un dispositivo de contrapresión, que se utiliza para mantener la presión en la columna en el nivel deseado y para convertir el eluyente, de fluido supercrítico en un gas, y arrastrarlo al detector. Las variaciones de presión en cromatografía de fluidos supercríticos tienen un efecto muy marcado sobre el factor retención o de capacidad, k’. Este efecto es una consecuencia del incremento de la densidad de la fase móvil a medida que aumenta la presión. Tal incremento de la densidad origina un aumento de la capacidad disolvente de la fase móvil, lo cual acorta los tiempos de elución. La mayoría de los perfiles de presión utilizados en cromatografía de fluidos supercríticos son: presión constante (isobárica) para un período de tiempo dado seguida de un aumento lineal o asintótico de la presión hasta alcanzar el valor de la presión final. Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas, aunque las primeras son las más empleadas. Las columnas abiertas son similares a las columnas de sílice fundida con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnas tienen una longitud de 10 a 20 m y un diámetro interno de 0,05 a 0.10 mm. El espesor de la película varía entre 0.05 1 micrómetro. Fases móviles. La fase móvil más utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente par un conjunto de moléculas orgánicas no polares. Además, es una sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, no tóxica, fácilmente disponible y muy barata cuando se compara con otras fases móviles cromatográficas. La temperatura crítica del CO2 ES 31° C y su presión crítica 72,9 atmósferas, lo cual permite jugar con una banda amplia de temperaturas y presiones sin superar las condiciones de operación de un equipo de HPLC moderno. Sustancias como etano, butano, óxido nitroso, diclorodifluorometano, éter dietílico, amoníaco y tetrahidrofurano han sido utilizadas como fases móviles de cromatografía de fluidos supercríticos. Detectores. La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en la cromatografía de gases, detectores de ionización de llama. Este detector es de respuesta universal a compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad. Los espectrómetros de masas también se pueden Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 10 adaptar como detectores más fácilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son de absorción en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisión de fluorescencia, termoiónico y fotométrico de llama. La cromatografía de fluidos supercríticos se ha aplicado a la separación de un amplio conjunto de sustancias, entre los que se cuentan productos naturales, fármacos, alimentos, pesticidas y herbicidas, tensoactivos, polímeros, aditivos de polímeros, combustibles fósiles y explosivos y propelentes. 1.8 Cromatografía de afinidad La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad de fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de soporte porque están unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz inerte que debe de tener una estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la fase estacionaria es sólida. Estos ligandos se clasifican según su naturaleza química o su selectividad para la retención de analitos, esta última se clasifica en ligandos específicos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando las proteínas no específicas se han lavado a través de la columna, se eluye la proteína ligada con solución que contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que se desactiva, generalmente por el acoplamiento o alteración de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible, se necesita un cambio en el pH, la fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones modifican las características de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la proteína para continuar con la regeneración de la columna cromatográfica. La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retención de proteínasafines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión, columnas cortas y un campo restringido para la separación. Esquema de cromatografía de afinidad: En el primer vaso, se encuentra una mezcla de proteínas que se añaden a la columna, la cual contiene un ligando específico ligado al polímero, para la proteína de interés. En el segundo matraz se encuentra una solución de ligando, el cual se añade a una probeta para que eluya a la proteína de interés. La bureta de en medio indica que las proteínas deseadas se lavan a través de la columna. Los puntos rojos representan la proteína de interés, los negros, el ligando y las bolas beige unidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polímero. Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 11 1.9 Cromatografía de líquidos de alta resolución La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada. Las razones son la sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, es ideal para la separación de especies no volátiles o termolábiles y por su gran aplicabilidad a sustancias que son de interés en la industria. Algunos ejemplos son: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y gran variedad de sustancias inorgánicas. La fase móvil es un líquido y la fase estacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable. 1.10 Electroforesis Los orígenes de ésta técnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logró separar mezclas de proteínas (micelas cargadas eléctricamente) por su distinta movilidad en un soporte poroso al que se aplicaba un campo eléctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separación de cualquier especie cargada o alrededor de una doble capa eléctrica. El fundamento de la técnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla de especies cargadas. Por aplicación de un campo eléctrico entre los extremos del soporte poroso las especies se separan en función de sus cargas y su movilidad iónica en ese medio. Cuanto más elevado sean el voltaje y la intensidad en menos tiempo se produce la separación; sin embargo valores altos de estas variables provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente evaporación del disolvente y acumulación de sales del tampón, lo cual es indeseable. Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) que son disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamente escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han utilizado alúmina, lana de vidrio, almidón, agar-agar, gel de sílice, etc. Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 12 Electroforesis capilar La sección transversal del aparato de electroforesis se puede reducir se forma drástica al realizar la electroforesis en el interior de un tubo capilar de diámetro interno menor a 0.1mm y una longitud de 50cm a 1m. Es efectivo llevar de ésta forma la técnica porque la resistencia eléctrica de la disolución es tan alta que la corriente se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes más altos sin calentamiento excesivo. La técnica tiene gran poder de resolución y se han desarrollado métodos para llevar a cabo la electroforesis incluso en moléculas neutras no iónicas. Además, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual modo que en una cromatografía en columna. El inconveniente de utilizar un capilar es que el volumen de muestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos, y después de la separación, cada uno de los analitos está en volúmenes inferiores al nanolitro. Con volúmenes de líquido tan pequeños, muy pocos métodos de detección se pueden usar eficazmente. 1.11 Bibliografía -Braithwaite, A. Métodos cromatográficos, 4ª ed., ED. Chapman & Hall, Londres, 1985. Páginas 216 چ 217, 271-272. Burriel Marti, Felipe Lucena Conde, Siro Arribas Jimeno, Jesús Hernández Méndez, Química Analítica چ Cualitativa, Ed. Thompson, España, 2003 pp 321-322. .Garrido, A., Fundamentos de química biológica. Interamericana Mc Graw-Hill. España. 1991 چ Kenneth A. Rubinson, Judith F. Rubinson, Análisis Instrumental, Ed. Prentice Hall, España 2004, pp چ 730-739. ,Lehninger, Albert. L. Principios de Bioquímica. Segunda Edición. Ediciones Omega. Barcelona, 1995 چ pp 137 Fig. 1. Diagrama de las partes básicas de un instrumento de electroforesis capilar con detección espectroscópica. La muestra penetra por la parte de la izquierda introduciendo el final del capilar en la disolución de la muestra y cargándolo, bien hidrodinámicamente, bien electrocinéticamente. Toda la unidad de la ilustración funciona a temperatura constante. El capilar está enrollado alrededor de un soporte. Durante el análisis los niveles de las dos disoluciones tampón deben ser iguales como se indica con la línea punteada) para evitar el flujo de masa debido a una diferencia de presión. Introducción a los métodos de separación Capítulo 1 13 McCABE / SMITH /HARRIOTT. “Operaciones Unitarias en Ingeniería Química” 1991. Cuarta Edición en چ Español. Editorial McGraw Hill S.A. España .PERRY, ROBERT H. “Manual del Ingeniero Químico” 1992. Sexta Edición. Tercera Edición en Español چ Editorial McGraw Hill. México ,Skoog A. Douglas. Principios de análisis instrumental, 5ª ed., Saunders Collage Publishing, Espana چ 2001, págs.: 785- 791 y 831- 836. ,Willard Hobart, Métodos instrumentales de análisis. 7ª. Ed., Compañía de publicaciones Wadsworth چ California, 1988, Páginas 644-650. http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.ht چ m http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf چ http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina چ http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papel چ http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papel Parámetros cromatográficos Capítulo 2 14 Capítulo 2 Parámetros cromatográficos 2.1 Glosario Anchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por un separador de banda. Banda: Es una situación ideal, es una distribución gausiana. La cantidad de compuesto que sale de cromatografico o de una columna electroforética. Coeficiente de difusión: Medida de la movilidad de una especie en unidades de cm2/s. Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribución de un soluto entre dos fases, para definir el coeficiente de partición solo se utiliza una forma de un soluto (kD). Coeficiente de selectividad: medida de la sensibilidad de un método para un interferente dado en comparación con su sensibilidad para el analito (KA,I). Cola: prolongación final de un pico cromatográfico, generalmente debida a la presencia de lugares muy activos en la fase estacionaria. Constante de disociación: constante de equilibrio de una reacción en la que un complejo metal- ligando se disocia para formar un ión metálico libre y un ligando (kD). Constante de equilibrio: K’ Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valor numérico de K’ depende de la fuerza iónica del medio. Cromatografía: separación en la que los solutos se distribuyen entre fase móvil y estacionaria.Cromatografía gaseosa: técnica cromatográfico en la que la fase móvil es un gas. Cromatograma: registro de la señal de detección en función del tiempo de elusión o del volumen. Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatográfico, se suele expresar en términos de la altura H, de los platos o del número N de platos teóricos. En la medida en que la distribución del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos está dada por la varianza dividida entre la longitud de la columna del empacado. Parámetros cromatográficos Capítulo 2 15 Ensanchamiento de banda: aumento de la anchura de base de un soluto a medida que se desplaza desde el punto de inyección al detector. Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k’). Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividad de la columna para uno de ellos (α). Factor de separación: medida de la eficacia de una separación en lo que se refiere a la separación entre el analito y el interferente. Fase estacionaria: fase extractante que permanece en posición fija. Fase móvil: fase extractarte que se desplaza a través del sistema. Número de platos teóricos: característica de una columna cromatográfica que se emplea para medir su eficiencia. Plato teórico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar una columna, como si estuviera compuesta de pequeñas zonas o platos, en las que tiene lugar el reparto entre las fases móvil y estacionaria Relación de distribución: cociente que expresa la concentración total de soluto en una fase en relación con una segunda fase; en su definición participan todas las zonas del soluto (D). Resolución: separación entre dos bandas cromatográficas (R). Selectividad: Medida de la ausencia de interferencia de un método que se mide ante el cociente de selectividad del mismo. Tiempo de retención: es el tiempo entre la inyección en una columna cromatográfica y la llegada a un pico de analito al detector. Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a través de la columna. Parámetros cromatográficos Capítulo 2 16 Un parámetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un proceso, una operación o un resultado. La parametrización de datos en cromatografía, como en otros métodos facilita la tabulación y la comunicación de dichos datos. Se puede parametrizar la forma, la posición y la resolución de las bandas de una cromatografía. Estos pueden correlacionarse satisfactoriamente con descripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separación. 2.2 Constantes de Distribución Al encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre un fenómeno de distribución, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a alguna de las dos fases. De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad de soluto que existe en una fase y en otra. La constante asociada es la llamada constante de distribución, que se define para un soluto A como: 𝐷𝐴 = 𝐴 1 𝐴 2 donde [A]1 y [A]2 son la concentración de A en la fase 1 y 2 respectivamente. Concretamente, en cromatografía la fase 1 es la fase estacionaria y la fase 2 es la fase móvil y el soluto A es el analito de interés. Esta constante es específica para cada compuesto con cada determinada fase estacionaria y fase móvil. 2.3 Factores de influencia en la retención La retención que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la diferencia de polaridades entre las fases estacionaria y la móvil, promoviendo que el soluto se reparta entre ellas según su coeficiente de distribución. De esta manera, al separarse una mezcla que contenga solutos con polaridad distinta, y por lo mismo coeficientes de distribución distintos, la retención será diferente para cada uno. En la cromatografía de gases, el to, es evaluado convenientemente a partir del tiempo de retención del “pico de aire”. En la cromatografía de líquidos, cualquier compuesto no retenido puede usarse como muestra para medir el to. El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo de retención ajustado o corregido, t’R. t'R = tR – to Parámetros cromatográficos Capítulo 2 17 Una medida conveniente y útil de la retención del soluto está dada por el factor de capacidad (o factor de retención), k’ 𝑘´ = 𝑡´𝑟 𝑡0 FIG. 1. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retención diferentes, así como el tiempo muerto. Los valores de k’ no tienen un significado simple en un gradiente de elución o en temperatura programada, y usualmente no son reportados cuando esos procedimientos son usados. Los valores de k’ pueden ser determinados a partir del tiempo de retención, tR. En los modos de retención de cromatografía se tiene: k’ > 0, que significa que no hay bandas eluidas antes del tiempo muerto, to. A menudo es útil expresar el tiempo de retención o el volumen en términos del factor de capacidad, k’. tR = to (1+ k’) VR = Vm (1 + k’) La retención del soluto en la fase estacionaria depende de la afinidad, y de los factores que puedan afectar a la misma. El fenómeno de adsorción depende fuertemente de la temperatura, a mayor sea ésta se fomentará la desorción, y debe por tanto controlarse dependiendo de la naturaleza del análisis. 2.4 Retención y Equilibrio en Cromatografía El soluto se encuentra en un equilibrio de distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y dependiendo del desplazamiento de dicho equilibrio es la retención del mismo. Una separación cromatográfica típica se muestra en la figura 2. La separación está fuertemente afectada por la proximidad de bandas adyacentes en el cromatograma. Parámetros cromatográficos Capítulo 2 18 Una importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de separación, α, donde dos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2: α = k2 / k1 El factor de separación, α, es usualmente identificado con la selectividad del sistema cromatográfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes tiempos de retención para dos compuestos específicos. Dicho factor debe tener un valor mayor a uno, pues esto significaría que no hay separación, pero es recomendable que sea menor a dos puesto que tiempos de retención muy largos se traducen en tiempo desperdiciado durante la operación experimental. Los valores de α depende de los dos solutos y de 1) La composición química de la fase estacionaria. 2) La composición química de la fase móvil (excepto en cromatografía de gases). 3) La temperatura. En cromatografía de fluidos supercríticos, la presión también puede afectar a α al cambiar la densidad de la fase móvil. FIG. 2. Separación de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografía de líquidos. 2.5 Eficiencia de separación de una columna Las columnas cromatográficas consisten en un número de zonas adyacentes en cada una de las cuales hay suficiente espacio para que un analito esté en equilibrio entre dos fases. Cada una de estas zonas se conoce con el nombre de plato teórico (de los que hay N en cada columna). La longitud de una columna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. El Parámetros cromatográficos Capítulo 2 19 valor numérico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. La altura del plato está relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de la columna, X: 𝐻 = σ2 X donde σ es un estándar de desviación de la banda gaussiana. Para los picos gaussianos simétricos la anchura de la base es igual a 4σ y la anchura del pico al punto de inflexión,ωi es igual a 2σ. Por lo tanto el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico. El número de platos teóricos en la columna entera viene dado por: 𝑁 = 𝐿 𝐻 = 𝐿 ∗ 𝑋 σ2 donde L es la longitud de la columna. Si consideramos la posición del pico a X = L con el hecho de que la anchura del pico en su base es ω, obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con más pendiente del pico, es igual a 4σ, la ecuación anterior se convierte en 𝑁 = 16 ∗ 𝐿2 W2 Si en lugar de medir L y ω en unidades de longitud se hace en tiempo, la ecuación quedará: 𝑁 = 16 𝑡𝑅 𝑊 2 La medición del ancho del pico es más confiable cuando se realiza a la mitad de la altura del pico, con lo cual se puede utilizar 𝑁 = 5.545 𝑡𝑅 𝑊1/2 2 También puede hacerse en función de la altura y área del pico 𝑁 = 2𝜋 𝑡𝑅 á𝑟𝑒𝑎 𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 2 Es importante que tanto 𝑡𝑅, W ó W1/2 ó á𝑟𝑒𝑎 𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 se expresen en las mismas unidades ya que N es adimensional. Parámetros cromatográficos Capítulo 2 20 Para que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de película delgados y columnas de poco diámetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de la fase móvil también afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad óptima para obtener el máximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de éste para no perder demasiado tiempo en análisis. 2.6 Procesos de ensanchamiento de banda El número de platos de una columna (eficiencia, N) es una medida del ensanchamiento de la banda cromatográfica. Cuando inyectamos un pequeño volumen de analito en una columna forma una banda estrecha en su inicio, pero a medida que el analito migra la banda se va ensanchando. La anchura de pico aumenta con la raíz cuadrada de la longitud que la banda ha recorrido. Según la ecuación de Van Deemter 𝐻 = 𝐴 + 𝐵 𝑣 + 𝐶 ∗ 𝑣 A representa el término de caminos múltiples. Esto es porque las moléculas no siguen únicamente un camino, hay multicanales, que se deben a la densidad de empacado de la fase estacionaria y afecta según el tamaño y forma de la partícula. B representa la difusión axial, la cual depende de la movilidad de las moléculas en las fases. El soluto se difunde desde la zona central que es la más concentrada hacia las regiones más diluidas. En esto influye la velocidad v , pues a velocidades muy altas no se alcanza a difundir y predomina el término A. Para encontrar la velocidad óptima puede trazarse una curva de Van Deemter al graficar H en función de v. Por último, C representa la resistencia a la transferencia de masa. Es necesario éste término porque en realidad los fenómenos que ocurren están fuera del equilibrio. Esto es porque las corrientes de la fase móvil como la capa de fase estacionaria tienen una anchura determinada. Por lo que las moléculas de analito necesitan primero migrar desde el centro de ellas hasta la interfase donde ocurre la transferencia, y este retraso temporal se traduce en ensanchamiento de bandas. 2.7 Resolución La separación relativa de dos bandas a menudo se refiere a su resolución, Rs. La resolución se define como Parámetros cromatográficos Capítulo 2 21 𝑅𝑠 = 𝑡2 − 𝑡1 1 2 (𝑤1 + 𝑤2) Aquí, t1 y t2 se refieren a los tiempos de retención (tR) de la primera y la segunda banda, y W1 y W2 son el ancho de dichas bandas. La figura 3 ilustra la separación de dos bandas adyacentes como una función de sus valores de Rs y su tamaño relativo. Se observa que la separación mejora sistemáticamente a mayores valores de Rs, y la separación es generalmente mejor para dos bandas de igual tamaño (y el mismo valor de Rs.). Esto es, mayores valores de Rs se requerirán normalmente para la separación de las bandas desiguales. Fig 3. Separación de dos bandas como una función de la resolución (Rs) y el tamaño relativo de banda. La resolución depende de la retención y selectividad de manera proporcional. A mayor selectividad y retención k´, mayor resolución. Para tener una buena separación se recomienda utilizar k´ > 2, y generalmente se trabaja con α ≈1. Para el análisis cuantitativo es deseable (pero no siempre práctico) alcanzar la resolución de al menos Rs = 1.5, desde que esto corresponde a la separación a la línea base de bandas de tamaño similar. La separación de la línea base hace que los sistemas de datos midan el tamaño de cada banda apropiadamente y esto significa una cuantificación fiable. Una resolución pobre puede deberse a que el método utilizado no es apropiado, pues no discrimina entre los solutos, o que hay mucha muestra en proporción a la columna cromatográfica. Parámetros cromatográficos Capítulo 2 22 2.8 Cuantificación en cromatografía Para llevar a cabo un análisis cuantitativo, es necesario que los datos obtenidos sean confiables, tanto para la construcción de la curva de calibración como para el tratamiento del analito mismo. Primero es necesario llevar a cabo un análisis cualitativo, en el cual se encuentren las condiciones óptimas. Para evaluar esto, se calculan los parámetros cromatográficos de cada ensayo que sirven como referencia. De ésta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las mejores condiciones posibles, acercándose a resultados reproducibles y por tanto precisos, y lo más exactos que ésta técnica nos permite. Si no se obtiene una buena resolución, primero debe repetirse el ensayo con menor cantidad de muestre, sino puede probarse utilizando una fase móvil distinta, y si esto no ayuda, puede utilizarse otra fase estacionaria. En caso de que la selectividad no sea buena, debe revisarse la temperatura de trabajo, y analizar la naturaleza química de las distintas fases así como solutos, para probar con otra fase sea estacionaria o móvil. No debe perderse de vista, que a menor tiempo de operación mejor, y que una vez encontradas las mejores condiciones, no deben alterarse. Para realizar la curva de calibración puede usarse el método de estándar externo o interno, siendo el segundo apropiado para eliminar posibles errores de operación. 2.9 Resumen La cromatografía es una técnica de separación que se basa en la diferencia de distribución que existe entre dos componentes de una mezcla en las fases estacionaria y móvil. Así, cada soluto tendrá un tiempo de retención distinto y podrán analizarse por separado. Los parámetros cromatográficos son claves para el diseño de un análisis, pues son herramientas que ayudan a evaluar las condiciones en las que se está llevando a cabo. Cada soluto tendrá asociado un tiempo de retención distinto que se puede expresar como el factor de capacidad, y la relación de los tiempos de retención o factores de capacidad de los solutos nos indicará si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolución se podrá evaluar si la separación entre los tiempos de retención se los solutos es suficiente o excesiva. El cálculo de los platos teóricos nos indicará la eficiencia del sistema. Una vez evaluados los parámetros cromatográficos, se podrá determinar si el cromatograma obtenido es aceptable, o si es necesario modificar alguna condición para optimizarlo. Parámetros cromatográficos Capítulo 2 23 2.10 Bibliografía Heftmann, E. Chromatography: Fundamentals and Applications of chromatography and related differential migration methods, Elsevier Science Publishers B.V,5a. edición, EUA, 1992, pp. 2-14 Rojo Callejas F., Manual de Química Analítica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Química UNAM, México 2002 http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr- 14/skoog/26d.html http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografiahttp://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-14/skoog/26d.html http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-14/skoog/26d.html Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 24 Capítulo 3 Cromatografía en fase líquida a columna abierta 3.1 Procedimientos de empaquetamiento En cromatografía de fase líquida, la fase móvil es un líquido y éste desciende a través de la columna. La fase estacionaria es frecuentemente un líquido que recubre el interior de un tubo capilar o la superficie de partículas sólidas empaquetadas dentro de la columna. Alternativamente, las mismas partículas sólidas pueden ser la fase estacionaria (como se muestra en la figura 1, en cualquier caso, el reparto de solutos entre las fases móvil y estacionaria dan lugar a la separación. Fig 1. Representación esquemática de una separación cromatográfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidad que el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna más tiempo. Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con partículas que contienen la fase estacionaria y los materiales más usados para los tubos de las columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulación más fácil. Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un sólido poroso con gran área superficial, inerte y con una buena resistencia mecánica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varían, entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (más empleado en CG), alúminas, resinas de intercambio iónico o compuestos de sílice como SiO2 amorfo, sin embargo, éste debe de someterse a un tratamiento para hacerlo aún más inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es característico que Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 25 el tamaño de las partículas y de los poros deben ser lo más uniforme posible. El procedimiento del empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos: 1. Colocación de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de manera uniforme y compacta en la columna (longitud y diámetro apropiados). 2. Verificación de ausencia de espacios vacíos en la columna (para evitar que los picos del cromatograma sean más anchos y de menor eficiencia. 2.2 Aplicación de la muestra Una vez que la columna se encuentra correctamente empaquetada, se procede a la aplicación de la disolución de la muestra. Cuando se introduce en la columna cierta cantidad de muestra, ésta se queda en una zona de cierta altura en la columna. Si entonces se introduce el disolvente, comienza el desplazamiento de la zona a lo largo de la columna. La parte superior de la zona se disuelve poco a poco y, empujado por la disolución que se forma, el frente de la zona avanza hacia la base de la columna. Si el disolvente utilizado para la elusión es el mismo que la disolución problema, los platos teóricos comprendidos en la parte central de la zona, reciben una fase móvil en equilibrio con ellos y las concentraciones permanecen estacionarias. El movimiento de la zona sólo es aparente en sus extremos por lo que su estudio se puede hacer sobre una zona que se supone no tiene más espesor de un plato teórico. 2.3 Procedimientos de elución La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto es prácticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elución como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Para el caso específico de cromatografía de adsorción, existe una ordenación de los disolventes de acuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serie eluotrópica. La fuerza eluyente es una medida de energía de adsorción del disolvente, supuesto valor cero para el sistema pentano/sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente respecto a la sílice en cromatografía de adsorción. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto más rápidamente se eluirán los solutos de la columna. Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 26 La cromatografía de adsorción sobre sílice pura es un ejemplo de cromatografía de fase normal, que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente más polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografía de fase inversa, que es la más utilizada, se caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o débilmente polar y el disolvente es más polar. Un disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografía de fase inversa elimina las colas de los picos porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningún soluto originando colas. La cromatografía de fase inversa también es menos sensible a impurezas polares (como el agua), que pueda haber en el eluyente. 2.4 Elución isocrática y gradiente La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes, se puede usar una elución gradiente. En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo un gradiente continúo. Fig 1. Las moléculas del disolvente y las moléculas del soluto compiten entre sí en su reacción con los puntos activos de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, más fácilmente se desplaza el soluto. 2.5 Cromatografía de absorción y de partición de columna Estas son dos técnicas de análisis cromatográfico, la diferencia entre ellas es que la retención del analito en la columna depende de la naturaleza de su interacción con la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el soluto, nuestro analito, con la fase estacionaria, en la de absorción, vemos que de pega a la superficie, mientras que en la de partición de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria. Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 27 2.6 Cromatografía de adsorción La absorción es un fenómeno de superficie, por lo tanto físico, en el cual diversas sustancias son atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficie interfacial, formándose una película del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, sea sólido o líquido, aunque este proceso implica una interacción de diferentes fuerzas, sean estas físicas o químicas, por ello se habla de fisisorción, cuando la naturaleza de las fuerzas que retienen al material es solo física, y quimisorción, cuando la retención implica enlaces con el adsorbente. Así pues, en la cromatografía de adsorción, se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que si es en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los demás componentes se eliminen. Durante la separación, se filtra una solución a través de una columna de adsorbente, que es la fase móvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase estacionaria sólida, formando una “cama” de partículas que se dividen de modo que el área de absorción sea máxima, o sea, se distribuyen a lo largo del sólido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de absorción. El equilibrio entre la fase estacionaria y móvil permite la separación delanalito. Si vemos la ilustración de abajo, los puntos negros representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es la fase sólida, los huecos en ella son los sitios de absorción, donde el analito interacciona con la fase estacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunque generalmente encontramos la Hidroxiapatita (Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato de magnesio. Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 28 Aplicaciones. Esta es una de las técnicas cromatográficas mas antiguas, su uso depende del tipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza química, en particular se usa para la separación de compuestos isoméricos, especies no polares, hidrocarburos alifáticos, y para compuestos con grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrógeno fuertes, por ello es utilizada para separar azúcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas así como oligosacáridos, y también se ha usado para obtener proteínas biliares. 2.7 Cromatografía de partición de columna Esta técnica se basa en la retención del analito en una columna sólida como granos de fibra o cualquier otro material inerte químicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolvente afín al analito; y una fase móvil liquida o gaseosa; cuando la fase móvil pasa a través de la columna, el equilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda al final disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas, que son el flujo de la fase móvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los círculos, alrededor de los cuales hay una capa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito, donde este se disuelve. Las moléculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la móvil, a esto se le llama partición puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoquímica del sistema, entre las dos fases. La retención depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la matriz sólida, y de que tanto la fase móvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como el analito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 29 de solvente adherida a la matriz sólida, y como vemos también, el analito se distribuye entre la capa de solvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como esta sobre una columna, por ello se le llaman partición de columna. La solubilidad en ambas fases esta dada por el coeficiente de partición, KD: 𝐾𝐷 = 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎 Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tiene diferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separación del analito de la mezcla se logra por migración diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito pro el disolvente de la columna, el reparto en esta será mayor que en la fase móvil. Aplicaciones. Esta técnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o líquidos inmiscibles. 2.8 Cromatografía en gel. La separación basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en sustancias sin carga durante una migración osmótica a través de geles. La filtración en gel es el método de separación que consiste en la separación de moléculas basado en el tamaño relativo de las mismas. En la cromatografía en gel, la fase estacionaria es una matriz porosa polimérica cuyos poros se llenan con el solvente que se usará en la fase móvil. El flujo de la fase móvil provocará que moléculas mayores pasen a través de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partículas más pequeñas tardarán más tiempo en salir dependiendo de la penetración que tengan sobre el gel. Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa. Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 30 El volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del líquido afuera de la matriz de gel (V0, volumen de la fase móvil que eludirá a una molécula completamente excluida ), el volumen del líquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm). El volumen de elusión (Ve) se puede relacionar con V0 y Vi: ide VKVV 0 Kd es el coeficiente de distribución volumétrica: ied VVVK /)( 0 Kd caracteriza el comportamiento de retención del soluto. Representa la fracción del volumen del gel que es accesible a la molécula en cuestión. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se una serie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene: En un rango pequeño de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una línea recta: MBAKd log La separación por cromatografía en gel está influenciada por las propiedades de los poros de la red tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material para el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polímeros entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamente suave. Los aerogeles son sólidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el vidrio y silica porosos. El nombre de los geles más comúnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 31 Aplicaciones. Desalinización: Largas moléculas de origen biológico son separadas de especies ionizables o inorgánicas. Un ejemplo en la separación de la hemoglobina y NaCl en un gel Sephadex. La cromatografía en gel se utiliza para separar proteínas, péptidos, ácidos nucléicos, polisacáridos, enzimas, hormonas y los químicos en polímeros, para determinar distribuciones de pesos moleculares en mezclas de polímeros. 2.9 Cromatografía de intercambio iónico. El intercambio iónico es un proceso donde una solución de un electrolito se pone en contacto con una resina de intercambio iónico y los iones activos de la resina son remplazados por las especies iónicas de carga similar del analito. Ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una solución y un sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución. Las resinas cambiadoras de iones están constituidas por una red tridimensional de cadenas polímeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos funcionales ionizables. Se tiene una fase insoluble con sitios iónicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condición de que se mantenga la electroneutralidad. Una resina típica se prepara por polimerización de estireno y divinilbenceno. Cambiadores catiónicos. Los grupos funcionales ácidos se pueden introducir fácilmente, tienen el protón disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros iones positivos. Cambiadores aniónicos. Si se introducen grupos funcionales básicos, la resina intercambia aniones. Los cambiadores aniónicos se preparan con aminas, obteniéndose in grupo amonio, y por tanto, un medio básico. Las propiedades más importantes que determinan el funcionamiento de una resina: o Tamaño de las partículas – velocidad de intercambio y permeabilidad de la columna. o Naturaleza de los grupos funcionales – tipo de los iones intercambiables. o Fuerza de los grupos funcionales – coeficiente de distribución. o Número de grupos funcionales– capacidad de la resina. Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 32 A partir de la sustitución de cantidades equimolares de iones de cargas iguales, se obtienen equilibrios de intercambio. Se aplica la ley de acción de masa, donde K(coeficiente de selectividad), es la constante de equilibrio del sistema. Y donde el coeficiente de distribución KD: ][ ][ H HRK KD Efecto del pH del eluyente. La carga eléctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertir por cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relación de distribución o evitar un intercambio total. El efecto del pH sobre la elusión: Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metálicos dando iones complejos de carga negativa. En esta forma, los cationes metálicos que se separen mal en cambiadores catiónicos, se pueden complejar y separar en cambiadores aniónicos. Aplicaciones. Eliminación de iones. Un agua completamente desionizada se obtiene pasándola a través de un cambiador de cationes, y después a través de un cambiador de aniones. Separación de aminoácidos. La naturaleza anfótera de este grupo permite cambiar el signo de su carga o eliminar la carga neta, de modo que un ácido determinado se puede intercambiar en una resina aniónica, en una resina catiónica o en ninguna de las dos, mediante control de pH de la solución. 2.10 Cromatografía covalente Es un sistema especial de cromatografía, el cual es altamente selectiva la fase estacionaria, en el que se forma un enlace covalente reversible entre la fase estacionaria y la biomolécula a separar, las separaciones se basan en el acoplamiento “llave-cerradura” típico de la biología molecular; por lo cual es muy utilizado en esta área, además de tener un pequeño inconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito. Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 33 2.11 Conformación de la cromatografía covalente a) Ligandos: Se trata de biomoléculas que se encuentran en una base sólida, siendo estas las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2 maneras: Ligandos específicos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos. b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión, estos soportes generalmente geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG. 2.12 Fundamento de la cromatografía de afinidad Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido. Se procede a la elusión de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase móvil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos de esta manera se eluye el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil siendo una etapa rápida. Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 34 2.13 Cromatografía Flash Es un método cromatográfico, el cual nos permite separar de una manera rápida, fiable y económica; principalmente utilizada para la separación y purificación de proteínas. La Cromatografía Flash consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presión para la separación puede llevarse a cabo con relativa rapidez. El sistema incluye dos bombas de flujo continuo en la depuración de las columnas (variables por el usuario), una bomba peristáltica puede utilizarse para deposito en la columna, seguido de la radiación ultravioleta para detectar las biomoléculas en la columna, un mezclador para producir un gradiente de elusión, las válvulas de motor puede ser utilizados para ayudar en la inyección de la muestra, la selección de la columna o corriente de inversión, y un controlador con una función de integración computadorizada, en el cual se muestran los resultados de el análisis. Aplicaciones. En farmacia la cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) se utiliza para la depuración de grandes cantidades de diferentes biomoléculas (es decir, las proteínas y el ADN). 2.14 Resumen Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con partículas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrecho con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta de dos sencillos pasos: a) colocación de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b) Verificación de compactación (no espacios vacíos). El desplazamiento de la muestra a través de la columna, depende de la afinidad por ésta y del disolvente empleado para el proceso. Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 35 La elución es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Existen dos tipos de elusiones: Elusión por gradiente (cambio continuo de la composición del eluyente en sentido de aumento de fuerza eluyente) y elusión isocrática (un solo disolvente). Cromatografía de adsorción: esta técnica aprovecha el fenómeno de la absorción de sustancias en una superficie para separar analitos de mezclas al hacerlos pasar por una columna con un material adsorbente, que retiene el analito cuando este pasa a través de su superficie. Cromatografía de partición de columna: sta técnica permite separar analitos al hacerlos pasar por una columna sobre la cual hay una capa fina de un disolvente químicamente similar al analito, en el que este queda disuelto y retenido cuando pasa la fase móvil, se separa cuando se da un reparto entre las fases, en el que se espera que la mayor parte se quede en el disolvente de la columna. Cromatografía en gel: consiste en la filtración en gel que consiste en la separación de moléculas basado en el tamaño relativo de las mismas. El flujo de la fase móvil del sistema provocará que moléculas mayores pasen a través de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partículas más pequeñas tardarán más tiempo en salir dependiendo de la penetración que tengan sobre el mismo. Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa. Cromatografía de intercambio iónico: el intercambio iónico es un proceso donde una solución de un electrolito se pone en contacto con una resina de intercambio iónico y los iones activos de la resina son remplazados por las especies iónicas de carga similar del analito. Se tiene una fase insoluble con sitios iónicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga. Cromatografía covalente: las separaciones se basan en el acoplamiento “llave-cerradura”típico de la biología molecular; por lo cual es muy utilizado en esta área, además de tener un pequeño inconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito. Permite la separación de anticuerpos y enzimas. Cromatografía Flash: consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presión para la separación puede llevarse a cabo con relativa rapidez. Es una técnica muy utilizada en el área de bioquímica ya que nos permite separar biomoléculas y proteínas. Cromatografía en fase líquida a columna abierta Capítulo 3 Página 36 2.15 Bibliografía BERMEJO, F. - Química Analítica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7ma edición, Madrid 1991. HARRIS, D. - Análisis Químico Cuantitativo - Ed. Reverté - 2ª edición - España, 2001. SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Química Analítica - 7ª ed - McGraw Hill – México, 2001. ROUESSAC - Métodos y técnicas instrumentales modernas. Análisis Químico - McGraw Hill – USA, 2003. SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosíntesis and Functions - Addison-Wesley - New York, 1975. PECSOK, Robert – Métodos Modernos de Análisis Químico – Editorial Limusa – México, 1981. BRAITHWAITE, SMITH – Chromatografic Methods – 4° edición - Chapman & Hall – UK, 1994. http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/ www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes www.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htm http://www.monografias.com/trabajos15/reparacion-pc/reparacion-pc.shtml#BIOS http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm Cromatografía de gases Capítulo 4 37 Capítulo 4 Cromatografía de gases Esta técnica permite el análisis rápido y exacto de gases, vapores líquidos; permite identificar los componentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrollado notablemente en separación, identificación y determinación de compuestos volátiles (gases y líquidos) de puntos de ebullición de hasta 350-400°C. El método tiene las ventajas de ser sensible, rápido y sencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra información cuantitativa exacta con cantidades muy pequeñas de muestra. En cromatografía de gases (GC) la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de un fase móvil de un gas inerte a diferencia de los otros tipo de cromatografía, la fase móvil no interaccionan con la moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna.Existen dos tipos de cromatografía de gases:la cromatografía Gas-Sólido (GCS) y la cromatografía gas liquido (GLC).La cromatografía gas liquido tiene gran aplicación en todos los campos de la ciencia y su denominación se abrevia normalmente como cromatografía de gases (GC). En la cromatografía gas sólido se produce la retención de los analitos de una fase estacionaria como consecuencia de la absorción física. La cromatografía gas sólido ha tenido una aplicación limitada debido a la retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de elusión con colas muy significativas (como consecuencia del carácter no lineal del proceso de absorción), de modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografía gas líquido se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquido inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte. 4.1 Instrumentación Los componentes básicos de un instrumento para la cromatografía de gases se muestran a continuación, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposición se utiliza cuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por la presencia de las moléculas de analito. Cromatografía de gases Capítulo 4 38 Gas portador. Entre los gases portadores deben ser químicamente inertes, se encuentran el helio, nitrógeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores de presión, manómetros y medidores de caudal. Además el sistema de gas portador contiene a menudo un tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmente mediante un regulador de presión de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algún tipo de regulador de presión o regulador de flujo instalado en el cromatógrafo. Sistema de inyección de muestra. La eficacia de la columna requiere que la muestra sea de un tamaño adecuado y que sea introducida como un <tapón> de vapor, la inyección lenta de la muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolución .El método mas común de inyección de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar una muestra liquida o gaseosa a través de un diafragma o <septum> de goma de silicona en una cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna (la cámara demuestra normalmente esta unos 50°C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra. Configuración de la columna y del horno para la columna. En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas, las rellenas, y las abiertas o capilares. Hasta la fecha la mayor parte de las cromatografía de gases se ha realizado con columnas rellenas. Sin embargo, en la actualidad esta situación está cambiando rápidamente y parece probable que en un futuro próximo, http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0f/Inyector_gc.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0f/Inyector_gc.png Cromatografía de gases Capítulo 4 39 excepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sean sustituidas por columnas abiertas más eficaces y rápidas. Las columnas cromatográficas varían desde menos de 2 hasta 50m de longitud o más. Están construidas con acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón. La temperatura de la columna es una variable importante para que un trabajo preciso ha de regularse a las décimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno de temperatura controlada , la temperatura optima de la columna depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerida. Sistemas de detección. El detector ideal para cromatografía de gases tiene las siguientes características. 1.- adecuada sensibilidad 2.- buena estabilidad y reproducibilidad 3.-respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios órdenes de magnitud 4.-intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos 400°C 5.-tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal 6.-alta fiabilidad y manejo sencillo 7.-respuesta semejante para todos los soluto s o por el contrario una respuesta selectiva y altamente predecible para uno o más tipos de soluto 8.-no destructivo de la muestra. Resolución (Rs). Existe una magnitud que expresa el poder de resolución de la columna y que se denomina resolución de la columna y se define: 𝑅𝑠 = 2 𝑡𝑟2 − 𝑡𝑟1 𝑊𝑏1 +𝑊𝑏2 Si se toma W como el ancho medio de los picos, la ecuación queda: 𝑅𝑠 = 2 𝑡𝑟2 − 𝑡𝑟1 𝑊 Para los picos que están próximos entre sí Wb1 y Wb2 serán lo suficientemente parecidos como para que baste medir sólo uno. Cromatografía de gases Capítulo 4 40 Como lo muestra la figura, la
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