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Prof. Dr. Luiz Elídio Gregório Biossíntese de Príncipios Ativos Vegetais INTRODUÇÃO • Metabolismo Conjunto de reações químicas que continuamente ocorrem em cada célula. Enzimas (biotransformação) INTRODUÇÃO KH F IG E D CA B Enzimas específicas Enzimas inespecíficas INTRODUÇÃO METABOLISMO PRIMÁRIO METABOLISMO SECUNDÁRIO BIOSSÍNTESE macromoléculas (carboidratos, lipídeos, proteínas,nucleotídeos) grande produção distribuição universal FUNÇÕES ESSENCIAIS Fornecer energia (ATP) e poder redutor (NADPH); Biossíntese de substâncias. distribuição restrita (especificidade) FUNÇÕES ADAPTATIVAS atividades biológicas produção em pequena escala micromoléculas (diversidade e complexidade estrutural) INTRODUÇÃO • Funções no organismo produtor Elevada capacidade biossintética ≠ INTRODUÇÃO PAPEL DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS NOS VEGETAIS “A riqueza de metabólitos secundários em plantas é, pelo menos parcialmente, explicável no simples fato de que os vegetais estão enraizados no solo e não podem se deslocar; eles não podem responder ao meio ambiente pelas vias possíveis aos animais.” Jeffrey Barry Harborne (1928 – 2002) INTRODUÇÃO • Importância Farmacêutica Isolamento em 1817 por Serturner ópio (Papaver somniferum) US$ 340/g morfina (sedativo) HO NMe O HO INTRODUÇÃO • Importância Farmacêutica Uso como antimalárico: Desde 1638 Isolamento:1820 por Pelletier e Caventou Síntese: 1944 por Woodward N N HO MeO quinina INTRODUÇÃO • Importância Farmacêutica Desenvolvimento de um antimalárico com base na estrutura da quinina N MeO HO N N N NH Cl quinina (Cinchona officinalis) cloroquina (sintético) INTRODUÇÃO • Importância Farmacêutica Gingko biloba (Gingkoaceae) (Tanakan, Tebonin) Amentoflavona (antioxidante) O O OH HO OH O O OH OH HO INTRODUÇÃO Razões para estudar a biogênese dos metabólitos secundários Importância dos metabólitos secundários, particularmente na área farmacêutica Possibilidade de intervenção no organismo produtor direcionando a sua produção - A variedade de estruturas químicas (esqueletos diferenciados). - Riqueza de informações sobre o comportamento químico das moléculas e sua utilização como modelo para síntese orgânica. - Informações valiosas sobre o comportamento biológico – químico (Estudo de Ecologia Química). - Estudos da constituição química possibilita o entendimento das relações evolutivas e sistemática (quimiossistemática). - Contribuição multidisciplinar Razões para estudar a biogênese dos metabólitos secundários INTRODUÇÃO METABÓLITOS SECUNDÁRIOS biossíntese 1 ou mais órgãos transporte Metabólitos podem ser translocados armazenamento utilização degradação Hidrofílicos: vacúolos Lipofílicos: glândulas e associados a componentes celulares lipofílicos como ceras e membranas Metabolismo Secundário Vegetal • principal produto: metabólitos secundários • 3 precursores principais: acetato, mevalonato e chiquimato OH OH OH CO2H OH OH HO2CCH3CO-SCoA acetil CoA ác. mevalônico ác. chiquímico INTRODUÇÃO Metabolismo Secundário Vegetal • as três vias dão origem a metabólitos secundários: – acetato: antraquinonas, polifenóis, prostaglandinas, etc. – mevalonato: terpenos, esteroides, saponinas, glicosídeos cardiotônicos, carotenos, etc. – chiquimato: fenilpropanoides, lignoides, cumarinas e alcaloides aromáticos, taninos hidrolisáveis, etc. • processo comum em plantas • produtos específicos peculiares de cada grupo Metabólitos Secundários O O O O OMe OMe N OO H H H H NH H H CO2H C5H11 OHO OH PGD2 rotenona estricnina O O O O HH O O sesamina O H HH OO O artemisinina Biossíntese de Metabólitos Secundários: Hipóteses • lixo metabólico • atração e repelência: estratégia para sobrevivência • ação específica em enzimas de predadores • teoria REDOX • alelopatias • funções ainda desconhecidas podem surgir Biossíntese de Metabólitos Secundários: Fatos • produção de dezenas de milhares de substâncias • substâncias estruturalmente complexas • necessidade de enzimas e complexos enzimáticos • muitos têm função ecológica (atração e repelência) • muitos têm ação específica em enzimas (curare, atropina) Metabolismo secundário: visão geral GLICOSE Ácido chiquímico Acetil-CoA triptofano fenilalanina/ tirosina ácido gálico alcaloides indólicos e quinolínicos taninos hidrolisáveis protoalcaloides alcaloides isoquinolínicos e benzilisoquinolínicos ácido cinâmico fenilpropanoides lignanas e ligninas cumarinas flavonoides taninos condensados antraquinonas Ciclo do ácido cítrico ornitina lisina alcaloides pirrolidínicos, tropânicos, pirrolizidínicos, piperidínicos e quinolizidínicos Via do mevalonato isoprenoides terpenoides esteroides saponinas condensação ácidos graxos acetogeninas Via mista Enz O O O O H PO OH OH O H + OH O OH OH OH PO O OH O O OH OH O H H + OH CO2-OH OH OOH OH O CO2- OH OH OH CO2- X Via do Chiquimato: Biossíntese PEP eritrose-4P chiquimato NADPH DAHP 3-desidrochiquimato 3-desidroquimato DAHP: 3-desoxi-arabinoheptulsonato-7-fosfato DAHP sintase desidroquinase -H2O Do chiquimato à fenilalanina OH OH PO CO2- PO CO2- O CO2- OH PO CO2-OP CO2- O OH PO CO2- O OH EnzX CO2- H CO2- CO2- O OH CO2- -2OC O CO2- OH -2OC NH3+ CO2- OH H OH H CO2- NH3+ H CO2- NH3+ CO2- O R H + EnzX- B fenilalanina tirosina corismato prefenato chiquimato NAD+ PEP rearranjo intramolecular prefenato fenilalanina 1) descarboxilação; 2) aromatização 3) aminação redutiva Via do Chiquimato: Do corismato ao triptofano CO2- O OH CO2- CO2- NH2 CO2- NH OPPO O OP O O N H O OH OP OH N H OP OH OH N H CO2- NH3+ H -CO2 -H2O triptofano corismato antranilato Via do Chiquimato: Triptofano: alcaloides Indólicos N OO H H H H NH N H N H OH H H MeO2C ioimbina estricnina Via do Chiquimato: Biossíntese alcaloides: principais precursores CO2H NH2 H2N CO2H NH2H2N CO2H NH2 CO2H NH2 HO N H NH2 CO2H N CO2H NH2 CO2H L-ornitina L-lisina L-fenilalanina L-tirosina L-triptofano ácido nicotínicoácido antranílico - pirrolidínicos - pirrolizidínicos - tropânicos - piperidínicos - quinolizidínicos - indolizidínicos - geralmente dá origem a anéis aromáticos em alcalóides complexos - isoquinolínicos - benzilisoquinolínicos - indólicos - quinolínicos - β-carbolínicos - terpeno-indólicos - quinazolidínicos - quinolínicos - piridínicos HN N NH2 CO2H L-histidina - imidazólicos • De modo geral, são formados a partir de aminoácidos • A origem biossintética freqüentemente resulta da combinação de derivados de rotas metabólicas distintas Biossíntese dos alcaloides a partir de aminoácidos aromáticos: fenilalanina / tirosina METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO FenilpropanoidesO HO SCoA Hydroxycinnamoyl-CoA O HO N R H O HO O R OHO HO O CO2- HO OH OH OH OH OH CO2- HO OH CO2- HO O HO OH OH HO OH OH O O OH OH HO HO HO O O O HO OH METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Lignanas e Ligninas METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO C6C3: Acoplamento Oxidativo de Fenóis (fenilpropanos) OH OH OMe O OH OMe O OH OMe O OH OMe O OH OMe . . . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Acoplamento Oxidativo: Lignanas (polímeros de fenilpropanos) O O O O HH O O sesamina METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Cinnamomum zeylanicum (Lauraceae) CHO cinamaldeído Pimpinella anisum (Umbelliferae) OMe anetol METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Syzigium aromaticum (Myrtaceae) OH MeO eugenol Sassafras albidum (Lauraceae) O O safrol Via do ácido chiquímico: biossíntese de derivados cumáricos 1) Oxidação (ác. o-cumárico) 2) Condensação da hidroxila fenólica com glicose 3) Isomerização cis e ciclização prenilação prenilação prenilação Via do chiquimato: Biossíntese taninos hidrolisáveis O OH HO PO eritrose-4-fosfato H CO2H O P H fosfoenolpiruvato (PEP) Reação do tipo aldol OH OH HO PO H O CO2H DAHP (desoxiarabino-heptulosonil-fosfato) OH OH HO O CO2H H -HOP CO2H OH OH HO CO2H OH OH O HO2C OH OH O OH CO2H OH OH HO -H2ONADPH -2H ácido gálico ácido chiquímico ácido 3-desidrochiquímico ácido 3-desidroquínico Re aç ão d o tip o al do l NAD GLICÓLISE CICLO DAS PENTOSES + glicose taninos hidrolisáveis METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Taninos Hidrolisáveis O O O O O OH OH OH O OH HO OH O HO OH HO O O OH OHHO O OH OH OH O galitanino (β-1,2,3,4,6-pentagaloil-D-glicose) Biossíntese Mista: Flavonoides • acetil-CoA + ácido cinâmico (C6C3) OH OH OH CO2H CO2H OH OOH OH ác. chiquímico ác. cinâmico 3x acetil-CoA chalcona METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Biossíntese dos flavonoides anel B e a ponte de 3 C anel A A B A C B METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Flavonoides: Tipos Estruturais • Substituintes mais comuns: ─OH, ─OAc, ─OMe em C3’, C4’ e C5’; ─OMe ou ─OAc em C5 e C7 O OOH OH O OOH OH O OOH OH OH OH OOH OH O OOH OH O OOH OH OH flavona flavonol flavanona diidroflavonol isoflavona chalcona METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Via mista: Biossíntese taninos condensados OOH HO O OH OOH HO O OH OH OHOH HO O OH OH OH HO O OH OH O2 2-oxoglutarato NADPH NADPH narigenina (flavanona) diidrocaempferol (diidroflavonol) leucopelargolidina (flavan-3,4-diol; leucoantocianina) afzalequina (catequina) TANINOS CONDENSADOS METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Via mista: Biossíntese taninos condensados Via mista: Biossíntese de antraquinonas METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO • Via do acetato Biossíntese dos ácidos graxos Via do acetato: condensação Carboxilação mediada por biotina Biotina (cofator enzimático) (C16) SCoA O SCoA O + Ácido β-policeto R COOH O O O OHOH OH O R O O COOHR anel benzênico anel pirônico Via do acetato (condensação): Biossíntese de acetogeninas Via do Mevalonato • derivados do isopreno (2-metilbutadieno) • caminho, rota ou via do mevalonato (C6) • união de unidades C5 derivadas do mevalonato: - pirofosfato de isopentenila (IPP) + pirofosfato de dimetilalila (DMAP) -O OH O OH OPP OPP METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO C10 C15 C20 C25 C30 C40 OPP HR Hs PPO Biossíntese de Monoterpenos DMAP geranil-PP (C10) IPP OPP monoterpenos (C10) -OPP METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Biossíntese de Sesquiterpenos OPP geranil-PP (C10) OPP sesquiterpenos (C15) + IPP -OPP farnesil-PP (C15) METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Biossíntese de Diterpenos OPP OPP farnesil-PP (C15) + IPP -OPP diterpenos (C20) geranil,geranil-PP (C20) METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Biossíntese de Triterpenos e Esteroides OPP + FPP -OPP triterpenos (C30) esteroides (C27, C28, C29) farnesil-PP (C15) esqualeno (C30) METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Ácido mevalônico Pirofosfato de isopentenila Visão geral da biossíntese de terpenoides e esteroides METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO Biossíntese de Saponinas prior to the proposed branchpoint of the two pathways. Increased phytosterol levels in oat (Avena strigosa) sad1 (saponin-deficient) mutants (Qin et al., 2010) and increase of saponin aglycones and concomitant decrease of phytosterols in cell suspension cultures of bramble (Rubus fruticosus) and liquorice (Glycyrrhiza glabra) treated with cycloartenol synthase specific inhibitors (Ayabe et al., 1990; Taton et al., 1986, 1992) also support that saponins are derived from phytosterol biosynthesis. The part of the triterpenoid saponin pathways shared with syn- thesis of plant sterols is outlined in Fig. 6. All terpenoids derive from condensation of five-carbon building blocks designated IPP (3-isopentenyl pyrophosphate, C5) and DMAPP (dimethylallyl pyrophosphate, C5). In plants IPP and DMAPP either derive from condensation of acetyl-CoA in the cytosolic mevalonate pathway or from pyruvate and phosphoglyceraldehyde in the plastidial MEP (also: DXP) pathway. Terpenoid biosynthesis in plants is extensively compartmentalized and triterpenes such as steroids and saponins are mainly synthesized in the cytosol utilizing IPP from the mevalonate pathway (Chappell, 2002; Kirby and Keasling, 2009; Rohmer, 1999; Trojanowska et al., 2000). In accordance with this conception, both phytosterol and ursolic/oleanolic acid bio- synthesis have been found strongly reduced in Uncaria tomentosa (cat’s claw) cell suspension cultures in response to treatment with an inhibitor of HMG-CoA reductase, a central enzyme of the mev- alonate pathway (Flores-Sánchez et al., 2002). IPP and DMAPP un- dergo condensation to GPP (geranyl pyrophosphate, C10), and addition of a second IPP unit leads to FPP (farnesyl pyrophosphate, C15), the common precursor of the vast array of sesquiterpenes produced by plants. Linkage of two FPP units leads to formation of squalene (C30), which subsequently is epoxygenated to 2,3- oxidosqualene (C30). 2,3-Oxidosqualene is considered the last common precursor of triterpenoid saponins, of phytosterols and steroidal saponins (e.g. Kalinowska et al., 2005; Phillips et al., 2006; Vincken et al., 2007). The steps at which steroidal saponin and phytosterol biosynthesis diverge have not been elucidated, although cholesterol has been suggested as a precursor of steroidal saponins (Kalinowska et al., 2005; Vincken et al., 2007). 4.2. Cyclization of 2,3-oxidosqualene – emergence of sapogenin heterogeneity The first committed step in the biosynthesis of triterpenoid sap- onins and phytosterols is the cyclization of 2,3-oxidosqualene. During this process internal bonds are introduced into the oxidosqualene backbone, resulting in formation of predominantly polycyclic molecules containing varying numbers of 5- and 6- membered rings. The high number of possibilities for establishingdifferent internal linkages during cyclization gives rise to a vast ar- ray of diverse structures and more than 100 different triterpene skeletons (Xu et al., 2004) have been found in nature. However, from this diversity only a limited number of possible cyclization products appear to be utilized in saponin biosynthesis (Vincken et al., 2007; Fig. 7). Enzymes catalyzing these cyclizations are designated oxido- squalene cyclases (OSCs, EC 5.4.99.x). Current knowledge of the catalytic mechanisms behind OSC activity has recently been re- viewed by Abe (2007). Accordingly, oxidosqualene cyclase cataly- sis largely proceeds according to the biogenetic isoprene rule as originally formulated by Ruzicka (1953). Thus, OSCs fulfill three major prerequisites for catalyzing the cyclization process: (1) a cat- alytic acid that initiates the cyclization process by protonating 2,3- oxidosqualene, (2) a specialized catalytic cavity that by primarily spatial constraints of the active site guides the cyclizing oxidosqua- lene backbone through defined intermediate stages that eventually lead to formation of specific cyclization end products, and (3) shielding of reactive intermediates during the cyclization in order S CoA O S CoA O S CoA O O PP O PP O PP O PP O O PP + O PP + O PP + mevalonate pathway phytosterols, steroidal saponins, steroidal glycoalkaloids triterpenoid saponins IPP DMPP GPP FPP squalene squalene 2,3-oxidosqualene IPP IPP FPP acetyl-CoA Fig. 6. Early steps in biosynthesis of phytosterols and triterpenoid saponins leading to the common precursor 2,3-oxidosqualene. IPP – Isopentenyl pyrophosphate, DMPP – dimethylallyl pyrophosphate, GPP – geranyl pyrophosphate, FPP – farnesyl pyrophosphate. J.M. Augustin et al. / Phytochemistry 72 (2011) 435–457 441 Biossíntese de Saponinas O HO HO HO HO HO HO HO HO HO 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 14 13 12 11 15 16 17 18 22 21 20 19 24 HO 23 29 30 25 26 27 28 A B C D E 2,3-oxidosqualene protosteryl cation dammarenyl cation tirucallanyl cation baccharenyl cation lupanyl cation germanicyl cation oleanyl cation taraxasterenyl cation ursanyl cation phytosterols, steroidal saponins, steroidal glycoalkaloids tirucallanes dammaranes lupanes oleananes ursanes taraxasteranes chair- boat- chair chair- chair- chair Fig. 7. Oxidosqualene cyclase (OSC) catalyzed cyclization cascades of 2,3-oxidosqualene into different triterpenoid sapogenin skeletons. 442 J.M. Augustin et al. / Phytochemistry 72 (2011) 435–457 METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO • Heterosídeos Substâncias resultantes da ligação covalente de uma ou mais unidades de açúcar e outra estrutura diferente chamada de aglicona. UTP + açúcar-1-fosfato ⇒ UDP-açúcar + Pi UDP-açúcar + aglicona ⇒ Heterosídeo + UDP N-heterosídeo O-heterosídeo C-heterosídeo Fatores de Influência na produção de metabólitos secundários METABOLISMO VEGETAL SECUNDÁRIO DOS SANTOS, R.I. METABOLISMO BÁSICO E ORIGEM DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS. In: SIMÕES, C. M. O. [et al]. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5ª ed. Porto Alegre/Florianópolis: Ed. UFRGS/Ed. UFSC, 2004, pp. 404-434. Verificação da pureza da amostra. BIBLIOGRAFIA Obrigado!!!
