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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas
Estudio de la función del sistema de dos componentes
CbrA/CbrB en la síntesis de alginato y represión catabólica por
carbono en Azotobacter vinelandii
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
Doctor en Ciencias
PRESENTA:
M. en C. Elva Yadira Quiroz Rocha
TUTOR PRINCIPAL
Dra. Cinthia E. Núñez López
Instituto de Biotecnología
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR
Dra. Rosa María Gutiérrez Ríos
Instituto de Biotecnología
Dr. Christian Sohlenkamp
Centro de Ciencias Genómicas
Cuernavaca, Morelos. Agosto, 2017
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
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respectivo titular de los Derechos de Autor.
2
El presente trabajo fue realizado en el Departamento de Microbiologia Molecular del
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autómona de México, bajo la tutoría
de la Dra. Cinthia E. Núñez López.
Durante el desarrollo del presente trabajo recibí financiamiento por parte del Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), con número de becario 239995, así como
apoyo de los proyectos PAPIIT-UNAM IN208514, CONACyT-CB 240095 e INFR
253487. Así mismo, agradezco al Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado (PAEP)
por el apoyo económico brindado durante mi estancia en el Centro Nacional de
Biotecnología (CNB), en Madrid. España. Además del financiamiento para asistir a
congresos nacionales e internacionales donde se presentó este trabajo.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Cinthia Núñez, gracias por la confianza que depositó en mí desde el inicio, por su
apoyo, disponibilidad, paciencia y dedicación. Mil gracias por darme oportunidades únicas
en la vida. Me siento muy afortunada y privilegiada de haber estado bajo su tutela. Porque
además de ser una excelente jefa siento que encontré una gran amiga.
A los Drs. Guadalupe Espín y Daniel Segura, gracias por los enriquecedores comentarios
en el laboratorio y durante los seminarios de grupo.
A los Drs. Rosa María Gutierrez y Christian Sohlenkamp por sus valiosas contribuciones,
comentarios y sugerencias durante los tutorales, los cuales llevaron a una mejora del
presente proyecto.
A los miembros del Jurado Revisor; los Drs Baltazar Becerril, Guillermo Gosset, José Luis
Puente, David Romero y Miguel Castañeda, gracias por el preciado tiempo y el esfuerzo
invertido en leer y corregir el presente manuscrito.
A los Drs Fernando Rojo y Renata Moreno además de los miembros del laboratorio 216
(Luis Yuste, Emma, Dione, Sofia y Ruggero) del Departamento de Biotecnología
Microbioana del Centro Nacional de Biotecnología (CNB), en Madrid, España. Gracias por
su apoyo, gentileza y disponibilidad con la que me trataron durante la estancia, a pesar de
estar poco tiempo con ustedes me hicieron sentir parte de su grupo.
A las técnicas académicas del laboratorio Espín-Merino: Biol. Soledad Moreno, M. C.
Josefina Guzmán y M. B. Maria Tabche. Gracias por el apoyo técnico brindado durante el
desarrollo del presente proyecto, por tener siempre esa gran disponibilidad de enseñar,
ayudar y permitir que el laboratorio esté en armonía, pero sobre todo gracias por su sincera
e invaluable amistad.
A Leonel gracias por tu apoyo, tu sinceridad y tu amistad, desde que llegaste al laboratorio
has sido como mi hermano… al contrario de lo que te digo a veces… ¡te quiero mucho!
A Claudia gracias por todos esos años que compartimos juntas, tanto en el laboratorio como
en nuestra vida diaria, gracias por tu confiza, tu apoyo y tus consejos.
A mi “familia académica”, mis amigos y compañeros del laboratorio; Julieta, Leidy,
Marcela, Chantal, Leonel, Claudia, Libertad, Adán, Adriana, Luis Felipe, José Luis
Rodríquez, José Luis Gama. Incluidos los que ya no están en el laboratorio pero siguien con
nuestro grupo: Armando y Mikey. Gracias por hacer más llevaderas y agradables las
interminables horas de trabajo en el laboratorio, realmente me siento muy afortunada de
haber encontrado amistades tan sinceras y entrañables, por no solo compartir su experiencia
y conocimiento, sino también por compartir gratos momentos he inolvidables vivencias.
A la Dra. Sunana Brom, gracias por el invaluable apoyo, consejos y consideraciones que ha
tenido con Luis Alfredo y conmigo.
2
DEDICATORIAS
A Cristian, mi querido hermanito, gracias por esas maravillosas lecciones de fortaleza,
tesón y amor por la vida, gracias por enseñarme que la verdadera felicidad se encuentra en
los pequeños detalles que nos ofrece el día a día. Sabes que eres y serás mi mayor ejemplo
de vida.
A mis padres Oscar y Elva gracias porque siempre han estado incondicionalmente conmigo
en cada uno de los pasos que he dado, por sus enormes sacrificios y sus sabios consejos, no
me alcanzarían las palabras ni la vida para expresarles el inmenso amor, respeto y
admiración que siento por ustedes.
A mis hermanos Karina y Oscar, gracias por su cariño y apoyo, porque a pesar del paso de
los años y las distancias que nos separan es sumamente reconfortante saber que siempre
están ahí para darme aliento.
A Luis Alfredo, este logro también es tuyo, gracias por estar ahí siempre, por tu amor,
comprensión y apoyo, por permitirme compartir alegrías y tristezas, logros y fracasos,
gracias por hacerme sentir segura y querida.
ÍNDICE
RESUMEN 7
ABSTRACT 9
1. INTRODUCCIÓN 11
1.1 Generalidades de Azotobacter vinelandii 11
1.2 Síntesis de Alginato, Poli-ß-hidroxibutirato (PHB) y Alquilresolcinoles (ARs) en A.
vinelandii 12
1.2.1 Síntesis de Alginato 12
1.2.2 Síntesis de poli-β-hidroxibutirato (PHB) 13
1.2.3 Síntesis de Alquilresolcinoles (ARs) 14
1.3 Regulación de la expresión genes involucrados en la síntesis de polímeros 15
1.4 Represión catabólica por carbono (CCR) 17
1.4.1 Represión catabólica en Escherichia coli y Bacillus subtilis 18
1.4.2 Represión catabólica en Pseudomonas 20
1.5 El sistema de regulación global Crc-Hfq/CrcZ-CrcY 21
1.6 El sistema de dos componentes CbrA/CbrB 24
2. ANTECEDENTES 25
2.1 Crecimiento diáuxico en A. vinelandii. � 26
2.2. La mutación cbrA:: Tn5 aumenta la síntesis de alginato A. vinelandii 27
2.3 La mutante cbrA es incapaz de consumir glucosa durante el crecimiento diáuxico en un
medio suplementado con glucosa y acetato 28
2.4 Genes relacionados con el transporte y metabolismo de glucosa que poseen posibles sitios
CA 28
3. HIPÓTESIS 30
4. OBJETIVOS 31
4.1 Objetivo General 31
4.2 Objetivos particulares 31
5. MATERIAL Y MÉTODOS 32
2
5.1 Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos usados en este estudio 32
5.2 Condiciones de cultivo. 36
5.3 Preinóculos para cinéticas de crecimiento 37
5.4 Preparación de células competentes de A. vinelandii 38
5.5 Transformación de A. vinelandii 38
5.6 Preparación de células competentes de P. putida 38
5.7 Electroporación de P. putida 39
5.8 Manipulación a ácidos nucleicos 39
5.9 Cuantificación de los niveles de RpoS mediante Western blot 39
5.10 Construcción de plásmidos usados en este estudio 40
5.10.1 Construcción del plásmido pEQ424P. 40
5.11 Construcción de las mutantes de A. vinelandii 41
5.11.1 Mutante AEalgD (algD::Km). 41
5.11.2Constricción de la mutante AErpoS. 41
5.11.3 Construcción de las cepas que portan las fusiones transcripcionales con el reportero gusA. 41
5.11.4 Mutantes AE-Ygus y CbrA-Ygus. 42
5.12 Construcción de la mutante de E. coli WHIPC. 42
5.13 Síntesis de CrcZ y marcaje radiactivo de los RNAs. 43
5.14 Ensayos EMSA con RNA y las proteínas Crc y Hfq. 44
5.15 Ensayos de qRT-PCR 44
5.16 Métodos analíticos 45
5.16.1 Cuantificación de proteína 45
5.16.2 Cuantificación específica de alginato por el método del carbazol. 45
5.16.3 Cuantificación de la actividad de β-Glucuronidasa 46
5.16.4 La actividad de ß-Galactosidasa 47
5.16.5 Cuantificación de acetato y glucosa 48
5.16.6 Cuantificación de ARs 48
5.16.7 Cuantificación de PHB 49
5.17 Análisis estadísticos. 49
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50
6.1 Estudio del papel de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq/CrcZ en el proceso de CCR, en
particular sobre la asimilación y metabolismo de glucosa en A. vinelandii � 51
6.1.1 Los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq de A. vinelandii operan de la misma manera que en
especies de Pseudomonas � 51
6.1.2 La HK CbrA es necesaria para el consumo de glucosa 58
6.1.3 La sobre-expresión de Crc en trans disminuye el crecimiento en glucosa 59
6.1.4 GluP es el transportador de glucosa en A. vinelandii 62
6.1.5 La expresión de gluP se encuentra bajo el control de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq 64
6.1.6. Los mRNAs de gluP y eda-1 son blanco directo del sistema Crc-Hfq 66
3
6.1.7. Las proteínas Crc y Hfq de P. putida reconoce al mRNA de gluP y eda-1 de A. vinelandii 68
6.1.8 La proteína Crc de P. putida impide la traducción del mRNA de gluP 69
6.2 DISCUSIÓN 71
6.3 Efecto del sistema CbrA/CbrB sobre la síntesis de alginato en A. vinelandii 74
6.3.1 Efecto de CbrA sobre la expresión de los genes de la biosíntesis de alginato 74
6.3.2 El efecto del TCS CbrA/CbrB sobre la síntesis de alginato es a través de regular la expresión
de RsmA 77
6.3.3 La transcripción del gen rsmA se inicia a partir de un promotor RpoS. 79
6.3.4 El TCS CbrA/CbrB regula positivamente la expresión de RpoS 80
6.3.5 Las mutantes cbrA y cbrB son incapaces de acumular PHB 82
6.3.6 El TCS CbrA/CbrB tiene un efecto negativo en la producción de Alquilresolcinoles (ARs) 84
6.4 DISCUSIÓN 85
6.5 Modelo propuesto de la regulación del TCS CbrA/CbrB sobre la represión catabólica por
carbono y la síntesis de alginato en A. vinelandii 90
7. CONCLUSIONES 91
8. PERSPECTIVAS 92
9. REFERENCIAS 93
10. ANEXO, ARTÍCULOS 104
4
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de A. vinelandii en fase vegetativa y enquistamiento. ....................... 12
Figura 2 Rutas de la Biosíntesis de alginato y PHB. ........................................................... 15
Figura 3. Modelo de regulación de la expresión de los genes involucrados en la biosíntesis
de los polímeros. ................................................................................................................... 16
Figura 4. Modelo esquemático del transporte de glucosa (Glc) y represión catabólica en E.
coli y B. subtilis .................................................................................................................... 19
Figura 5. Modelo de represión catabólica en Pseudomonas spp.. ....................................... 24
Figura 6. Crecimiento de A. vinelandii en cultivo en lote en una mezcla de acetato y
glucosa. ................................................................................................................................. 26
Figura 7. Crecimiento y consumo de glucosa en la mutante cbrA. ..................................... 28
Figura 8. Contexto genómico, secuencia de nucleótidos y predicción de la estructura
tridimensional del sRNA CrcZ de A. vinelandii. .................................................................. 52
Figura 9. Contexto genómico, secuencia de nucleótidos y predicción de la estructura
tridimensional del sRNA CrcY de A. vinelandii. ................................................................. 54
Figura 10. Efecto de la HK CbrA en la expresión de los genes crcZ y crcY. .................... 55
Figura 11. Las proteínas Crc-Hfq forman un complejo ribonucleoprotéico con CrcZ. ...... 57
Figura 12. La HK CbrA es necesaria para la asimilación de glucosa. ................................ 59
Figura 13. Efecto de la sobreexpresión de Crc en diferentes fuentes de carbono. .............. 61
Figura 14. El gen gluP de A. vinelandii codifica un transportador de glucosa. .................. 63
Figura 15. La expresión de gluP está bajo el control de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq.
.............................................................................................................................................. 65
5
Figura 16. Las proteínas Crc y Hfq son capaces de formar un complejo ribonucleoproteíco
con el sitio CA presente en el líder del mRNA de gluP y eda-1. ......................................... 67
Figura 17. Las proteínas Hfq y Crc de P. putida son capaces de formar un complejo
ribonucleoprotéico con los sitios CA presentes en los ribonucleótidos de gluP y eda-1. ... 69
Figura 18. Efecto de la proteína Crc en la expresión de la fusión traduccional gluP´-lacZ en
P. putida. ............................................................................................................................... 70
Figura 19. Producción de alginato y cinética de crecimiento de diferentes cepas de A.
vinelandii. ............................................................................................................................. 75
Figura 20. Efecto de la HK CbrA en la expresión de los genes de la vía de la biosíntesis de
alginato. ............................................................................................................................... 76
Figura 21. Análisis de la expresión de rsmA en diferentes cepas. ....................................... 78
Figura 22. La transcripción de rsmA es a partir de un promotor dependiente de RpoS. ..... 80
Figura 23. Influencia del TCS CbrA/CbrB en la expresión de RpoS. ................................. 81
Figura 24. Efecto del TCS CbrA/CbrB en la acumulación de PHB. ................................... 83
Figura 25. Efecto del TCS CbrA/CbrB en la síntesis de Alquilresolcinoles. ...................... 85
Figura 26. Modelo propuesto de regulación del TCS CbrA/CbrB sobre la síntesis de
alginato y asimilación de glucosa en A. vinelandii. ............................................................. 90
6
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Genes de A. vinelandii involucrados en el transporte y catabolismo de glucosa que
contienen posibles sitios de unión a Crc-Hfq. ...................................................................... 29
Tabla 2. Cepas y plásmidos utilizadas en este trabajo ......................................................... 32
Tabla 3. Oligonucleótidos usados en este trabajo ............................................................... 35
7
RESUMEN
Azotobacter vinelandii es una bacteria de vida libre que pertenece a la familia
Pseudomonadaceae. Es considerada un modelo de estudio interesante debido a que puede
producir polímeros con aplicaciones biotecnológicas como el polisacárido alginato y el
poliéster intracelular PHB. Al igual que en Pseudomonas spp., A. vinelandii prefiere el uso
de ácidos orgánicos sobre los carbohidratos como la glucosa. Contrario a lo que sucede en
E. coli, el proceso de Represión Catabólica por Carbono (CCR) en especies de
Pseudomonas es controlado por el sistema de regulación post-transcripcional CbrA/CbrB-
Crc/Hfq. Las proteínas Crc-Hfq impiden la traducción de sus genes blanco, al unirse a
secuencias ricas en adeninas(llamados motivos CA, AANAANAA) cerca del sitio de unión
a ribosoma. Estas proteínas son antagonizadas por los pequeños RNAs CrcZ y CrcY, los
cuales son activados por el sistema de dos componentes CbrA/CbrB. Así pues CbrA/CbrB
encabeza la cascada de señalización para el control del la RCC, entre otros procesos
celulares. En este trabajo se caracterizó la función del sistema CbrA/CbrB-Crc/Hfq en A.
vinelandii. Nuestros resultados indican que la función del sistema CbrA/CbrB-Crc/Hfq está
conservada entre Pseudomonas y A. vinelandii, pues la cinasa histidínica CbrA fue
necesaria para la expresión de los sRNAs CrcZ/Y y para el consumo de glucosa, una fuente
de carbono no preferida en A. vinelandii. De manera interesante, comprobamos, mediante
ensayos tipo EMSA, que el principal blanco directo de regulación por las proteínas Hfq-Crc
era el mRNA del gen gluP (Avin04150), el cual codifica un transportador de glucosa tipo
simporter de la superfamilia de facilitadores mayores que no había sido reportado
anteriormente en la familia Pseudomonadaceae. A pesar de que el gen gluP no esta
presente en especies de Pseudomonas, comprobamos que las proteínas Hfq-Crc de
Pseudomonas putida fueron capaces de reconocer la región líder del mRNA de gluP y que
in vivo estas proteínas inhibieron la expresión de una fusión traduccional gluP-´lacZ,
estableciendo que las proteínas Crc-Hfq de A. vinelandii y P. putida eran funcionalmente
intercambiables. Originalmente, el TCS CbrA/CbrB fue identificado debido al efecto
negativo que ejercía sobre la síntesis del polisacárido alginato. Así pues, en una segunda
etapa de este trabajo nos enfocamos a establecer el mecanismo de regulación de dicho
efecto. Un estudio de los patrones de expresión del gen clave de esta ruta biosintética, el
8
gen algD, reveló que su traducción estaba desreprimida en la mutante cbrA. Mediante
ensayos de qRT-PCR y Western blot logramos establecer que CbrA/CbrB regula la
expresión de la proteína RsmA, cuyos homólogos en otras bacterias controlan el
metabolismo de carbono. El efecto del sistema de dos componentes CbrA/CbrB sobre el
gen rsmA fue indirecto pues el factor sigma RpoS era intermediario en este proceso. Todos
estos resultados indicaron la existencia de la cascada de regulación CbrA/CbrB-RpoS-
RsmA para el control de la expresión de algD en la síntesis de alginato. En conjunto, la
caracterización de la función del TCS CbrA/CbrB en A. vinelandii nos permitió
identificarlo como un elemento clave en el control del metabolismo de carbono al controlar
el fenómeno de CCR, por un lado, y la acumulación de RsmA para el control de las
cantidades del polisacárido alginato. El control que CbrA/CbrB ejerce sobre la CCR y la
expresión de genes (rsmA, rpoS) que regulan una gran variedad de vías, indica un papel
central en la regulación del metabolismo en A. vinelandii
9
ABSTRACT
Azotobacter vinelandii is a free-living bacterium belonging to Pseudomonadaceae family.
It has been considered a good source for the production of polymers of � biotechnological
interest such as the exopolyssacharide alginate and the polyester PHB. As in Pseudomonas
spp. A. vinelandii prefers the use of organic acids to carbohydrates such as glucose. Unlike
E. coli, Carbon Catabolite Repression (CCR) in Pseudomonas species is controlled by the
CbrA/CbrB-Crc/Hfq postranscriptional regulatory system. The Crc and Hfq proteins work
together to inhibit the translation of some mRNAs that present an A-rich sequence (named
CA motif) located close to the ribosome-binding site. However, the activity of the Crc/Hfq
proteins is antagonized by the CrcZ and CrcY small RNAs (sRNA), which are activated by
the two component system CbrA/CbrB. Therefore, CbrA/CbrB heads the CCR signaling
pathway, and other cellular processes. In the present work we characterized the function of
the CbrA/CbrB-Crc/Hfq system in A. vinelandii. Our results show that the function of the
CbrA/CbrB-Crc/Hfq system is conserved between Pseudomonas and A. vinelandii. We
found that the histidin kinase CbrA was necessary to activate the expression of CrcZ/CrcY
sRNAs and glucose consumption, a non-preferred carbon source in this bacterium.
Interestingly, EMSA assays demonstrated that the Crc-Hfq proteins, were capable of
forming a complex with the leader region of the gluP mRNA (Avin04150), which encodes
an H+-coupled glucose-galactose symporter� uncommon in the Pseudomonadaceae family.
We found that expression of gluP was under catabolite repression control through the
CbrA/CbrB and Crc/Hfq regulatory systems.� Crc and Hfq proteins, from either A.
vinelandii or P. putida could form a stable complex with the CA motif present in the leader
region of gluP mRNA. Moreover, in P. putida, the gluP CA motif was functional and
promoted translational inhibition of a gluP-´lacZ translational fusion, implying that the
Crc-Hfq proteins from A. vinelandii and P. putida are functionally interchangeable. The
two-component system CbrA/CbrB was originally identified in A. vinelandii as a negative
regulator of alginate synthesis. In a second stage of this work, we investigated the
molecular basis of this this effect. We found that the expression of the algD gene, encoding
a key enzyme in this biosynthetic pathway, was de-repressed, mainly at the translational
level. Western blot and qRT-PCR assays showed that the two-component system
10
CbrA/CbrB was necessary for full expression of the RsmA protein, its homologues in other
bacteria control carbon metabolism. The effect of CbrA/CbrB on RsmA expression was
indirect and the sigma factor RpoS was one of the intermediaries in this signalling cascade.
Taken together these data revealed the existence of the regulatory �cascade CbrA/CbrB-
RpoS-RsmA for the control of algD expression in alginate production. In conclusion, our
results clearly highlight the importance of the two-component system CbrA/CbrB in the A.
vinelandii carbon metabolism, since it is a key element in the process of CCR and in the
expression of the secondary metabolism regulatory proteins RsmA and RpoS.
Introcucción
11
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Generalidades de Azotobacter vinelandii
Azotobacter vinelandii es una gamma proteobacteria Gram negativa, de vida libre
perteneciente a la familia Pseudomonadaceae. Son células pleomórficas y poliploides,
dependiendo del medio y las condiciones de cultivo pueden alcanzar hasta 80 copias de su
cromosoma. Su tamaño es de 2 µm o más de diámetro y 4 µm de longitud, son mótiles
gracias a la presencia de flagelos perítricos. Es quimiorganotrófica, es decir, es capaz de
utilizar ácidos orgánicos, carbohidratos, sales y alcoholes como fuentes de carbono
(Kennedy et al., 2005). Es aerobia estricta, pero tiene la capacidad de fijar nitrógeno en
aerobiosis debido a que posee tres complejos diferentes de nitrogenasa. Logra proteger este
proceso tan sensible al oxígeno mediante un mecanismo conocido como “protección
respiratoria”, el cual consiste en ajustar la velocidad de consumo de oxígeno, logrando
mantener niveles bajos de éste en el citoplasma (Kennedy et al., 1986; Kennedy et al.,
2005).
El genoma de la cepa DJ de A. vinelandii ya se encuentra secuenciado, su tamaño es de 5
365 318 pares de bases (pb), y posee un contenido de GC del 65.7% (Setubal et al., 2009).
Durante fase estacionaria tardía o bajo condiciones adversas, A. vinelandii, es capaz de
sufrir un proceso de diferenciación, en el que forma quistes resistentes a la desecación, los
cuales son células metabólicamente inactivas, constituidas por una estructura de forma
ovalada, conocida como cuerpo central, que contiene numerosos gránulos de poli-ß-
hidroxibutirato (PHB). El cuerpo central está rodeado por una cápsula, la cual está
compuesta por una capa externa laminada llama exinay una capa interna más compacta
llamada intina. Ambas capas están compuestas del polisacárido extracelular alginato (Fig.
1) (Sadoff, 1975).
Introcucción
12
Figura 1. Estructura de A. vinelandii en fase vegetativa y enquistamiento. (a) célula de A. vinelandii en
fase vegetativa. (b) Quiste de A. vinelandii, Cb, cuerpo central, In, intina, Ex, exina, phb, poli-β-
hidroxibutirato (Segura et al., 2014).
Una de las características que hace de A. vinelandii un modelo interesante de estudio es su
capacidad de producir polímeros de uso industrial como el polímero extracelular alginato,
el poliéster intracelular PHB, además de unos lípidos fenólicos llamados Alquilresolcinoles
(ARs) y Alquilpironas (APs) (Galindo et al., 2007).
1.2 Síntesis de Alginato, Poli-ß-hidroxibutirato (PHB) y
Alquilresolcinoles (ARs) en A. vinelandii
1.2.1 Síntesis de Alginato
Los alginatos son una importante familia de biopolímeros la cual posee un gran interés
científico y biotecnológico. El alginato es un polisacárido lineal compuesto por residuos de
ácido β-D-Manurónico (M) y su epímero el ácido α-L-gulurónico (G), unidos por enlaces
β-1,4. El orden de estos monómeros resulta en alginatos con diferentes propiedades físicas
y químicas (Galindo et al., 2007; Hay et al., 2013). Para A. vinelandii el alginato es esencial
para la correcta biogénesis del quiste maduro; durante la fase vegetativa se ha propuesto
n-butanol or b-hydroxybutyrate (BHB), the encystment is
synchronously induced (Lin and Sadoff, 1968; Sadoff,
1975).
Studies on the encystment process of Azotobacter under
transmission electron microscopy showed the morpholo-
gical changes occurring during this process. On encyst-
ment, a process that takes 3–5 days, the usually rod-shaped
vegetative cells terminate cell division and lose their flagella
(Sadoff, 1975; León and Espı́n, 2008). These large vegeta-
tive cells then enter a compaction stage 24–36 h after
initiation of encystment, starting to round up to a near
spherical shape. When the encystment is induced by
n-butanol or BHB, large inclusions of PHB are formed in
the cytoplasm at this stage. At 36 h, the bark-like coat
named exine starts forming around the periphery of the
central body and is clearly visible in the majority of cells at
48 h. Between the exine and the central body, the intine
layer is visible like an empty space at 36 h but at 48 h
becomes granular and starts to increase in size. During the
periodbetween 72and120 h, the cysts are in thematuration
stage, where the central body is reduced in size and the
intine increases, showing multiple layers. These mature
cysts can remain dormant for years ondry soil (Vela, 1974),
but under suitable conditions these dormant cells germi-
nate. In this process, the intine becomes less prominent, the
exine ruptures and a rod-shaped cell is liberated to rein-
itiate the vegetative phase of its life cycle. Germination
takes 6–12 h.
Besides the morphological differentiation described,
during encystment an ordered sequence of biochemical
changes also occur. On initiation of encystment, glucose-6-
phosphate dehydrogenase activity decreases immediately
to very low levels. It is followedbyan increase in the specific
enzymatic activities for BHB metabolism (BHB dehy-
drogenase), gluconeogenesis (fructose 1,6 diphosphate
aldolase and fructose 1,6 diphosphatase) and the glyox-
ylate shunt (isocitrate lyase andmalate synthase) (Hitchins
and Sadoff, 1973).Deoxyribonucleic acid (DNA) synthesis
stops just before the last cell division (within 4–6 h), but the
synthesis of ribonucleic acid (RNA) continues for 12 hafter
induction of encystment (Sadoff et al., 1971). Significant
changes in the respiratory activity are observed. The oxy-
gen uptake rate decreases 16-fold after 3 h and remains low
for the rest of the process (Stockall and Edwards, 1985).
This reduction is accompanied by a change in the amount
and nature of membrane cytochromes and by a 10-fold
reduction in the reduced nicotinamide adenine dinucleo-
tide dehydrogenase activity. The nitrogen fixation activity
is completely inhibited after 3 h due to a lack of respiratory
protection and the irreversible proteolysis of the nitro-
genase (Kossler and Kleiner, 1986). However, protein
synthesis takes place during encystment due to extensive
protein turnover. Pulse-chase experiments using (U-14C)
leucine demonstrated a protein turnover of 50%during the
first 30 h of encystment, indicating that encystment-specific
proteins are synthesised at the expense of nonessential
proteins,which are degraded toprovide aminoacids for the
synthesis of new proteins (Ruppen et al., 1983). Interest-
ingly, after 2 h of encystment, protein synthesis increases
and reaches a peak at approximately 12–18 h postinduc-
tion. Then, it gradually decreases over a 4-day period
(Su et al., 1987).
Some Properties of the Cysts
Cysts ofAzotobacter are not onlymorphologically but also
physiologically different from the vegetative cell. A soil
organismmust be able to dealwith changes in temperature,
nutrient levels, moisture content, light exposure and other
forms of stress. The developmental alternation between
two stages, each of which is adequate for survival under a
different circumstance, allows the organism to survive in
such a changing environment. Azotobacter cysts are
metabolically dormant cells that are considerably more
resistant to deleterious conditions than vegetative cells.
Desiccation resistance is one of the main characteristics of
the cysts, and it is used to distinguish between vegetative
cells and cysts. Dry cultures of A. vinelandii containing
cysts can survive formore than 10 years (Vela, 1974). Later
(a) (b) (c)
f
Cb Ex
In
phb
Figure 1 Electron micrographs of an A. vinelandii vegetative cell (a); a vegetative cell negatively stained for visualisation of flagella (b); a cyst (c). Ex, exine;
In, intine; Cb, central body; phb, polyhydroxybutyrate granules; f, flagella.
eLS & 2014, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net2
Azotobacter Cysts
n-butanol or b-hydroxybutyrate (BHB), the encystment is
synchronously induced (Lin and Sadoff, 1968; Sadoff,
1975).
Studies on the encystment process of Azotobacter under
transmission electron microscopy showed the morpholo-
gical changes occurring during this process. On encyst-
ment, a process that takes 3–5 days, the usually rod-shaped
vegetative cells terminate cell division and lose their flagella
(Sadoff, 1975; León and Espı́n, 2008). These large vegeta-
tive cells then enter a compaction stage 24–36 h after
initiation of encystment, starting to round up to a near
spherical shape. When the encystment is induced by
n-butanol or BHB, large inclusions of PHB are formed in
the cytoplasm at this stage. At 36 h, the bark-like coat
named exine starts forming around the periphery of the
central body and is clearly visible in the majority of cells at
48 h. Between the exine and the central body, the intine
layer is visible like an empty space at 36 h but at 48 h
becomes granular and starts to increase in size. During the
periodbetween 72and120 h, the cysts are in thematuration
stage, where the central body is reduced in size and the
intine increases, showing multiple layers. These mature
cysts can remain dormant for years ondry soil (Vela, 1974),
but under suitable conditions these dormant cells germi-
nate. In this process, the intine becomes less prominent, the
exine ruptures and a rod-shaped cell is liberated to rein-
itiate the vegetative phase of its life cycle. Germination
takes 6–12 h.
Besides the morphological differentiation described,
during encystment an ordered sequence of biochemical
changes also occur. On initiation of encystment, glucose-6-
phosphate dehydrogenase activity decreases immediately
to very low levels. It is followedbyan increase in the specific
enzymatic activities for BHB metabolism (BHB dehy-
drogenase), gluconeogenesis (fructose 1,6 diphosphate
aldolase and fructose 1,6 diphosphatase) and the glyox-ylate shunt (isocitrate lyase andmalate synthase) (Hitchins
and Sadoff, 1973).Deoxyribonucleic acid (DNA) synthesis
stops just before the last cell division (within 4–6 h), but the
synthesis of ribonucleic acid (RNA) continues for 12 hafter
induction of encystment (Sadoff et al., 1971). Significant
changes in the respiratory activity are observed. The oxy-
gen uptake rate decreases 16-fold after 3 h and remains low
for the rest of the process (Stockall and Edwards, 1985).
This reduction is accompanied by a change in the amount
and nature of membrane cytochromes and by a 10-fold
reduction in the reduced nicotinamide adenine dinucleo-
tide dehydrogenase activity. The nitrogen fixation activity
is completely inhibited after 3 h due to a lack of respiratory
protection and the irreversible proteolysis of the nitro-
genase (Kossler and Kleiner, 1986). However, protein
synthesis takes place during encystment due to extensive
protein turnover. Pulse-chase experiments using (U-14C)
leucine demonstrated a protein turnover of 50%during the
first 30 h of encystment, indicating that encystment-specific
proteins are synthesised at the expense of nonessential
proteins,which are degraded toprovide aminoacids for the
synthesis of new proteins (Ruppen et al., 1983). Interest-
ingly, after 2 h of encystment, protein synthesis increases
and reaches a peak at approximately 12–18 h postinduc-
tion. Then, it gradually decreases over a 4-day period
(Su et al., 1987).
Some Properties of the Cysts
Cysts ofAzotobacter are not onlymorphologically but also
physiologically different from the vegetative cell. A soil
organismmust be able to dealwith changes in temperature,
nutrient levels, moisture content, light exposure and other
forms of stress. The developmental alternation between
two stages, each of which is adequate for survival under a
different circumstance, allows the organism to survive in
such a changing environment. Azotobacter cysts are
metabolically dormant cells that are considerably more
resistant to deleterious conditions than vegetative cells.
Desiccation resistance is one of the main characteristics of
the cysts, and it is used to distinguish between vegetative
cells and cysts. Dry cultures of A. vinelandii containing
cysts can survive formore than 10 years (Vela, 1974). Later
(a) (b) (c)
f
Cb Ex
In
phb
Figure 1 Electron micrographs of an A. vinelandii vegetative cell (a); a vegetative cell negatively stained for visualisation of flagella (b); a cyst (c). Ex, exine;
In, intine; Cb, central body; phb, polyhydroxybutyrate granules; f, flagella.
eLS & 2014, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net2
Azotobacter Cysts
a b
Introcucción
13
que el alginato le sirve para formar películas de adherencia a superficies o que podría actuar
como barrera contra la difusión de oxígeno o metales pesados (Lin & Sadoff, 1969).
Azotobacter, junto con Pseudomonas son los dos géneros bacterianos en los que se ha
demostrado la secreción de alginato (Hay et al., 2013). La ruta biosintética de este polímero
es similar en ambas, y está descrita a detalle (Galindo et al., 2007). En estas bacterias los
azúcares de 6 carbonos son degradados por la vía Entner-Doudoroff, cuyos productos
finales son el Piruvato y el gliceraldehído-3P. El piruvato es posteriormente catabolizado a
acetil-CoA, mientras que el gliceraldehído-3P es convertido en fructosa-6-fosfato (Conway,
1992).
En A. vinelandii la fructosa-6-fosfato en convertida mediante tres reacciones enzimáticas a
GDP-Manosa la cual es oxidada, por la enzima GDP-manosa deshidrogenasa (GMD,
codificada en el gen algD), a GDP-manurónico. Éste último es sustrato del complejo
polimerasa Alg8-Alg44 para formar ácido polimanurónico, el cual está sujeto a
modificaciones por la epimerasa (AlgG) y el complejo acetilasa (AlgI, AlgV, AlgF y
AlgX). Finalmente, la exportación del polímero se lleva a cabo por la proteína de
membrana interna AlgJ (Fig. 2) (Hay et al., 2010; Whitney et al., 2011).
1.2.2 Síntesis de poli-β-hidroxibutirato (PHB)
El poli-β-hidroxibutirato es un poliéster constituido por monómeros de β-hidroxibutirato,
perteneciente a la familia de los poli-hidroxialcanoatos (PHAs), los cuales poseen un gran
interés industrial debido a que presentan características muy similares a los plásticos
derivados del petróleo (Chen, 2009; Lenz & Marchessault, 2005). El PHB es almacenado
en forma de gránulos insolubles en el citoplasma, y se ha propuesto que es usado como
fuente de carbono de reserva durante periodos de limitación de mutrimentos (Anderson &
Dawes, 1990).
La síntesis de PHB en A. vinelandii se produce principalmente durante la fase estacionaria
del crecimiento. Inicia con la condensación de dos moléculas de acetil-CoA, por la enzima
�-cetotiolasa (phbA), formando acetoacetil-CoA, el cual es reducido por la acetoacetil-
CoA reductasa (phbB), y finamente polimerizado por la PHB sintasa (phbC), (Segura et al.,
Introcucción
14
2003a)(Fig. 2). Los genes que codifican las enzimas para la síntesis de PHB, se encuentran
organizados en el operón phbBAC, el cual se transcribe a partir de dos promotores; pB1 y
pB2. Para la activación del pB1 es necesario el regulador PhbR, el cual se ha descrito como
un activador transcripcional de la familia AraC/XylS, mientras que la transcripción del pB2
es dependiente del factor sigma RpoS (Fig. 3) (Peralta-Gil et al., 2002).
1.2.3 Síntesis de Alquilresolcinoles (ARs)
Los ARs y las Alquilpironas (APs) son lípidos fenólicos producidos por A. vinelandii, los
cuales son comunes en plantas pero su síntesis es rara en las bacterias (Bitkov et al., 1992;
Reusch & Sadoff, 1979). En A. vinelandii se ha demostrado que reemplazan los
fosfolípidos de la membrana de las células vegetativas cuando inicia el proceso de
enquistamiento, constituyendo el 95% de los lípidos totales de la membrana del quiste
(Reusch & Sadoff, 1983). Los ARs también se encuentran en la exina (Fig. 1) y poseen una
función estructural, ya que las cepas incapaces de producir ARs presentan una exina
desorganizada y se aglutinan entre ellas. A pesar de estos fenotipos, las cepas no
productoras de ARs son resistentes a la desecación, lo cual indica que estos lípidos
fenólicos no son esenciales para este proceso (Segura et al., 2009). Los principales ARs
sintetizados son el 5-heneicosilresolcinol y 5-n-tricosilresolcinol (conocidos como AR1),
las cuales son de 21 y 23 cadenas de carbono, respectivamente, además de sus derivados
galactosidados (conocidos como AR2) (Reusch & Sadoff, 1983).
Las enzimas que sintetizan estos compuestos están codificadas en el operón arsABCD. Las
proteínas ArsB y ArsC son policétido sintasas de tipo III, las cuales sintetizan ARs y APs
respectivamente, mientras que ArsA es una sintasa de ácidos grasos, responsable de la
síntesis de ácidos grasos de 22 – 26 carbonos, los cuales junto con dos o tres moléculas de
malonil-CoA, sirven como sustratos para ArsB y ArsC. Por otra parte, ArsD es una 4´-
fosfopantetenil transferasa, la cual catalizará la modificación post-traduccional de ArsA
(Funa et al., 2006; Miyanaga et al., 2008). La expresión de estos genes se encuentra bajo el
control del activador transcripcional ArpR (Romero et al., 2013).
Introcucción
15
Figura 2 Rutas de la Biosíntesis de alginato y PHB. En verde y a la izquierda de la flecha de indican las
enzimas que participan en ese paso de la ruta. En rojo y a la derecha de la flecha se indican los genes en los
que se codifican dichas enzimas (Galindo et al., 2007).
1.3 Regulación de la expresión genes involucrados en la síntesis de
polímeros
Se ha observado que diversos sistemas de regulación están involucrados en el control de la
síntesis de estos polímeros (Fig. 3). Uno de estos reguladores es el factor sigma llamado
AlgU o sigma E. La inactivación del gen algU afecta la síntesis de alginato, además de la
formación dequistes. Se ha demostrado que este factor sigma es requerido para la
expresión de los genes algD y algC (Campos et al., 1996; Moreno et al., 1998).
Microbial Cell Factories 2007, 6:7 http://www.microbialcellfactories.com/content/6/1/7
Page 3 of 16
(page number not for citation purposes)
protein, a mannuronate polymerase (MP) [10]. The
resulting polymannuronic molecule is then modified by
an acetylase complex comprising AlgI, AlgV, AlgF proteins
(AlgI, AlgJ and AlgF for P. aeruginosa), and some of the
non-acetylated mannuronate residues are epimerized to
guluronate by a mannuronate epimerase (ME or AlgG)
and then exported through the outer membrane via the
pore-forming protein AlgE (AlgJ in A. vinelandii) (Figure
1).
In the case of A. vinelandii but not in that of the Pseu-
domonas species, the exported polymer is converted to the
final alginate by a family of seven homologous secreted
mannuronan C-5 extracellular epimerases (AlgE1-7)
[11](Figure 1). These epimerases are essential for the for-
mation of mature cysts, as a mutation which inactivates
the Type I secretion system responsible for the export of
the AlgE1-7 epimerases produced cysts lacking the intine
and exine coats and were therefore unable to survive des-
iccation. This suggests that the guluronic acid residues in
alginate are important for the formation of the alginate
coat surrounding the cysts [12]. It is thought that the AlgG
AlgK, AlgX and AlgL proteins form a scaffold which guides
the polymer through the periplasm, to then be secreted
across the outer membrane [13,14]. AlgL is also an algi-
nate lyase enzyme [15]. The idea that AlgL played a role in
Pathways for alginate and poly-β-hydroxybutyrate (PHB) biosynthesis and their metabolic relations in Azotobacter vinelandiiFigure 1
Pathways for alginate and poly-β-hydroxybutyrate (PHB) biosynthesis and their metabolic relations in Azotobacter vinelandii.
Dashed arrows indicate multi-enzyme pathways; the enzyme names and their abreviations are indicated in green and the corre-
sponding genes are in red. PMI, phosphomannose isomerase; GMP, guanosine diphosphomannose pyrophosphorylase; PMM,
phosphomannomutase; GMD, GDP-mannose dehydrogenase; MP, mannuronate polymerase; ME, mannuronate epimerase
AlgG; MEs, mannuronate epimerases AlgE1 to 7.
Introcucción
16
Otro sistema de regulación que controla la producción de los polímeros es el sistema de
dos componentes (TCS) GacS/GacA (Fig. 3). En las gama proteobacterias el sistema
Gac/Rsm regula metabolismo primario y secundario (Romeo et al., 2013). Mutaciones en la
Histidín Cinasa (HK) gacS o en el Regulador de Respuesta (RR) gacA, impiden la síntesis
de alginato (Castañeda et al., 2000; Castañeda et al., 2001). Este sistema regula la
producción de alginato mediante un control post-transcripcional del gen algD a través del
sistema Rsm. Es decir, GacA activa la transcripción de varios RNAs pequeños (sRNAs) no
codificantes de la familia RsmZ-Y (CsrB-C), los cuales antagonizan la actividad del
represor traduccional RsmA (homóloga de la proteína CsrA de Escherichia coli). RsmA es
capaz de unirse al RNA mensajero (mRNA) de algD impidiendo su traducción (Manzo et
al., 2011). De igual manera El sistema Gac/Rsm controla síntesis de PHB, ya que RsmA
también es capaz de unirse al mRNA de phbR, el cual codifica el activador transcripcional
del operón biosintético de PHB (Hernández-Eligio et al., 2012) (Fig. 3).
Figura 3. Modelo de regulación de la expresión de los genes involucrados en la biosíntesis de los
polímeros. Líneas verdes: regulación positiva; líneas rojas: regulación negativa; los promotores están
representados por rectángulos del mismo color del gen al que corresponden (Segura et al., 2014).
Introcucción
17
Otra de las vías por la cual el sistema GacS/GacA regula la síntesis de alginato, PHB y ARs
es a través de controlar la expresión del factor sigma alternativo de fase estacionaria RpoS,
(Castañeda et al., 2001). RpoS es requerido para la expresión de genes de estas rutas
biosintéticas (Fig. 3). RpoS reconoce un promotor del gen algD para inicio de su
transcripción; por otro lado RpoS reconoce el promotor de arpR, el activador
transcripcional de la síntesis de AR (Romero et al., 2013). Por otro lado, se ha demostrado
que la síntesis de PHB también es regulada por RpoS, debido a que la transcripción del
operón biosintético de PHB es a través de dos promotores, una de los cuales es dependiente
de el factor sigma RpoS (Hernández-Eligio et al., 2011).
1.4 Represión catabólica por carbono (CCR)
Las bacterias de vida libre frecuentemente poseen un metabolismo versátil que les permite
usar diferentes compuestos como fuente de carbono y energía. Esto facilita su
supervivencia en diferentes hábitats y su adaptación a diversos cambios medioambientales.
Por esta razón el metabolismo de las bacterias tiene que estar sometido a un control estricto
(Rojo, 2010). La represión catabólica por carbono (CCR) es un mecanismo de regulación
que permite la asimilación selectiva de compuestos preferidos entre una mezcla de diversas
fuentes de carbono potenciales. Por lo tanto, es un proceso muy complejo que requiere, en
muchos casos, la represión de un gran número de genes. Esta coordinación la proporcionan
redes de regulación global, que a través de regladores, controlan la expresión de múltiples
rutas metabólicas al mismo tiempo (Görke & Stülke, 2008; Rojo, 2010).
Este proceso está muy extendido entre las bacterias, especialmente las de vida libre y con
metabolismo versátil. Sin embargo, sus mecanismos moleculares parecen ser muy
diferentes entre especies. En el género Pseudomonas, a diferencia de Escherichia coli y de
Bacillus subtilis, las fuentes de carbono preferidas son los ácidos orgánicos y los
aminoácidos sobre los carbohidratos como la glucosa (Rojo, 2010).
Introcucción
18
1.4.1 Represión catabólica en Escherichia coli y Bacillus subtilis
La represión catabólica ha sido estudiada principalmente en bacterias modelo como E. coli
y B. subtilis, en las cuales la fuente de carbono preferida es la glucosa; de forma que,
cuando en el medio existen otras fuentes de carbono además de la glucosa, ésta será la que
se metabolice en primer lugar (Muñoz-Elias & McKinney, 2006). Éste azúcar es capaz de
atravesar la membrana citoplasmática, a través de una variedad de sistemas de transporte,
entre ellos, el principal es el sistema de Fosfotransferencia (PTS), el cual es capaz de
acoplar la asimilación de glucosa y su fosforilación en un solo paso, dicha fosforilación
también puede llevarse a cabo por la glucocinasa (Glk) (Görke & Stülke, 2008). El sistema
PTS está compuesto de varias enzimas que transfieren el grupo fosfato desde el
fosfoenolpiruvato (PEP) a la glucosa (Fig. 4A). Cuando la glucosa está presente en alta
concentración la enzima EIIAGlc se encuentra en un estado no fosforilado ya que el grupo
fosfato es rápidamente transferido a la glucosa para obtener la glucosa-6-fosfato. En este
estado metabólico, la proporción entre el PEP y el piruvato es baja y la enzima EIIAGlc no
fosforilada es capaz de inhibir a transportadores de otras fuentes de carbono no preferidas
(como lactosa, maltosa o melibiosa) impidiendo el transporte de dichos compuestos
(Bettenbrock et al., 2007; Park et al., 2006). Por otra parte, cuando la glucosa se encuentra
en baja concentración, la proporción de PEP/piruvato hace que se incremente la forma
fosforilada de la enzima EIIAGlc, lo cual libera la represión sobre los transportadores de las
fuentes de carbono no preferidas, permitiendo de esta manera que dichos transportadores se
expresen y por lo tanto la bacteria sea capaz de asimilar dichas fuentes de carbono. Este
tipo de CCR es llamada exclusión del inductor (Bettenbrock et al., 2007; Görke & Stülke,
2008; Hogema et al., 1998).
La activación completa de las rutas parael metabolismo de las fuentes de carbono no
preferidas también requiere de una activación transcripcional de dichas rutas metabólicas,
la cual está dada por el complejo cAMP-CRP. Cuando la glucosa se ha consumido por
completo, la forma fosforilada de la enzima EIIAGlc, es capaz de interaccionar con la
adenilato ciclasa, estimulando su actividad para generar cAMP a partir de la hidrólisis de
ATP (Bettenbrock et al., 2007; Park et al., 2006). El regulador CRP al asociarse con cAMP
forma un dímero el cual es capaz de activar la transcripción de sus genes blanco (Fig. 4A)
(Görke & Stülke, 2008).
Introcucción
19
Figura 4. Modelo esquemático del transporte de glucosa (Glc) y represión catabólica en E. coli y B.
subtilis. MC: membrana celular, PEP: fosfoenolpiruvato, Pir: piruvato. a. En E. coli, el responsable último de
la represión catabólica es el estado se fosforilación de la proteína EIIAGlc, un componente de sistema PTSGlc.
Cuando no está fosforilado (porque hay glucosa disponible) EIIAGlc interacciona con los transportadores de
otros azúcares como lactosa (Lac) o maltosa (Mal), impidiendo su entrada. Cuando no hay glucosa, la forma
predominante es P-EIIAGlc, que permite el trasporte de otros azúcares induciéndose las respectivas rutas
catabólicas. Además, se estimula la síntesis de AMPc, que permite que la proteína CRP dimerice y estimule la
inducción de rutas de degradación de azúcares alternativos a la glucosa. b. En B. subtilis, HPr es la
responsable del fenómeno de represión catabólica. Cuando hay glucosa disponible, se fosforila en Ser-46, que
interacciona con la proteína CcpA. Este complejo inhibe la transcripción de aquellas rutas metabólicas para la
asimilación de azúcares alternativos que contengan la secuencia diana denominada cre (adaptado de Rojo,
2010).
Al igual que en E. coli, en B. subtilis la glucosa es la fuente de carbono preferida, y aunque
el sistema PTS está implicado en la asimilación de glucosa de manera similar que en E.
Introducción
20
estimulando la fosforilación de la proteína HPr en la serina 46 a través de la
enzima HPr quinasa/fosforilasa (HPrK). HPr es un elemento del sistema PTS
que, cuando está fosforilado en la serina 46, es capaz de unirse a la proteína
CcpA. El complejo CcpA-P-Ser-HPr se une al ADN en las denominadas
regiones cre (elementos de respuesta catabólica) reprimiendo la expresión
de muchos genes catabólicos. Además de HPr, en Bacillus existe otra
proteína similar denominada Crh que también interviene en represión
catabólica así como otras proteínas de control catabólico independientes de
CcpA (56).
Figura 1. Modelo esquemático del transporte de glucosa (Glc) y represión catabólica
en E. coli y B. subtilis (adaptado de Rojo, 2010 (129)). MC: membrana celular, PEP:
fosfoenolpiruvato, Pir: piruvato. A) En E. coli, el responsable último de la represión
catabólica es el estado se fosforilación de la proteína EIIAGlc, un componente del
a. E. coli
b. B. subtilis
Introcucción
20
coli, el mecanismo molecular por el cual se lleva a cabo la CCR en B. subtilis es diferente.
Las proteínas claves de la CCR en B. subtilis son la proteína HPr junto con el regulador
transcripcional CcpA. En pocas palabras, durante una alta actividad glicolítica (altos
niveles de glucosa), los niveles citoplasmáticos de fructosa-1,6-bifosfato aumentan. Esto
causa la fosforilación de la proteína HPr, la cual en su estado fosforilado (P-Ser46-HPr) es
capaz de asociarse con la proteína CcpA. El complejo CcpA/P-Ser46-HPr es capaz de
unirse a unas secuencias en sus genes blanco, llamadas cre (catabolite responsive
sequences), las cuales reprimen la transcripción de un gran número de vías catabólicas,
además de limitar el transporte de la fuente de carbono no preferida (Fig. 4B). Bajo
condiciones de limitación de nutrientes, la proteína HPr se encuentra en su estado no
fosforilado, lo cual permite la liberación de la represión (Fig. 4B). En concreto, B. subtilis
es capaz de regular su metabolismo al detectar los niveles de fructosa-1,6-bifosfato y el
estado energético de la célula a través del estado de fosforilación de la proteína HPr (Görke
& Stülke, 2008; Rojo, 2010).
1.4.2 Represión catabólica en Pseudomonas
Las Pseudomonas, es un género de bacterias muy extendido en diferentes y muy variables
ecosistemas, como suelo o agua, asociadas a plantas, animales o incluso tejidos humanos
(Palleroni & Moore, 2004) Una característica muy común ente las Pseudomonas es su gran
versatilidad metabólica, ya que son capaces de asimilar una gran variedad de compuestos.
Sin embargo, en Pseudomonas la glucosa no juega el mismo papel central que en E. coli y
B. subtilis. De hecho las fuentes de carbono preferidas en las Pseudomonas son los ácidos
orgánicos o los aminoácidos sobre la glucosa (Rojo, 2010). Por ejemplo, en presencia de
succinato y glucosa la expresión de las enzimas de la vía catabólica de la glucosa como la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa están
reprimidas hasta que el succinato se ha consumido por completo. La expresión de genes
para la asimilación de otros azúcares como gluconato, glicerol, fructosa y manitol también
se inhiben en la presencia de succinato o acetato (Collier et al., 1996).
En Pseudomonas la glucosa posee una influencia diferente en la CCR en comparación con
E. coli y B. subtilis, pero además su transporte y metabolismo también presentan notables
Introcucción
21
diferencias. Como ya se había mencionado anteriormente en las Enterobacterias y los
Firmicutes, la glucosa es trasportada y fosforilada a través del sistema PTS. A diferencia de
los géneros antes mencionados, en Pseudomonas spp la glucosa es transportada hacia el
periplasma a través de la porina OprB-1, posteriormente ésta puede ser transportada
directamente al citoplasma por el transportador tipo ABC GtsABC, o convertida en
gluconato o 2-cetogluconato en el espacio periplásmico, compuestos que posteriormente
son internalizados por transportadores específicos (del Castillo et al., 2007; Lessie &
Phibbs, 1984; Schleissner et al., 1997). Una vez dentro de la célula, la glucosa, gluconato o
2-cetogluconato son procesados para producir 6-fosfogluconato, el cual posteriormente es
oxidado a través de la vía Entner-Doudoroff (del Castillo et al., 2007; Lessie & Phibbs,
1984).
Además de las diferencias en la jerarquía de asimilación de diversas fuentes de carbono,
también se han descrito diferencias significativas en el mecanismo de represión catabólica
en las Pseudomonas, ya que como se había mencionado anteriormente en E. coli, esta
regulación ocurre a nivel transcripcional dependiente del complejo cAMP-CRP y del estado
de fosforilación de la enzima EIIAGlc. Mientras que en Pseudomonas spp esta regulación se
lleva a cabo principalmente a nivel traduccional gracias a la participación de la proteína
Crc (Rojo, 2010).
1.5 El sistema de regulación global Crc-Hfq/CrcZ-CrcY
La proteína de Control de la Represión Catabólica (Crc), tiene un papel clave en la CCR en
las Pseudomonas. Ésta es una proteína de 30 kDa (259 aminoácidos). Crc fue inicialmente
identificada en cepas de P aeruginosa en donde la mutación en el gen crc mostró un
incremento en el consumo de glucosa y manitol aún en presencia de succinato, junto con
una mayor actividad de las vías catabólicas de dichas fuentes de carbono (Wolff et al.,
1991). Además de que análisis proteómicos y transcriptómicos de la mutante crc crecida en
medio rico (LB), mostraron modificación en la expresión de al menos 134 genes, muchos
de ellos involucrados en el transporte y metabolismo de aminoácidos o carbohidratos, pero
también genes implicados en patogenicidad, formación de biofilm y swimming, entre otros
procesos celulares (Moreno et al., 2009a).
Introcucción
22
Cuando Pseudomonascrece en presencia de una fuente de carbono preferida, Crc favorece
su asimilación impidiendo la expresión de genes involucrados en el transporte o asimilación
de fuentes de carbono menos preferidas (Hernández-Arranz et al., 2013; Moreno et al.,
2009a; Moreno et al., 2010) (Fig. 5). La proteína Crc controla la expresión de sus genes
blanco a nivel post-transcripcional, impidiendo la traducción de mRNAs, que contienen un
sitio AAnAAnAA (donde “n” es cualquier nucleótido). Este sitio es conocido como de
Actividad Catabólica (CA), el cual está presente cerca del sitio de unión al ribosoma (RBS)
de los genes blanco (Fig. 5) (Moreno et al., 2007; Moreno & Rojo, 2008; Moreno et al.,
2009a; Sonnleitner et al., 2009; Yuste & Rojo, 2001). Aunque anteriormente se creía que
Crc era capaz de reconocer y unirse directamente al sitio CA, descubrimientos recientes han
demostrado que la proteína Crc purificada no tiene la capacidad de unirse al mRNA por sí
sola (Moreno et al., 2015; Sonnleitner & Blasi, 2014), sino que requiere de la presencia de
la chaperona de RNA Hfq, la cual es quien reconoce y se une al motivo CA de los mRNAs
blanco, siendo el papel de Crc estabilizar dicha unión a través de un mecanismo que todavía
no ha sido dilucidado (Madhushani et al., 2015; Moreno et al., 2015; Sonnleitner & Blasi,
2014).
Hfq es una proteína pequeña, homo-hexamérica, muy abundante y ampliamente distribuida
entre los diferentes géneros bacterianos. Su función está relacionada a la regulación post-
transcripcional de expresión de genes blanco. En E. coli, Hfq puede facilitar el
apareamiento de los RNAs pequeños (también llamados sRNA) con su mRNA blanco; este
apareamiento cambia la estructura del mRNA de manera que puede ocultar el RBS,
impidiendo la traducción de dicho mRNA, lo cual resulta en una regulación negativa por
parte de Hfq. Sin embargo, existe evidencia que este cambio en la estructura secundaria del
mRNA debido a la unión del sRNA y Hfq puede tener el efecto contrario, es decir, facilitar
el acceso de los ribosomas al RBS, lo cual activa la traducción de estos mRNA. También se
ha demostrado que Hfq es capaz de proteger a algunos sRNAs de la degradación por
ribonucleasas, o por el contrario puede inducir la degradación de sRNAs o mRNAs blanco
(Aiba, 2007; De Lay et al., 2013; Holmqvist & Vogel, 2013; Morita et al., 2005; Vogel &
Luisi, 2011).
La actividad de Crc/Hfq es mayor en las células durante el crecimiento exponencial en un
medio rico en nutrientes tal como LB, pero desaparece cuando las células alcanzan la fase
Introcucción
23
estacionaria de crecimiento. Sin embargo, la expresión del gen crc y los niveles de la
proteína Crc cambian poco a lo largo del crecimiento en medio LB o en un medio mínimo
que contiene succinato como fuente de carbono (Moreno et al., 2015; Ruiz-Manzano et al.,
2005; Yuste et al., 2006). Aunque la expresión de Crc es similar independientemente del
medio y la fase de crecimiento, su actividad varía fuertemente de acuerdo con estos
elementos (Fig. 5) pues esta actividad es antagonizada por uno o más RNAs pequeños
(sRNAs) no codificantes.
En Pseudomonas aeruginosa se ha identificado uno de estos sRNAs, el cual es llamado
CrcZ, mientras que en Pseudomonas putida contiene, además de CrcZ, un homólogo
llamado CrcY. En Pseudomonas syringae se ha identificado un tercer sRNA llamado CrcX,
el cual parece ser específico de esta especie (Filiatrault et al., 2013). Estos sRNAs
contienen en su secuencia varios sitios CA, lo cuales quedan expuestos en estructuras de
tipo “asa” cuando se estructuran. Se ha propuesto que estos sRNAs son capaces de
antagonizar la actividad de Crc-Hfq, secuestrándolas ya que sus secuencias CA mimetizan
las de sus genes blanco (Fig. 5). Es decir, estos sRNAs modulan la disponibilidad de Hfq y
de Crc, cuando sus efectos no se necesitan, por ejemplo cuando se ha agotado la fuente de
carbono preferida y es necesario liberar la represión que Crc-Hfq ejercen sobre los genes de
asimilación de fuentes de carbono menos preferidas (Moreno et al., 2012; Moreno et al.,
2015; Sonnleitner et al., 2009; Sonnleitner & Blasi, 2014). Los niveles de estos sRNAs
fluctúan de acuerdo a la fuente de carbono y nitrógeno presente en el medio. Esto significa
que durante condiciones de fuerte represión catabólica (por ejemplo durante la fase de
crecimiento exponencial en LB), la cantidad de estos sRNAs es baja, lo que permite Crc-
Hfq estén libres e impidan la traducción de sus genes blanco. Posteriormente cuando se
alcanza la fase estacionaria donde las fuentes de carbono preferenciales se ha consumido,
los niveles de los sRNAs aumentan, de manera que antagonizan la actividad de las
proteínas Crc-Hfq, liberando la represión catabólica, y permitiendo que las fuentes de
carbono menos preferidas sean consumidas (Moreno et al., 2009a; Moreno et al., 2009b;
Ruiz-Manzano et al., 2005; Sonnleitner et al., 2009).
En P. putida los sRNAs CrcZ y CrcY tienen una longitud de 368 nucleótidos (nt) y
contienen seis motivos CA (Fig. 5). Se ha demostrado que la transcripción de crcZ y crcY
ocurre a partir de un promotor dependiente de RpoN, y requiere de la activación del
Introcucción
24
Sistema de dos Componentes (TCS) CbrA/CbrB (Fig. 5) (Abdou et al., 2011; Moreno et
al., 2012).
Figura 5. Modelo de represión catabólica en Pseudomonas spp. EL TCS CbrA/CbrB activa la
transcripción del sRNA CrcZ, el cual antagoniza la actividad de las proteínas Crc-Hfq quienes se unen a los
mRNAs de sus genes blancos, impidiendo su traducción.(Moreno et al., 2012)
1.6 El sistema de dos componentes CbrA/CbrB
Los TCS poseen un papel clave en la adaptación de células bacterianas a factores como la
disponibilidad de nutrientes, estrés, señales ambientales, osmolaridad, entre otros (Calva &
Oropeza, 2006; Gao & Stock, 2009). El TCS CbrA/CbrB fue descrito por primera vez en P.
aeruginosa. CbrA, es una histiín cinasa típica, localizada en membrana interna que tiene
homología con a la familia de histidín cinasas NtrB, mientras que el regulador de respuesta
CbrB es un activador transcripcional que pertenece a la familia de proteínas NtrC, el cual
mediums tested (repressing or non-repressing), the simul-
taneous absence of both CrcZ and CrcY significantly
reduced growth rate under non-repressing conditions
when succinate, fumarate or glucose were provided as
the sole carbon source, and totally impaired growth if
citrate or benzoate was the sole carbon source available.
On the contrary, growth rate was not affected in LB
medium. This behaviour is consistent with a situation in
which Crc is deregulated and fully active when both CrcZ
and CrcY are absent. In LB medium, this should pose no
problems since Crc is performing its due task, helping
to co-ordinate the assimilation of the different carbon
sources available. However, the presence of abnormally
high levels of free Crc under conditions that should
otherwise be non-repressing can lead to a detrimental
repression of genes whose expression in needed for the
transport and/or assimilation of the compound being used
as the sole carbon source. For example, Crc inhibits the
expression of genes required for the transport and assimi-
lation of glucose (del Castillo and Ramos, 2007; Moreno
et al., 2009a; Browne et al., 2010) and benzoate (Moreno
and Rojo, 2008) under repressing conditions. If these
genes are repressed when glucose (or benzoate) is the
sole carbon source available because CrcZ and CrcY are
not present to antagonize Crc, then Crc becomes harmful
for growth. Similarly, binding sites for Crc are apparent
at the translation start sites of genes involved in the
transport of citrate (PP_2057) and C4-dicarboxylates
(PP_1169) (Browne et al., 2010), which could explain the
inability of the strain lacking both CrcZ and CrcY to use
citrate as the carbon source, and its difficulties to use
fumarate or succinate.CrcY appears to be present in the genome of all
sequenced P. putida and P. fluorescens strains available
at the http://www.pseudomonas.com database, but could
not be found in those of P. aeruginosa and P. mendocina.
However, CrcZ could be detected in all cases. Interest-
ingly, P. syringae has three sRNAs that show potential
binding sites for Crc and map immediately downstream of
RpoN dependent promoters (Filiatrault et al., 2010). Their
role in catabolite repression has not been investigated.
One of them, named Psr1, is located between the cbrB
and pcnB genes, a genomic context identical to that of
CrcZ in other pseudomonads. The second one, named
Fig. 9. Model showing how the co-ordinated action of the CrcZ and CrcY sRNAs can regulate the pool of free Crc protein. These sRNAs, the
levels of which vary according to growth conditions, trap Crc protein, thereby impeding its binding to target mRNAs to inhibit translation
initiation. The Crc binding site can be immediately upstream from the Shine-Dalgarno sequence, or overlapping the AUG initiation codon,
depending on the mRNA considered.
Pseudomonas putida CrcZ and CrcY small RNAs 35
© 2011 Blackwell Publishing Ltd, Molecular Microbiology, 83, 24–40
mediums tested (repressing or non-repressing), the simul-
taneous absence of both CrcZ and CrcY significantly
reduced growth rate under non-repressing conditions
when succinate, fumarate or glucose were provided as
the sole carbon source, and totally impaired growth if
citrate or benzoate was the sole carbon source available.
On the contrary, growth rate was not affected in LB
medium. This behaviour is consistent with a situation in
which Crc is deregulated and fully active when both CrcZ
and CrcY are absent. In LB medium, this should pose no
problems since Crc is performing its due task, helping
to co-ordinate the assimilation of the different carbon
sources available. However, the presence of abnormally
high levels of free Crc under conditions that should
otherwise be non-repressing can lead to a detrimental
repression of genes whose expression in needed for the
transport and/or assimilation of the compound being used
as the sole carbon source. For example, Crc inhibits the
expression of genes required for the transport and assimi-
lation of glucose (del Castillo and Ramos, 2007; Moreno
et al., 2009a; Browne et al., 2010) and benzoate (Moreno
and Rojo, 2008) under repressing conditions. If these
genes are repressed when glucose (or benzoate) is the
sole carbon source available because CrcZ and CrcY are
not present to antagonize Crc, then Crc becomes harmful
for growth. Similarly, binding sites for Crc are apparent
at the translation start sites of genes involved in the
transport of citrate (PP_2057) and C4-dicarboxylates
(PP_1169) (Browne et al., 2010), which could explain the
inability of the strain lacking both CrcZ and CrcY to use
citrate as the carbon source, and its difficulties to use
fumarate or succinate.
CrcY appears to be present in the genome of all
sequenced P. putida and P. fluorescens strains available
at the http://www.pseudomonas.com database, but could
not be found in those of P. aeruginosa and P. mendocina.
However, CrcZ could be detected in all cases. Interest-
ingly, P. syringae has three sRNAs that show potential
binding sites for Crc and map immediately downstream of
RpoN dependent promoters (Filiatrault et al., 2010). Their
role in catabolite repression has not been investigated.
One of them, named Psr1, is located between the cbrB
and pcnB genes, a genomic context identical to that of
CrcZ in other pseudomonads. The second one, named
Fig. 9. Model showing how the co-ordinated action of the CrcZ and CrcY sRNAs can regulate the pool of free Crc protein. These sRNAs, the
levels of which vary according to growth conditions, trap Crc protein, thereby impeding its binding to target mRNAs to inhibit translation
initiation. The Crc binding site can be immediately upstream from the Shine-Dalgarno sequence, or overlapping the AUG initiation codon,
depending on the mRNA considered.
Pseudomonas putida CrcZ and CrcY small RNAs 35
© 2011 Blackwell Publishing Ltd, Molecular Microbiology, 83, 24–40
Crc
Crc
Hfq
Crc
Crc
Crc
Hfq
Hfq
Hfq
Hfq
Hfq
Pool of free Crc and
Hfq proteins
Hfq
Crc
Hfq
Crc
Crc
Introcucción
25
reconoce promotores del tipo RpoN. Mutaciones en los genes cbrA o cbrB resultan en la
incapacidad de la bacteria de usar como única fuente de carbono una variedad de
compuestos como manitol, glucosa, piruvato, citrato y algunos aminoácidos (por ejemplo
arginina, histidina y prolina). Además, estas mutaciones resultaron en una mayor resistencia
hacia varios antibióticos (Polimixina B, Ciprofloxacino y Tobramicina) (Li & Lu, 2007;
Nishijyo et al., 2001; Yeung et al., 2011). Adicionalmente, se ha propuesto que en las
especies de Pseudomonas el sistema CbrA/B actúa coordinadamente con NtrB/C para
mantener el balance carbono/nitrógeno, además de tener un importante papel en la
tolerancia al estrés, formación de biopelícula y citotoxicidad (Abdou et al., 2011; Amador
et al., 2010; Yeung et al., 2014; Zhang et al., 2015).
Los genes cbrA-cbrB están localizados río arriba del gen crcZ, y como se había
mencionado anteriormente el TCS CbrA/B es necesario para activar la transcripción de los
sRNAs CrcZ y CrcY. En presencia de fuentes de carbono menos preferidas CbrA/B induce
la transcripción de estos RNAs no codificantes, los cuales antagonizan la actividad de las
proteínas Crc-Hfq, liberando represión sobre los mRNAs blanco, los cuales no solo están
involucrados con el catabolismo de las fuentes de carbono menos preferidas, sino también
en otros procesos como la virulencia, susceptibilidad a antibióticos y desarrollo del biofilm
(Abdou et al., 2011; Garcia-Mauriño et al., 2013; Linares et al., 2010; Moreno et al., 2012;
Sonnleitner et al., 2009; Yang et al., 2015)
Tanto en P. aeruginosa como en P putida CbrB reconoce y se une a una secuencia
palindrómica (TGTTAC-N14-GTAACA), localizada entre las posiciones -151 y -108 del
inicio de la transcripción de crcZ, o crcY respectivamente, activando su expresión junto con
el factor σ54 (Abdou et al., 2011; Garcia-Mauriño et al., 2013; Moreno et al., 2012). En P.
aeruginosa las cepas mutantes cbrB y crcZ presentan fenotipos muy similares pero no
idénticos, lo cual sugiere la presencia de otros blancos de CbrB que aun no han sido
caracterizados (Sonnleitner et al., 2012).
Antecedentes
26
2. ANTECEDENTES
2.1 Crecimiento diáuxico en A. vinelandii. �
A. vinelandii es capaz de usar carbohidratos, alcoholes y ácidos orgánicos como fuente de
carbono (Kennedy et al., 1986). Esta bacteria presenta un crecimiento diáuxico cuando es
cultivada en un medio con acetato y glucosa (Barnes, 1974; George et al., 1985; Tauchert et
al., 1990). En esta condición el acetato es usado como fuente de carbono primaria, cuando
éste se agota inicia el consumo de glucosa, indicando que la presencia de acetato en el
medio reprime el sistema de transporte de glucosa. Aunado a esto, la presencia de
intermediarios del ciclo de ácidos tricarboxílicos como citrato y 2-oxo-glutarato también
impiden el consumo de glucosa (Fig. 6), (Tauchert et al., 1990), lo cual sugiere la
existencia de un mecanismo de CCR en A. vinelandii, similar al que se ha descrito en
especies de Pseudomonas.
Figura 6. Crecimiento de A. vinelandii en cultivo en lote en una mezcla de acetato y glucosa. Se muestran
las concentraciones de proteína celular (X), acetato (triángulos negros) y glucosa (triángulos blancos)
(Tauchert et al., 1990).
26
2 ANTECEDENTES
2.1 CRECIMIENTO DIÁUXICO EN A. vinelandii.
Se ha reportado que A. vinelandii exhibe crecimiento diáuxico cuando se
cultiva con suficientes concentraciones de más de una fuente de carbono
como glucosa y acetato. El acetato es usado como la fuente de carbono
primaria (George et al., 1985;Tauchert et al., 1990) y esto correlaciona con
altos niveles de la enzima acetato cinasa. Figura 6)
Figura 6. Crecimiento de A. vinelandii en cultivo en lote en una mezcla de acetato y
glucosa. Se muestran las concentraciones de proteína celular (X), acetato
(triángulos negros) y glucosa (triángulos blancos) (Tauchert et al., 1990).
Posteriormente, una vez consumido el acetato hay un aumento de dos enzimas
que intervienen en la glicólisis: la glucosa 6-P deshidrogenasa (Zwf) y la
gliceraldehído 3-P deshidrogenasa, enzimas pertenecientes a la vía ED
(Conway, 1992).
Aunque los mecanismos moleculares de esta regulación se desconocen, se
sabe que metabolitos derivados del acetato como acetil-CoA y acetil-fosfato
inhiben la actividad de la glucosa 6-P deshidrogenasa (Tauchert et al., 1990)
Antecedentes
27
2.2. La mutación cbrA:: Tn5 aumenta la síntesis de alginato en A.
vinelandii
Con el fin de entender las redes de regulación de la producción de alginato en A. vinelandii,
en nuestro grupo de investigación se generó un banco de mutantes por mutagénesis al azar
con un miniTn5. En este banco se identificaron las candidatas que presentaron una
morfología colonial hipermucoide, indicativo de un alto nivel del exopolisacárido alginato
(Guzmán, 2001). Entre ellas, se identificó una llamada GG15, en la cual el mTn5
interrumpió el gen ortólogo a cbrA de Pseudomonas spp (Serrano-Román, 2010). Río abajo
de cbrA se localiza tanto el gen cbrB como el gen crcZ, por lo que el arreglo génico del
locus cbrA-cbrB-crcZ se conserva entre Pseudomonas spp y A. vinelandii.
En la caracterización fenotípica inicial de la mutante GG15, ésta mostró un incremento de 6
veces en la producción de alginato con respecto a la cepa silvestre (AEIV) (620 vs 80 µg
alginato/mg proteína, respectivamente) en cajas de medio mínimo Burk suplementado con
sacarosa. Además la complementación genética de la mutante GG15 con una copia silvestre
del gen cbrA restableció la producción de alginato a niveles silvestres (60 µg alginato/mg
proteína) (Serrano-Román, 2010). Estos resultados indicaron claramente que la histidín
cinasa CbrA ejerce un control negativo sobre la síntesis de alginato en A. vinelandii.
Por otra parte al generar la mutante cbrB, esta también mostró un fenotipo hipermucoide
con respecto a la cepa silvestre (1300 vs 120 µg de alginato/mg de proteína de la cepa
silvestre). Sin embargo, su crecimiento tanto en medio sólido como en medio líquido se
vio afectado, sugiriendo un papel importante de este regulador en el crecimiento vegetativo
(Bonilla-Badía, 2010). Colectivamente estos resultados indicaron que el sistema CbrA/B
regula negativamente la síntesis de alginato y que además es necesario para un óptimo
crecimiento vegetativo de A. vinelandii.
Antecedentes
28
2.3 La mutante cbrA es incapaz de consumir glucosa durante el
crecimiento diáuxico en un medio suplementado con glucosa y acetato
La caracterización de la mutante cbrA de A. vinelandii demostró que la histidín cinasa
CbrA era necesaria para el consumo de glucosa durante el crecimiento diáuxico acetato-
glucosa, pues la mutante cbrA fue incapaz de crecer a expensas de la glucosa una vez
consumido el acetato del medio (Fig. 7A y 7B) (Hernández-Ortíz, 2014). Este resultado
concuerda con la función del TCS CbrA/CbrB como un regulador maestro del proceso de
CCR, en donde CbrA se necesita para contrarrestar el efecto de las proteínas Crc-Hfq
durante la inhibición de la asimilación de fuentes de carbono preferidas.
2.4 Genes relacionados con el transporte y metabolismo de glucosa que
poseen posibles sitios CA
En este contexto, resulta interesante que un análisis in silico de los genes relacionados con
el transporte y metabolismo de glucosa en A. vinelandii identificó que varios de ellos
presentan posibles sitios de reconocimiento de las proteínas Hfq-Crc (motivos CA) (Tabla
1). En conjunto todos estos resultados sugirieron que CbrA regula la asimilación de glucosa
a través del sistema Crc-Hfq/CrcZ-Y.
Figura 7. Crecimiento y consumo de glucosa en la mutante cbrA. (a). La cepa silvestre AEIV es capaz de
crecer a expensas del consumo de acetato y posteriormente el de glucosa (línea roja), mientras que la mutante
cbrA, estaciona su crecimiento una vez que presumiblemente se ha agotado el acetato del medio (línea azul).
(b). La cepa AEIV consume por completo la glucosa del medio (línea roja), mientas que la mutante cbrA no
es capas de consumirla (línea azul) (Hernández-Ortíz, 2014).
!
Crecimiento Consumo de glucosa b) a)
Antecedentes
29
Tabla 1. Genes de A. vinelandii involucrados en el transporte y catabolismo de glucosa
que contienen posibles sitios de unión a Crc-Hfq.
Secuencia Posición
(Rel. Al ATG)
Gen Clave Descripción
ACAACAAGA -7 a -17 gluP Avin_04150 Transportador de glucosa/galactosa
AAAGAAAAA -5 a -13 zwf-3 Avin_16620 Glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa
AAAAAGAACAA -6 a -16 zwf-2 Avin_17630 Glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa
AACAACAAA -18 a -26 eda-1 Avin_27250
Aldolasa-
cetohidroxiglutarato/
Aldolasa-ceto-desoxi-
fosfogluconato
AAAAACAACAA -16 a -26 kguT Avin_26900 Transportador de 2-cetogluonato
AAGAACA +3 a +9 KguD Avin_26910 2-cetogluconato 6-fosfto reductasa
AACAACAA +1 a -8 eno Avin_38790 Fosfopiruvato hidratasa (Enolasa)
Debido a los múltiples reportes de que el TCS CbrA/CbrB encabeza la cascada para el
control de la CCR en diversas especies de Pseudomonas, en este trabajo nos propusimos
investigar el papel de este sistema en la CCR en A. vinelandii, además de establecer el
mecanismo por el cual controla la síntesis de alginato, ya que hasta el momento no existen
reportes previos de que éste TCS regule la producción de este polisacárido.
Hipótesis
30
3. HIPÓTESIS
En A. vinelandii El TCS CbrA/CbrB controla negativamente la síntesis de alginato al
afectar la expresión de reguladores clave en esta ruta biosintética (como el sistema Gac-
Rsm). Por otro lado, encabeza una cascada de regulación para el control del proceso de
CCR para la asimilación de fuentes de carbono secundarias como glucosa.
Objetivos
31
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Establecer el mecanismo molecular por el cual el sistema de dos componentes CbrA/CbrB
controla negativamente la síntesis de alginato y la represión catabólica por carbono en A.
vinelandii.
4.2 Objetivos particulares
. Determinar el papel del TCS CbrA/CbrB en el proceso de CCR en A. vinelandii. �
.
. Determinar el efecto de TCS CbrA/CbrB sobre la expresión de los genes alg para la
biosíntesis de alginato. En particular algD, el gen clave de la ruta biosintética
. �
. Establecer si la HK CbrA posee un efecto sobre la actividad de los reguladores
ya �conocidos (Sistema GacS/GacA y la proteína RsmA) que controlan la síntesis de
alginato. �
Material y Métodos
32
5. MATERIAL Y MÉTODOS
5.1 Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos usados en este
estudio
Tabla 2. Cepas y plásmidos utilizadas en este trabajo
Nombre Genotipo/Características relevantes Referencia
Cepas
A. vinelandii
AEIV Cepa silvestre (Larsen & Haug, 1971)
GG15 Derivada de la AEIV obtenida por mutagénesis al
azar con un miniTn5, identificada por su fenotipo
hipermucoide. cbrA::miniTn5, Spr
(Quiroz-Rocha, 2012)
EQR02 Derivada de la AEIV, porta una inserción del casete
de Spr en el gen cbrA en dirección opuesta al sentido
de la transcripción
(Quiroz-Rocha, 2012)
JS05 Derivada de la GG15, complementada con una copia
silvestre de cbrA integrada en el cromosoma. Gmr
(Serrano-Román, 2010)
CFB03 Mutante cbrB::Sp derivada de la cepa AEIV (Bonilla-Badía, 2010)
AEalgD Derivada de la cepa AEIV, porta una inserción del
casete de Kmr en el región estructural del gen algD
(Manzo et al., 2011)AED-gusA Derivada de la AEIV porta en el cromosoma una
fusión transcripcional algD-gusA. Gmr
García-Aguilar, 2016.
Tesis de Licenciatura
cbrAD-gusA Derivada de la cbrA::Sp porta en el cromosoma una
fusión transcripcional algD-gusA. Gmr Spr
Este trabajo
AED-´gusA Derivada de la AEIV porta en el cromosoma una
fusión traduccional algD-gusA. Gmr
García-Aguilar, 2016.
Tesis de Licenciatura
cbrAD-´gusA Derivada de la cbrA::Sp porta en el cromosoma una
fusión traduccional algD-gusA. Gmr Spr
Este trabajo
Material y Métodos
33
EQR101Z2 Derivada de la AEIV porta en el cromosoma la
fusión transcripcional prsmZ2-gusA. Tcr
Este trabajo
EQR103Z2 Derivada de la cbrA::Sp porta en el cromosoma la
fusión transcripcional prsmZ2-gusA. Tcr Spr
Este trabajo
AErpoS Derivada de la cepa AEIV porta la mutación
rpoS::Sp. Spr
(Cocotl-Yañez et al.,
2014)
AEgacA Derivada de la cepa AEIV porta la mutación
gacA::Gm. Gmr
(Manzo et al., 2011)
AE-Zgus Derivada de la cepa AEIV porta la fusión
transcripcional crcZ-gusA. Tcr
(Quiroz-Rocha, 2012)
CbrA-Zgus Derivada de la EQR02 porta la fusión
transcripcional crcZ-gusA.Spr, Tcr
(Quiroz-Rocha, 2012)
AE-Ygus Derivada de la cepa AEIV porta la fusión
transcripcional crcY-gusA. Tcr
Este trabajo
CbrA-Ygus Derivada de la EQR02 porta la fusión
transcripcional crcY-gusA.Spr, Tcr
Este trabajo
AH1 Derivada de la GG15 porta una inserción del casete
de Kmr interrumpiendo el gen algD
(Hernández-Ortíz, 2014)
AHI30 Derivada de la AEIV porta una inserción del casete
de Spr en el gen gluP
(Hernández-Ortíz, 2014)
P. putida
KT2440 Cepa silvestre (Franklin et al., 1981)
KTCRC KT2440 mutante en crc; porta una inserción del
casete de resistencia a tetraciclina interrumpiendo el
gen crc.
(Hernández-Arranz et al.,
2013)
KTgluP-PT Derivada de la cepa KT2440; porta el vector
pEQ424P
Este trabajo
CRCgluP-PT Derivada de la cepa KTCRC; porta el vector
pEQ424P
Este trabajo
E. coli
DH5a supE44 DlacU169 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-
1 relA1
(Hanahan, 1983)
WHIP ∆ptsHIcrr, galP::FRT (Fuentes et al., 2013)
Material y Métodos
34
WHIPC ∆ptsHIcrr,∆mglABC::FRT-Cm-FRT, galP::FRT Este trabajo
EC6779 Cepa mutante en hfq, derivada de la cepa
BL21(DE3), Cmr
(Madhushani et al.,
2015)
Plásmidos
pJET1.2 Vector de Clonación; Apr Thermo Fisher
Scientific
pCR2.1-TOPO Vector de Clonación; Apr Kmr Invitrogen
pMOS Blue Vector de Clonación; Apr GE Healthcare
pBSL141 Fuente del casete de Gmr (Alexeyev et al., 1995)
pHP45Ω -Sp Fuente del casete de Ω Sp (Fellay et al., 1987)
pUMATcgusAT Vector con el gen gusA para fusiones
transcripcionales; Tcr
(Muriel-Millán et al.,
2015)
pUJ9 Vector que porta lacZ sin promotor, usado para
generar fusiones traduccionales, Apr
(de Lorenzo et al., 1990)
pTZ19r Vector de expresión bajo el promotorT7, Apr Thermo Fisher
Scientific
pSEVA424 Plásmido con el promotor Ptrc inducible con IPTG;
Smr
(Silva-Rocha et al.,
2013)
pET22b Vector de expresión bajo el promotor T7, posee una
etiqueta de histidinas para el C-terminal; Apr
NOVAGEN
pTYB1 Vector de expresión T7 para fusiones en fase con
una etiqueta de domino de unión a quitina, Apr
New England Biolabs
pKD3 FRT-Cm-FRT, blar (Datsenko & Wanner,
2000)
pJGEY2 Porta la mutación cbrA::Sp polar (Quiroz-Rocha, 2012)
pSRKKm Vector replicativo vector en A. vinelandii contiene
un promotor inducible con IPTG
(Khan et al., 2008)
pGJ112 Derivado del pUMATcgusAT, porta un fragmento
de 0.246 Kb de la región reguladora de of crcY
Este trabajo
pSRK-crc Derivado del pSRKKm, porta una copia del gen
crc, bajo el control del promotor inducible con
IPTG
(Quiroz-Rocha, 2012)
pSRK-gluP Derivado del pSRKKm, porta una copia del gen
gluP, bajo el control del promotor inducible con
IPTG
(Hernández-Ortíz, 2014)
Material y Métodos
35
pUJEQP Derivado del pUJ9, porta el promotor del gen gluP
de A. vinelandii
Este trabajo
pEQ424P Derivado del pSEVA424, porta la fusión
traduccional gluP-LacZ, bajo el control del promotor
inducible con IPTG
Este trabajo
pET22::Hfq Derivado del pET22b, porta una copia del gen hfq de
A. vinelandii
Este trabajo
pEQEcrc
(pTYB1::crc)
Derivado del pTYB1, porta una copia del gen crc de
A. vinelandii
Este trabajo
pEQZIT(pTZ19::cr
cZ)
Derivado del pTZ19r, porta una copia del gen crcZ
de A. vinelandii
Este trabajo
palgD-gusA T Derivado pGem, porta la fusión transcripcional
palgD-gusA
García-Aguilar, 2016.
Tesis de Licenciatura
palgD-gusA PT Derivado pGem, porta la fusión traduccional palgD-
gusA
García-Aguilar, 2016.
Tesis de Licenciatura
pUMAZ2 Derivado del pUMA-T, porta la fusión
transcripcional prsmZ2-gusA
Este trabajo
Tabla 3. Oligonucleótidos usados en este trabajo
Nombre del oligonucleótido Secuencia (5′–3′)
gluP-F CAT GTG GAT CGA CTC AGG AG
gluP-R CCA GGC ATT CGG TAT AGA AG
crcY-Pst-R CTGCAGTTGTTGTTCTTGAGATACCG
crcY-Xb-F TCTAGACGGTAACAAACGGACG
TTAC
mglABCDtF AGC ATT TAT CTC AAG CAC TAC CCT GCA TAA
GAA AAA CCG GAG ATA CCA TGG TGT AGG
CTG GAG CTG CTT C
mglABCDtR TTT ATG ACC GAA TGC GGA CCA CAT TCA CAT
CAT TTC TTA CGC GCG TAT TTA TGG GAA TTA
GCC ATG GTC C
mglABF GCT TCG GCG TTC AGT AAC AC
mglABR TAT GAC CGA ATG CGG ACC AC
exphfqFw ATC CAT ATG TCA AAA GGG CAT TCG
exphfqRv ATC CTC GAG GGC GTT GCC GGG TTC GGG
crc-Nde Fw TTT TGG GGG CCA CAT ATG CGG
crc-Xho Rv ATC CTC GAG CAG GCT CAG CAG CCA GTC G
crcZHd-Fw GGA AAG CTT CGT ACA ACA ACA ATA ACA
crcZEco-ROK ACCGAATTCGAACGCAGAAAGGGAGCC
gluP F EcoR1 TTT TTG AAT TCT GAA ACG ATT CAT CAA TA
gluP R Bam TTTTTGGATCCTCTACCGTCGTCATCGTG
LgluP-FwEcoRI TTATTGAATTCGGCCTCTCCTTGAAGCAA
LacZ-RevHindIII TTATTAAGCTTTTATTTTTGACACCAGACCA
Material y Métodos
36
16S Fw ACCGCATCCAAAACTACTGG
16S Rv GCCACTGGTGTTCCTTCCTA
gluP qPCR Fw GCGATTGAGCCTGTACGT TT
gluP qPCR Rv CTGAGGCTGAACAGGTCCTT
RT-2 upRsmA GTCGGAGAGACCCTCATGG
RT-2 downRsmA GACCTCTTTTGGTGCATTGA
upRT-rpoS AGGATGTCCTGGACGATGAG
dwRT-rpoS TCCAGCGCCCTAGTGTAGTC
RsmAPrim GACTGTCACATCATCACC
UprsmAHind CAAAGCTTGTGGGTGATGAT
DwrsmAXho CACTCGAGGTGGCTTGGCT
algD-RT3-F TTCGGACTGGGCTATGTAGG
algD-RT3-R GCCCTGATTGATCATGTCG
alg8-RT-F CCATGGGAATCATCCATTTC
alg8-RT-R GAAACACATGGGAAGGATCG
algC-RT-F GAGCTGGTCGAGCAGTTGAT
algC-RT-R ATGTTGGCCGCGTAGTAGAG
5.2 Condiciones de cultivo.
Para el crecimiento vegetativo, las cepas de A. vinelandii fueron cultivadas en medio
mínimo Burk (BS), compuesto por: 20 g/L de sacarosa, Buffer Fosfatos (0.8 g/l K2HPO4 y
0.2 g/l de KH2PO4, pH=7), 0.073 g/l de CaCl2·2H2O, 0.183 g/l de Na2SO4, 0.160 g/l de
MgCl2·6H2O, 0.0002 g/l de NaMoO4·2H2O y 0.005 de FeSO4·7H2O. Los medios Burk
glucosa (BG), Burk acetato (BA) y Burk succinato (BScc), contienen como fuente de
carbono: glucosa 54 g/l, acetato de sodio 24 g/l y ácido succínico 35.4 g/l (pH= 7,
neutralizado con NaOH) , respectivamente. El medio Burk acetato-glucosa (BGA) contiene
24 g/l de acetato de sodio y 54 g/l de glucosa, además de todas las sales del medio Burk.
Para la preparación del medio sólido se agregó agar al 1.5%, el cual fue esterilizado junto
con el agua. Todas las soluciones se esterilizaron a 120 ºC durante 20 minutos, a excepción
del FeSO4·7H2O y la glucosa, los cuales fueron esterilizados por filtración usando una
membrana de 0.45 µm.
El medio de competencia de A. vinelandii (CM), contiene todas las sales mencionadas
anteriormente, con excepción de NaMoO4·2H2O y FeSO4·7H2O.
Material y Métodos
37
Para la condición de enquistamiento (producción de alquilresolcinoles), inicialmente los
cultivos de A. vinelandii fueron crecidos en medio BS durante 48 h. Las células fueron
recuperadas por centrifugación y lavadas tres veces con 10 mM de MgSO4 estéril, para
posteriormente ser inoculadas en medio Burk adicionado con 0.2% de butanol como fuente
de carbono (BBOH).
Las cepas de E. coli DH5α (Hanahan, 1983)y la cepa EC6779 (Madhushani et al., 2015),
fueron crecidas en medio Luria-Bertani (LB) a 37ºC. La cepa WHIPC fue crecida en medio
Mineral M9 suplementado con 2.5 g/l de glucosa. La cepas de P. putida KT2440 (Franklin
et al., 1981) y su derivada KTCRC (crc::tet), fueron crecidas en LB como se ha reportado
previamente (Hernández-Arranz et al., 2013).
Las concentraciones de antibiótico usadas para cepas de A. vinelandii fue: Km 3 µg/ml,
Gm 1 µg/ml, Sp 100 µg/ml, Nal 30 µg/ml y Tc 30 µg/ml. Para las cepas Pseudomonas
putida, las concentraciones de antibiótico fueron: Sm 50 µg/ml, Tc 10 µg/ml y
cloranfenicol 30 µg/ml. Para las cepas de E. coli: Km 30 µg/ml, Gm 10 µg/ml, Sp 25
µg/ml, Sm 30 µg/ml y Tc 10 µg/ml
5.3 Preinóculos para cinéticas de crecimiento
Los preinóculos se prepararon transfiriendo una asada de colonia proveniente de una caja
fresca a 50 ml de BS líquido en un matraz de 250 ml. Éste se incubó a 30 ºC durante 18
horas con agitación de 200 rpm. Posteriormente se lavaron tres veces con Buffer Burk
(medio Burk sin fuente de carbono), y se resuspendieron en 30 ml del mismo buffer. Se
tomó la D.O. (A600) de estas células lavadas, con el fin de estandarizar la D.O. de los
cultivos iniciales a 0.02
Para otros experimentos, como la cuantificación de alginato, PHB y alquilresolcinoles, los
preinóculos se prepararon en matraces de 125 ml con 25 ml de BS, también fueron crecidos
durante 18 h, los cuales posteriormente se utilizaron para inocular matraces de 250 ml con
50 ml de BS.
Material y Métodos
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5.4 Preparación de células competentes de A. vinelandii
Se cultivó la cepa AEIV a 30 ºC en cajas de CM durante 24 h, posteriormente se realizó un
segundo pase en medio CM y se incubó a 30 ºC, pero en esta ocasión el tiempo de
incubación fue de 15 h, después se recogió todo el tapete celular con un asa estéril y se
lavaron las células en varias ocasiones con MgSO4 10 mM, con la finalidad de remover el
alginato. Finalmente esta pastilla celular libre de alginato se resuspendió en 350 µl de CM
16 mM de MgSO4. Éstas células competentes siempre se utilizaron después de su
preparación, ya que si se almacenan pierden su competencia.
5.5 Transformación de A. vinelandii
Se transformaron las células competentes de A. vinelandii (100 µl) con ~5 µg de plásmido
linearizado, mezclando ambos en un tubo Eppendorf de 1.5 ml estéril. Esta mezcla de
células-ADN se colocó en medio CM sólido y se extendió con la punta de la micropipeta
hasta cubrir una superficie de aproximadamente 2 cm2. Se incubó esta caja durante 24 h a
30ºC para posteriormente recolectar el tapete celular, se lavó nuevamente con MgSO4 y por
último se plateó un volumen de entre 50 y 100 µl en medio de selección. Esta caja se
incubó en las condiciones anteriormente descritas.
5.6 Preparación de células competentes de P. putida
El proceso se realizó con todas las soluciones frías y estériles. Se inició con un preinóculo
de aproximadamente 18 h de la cepa de P. putida crecida en medio LB líquido.
Posteriormente se inocularon 50 ml de LB y se dejó crecer el cultivo a 30 ºC con agitación
hasta que éste alcanzó una D.O. de 0.5 (A600). Se obtuvo el paquete celular mediante
centrifugación durante 10 min a 6 000 rpm y 4 ºC. Éste se resuspendió en 30 ml de glicerol
al 10% (estéril y frio). Se centrifugó y resuspendió nuevamente en 30 ml de glicerol al
10%, se centrifugó nuevamente y se resuspendió en 3.5 ml de glicerol al 10%. Se realizaron
alícuotas de 100 µl en tubos Eppendorf, las cuales se utilizaron para electroporar. Las
Material y Métodos
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células competentes de P. putida no conservan su competencia durante mucho tiempo, por
lo cual deben prepararse el día que se van a utilizar.
5.7 Electroporación de P. putida
En el tubo Eppendorf que contenía la alícuota de 100 µl de células de P. putida se
mezclaron 1-2 µl del plásmido a transformar (no más de 100 ng de DNA). Se transfirió la
mezcla a celdas de electroporación previamente enfriadas evitando la formación de
burbujas, y de le dio un pulso de 1.7 Kv en un E. coli PulserTM , inmediatamente se
adicionó 1 ml de medio LB (sin antibiótico) a la celda, se transfirió a un tubo de vidrio y se
incubó en agitación a 30 ºC para permitir la recuperación de las células. Al cabo de este
tiempo se platearon volúmenes de entre 50 y 150 µl en cajas de medio LB sólido con el
antibiótico de selección. Se dejaron crecer durante 24 h a 30 ºC.
5.8 Manipulación de ácidos nucleicos
La secuencia genómica de A. vinelandii está disponible (Setubal et al., 2009), esta
secuencia fue usada para el diseño de los oligonucleótidos usados para todas las
amplificaciones por PCR. Los oligonucleótidos usados están enlistados en la Tabla 3. Para
las amplificaciones usando DNA cromosomal de la cepa AEIV se utilizó la enzima
Phusion � DNA polymerase (Thermo Scientific).
5.9 Cuantificación de los niveles de RpoS mediante Western blot
A partir de cultivos crecidos en medio líquido BS durante 24 h, se tomaron 100 µg de
proteína total, los cuales fueron mezclados con el buffer de carga para SDS-PAGE y
calentados a 95 ºC durante 10 min. Las proteínas fueron separadas en geles SDS-PAGE al
12% y transferidas a membranas de nitrocelulosa (Amersham). La proteína RpoS fue
detectada usando el antisuero policlonal RpoS-6His a una dilución de 1:5000 en Buffer
Material y Métodos
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Salino Tris (TBS) pH 7.5, adicionado con 0.1% de Tween 20 (TBST), seguido por una
incubación con anticuerpo anti-conejo IgG acoplado a fosfatasa alcalina (Abcam) a una
dilución de 1:10000 en TBST. Las membranas fueron reveladas mediante el uso del kit
BCIP/NBT (Invitrogen). Los niveles relativos de RpoS fueron calculados mediante
densitometría usando el programa ImageJ (Schleissner et al., 1997).
5.10 Construcción de plásmidos usados en este estudio
5.10.1 Construcción del plásmido pEQ424P.
Para generar la fusión traduccional del líder de gluP con el reportero lacZ, se amplificó un
fragmento EcoRI-BamHI de 670 pb, correspondiente a la región -630 al + 28 nt del gen
gluP usando los oligonucleótidos gluPF-EcoR1 y gluPR-Bam. El producto de PCR fue
previamente digerido con las enzimas EcoRI y BamHI, y fue clonado entre los sitios
correspondientes del vector pJU9 (de Lorenzo et al., 1990), el cual contiene el gen
reportero lacZ sin promotor, generando el plásmido pUJEQP. La fusión traduccional Ptrc-
gluP´-lacZ, fue construida en el plásmido pSEVA424 (Silva-Rocha et al., 2013), en el
cual, la fusión traduccional gluP´-lacZ podría ser transcrita desde el promotor Ptrc posterior
a la adición de IPTG. Para este fin la fusión gluP´-lacZ fue amplificada por PCR usando
como templado el plásmido pUJEQP y los oligonucleótidos LgluP-FwEcoRI y LacZ-
RevHindIII, los cuales contenían los sitios de restricción para las enzimas EcoRI y HindIII,
respectivamente. El fragmento amplificado fue digerido con las enzimas EcoRI y HindIII, y
subclonado en el plásmido pSEVA424 previamente digerido con las mismas enzimas de
restricción. Al plásmido resultante se le llamó pEQ424P. Éste plásmido fue introducido
mediante electroporación en las cepas de P. putida KT2440 (cepa silvestre) (Franklin et al.,
1981), y su derivada KTCRC (mutante crc::tet) (Hernández-Arranz et al., 2013).
Material y Métodos
41
5.11 Construcción de las mutantes de A. vinelandii
5.11.1 Mutante AEalgD (algD::Km).
El plásmido pMSD27, el cual porta el gen algD (Campos et al., 1996), fue parcialmente
digerido con la enzima ScaI, cortando el gen algD en el codón 356, los extremos de esta
digestión fueron rellenados con la enzima Klenow, para posteriormente ligar un cassette de
resistencia a Km previamente liberado del plásmido pBSL99 (Alexeyev et al., 1995) con
EcoRV, ambos fragmentos fueron ligados produciendo el plásmido pJGD. Posteriormente
células competentesfueron transformadas con el plásmido linearizado con la enzima PstI
para asegurar el remplazo alélico por doble recombinación homóloga. Las mutantes Kmr
resultantes fueron llamadas AEalgD, la ausencia de copias silvestres del gen algD fue
confirmada mediante PCR.
5.11.2 Construcción de la mutante AErpoS.
El plásmido pSMS7 (Castañeda et al., 2001), el cual porta la mutación rpoS::Sp fue
transformado en el fondo de la cepa AEIV. Este plásmido es incapaz de replicarse en A.
vinelandii, por lo que fue usado para transformar células competentes de la cepa AEIV.
Fueron seleccionadas las dobles recombinantes resistentes a Spr. Se confirmó mediante
PCR que el locus rpoS portara la mutación rpoS::Sp. La cepa resultante fue llamada
AErpoS.
5.11.3 Construcción de las cepas que portan las fusiones transcripcionales con
el reportero gusA.
La región reguladora de rsmZ2 fue liberada del plásmido pSAHFUTs-Z2 (Hernández-
Eligio et al., 2012) y clonada en el sitio EcoRI del pUMATcgusA-T (Muriel-Millán et al.,
2015), produciendo el plásmido pUMAZ2. Las cepas AEIV y mutante GG15 fueron
transformadas con este plásmido previamente linearizado con la enzima NdeI,
posteriormente las transformantes Tcr fueron seleccionadas. La cepa derivada de la AEIV
Material y Métodos
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que porta la fusión transcripcional prsmZ2-gusA fue llamada EQR101-Z2, mientras que la
derivada de la mutante GG15 fue llamada EQR103-Z2. La presencia de la fusión
transcripcional en el cromosoma de ambas cepas fue confirmada mediante PCR.
Para la construcción de las mutantes cbrA que portaran las fusiones transcripcionales y
traduccionales de algD al gen reportero gusA, se usaron las cepas AED-gusA y AED-´gusA
(García-Aguilar, 2016. Tesis de Licenciatura). Estas cepas portan en el cromosoma una
fusión transcripcional y traduccional (respectivamente) interrumpiendo la región estructural
de algD. La cepa mutante EQR02 (cbrA::Sp) fue transformada con DNA cromosomal de
las cepas AED-gusA y AED-´gusA, para posteriormente seleccionar las transformantes
Gmr. Las cepas derivadas resultantes fueron llamadas cbrAD-gusA y cbrAD-´gusA,
respectivamente.
5.11.4 Mutantes AE-Ygus y CbrA-Ygus.
Para la construcción de las cepas que portan la fusión transcripcional pcrcY-gusA, primero
se generó el plásmido pGJ112. Esto se logró al amplificar por PCR un fragmento de 246 pb
usando los oligonucleótidos crcY-Xb-F y crcY-Pst-R, el cual corresponde a la región
reguladora de crcY, este fragmento incluye los sitio de restricción XbaI y PstI. Este
fragmento fue subclonado en el vector pUMATcgusAT (Muriel-Millán et al., 2015),
previamente digerido con las enzimas XbaI y PstI, generando el plásmido pGJ112 (pcrcY-
gusA). Posteriormente, células competentes de las cepas AEIV y EQR02 (cbrA::Sp) de A.
vinelandii fueron transformadas como el plásmido pJG112 previamente linearizado con la
enzima NdeI. Derivadas de las cepas AEIV y EQR02 Tcr fueron seleccionadas, y se
confirmó mediante PCR, que portaran la fusión pcrcY-gusA, las cepas resultantes fueron
llamadas AE-Ygus y CbrA-Ygus, respectivamente.
5.12 Construcción de la mutante de E. coli WHIPC.
La cepa mutante WHIPC porta mutaciones en los genes que codifican los mayores sistemas
de transporte de glucosa (∆ptsHIcrr, ∆mglABC::FRT-Cm-FRT, galP::FRT), esta cepa es
una derivada de la mutante WHIP (Fuentes et al., 2013), la cual carece del transportador
Material y Métodos
43
tipo simporter de galactosa GalP y los genes que codifican los componentes generales del
sistema de Fosfotransferencia (PTS) (galP::FRT; ∆ ptsHIcrr,). El operón mglABC fue
inactivado en la mutante WHIP usando el procedimiento de Datsenko previamente descrito
(Datsenko & Wanner, 2000), esto se logró empleando productos de PCR amplificados con
los oligonucleótidos mglABCDtF y mglABCDtR, además del plásmido pKD3 como
templado (Fuentes et al., 2013), la verificación de la deleción cromosomal del operón
mglABC en la mutante WHIPC, se realizó mediante PCR usando los oligonucleótidos
mglABF y mglABR previamente reportados (Fuentes et al., 2013).
5.13 Síntesis de CrcZ y marcaje radiactivo de los RNAs.
Los oligonucleótidos de RNA fueron sintetizados por Sigma, estos fueron marcados
radiactivamente se usó la T4 polinucleótido quinasa y [γ-32P]-ATP, para posteriormente
ser purificados con una columna MicroSpin G-25 (GE Healthcare). El sRNA CrcZ fue
sintetizado mediante transcripción in vitro. Para este fin, crcZ fue amplificado por PCR
usando los oligonucleótidos crcZHd-Fw y crcZEco-ROK, los cuales se encontraban
flanqueados por los sitios de restricción HindIII (extremo 5´) y EcoRI (Extremo 3´). El
fragmento de DNA obtenido fue digerido con las enzimas HindIII and EcoRI, para
posteriormente ser clonado entre los sitios de restricción correspondientes del plásmido
pTZ19r (Thermo-Scientific), obteniendo el plásmido pEQZIT. Para obtener el sRNA CrcZ
radiactivamente marcado se realizó una reacción que contenía (25 μl) 40 mM Tris-HCl, pH
7.9, 6 mM MgCl2, 2 mM spermidine, 10 mM NaCl, 1 μg de pEQZIT linearizado con
EcoR1, 10 mM DTT, 500 μM ATP, CTP y GTP, 100 μM of UTP, 3.5 μl of [α-32P]-UTP
(3000 Ci mmol
−1
, 10 mCi ml
−1
) y 20 U of T7 RNA polimerasa. El RNA fue purificado de
un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 6%. El RNA transcrito correspondiente a CrcZ
fue eluido durante toda la noche a 4ºC en un buffer que contenía 0.5 M de acetato de
amonio, 1 mM EDTA, 16% de fenol y 0.1% SDS, posteriormente se extrajo con fenol y se
precipitó con etanol.
Material y Métodos
44
5.14 Ensayos EMSA con RNA y las proteínas Crc y Hfq.
Las proteínas Crc y Hfq-His de A. vinelandii fueron expresadas y purificadas como se había
reportado anteriormente (Moreno et al., 2015). Para realizar estos ensayos, se incubó el
RNA marcado radiactivamente (0.1 nM) por 30 min a 20ºC, en ausencia o presencia de las
proteínas indicadas en los pies de las figuras, en 20 μl de reacción contienen 10 mM de
HEPES-hidróxido de potasio (KOH), pH 7.9, 35 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 μg de tRNA de
levadura (para eliminar interacciones inespecíficas), y 10 unidades de RNAsin, inhibidor de
RNasas (Promega). Después de agregar 4 μl de buffer de carga (60% de glicerol y 0.025%
of xilen cianol), las muestras fueron resueltas en geles de poliacrilamida al 4%
(acrilamida/bis-acrilamida 80:1) cuando se analizaron los pegados al sRNA CrcZ, y al 6%
(acrilamida/bis-acrilamida 29:1) cuando se utilizaron los oligonucleótidos de RNA. La
electroforesis fue realizada a 4ºC, usando TBM como buffer de corrida.
5.15 Ensayos de qRT-PCR
Las cepas de A. vinelandii fueron cultivadas en medio líquido Burk sacarosa. Para
posteriormente recolectar las células por centrifugación, el RNA total fue extraído como se
ha descrito previamente (Barry et al., 1992). La contaminación de DNA genómico fue
removida usando DNase I (Thermo Fisher Scientific). Los niveles relativos del RNA
mensajero (mRNA), fueron determinados en relación con el mRNA de gyrA, como se ha
descrito a detalle (Ahumada-Manuel et al., 2016). Un control sin templado para cada
reacción fue incluido por cada gen probado. La técnica de cuantificación usada para
analizar los datos fue el método 2-D,DCT, reportado anteriormente (Livak & Schmittgen,
2001).
Material y Métodos
45
5.16 Métodos analíticos
5.16.1 Cuantificación de proteína
La cuantificación de proteína se realizó en base al método reportado por Lowry et al.,
(1951). La pastilla obtenida del cultivo de A. vinelandii se lavó con MgSO4 10mM y se
resuspendió en 1 ml de esta solución. Posteriormente se tomó una cantidad adecuada de
muestra y se aforó a 200 µl, a la cual se le añadió 1 ml de solución reactiva. Se dejó reposar
10 minutos para posteriormente agregar 100 µl de reactivo de Folín (Sigma) diluido en un
volumen de agua, y se dejó otra vez en reposo por 30minutos. Por último, la absorbancia se
lee a 625 nm. Paralelamente se corrió la curva de calibración con concentraciones de
albúmina de 25, 50, 100, 200 y 400 µg/ml. Las soluciones utilizadas fueron: a) Na2CO3 2%
en NaOH 0.1 N; b) Tartrato de sodio y potasio 2%; c) CuSO4 1%. La solución reactiva se
preparó con 1 ml de solución C, más 1 ml de solución B, más 98 ml de solución A.
5.16.2 Cuantificación específica de alginato por el método del carbazol.
Se incubaron los matraces de 250 ml con un volumen de 50 ml de BS durante 48 h a 30 ºC,
pasadas las 48 h se tomaron 3 ml de cultivo y se vertieron en un tubo Eppendorf de 5ml,
posteriormente se adicionaron 250 µl de EDTA 0.1 M y 250 µl de NaCl 1M para separar
por completo el alginato de las células. Se centrifugó a 10 000 rpm y se separó el
sobrenadante del paquete celular, el cual se conservó para cuantificar la cantidad de
proteína por el método del Lowry. El sobrenadante se pasó a un tubo Falcon de 15 ml y se
precipitó el alginato mediante la adición de 2 volúmenes de isopropanol. Una vez
precipitado el alginato se centrifugó a 7 000 rpm para separar todo el sobrenadante. Cuando
se decantó por completo el sobrenadante, los tubos se dejaron reposar en la campana de
extracción para que se secaran por completo. Una vez seco el alginato, se resuspendió en un
volumen conocido y se sometió a la reacción del carbazol descrita previamente (Knutson &
Jeanes, 1968).
La curva estándar para la cuantificación de alginato se realizó tomando volúmenes de 5, 10,
20, 30, 40, 60, 80, 100 y 120 µl de una solución de 1 mg/ml de alginato, los cuales se
Material y Métodos
46
llevaron a un volumen final de 200 µl en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. De esta manera
tenemos una curva estándar que va desde los 5 hasta los 120 µg de alginato. Las muestras
de alginato ya secas se resuspendieron en un volumen controlado de agua, hasta observar
una solución transparente. De esta solución de alginato se tomó una alícuota que no pasó
de los 200 µl, por ejemplo, si se tomaron 100 µl de la muestra problema, esta se debe llevar
a un volumen final de 200 µl al adicionar los 100 µl faltantes. Una vez preparadas las
muestras, se introdujeron en hielo y se les agregó lentamente y con mucho cuidado 1 ml de
la solución de ácido sulfúrico-boratos fría. Finalmente se adicionaron 200 µl de reactivo de
carbazol y se mezcló vigorosamente con un vortex durante 5 segundos. Todos los tubos,
incluidos los de la curva estándar se introdujeron en un baño (Termoblock) a 55 ºC durante
30 min. Al cabo de este tiempo se retiraron del baño y se agitaron nuevamente en el vortex,
se dejaron enfriar y la absorbancia se midió en un espectrofotómetro a 530 nm en celdas de
cuarzo. Se reportó la producción específica de alginato en mg de alginato/mg de proteína ó
µg de alginato/mg de proteína.
La solución de ácido sulfúrico-boratos se preparó mezclando 24.7g de ácido bórico en 30
ml de agua con poca agitación y se calentó suavemente (<90 ºC), el ácido bórico se disolvió
hasta que se agregó 10.09 g de KOH. Por último se aforó la solución a un volumen final de
45 ml. Esta solución se enfrió un poco, pero sin permitir la precipitación de los boratos.
Finalmente se mezclaron cuidadosamente 975 ml de ácido sulfúrico concentrado con 25 ml
de la solución de boratos previamente preparada, lo cual debió realizarse lentamente ya que
la solución de boratos aún estaba caliente, por lo cual fue recomendable realizarlo en hielo
y que el ácido sulfúrico también esté frio.
5.16.3 Cuantificación de la actividad de β-Glucuronidasa
Se prepararon las siguientes soluciones: Lisozima 10mg/mL, PNPG (P-nitrofenil-β-
glucorónido) 4.0 mg/mL, Na2CO3 1.2 M, Tritón 100x solución al 10% V/V de tritón en
agua destilada, K2HPO4 0.5 M, KH2PO4 0.5 M, EDTA 0.25 M, DTT 0.25 M.
El buffer Z, se prepara preferentemente antes de iniciar la reacción mezclando: 3.0 mL de
K2HPO4 0.5 M, 2.0 mL de KH2PO4 0.5 M, 0.2 mL de EDTA 0.25 M y 1 mL de DTT 0.25
M, llevando el volumen a 50 mL.
Material y Métodos
47
Para proceder a la cuantificación se resuspendió el paquete celular de la muestra en 1mL de
MgSO4 10 mM, del cual se tomaron 20 µl (volumen de reacción) este volumen puede
variar dependiendo del grado de expresión que tenga la β-Glucuronidasa, a estos se le
agregaron 710 µL del buffer Z. Al mismo tiempo se preparó un blanco que contenía solo
730 µL de buffer Z y se procesó junto con las demás muestras. Se les agregó 10 µL de
solución de Lisozima y se incubaron los tubos a 37º durante 5 minutos, pasado el tiempo se
les añadió 10 µL de la solución de Tritón al 10%, posteriormente se les agregó 100 µL de la
solución de PNPG y es muy importante que se cronometren exactamente 15 minutos de
reacción (tRx) mientras se transfirieron los tubos a un baño de agua a 28ºC. Se agregó 150
µL de Na2CO3 para detener la reacción. Finalmente se leyó la absorbancia a 405 nm contra
el blanco.
Para calcular la actividad de β-Glucuronidasa usamos la siguiente fórmula:
U β-Gluc = D.O. (405 nm) x 1000
(0.018)(t Rx en minutos)(Vol Rxn µL)( µg Proteina/mL)
1 U = nmoles de PNPG producidos/minuto/µg proteína
5.16.4 Cuantificación de la actividad de β -Galactosidasa
La actividad de ß-galactosidasa fue cuantificada como se ha descrito por (Miller, 1972).
Antes de iniciar se prepararon las siguientes soluciones: Buffer fosfatos 0.5 M y pH 6.5
(69g/l de NaH2PO4·H2O más 179.08 g/l de Na2HPO4·12H2O) estéril, ONPG (O-nitrofenil
β-D-galactosido) a una concentración de 4 mg/ml (diluido en Buffer fosfatos), SDS 0.1%
(P/V) y 106 g/l de Na2CO3 (esterilizado en autoclave).
El Buffer Z de prepara preferentemente el día del experimento. Se compone de: 21.49 g/l
de Na2HPO4·12H2O, 5.52 g/l de NaH2PO4·H2O, 0.75 g/l de KCl, 0.25 g/l de MgSO4·7H2O
y 3.5 ml/l de ß-Mercaptoetanol. Se ajustó el pH a 7 y se filtró.
La actividad de ß-galactosidasa de las cepas de P. putida fue determinada de la siguiente
manera: Un cultivo de toda la noche de P. putida fue diluido a una turbidez final de 0.05
(A600) en medio LB fresco. Cuando se indica, se agregó 0.5 mM de IPTG para inducir la
Material y Métodos
48
expresión del promotor Ptrc. Las células fueron crecidas en agitación a 30ºC. Una vez que
el cultivo alcanzó una D.O. de entre 0.08 y 0.1, se empezó a medir la absorbancia en los
tiempos indicados. Para la cuantificación de ß-galactosidasa se tomaron 50 µl directamente
de la cubeta del espectrofotómetro donde se midió la absorbancia de la muestra y se añadió
a un tubo previamente preparado con 1 ml de Buffer Z, 25 µl de SDS al 0.1% y 25 µl de
cloroformo. Se mezcló usando el vortex durante 10 segundos y se dejó reposar hasta que
perdió la turbidez y el cloroformo se precipitó al fondo del tubo. Se añadieron 200 µl de
ONPG al mismo tiempo que se inició a cronometrar el tiempo, mientras se agitaba
suavemente el tubo (sin usar vortex), una vez que la reacción viró a amarillo se detuvo al
añadir 1 ml de Na2CO3 y se registró el tiempo de reacción. Se midió la D.O. a una
absorbancia de 420 y 550 nm para la misma muestra. Como muestra blanco se usó medio
LB estéril.
Para calcular la actividad de β-Galactosidasa usamos la siguiente fórmula:
U β-Gal = 1000 x D.O. A420 - (1.75 x D.O. A550)
T(min) x V(ml) x D.O. A600(células)
5.16.5 Cuantificación de acetato y glucosa
Las muestras para Las cuantificaciones de acetato y glucosa se obtuvieron durante la
cinética de crecimiento diauxico acetato-glucosa. Éstas fueron tomadas a los tiempos
indicados, posteriormente se centrifugaron a 13 000 rpm para obtener el sobrenadante libre
de células. Las cuantificaciones de acetato y glucosa fueron realizadas mediante HPLC
usando una columna Aminex HPX-87H(300 9 7.8 mm)(Bio-Rad, Hercules, CA, USA). El
eluyente fue H2SO4 (7 mM) a un flujo de 0.8 ml min-1.
5.16.6 Cuantificación de ARs
El fenotipo de síntesis de alquilresolcinoles fue determinado en células crecidas durante 5
días en matraces con medio líquido BBOH, las cuales fueron recolectadas y los ARs
cuantificados de acuerdo a lo reportado por Segura et. al., 2003. Los lípidos fueron
extraídos con acetona durante una hora a temperatura ambiente. El extracto de acetona fue
Material y Métodos
49
removido y colocado en un tubo limpio, una segunda extracción fue realizada durante 12 h
a temperatura ambiente. Los extractos resultantes fueron mezclados y utilizados para una
determinación espectrofotométrica de ARs usando el colorante Fast Blue B (0.5% Fast
Blue B y 5% de ácido acético). Se usó orcinol para realizar una curva estándar. El colorante
Fast Blue B, por ser una sal de diazonio, forma un acoplamiento diazoico (N=N) con el
anillo fenólico de los ARs, por lo cual, las células que producen ARs retienen el colorante
(tinción roja).
5.16.7 Cuantificación de PHB
La cuantificación de PHB se realizó usando el método espectrofotométrico de Law &
Slepecky, 1961, basado en la conversión de PHB a ácido crotónico en presencia de ácido
sulfúrico concentrado. Las células para esta determinación fueron cosechadas de matraces
con BS líquido crecidas durante 48 h, las cuales fueron lavadas con EDTA 0.1 M para
quitarles por completo el alginato y resuspendidas en 500 µl de MgSO4 10 mM 50 µl de
cada suspensión fueron mezclados con 1 ml de hipoclorito al 30% e incubados durante una
hora a 37 ºC. Las muestras fueron centrifugadas a 13 000 rpm durante 25 min, lavadas con
1 ml de agua y centrifugadas nuevamente. Posteriormente se realizaron lavados con etanol
absoluto y acetona. Una vez secas las pastillas de PHB, fueron resuspendidas en 1 ml de
ácido sulfúrico concentrado y calentadas durante 10 min a 95 ºC. La densidad óptica de las
muestras fue determinada a una longitud de onda de 235 nm. Cuando es necesario, las
cifras muestran los valores medios y las desviaciones estándar entre las repeticiones.
5.17 Análisis estadísticos.
Los análisis estadísticos fueron realizados usando el Software GraphPad Prism (versión
7.0) (GraphPad Software, La Jolla, CA). �La significancia estadística fue determinada
usando un análisis t de Student, donde un valor de p �≤ �0.05 fue considerado como
significativo.
Resultados y Discusión
50
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados y la discusión de este trabajo se dividieron en dos apartados:
6.1. Estudio del papel de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq/CrcZ en el
proceso de CCR, en �particular sobre la asimilación y metabolismo de
glucosa en A. vinelandii. �
6.2. Efecto del sistema CbrA/CbrB sobre la síntesis de alginato en A.
vinelandii. �
Resultados y Discusión
51
6.1 Estudio del papel de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq/CrcZ en el
proceso de CCR, en particular sobre la asimilación y metabolismo de
glucosa en A. vinelandii �
6.1.1 Los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq de A. vinelandii operan de la misma
manera que en especies de Pseudomonas �
Cómo se mencionó en apartados anteriores, el sistema CbrA/CbrB, junto con las proteínas
Crc-Hfq y los sRNAs CrcZ/CrcY poseen un papel clave en la represión catabólica en
Pseudomonas. En A. vinelandii los genes que codifican todos los compontes de los
sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq están presentes en su genoma. El gen cbrB (Avin42680), el
cual codifica el RR CbrB, junto con el gen que codifica para el sRNA CrcZ, se localizan río
abajo del gen cbrA (Avin42670) (Fig. 8). Las proteínas CbrA y CbrB poseen una identidad
mayor al 77%, mientras que los sRNAs CrcZ y CrcY poseen una identidad mayor al 68%
en comparación con sus homólogos de P. aeruginosa y P. putida. El sRNA CrcZ contiene
seis posibles sitios CA de unión a Hfq (AAnAAnAA) (Fig. 8a). La predicción de la
estructura secundaria del sRNA mostró que estos sitios ricos en adeninas están localizados
en estructuras tipo “asa” (Fig. 8b). Por otra parte en A. vinelandii el gen crcY se localizó en
la región intergénica entre los ORFs Avin04820 y el Avin04790, los cuales codifican para
proteínas hipotéticas (Fig. 8c). La secuencia de crcY mostró cinco sitios CA, sin embargo,
al realizar la predicción de la estructura secundaria, solo cuatro de los cinco sitios de
localizaron en “asas” (Fig. 8d).
Los genes crc (Avin02870) y hfq (Avin07540) también fueron identificados en el genoma
de A. vinelandii, las proteínas Crc y Hfq mostraron un 88 y un 93% de identidad
respectivamente, en comparación con sus homólogos de P. aeruginosa.
Resultados y Discusión
52
Figura 8. Contexto genómico, secuencia de nucleótidos y predicción de la estructura tridimensional del
sRNA CrcZ de A. vinelandii. (a) Los sitios CA están indicados en cajas rojas. Las regiones -12 y -24
correspondientes al promotor RpoN están indicadas, al igual que las secuencias de reconocimiento de CbrB
(cajas negras). Las regiones -10 y -35 del posible promotor RpoD predicho están subrayadas. Las regiones
invertidas repetidas que define el final de CrcZ están indicadas por flechas. (b) La estructura tridimensional de
CrcZ fue realizada usando RNAfold (http:/ rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi), los sitios CA predichos
están indicados del 1 al 6.
a
11
Supplementary Figures
Figure S1. Predicted secondary structure of the A. vinelandii small RNA CrcZ. It was
conducted using the RNAfold algorithm (http:/ rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi).
The predicted A-rich Hfq-binding motifs 1 to 6 are indicated.
G
U
A
C
A
A
C
A
A
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G G
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G
G
C
U
C
C
C
U
U
U
CU
G
1
2 3
6
5
4
b
Resultados y Discusión
53
Como primer acercamiento para averiguar si la estructura funcional del sistema
CbrA/CbrB-Crc se conservaba, se investigó si la expresión de los sRNAs CrcZ y CrcY se
encuentran bajo el control del TCS CbrA/CbrB. Para tal fin se generaron fusiones
transcripcionales de las regiones reguladoras de crcZ y crcY con el gen reportero gusA
(PcrcZ- gusA y PcrcY-gusA, respectivamente) en la cepa silvestre de A. vinelandii (AEIV)
y en su derivada mutante cbrA. Estas cepas fueron cultivadas en medio Burk sacarosa y se
cuantificó la actividad β-glucuronidasa durante las fases de crecimiento exponencial (8 h)
y estacionaria (24 h).
Resultados y Discusión
54
Figura 9. Contexto genómico, secuencia de nucleótidos y predicción de la estructura tridimensional del
sRNA CrcY de A. vinelandii. (a) Los sitios CA están indicados en cajas rojas. Las regiones -12 y -24
correspondientes al promotor RpoN están indicadas, al igual que las secuencias de reconocimiento de CbrB
(cajas negras). Las regiones -10 y -35 del posible promotor RpoD predicho están subrayadas. (b) La
estructura tridimensional de CrcZ fue realizada usando RNAfold (http:/ rna.tbi.univie.ac.at/cgi-
bin/RNAfold.cgi), los sitios CA predichos están indicados del 1 al 5.
Como se muestra en la Fig. 10a y 10b,la transcripción de ambos sRNAs fue dependiente
de la HK CbrA, ya que la actividad de ambas fusiones transcripcionales se redujo al menos
12
Figure S2. Genomic context and nucleotide sequence of the A. vinelandii crcY gene.
The six CrcY A-rich Hfq-binding motifs are indicated by red boxes. The -12 and -24
regions of the RpoN predicted promoter as well as putative sequences recognized by CbrB
(asterisks) are indicated. The predicted -10 and -35 regions of an RpoD promoter are
underlined.
a
13
Figure S3. Predicted secondary structure of the A. vinelandii sRNA CrcY. It was
conducted using the RNAfold algorithm (http:/ rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi).
The predicted A-rich Hfq-binding motifs are indicated by red numbers.
GC A
C
A
C
A
A
C
A
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A
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A G
C A
C
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U U C U U C
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G U G
G
C G G U C
G
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C A A
A
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C
U
GUGCUUC
GAGCGA
UC
C
C
CC
UU
UC
CG
GAAA
5 3
2 1
b
Resultados y Discusión
55
cuatro veces en la mutante cbrA, durante ambas fases de crecimiento. Aunado a esto, el
análisis in silico de las regiones reguladoras, tanto de crcZ como de crcY permitió localizar
un posible promotor RpoN (Fig. 8a y 9a). Además, también identificamos secuencias
consenso de reconocimiento del RR CbrB en los promotores de estos sRNAs (Fig. 8a y 9a).
Colectivamente estos resultados indican que el TCS CbrA/CbrB activa la transcripción de
los sRNAs CrcZ y CrcZ, como ha sido descrito en diversas especies de Pseudomonas.
Figura 10. Efecto de la HK CbrA en la expresión de los genes crcZ y crcY. (a) Fusión transcripcional de
crcZ en la cepa silvestre AEIV (barras negras) y mutante cbrA (barras blancas). (b) Fusión transcripcional de
crcY en la cepa silvestre AEIV (barras negras) y mutante cbrA (barras blancas). La diferencia significativa fue
analizada mediante t-test (*p< 0.05, **p<0.01 o ***p< 0.001).
6.1.1.1 Las proteínas Hfq-Crc de A. vinelandii son capaces de formar un
complejo con CrcZ
Posteriormente investigamos la capacidad de CrcZ para formar un complejo con las
proteínas Crc y Hfq de A. vinelandii, mediante el uso de ensayos de retardo de movilidad
electroforética (EMSAs). Para tal fin, el sRNA CrcZ radiactivamente marcado fue
sintetizado mediante transcripción in vitro y las proteínas Crc y Hfq de A. vinelandii fueron
expresadas y purificadas en la cepa de expresión de E. coli MG1655 la cual porta una
U
ß
-G
lu
c
U
ß
-G
lu
c
Tiempo (h) Tiempo (h)
Resultados y Discusión
56
mutación en hfq (Madhushani et al., 2015), esto con el fin de prevenir contaminaciones de
Hfq de la cepa de expresión. Cabe mencionar que las purificaciones de la proteína Crc se
realizaban usando resina de Níquel y en ensayos tipo EMSA esta proteína aparentemente
era capaz de unirse a mRNAs que presentaran el motivo CA. Por esta razón, inicialmente se
había propuesto que era Crc quien se unía directamente a estas secuencias (Moreno et al.,
2007; Moreno et al., 2009b; Sonnleitner et al., 2009). Sin embargo, recientemente se
demostró que esta unión se debía a la presencia de pequeñas cantidades de la proteína Hfq
de E.coli como contaminante, y era Hfq quien realmente se unía al motivo CA (Milojevic et
al., 2013). Para evitar la contaminación por Hfq de E. coli en los extractos de las proteínas
purificadas, se utiliza como cepa de expresión una mutante de E. coli en hfq (Moreno et al.,
2015).
Como observamos en la Fig. 11a, Hfq por sí sola es capaz de formar un complejo con CrcZ
desde concentraciones tan bajas como 0.02 μM, lo cual sugiere una alta afinidad de esta
chaperona por los sitios ricos en adeninas presentes en CrcZ de A. vinelandii, ya que por el
contrario, en P. putida es necesaria una concentración 50 veces mayor de Hfq (1µM) para
lograr que esta proteína forme un complejo estable con el sRNA CrcZ de esta misma
bacteria (Moreno et al., 2015). Cuando la concentración de Hfq incrementa, el complejo
formado muestra una menor movilidad electroforética, lo cual es consistente con que CrcZ
presenta seis sitios CA a los que se une Hfq (Fig. 11a).
Al igual que la proteína Crc de especies de Pseudomonas, la proteína Crc de A. vinelandii
por sí misma fue incapaz de formar un complejo estable con CrcZ, incluso en presencia de
altas concentraciones (Fig. 11b). Sin embargo, a una concentración de 0.2 μM de Hfq, la
presencia de Crc fue capaz de cambiar el patrón de migración del complejo Hfq-CrcZ, el
cual muestra una mayor movilidad electroforética, sugiriendo la formación de un complejo
tripartita CrcZ-Hfq-Crc (complejo Ribonucleoproteíco o RNP por sus siglas en inglés) (Fig.
11b). Por otra parte, a una concentración más baja de Hfq (0.05 μM), la presencia de Crc
también fue capaz de estabilizar el RNP CrcZ-Hfq formado, ya que se pudo observar una
banda mas íntegra y definida en comparación con la formada en presencia de solo Hfq
(Fig.11c). Aunado a los resultados anteriores, comprobamos que la proteína Crc
específicamente se une al complejo CrcZ-Hfq cambiando su patrón de migración, ya que el
Resultados y Discusión
57
uso de la misma concentración de suero de albúmina bovina (BSA), no produjo ningún
cambio en la migración del complejo (Fig. 11d).
En conjunto estos resultados indican que tanto el sistema CbrA/CbrB y el sistema Crc-Hfq
de A. vinelandii opera de manera similar a lo reportado previamente en Pseudomonas spp.
Figura 11. Las proteínas Crc-Hfq forman un complejo ribonucleoprotéico con CrcZ. (a) Los complejos
ribonucleoproteícos se formaron en presencia del sRNA CrcZ y concentraciones crecientes de Hfq (0, 0.02,
0.05, 0.1, 0.2, 0.5 and �1 μM). (b y c) complejo formado en presencia de Crc, de Hfq o ambos. (d) Crc fue
sustituido por 1 μM de BSA. Crc y Hfq fueron agregadas en las concentraciones indicadas (Crc expresada en
monómeros y Hfq en hexámeros). El RNA y los complejos RNA-proteína, fueron resueltos en un gel de
poliacrilamida no desnaturalizante. La posición del RNA libre y los de los complejos ribonucleoprotéico
(RPN) están indicados.
Complejo
RNP
Complejo
RNP
Complejo
RNP
Complejo
RNP
Resultados y Discusión
58
6.1.2 La HK CbrA es necesaria para el consumo de glucosa
Estudios previos habían demostrado el uso preferencial del acetato sobre glucosa en A.
vinelandii en la cepa OP (George et al., 1985; Tauchert et al., 1990), una derivada de la
cepa O, la cual es incapaz de producir el exo-polisacárido alginato. Sin embargo, el
mecanismo de esta represión catabólica era aun desconocido. Debido a que se ha reportado
que el TCS CbrA/CbrB encabeza la cascada de la CCR en especies de Pseudomonas
decidimos establecer el papel de este TCS sobre la CCR en A. vinelandii. Para tal fin
decidimos evaluar el comportamiento de la mutante cbrA cuando crece en medio diáuxico
glucosa-acetato. Como se había mencionado anteriormente, esta cepa presenta una
producción de alginato alrededor de cinco veces mayor en comparación con la cepa
parental AEIV. Dado que este polímero se sintetiza a partir de fructosa-6-fosfato, compite
por la fuente de carbono disponible en el medio (Hay et al., 2013). Por tal razón, el fenotipo
de sobre-producción de alginato de la mutante GG15impediría una evaluación fiable de la
función CbrA en el crecimiento sobre diferentes fuentes de carbono. Por esta razón, se
evaluó el efecto de HK CbrA sobre el proceso CCR en un fondo genético alg— (no
productor de alginato). Para este fin se utilizó la cepa AEalgD, una derivada de la cepa
AEIV que porta una mutación algD::Km, y la mutante AH1, un derivado AEalgD que
también porta de una mutación cbrA::mTn5.
Como se muestra en la Fig. 12a, ambas cepas, AEalgD y AH1 crecieron en sacarosa como
única fuente de carbono. Sin embargo, la cepa AH1 fue incapaz de crecer en glucosa (Fig.
12a) lo cual indica que la HK CbrA es necesaria para el consumo de este carbohidrato en A.
vinelandii. Por otra parte, cuando ambas cepas se cultivan en un medio acetato-glucosa
(Fig. 12b), podemos observar que en la cepa AEalgD es capaz de crecer primero a expensas
del consumo el acetato; cuando el acetato se ha acabado se inicia el consumo de glucosa, lo
cual es consistente con reportes previos que indican que A. vinelandii presenta crecimiento
diauxico, cuando se cultiva en un medio con acetato y glucosa (Tauchert et al., 1990). En
contraste, la cepa mutante cbrA llamada AH1 creció en acetato, pero la asimilación de
glucosa fue inhibida y el crecimiento se estacionó tan pronto como el acetato fue
consumido. Estos resultados indican que la HK CbrA está involucrada en el control de la
CCR en A. vinelandii, debido a que, como ya hemos comprobado el sistema CbrA/CbrB es
Resultados y Discusión
59
necesario para la expresión de los sRNAs , los cuales antagonizan el efecto de las proteínas
Crc-Hfq (Moreno et al., 2012; Moreno et al., 2015; Sonnleitner & Blasi, 2014). Nuestra
hipótesis es que la mutación cbrA en A. vinelandii genera una fuerte represión catabólica
dependiente de Crc-Hfq, la cual no puede ser liberada por la baja expresión de CrcZ y
CrcY, por lo cual decidimos explorar dicha posibilidad.
Figura 12. La HK CbrA es necesaria para la asimilación de glucosa. (a) Cinética de crecimiento de la
cepa AEalgD (círculos negros) en sacarosa (línea continua) o glucosa (línea punteada), y de la cepa AH1
(círculos blancos) en sacarosa (línea continua) o glucosa (línea punteada) (b). Cinética de crecimiento
(círculos), y consumo de acetato (triángulos) o glucosa (rombos) de la cepa silvestre (símbolos negros) o la
cepa mutante cbrA (símbolos blancos) en medio mínimo Burk suplementado con 30mM de acetato y 30mM
de glucosa como fuentes de carbono.
6.1.3 La sobre-expresión de Crc en trans disminuye el crecimiento en glucosa
Como se mencionó en el apartado anterior, la cepa mutante en cbrA llamada AH1 fue
incapaz de asimilar la glucosa en presencia de acetato, por lo que quisimos explorar la
posibilidad de que este efecto del sistema CbrA/CbrB sobre el consumo de glucosa, fuera a
través del sistema Crc. Cabe mencionar que los intentos de construir mutantes en crc ó
crcZ no fueron exitosos a pesar de que se trató de seleccionarlas usando medio rico o
medios mínimos, suplementados con acetato, succinato, glucosa o sacarosa como fuentes
a
a
a
Tiempo (h)
C
re
ci
m
ie
nt
o
(A
60
0)
b
a
b
Tiempo (h)
Fuente de carbono (m
M
)
aC
re
ci
m
ie
nt
o
(A
60
0)
Resultados y Discusión
60
de carbono, ya sea en condiciones de crecimiento diazotrófico o en presencia de una fuente
de nitrógeno. Estos resultados sugieren fuertemente que tanto la proteína Crc como el
sRNA CrcZ son esenciales para el crecimiento vegetativo de A. vinelandii, por lo menos en
nuestras condiciones de laboratorio. Por lo tanto , al no poder generar dichas mutantes para
evaluar su fenotipo, nuestra siguiente estrategia fue evaluar el efecto de una sobre-
expresión de Crc durante la asimilación de glucosa. Para lo cual se utilizó un plásmido que
portara el gen crc de A. vinelandii bajo un promotor lac inducible con IPTG (pSRK-crc), el
cual es derivado del pSRK-Km (Khan et al., 2008). Ambos plásmidos (el pSRK-crc y el
pSRK-Km vacío) fueron transformados en el fondo de la cepa silvestre AEIV, para
posteriormente evaluar el crecimiento de las cepas resultantes en glucosa como única
fuente de carbono. Como podemos observar en la Fig. 13a, la cepa AEIV que porta el
vector vacío muestra un crecimiento normal, alcanzando la fase estacionaria a las 24 horas
de cultivo (Fig. 13a). Este comportamiento fue similar en la cepa AEIV que porta el vector
pSRK-crc en ausencia del inductor (Fig. 13a). Sin embargo, la presencia de 1mM de IPTG
al medio de cultivo, la cepa que porta el vector pSRK-crc mostró un retraso en el
crecimiento durante las primeras 10 h; después de transcurrido este tiempo el crecimiento
inició nuevamente, pero se estacionó a las 16 horas de cultivo, alcanzando una
concentración máxima de proteína de 375 μg/ml (Fig. 13a), tres veces menor que la cepa
control. Este resultado nos indica que la proteína Crc tiene un efecto negativo en el
catabolismo de glucosa.
Resultados y Discusión
61
Figura 13. Efecto de la sobreexpresión de Crc en diferentes fuentes de carbono. Cinética de crecimiento
de la cepa silvestre AEIV que porta el vector pSRK-Km vacío (n), o el vector inducible con IPTG pSRK- crc
(crc+), en presencia (○) o ausencia (●) de 1mM de IPTG. Las cepas fueron crecidas en medio mínimo Burk
con 30mM de (a) glucosa, (b) sacarosa, (c) acetato y (d) succinato como única fuente de carbono.
Cuando la cepa que sobre-expresa Crc se cultivó con sacarosa como única fuente de
carbono, Se observó que durante la fase estacionaria esta cepa alcanzó un concentración de
proteína dos veces menor que el cultivo que no fue inducido (Fig. 13b), o el que porta el
vector vacío (Fig. 13b). Este resultado era de esperarse, debido al efecto que Crc mostró
14
Figure S4. Effect of Crc over-expression on A. vinelandii growth. Growth kinetics of the
wild type A. vinelandii AEIV strain, harbouring the empty vector pSRK-Km (!) or the
pSRK-crc (crc+) vector, in the presence (!) or absence (") of 1 mM IPTG. Cultures were
developed in Burk’s minimal medium supplemented with 30 mM of sucrose (a), acetate (b)
or succinate (c) as the sole carbon source and 1.5 µgml-1 of kanamycin as a selection
marker. 25 ml of Burk’s medium supplemented with 30 mM sucrose were cultured for 18
h; cells were harvested by centrifugation, washed with phosphate buffer 10 mM pH 7.2 and
resuspended in the same solution. 400 µg of these cells were used to inoculate 50 ml of the
culture medium and samples were collected at the indicated times for protein
quantification. The results represent the averages of the results of three independent
experiments, and error bars depict standard deviations.
0 10 20 30 40 50 60
1
10
100
1000
10000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
a b c
0 10 20 30
1
10
100
1000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
0 10 20 30
1
10
100
1000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
14
Figure S4. Effect of Crc over-expression on A. vinelandii growth. Growth kinetics of the
wild type A. vinelandii AEIV strain, harbouring the empty vector pSRK-Km (!) or the
pSRK-crc (crc+) vector, in the presence (!) or absence (") of 1 mM IPTG. Cultures were
developed in Burk’s minimal medium supplemented with 30 mM of sucrose (a), acetate (b)
or succinate (c) as the sole carbon source and 1.5 µgml-1 of kanamycin as a selection
marker. 25 ml of Burk’s medium supplemented with 30 mM sucrose were cultured for 18
h; cells were harvested by centrifugation, washed with phosphate buffer 10 mM pH 7.2 and
resuspended in the same solution. 400 µg of these cells were used to inoculate 50 ml of the
culture medium and samples were collected at the indicated times for protein
quantification. The results represent the averages ofthe results of three independent
experiments, and error bars depict standard deviations.
0 10 20 30 40 50 60
1
10
100
1000
10000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
a b c
0 10 20 30
1
10
100
1000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
0 10 20 30
1
10
100
1000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
14
Figure S4. Effect of Crc over-expression on A. vinelandii growth. Growth kinetics of the
wild type A. vinelandii AEIV strain, harbouring the empty vector pSRK-Km (!) or the
pSRK-crc (crc+) vector, in the presence (!) or absence (") of 1 mM IPTG. Cultures were
developed in Burk’s minimal medium supplemented with 30 mM of sucrose (a), acetate (b)
or succinate (c) as the sole carbon source and 1.5 µgml-1 of kanamycin as a selection
marker. 25 ml of Burk’s medium supplemented with 30 mM sucrose were cultured for 18
h; cells were harvested by centrifugation, washed with phosphate buffer 10 mM pH 7.2 and
resuspended in the same solution. 400 µg of these cells were used to inoculate 50 ml of the
culture medium and samples were collected at the indicated times for protein
quantification. The results represent the averages of the results of three independent
experiments, and error bars depict standard deviations.
0 10 20 30 40 50 60
1
10
100
1000
10000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
a b c
0 10 20 30
1
10
100
1000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
0 10 20 30
1
10
100
1000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
a b
c d
μ
g
Pr
ot
eí
na
/m
l
μ
g
Pr
ot
eí
na
/m
l
μ
g
Pr
ot
eí
na
/m
l
μ
g
Pr
ot
eí
na
/m
l
μ
g
Pr
ot
eí
na
/m
l
Vector vacío Vector vacío
Vector vacío Vector vacío
Tiempo (h) Tiempo (h)
Tiempo (h) Tiempo (h)
Resultados y Discusión
62
sobre el catabolismo de glucosa (Fig. 13a). En contraste, el crecimiento de esta cepa que
sobre-expresa Crc no se afectó en fuentes de carbono preferenciales como acetato o
succinato (Fig. 13c y 13d). En conjunto estos resultados indican que los altos niveles de Crc
en la cepa AEIV/pSRK-crc simulan condiciones de fuerte represión catabólica, por lo cual
se impide el consumo de glucosa, una fuente de carbono secundaria para A. vinelandii
6.1.4 GluP es el transportador de glucosa en A. vinelandii
Debido a que comprobamos que los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq están directamente
relacionados con el catabolismo de fuentes de carbono, específicamente sobre la
asimilación de glucosa, nos propusimos investigar si los genes involucrados en el transporte
y metabolismo de glucosa podrían ser blanco directo de las proteínas Crc-Hfq.
El genoma de A. vinelandii posee varios genes involucrados en el metabolismo y
asimilación de glucosa, que muestran sitios posibles de unión a Crc-Hfq (AANAANAA)
cerca del inicio de la traducción (Tabla 1), entre ellos el gen gluP (Avin04150) (Fig. 14a).
Este gen está anotado como un transportador de glucosa-galactosa, perteneciente a la
Superfamilia MFS (Major Facilitator Superfamily) y a la familia FGHS (Fucose-Galactose-
Glucose:H+ Symporter) (Pao et al., 1998; Saier et al., 1999). El gen gluP codifica una
proteína de 429 aminoácidos, su estructura tridimensional predicha muestra 12 hélices
trans-membranales típicas de los miembros de la familia MFS (Saier et al., 1999), además
muestra 48% de identidad con el transportador de glucosa-galactosa (GluP) previamente
descrito en Brucella abortus (Essenberg et al., 1997). Homólogos del gen gluP de A.
vinelandii también están presentes en Azotobacter chroococcum y Azotobacter beijerinckii
(con un porcentaje de identidad mayor al 90%).
Interesantemente, el genoma de A. vinelandii carece del transportador de glucosa típico
presente en Pseudomonas spp., el transportador de tipo ABC GtsABC. Por lo cual nos
preguntamos si GluP sería el principal transportador de glucosa en A. vinelandii.
Para determinar el papel de GluP en la asimilación de glucosa, en el laboratorio
previamente se había generado la cepa AHI30, la cual es derivada de la cepa silvestre
AEIV, que porta la mutación gluP::Sp, además de la cepa complementada AHI30/ pSRK-
gluP, las cuales fueron caracterizadas para evaluar el efecto de la mutación de gluP en A.
Resultados y Discusión
63
vinelandii (Hernández-Ortíz, 2014). Como ese observa en la Fig. 14b esta mutante puede
crecer en sacarosa (BS), sin embargo, fue incapaz de crecer en un medio mínimo como
glucosa como única fuente de carbono (BG). Aunado a este resultado, la complementación
en trans con una copia silvestre del gen gluP bajo un promotor inducible (AHI30/pSRK-
gluP), restauró el crecimiento de la cepa AHI30 en glucosa como única fuente de carbono,
solo en presencia de IPTG (Fig. 14b). En conjunto estos resultados indican que GluP es
necesario para el consumo de este carbohidrato.
Figura 14. El gen gluP de A. vinelandii codifica un transportador de glucosa. (a). Contexto genómico del
gen gluP de A. vinelandii. (b) Crecimiento de la mutante gluP::Sp (AHI30) y su derivada AHI30/gluP+ la cual
porta el plásmido pSRK-gluP (gluP+) en placas con medio mínimo Burk-sacarosa (BS), o Burk-glucosa (BG).
Cuando se indica se agregó 1mM de IPTG al medio para inducir la transcripción de gluP a través del
promotor lac. (c). Cinética de crecimiento cuantificada como biomasa celular (g l-1) (cuadros) y consumo de
glucosa (círculos) por la mutante de E. coli WHIPC (símbolos negros) o su derivada que porta el vector
pSRK-gluP (gluP+) (símbolos blancos) en presencia de 0.1mM de IPTG.
Adicionalmente, para confirmar el papel de GluP como transportador de glucosa en A.
vinelandii, se realizó una complementación heteróloga con el gen gluP de A. vinelandii en una
cepa de E. coli que posee mutaciones en los principales sistemas de transporte de glucosa. Con
este propósito se evaluó una mutante de E. coli WHIPC, la cual posee deleciones en los genes
que codifican los componentes generales del sistema PTSGlc, el transportador tipo ABC de
a
b
c
Tiempo (h)
G
lu
co
sa
g
/l Biom
asa g/l
Resultados y Discusión
64
glucosa/galactosa Mgl y el transportador de galactosa tipo simporter GalP. Los plásmidos
pSRK-Km (control) y pSRK-gluP le fueron transferidos a la cepa WHIPC, posteriormente el
crecimiento de las cepas resultantes fueron probadas en medio mínimo M9 suplementado con
2.5 g/L de glucosa. Como se muestra en la Fig. 14c, el crecimiento de la mutante WHIPC
ocurre a una velocidad especifica de 0.12 h−1 y un consumo de glucosa de 0.01 g g de peso
celular seco (DCW)−1 h−1. En contraste, el crecimiento en medio mínimo M9 suplementado
con 2.5 g/L de glucosa y 1mM de IPTG de la mutante WHIPC portadora del plásmido pSRK-
gluP mejoró claramente, mostrando una velocidad específica de crecimiento de 0.34 h−1 y un
consumo de glucosa máximo de glucosa de 0.1 g gDCW−1 h−1(Fig. 14c), el cual es diez veces
mayor que el de la mutante WHIPC. Se realizaron sin éxito diversos intentos por cultivar la
cepa WHIPC que porta el vector vacío pSRK-Km en medio líquido M9 con glucosa y
kanamicina, sin embargo, dicha cepa no fue capaz de crecer. Lo cual sugiere que el vector por
sí mismo representa una carga genética que impide el crecimiento. En conjunto estos
resultados confirman que la proteína GluP de A. vinelandii, es un transportador de glucosa
funcional.
6.1.5 La expresión de gluP se encuentra bajo el control de los sistemas
CbrA/CbrB y Crc-Hfq
En apartados anteriores observamos que en A. vinelandii el catabolismo de glucosa está
impedido mientras haya acetato presente en el medio, así que nuestra hipótesis fue que la
expresión de GluP (el transportador de glucosa) podría estar reprimida en condiciones de
una fuerte represióncatabólica, por ejemplo en presencia de acetato. Por esta razón
decidimos evaluar la expresión del mRNA de gluP mediante qRT PCR.
La cuantificación de los niveles de mRNA de gluP en la cepa parental AEalgD en medio
con acetato y glucosa, mostró que a las 10 h de cultivo (durante el consumo de acetato,
fuerte represión catabólica), la expresión del mRNA de gluP fue baja. Por el contrario a las
30 h (durante el consumo de glucosa, baja represión catabólica), la expresión de gluP
aumentó alrededor de 19 veces (Fig. 15a). Por otra parte, en la cepa AH1 (mutante en
cbrA), los niveles de gluP se mantuvieron bajos a través de a curva de crecimiento en
Resultados y Discusión
65
comparación con la cepa parental AEalgD (Fig. 15a). Este resultado, nos indica que la HK
CbrA es necesaria para la expresión de gluP.
Figura 15. La expresión de gluP está bajo el control de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq. (a). Niveles
del mRNA de gluP determinados mediante qRT-PCR de la cepa silvestre (barras blancas) y mutante cbrA
(barras grises) durante el crecimiento diauxico acetato-glucosa. (b) Niveles de expresión relativa del mRNA
de gluP cuantificados mediante qRT-PCR de la cepa AEIV que porta el vector pSRK-crc durante fase
exponencial (10 h) o estacionaria (16 h), en ausencia (columnas blancas) o en presencia (columnas grises) de
1mM de IPTG. La diferencia significativa fue analizada mediante t-test. La diferencia significativa se
encuentra indicada (*p< 0.05 o ***p< 0.001).
Posteriormente investigamos si la inhibición del crecimiento en glucosa como única fuente
de carbono de la cepa que sobre-expresa Crc podría estar asociada con la disminución en la
expresión de gluP, para lo cual también cuantificamos los niveles del mRNA de gluP
mediante qPCR, durante las fases de crecimiento exponencial y estacionaria (6 y 10 horas).
Encontramos que durante la fase exponencial de crecimiento (6 h), los niveles del mRNA
de gluP se redujeron alrededor de 20% en la cepa que sobre-expresa Crc (Fig. 15b,),
mientras que durante la fase estacionaria la disminución del mensajero de gluP fue aún más
evidente en la cepa que sobre-expresa Crc, donde se redujo alrededor de un 60% (Fig. 15b).
Estos resultados confirman que la proteína Crc posee una efecto negativo sobre la cantidad
a
Tiempo (h) Tiempo (h)
Ex
pr
es
ió
n
re
la
tiv
a
gl
uP
Ex
pr
es
ió
n
re
la
tiv
a
gl
uP
a
a
b
Resultados y Discusión
66
del transcrito de gluP (Fig. 15b). En conjunto estos resultados sugieren que durante
condiciones de fuerte represión catabólica gluP podría ser un blanco directo del sistema
Crc-Hfq, por lo cual decidimos evaluar esta posibilidad.
6.1.6. Los mRNAs de gluP y eda-1 son blanco directo del sistema Crc-Hfq
Como he había mencionado en la sección de antecedentes, un análisis in silico permitió
identificar diversos genes relacionados con el metabolismo de glucosa en A. vinelandii, los
cuales poseen un sito CA cercano al inicio de traducción, entre ellos gluP (transportador de
glucosa), y eda-1. El gen eda-1 codifica la enzima KDPG-aldolasa de la vía Entner-
Doudoroff, por la cual A. vinelandii es capaz de metabolizar la glucosa, por esta razón, nos
pareció importante evaluar si este gen pudiera ser blanco directo de las proteínas Crc-Hfq.
Para comprobar que el mRNA de estos genes fuera blanco directo de las proteínas Crc y
Hfq se realizaron ensayos de retardo de movilidad electroforética (EMSAs), para lo cual se
sintetizaron oligonucleótidos de RNA (para ambos genes) que contuvieran el posible sitio
de unión a Hfq rico en adeninas (Fig. 16e), además de que se expresaron y purificaron las
proteínas Crc y Hfq de A. vinelandii. Consistente con los resultados previos, la proteína
Crc de A. vinelandii por sí misma fue incapaz de unirse al ribonucleótido de gluP (Fig. 16
a, b y c) o al de eda-1 (16c), mientras que la proteína Hfq, sí puede unirse a ambos
ribonucleótidos formando un complejo inestable que se va disociando durante la
electroforesis (Fig. 16a y c). Sin embargo, cuando Crc y Hfq están presentes, se forma un
estable complejo ribonucleoproteico con ambos ribonucleótidos (Fig. 16a y c).
Adicionalmente, se realizó un ensayo de titulación usando el ribonucleótido de gluP con el
fin de conocer la concentración aproximada de Hfq y Crc necesaria para formar un
complejo estable que retuviera todo el RNA libre. Pudimos observar que se requiere
aproximadamente cantidades equimolares de las proteínas Crc y Hfq (considerando a Hfq
como hexámero) (Fig. 16b), ya que a esta concentración (1µM de cada proteína), se ha
retardado todo el RNA libre. Podemos concluir que este complejo se forma específicamente
cuando las proteínas Hfq y Crc se unen al sitio rico en adeninas, ya que durante el ensayo
con el ribonucleótido control carente del sitio CA (Fig. 16d) no se observó la formación del
complejo, incluso en presencia de ambas proteínas. En conjunto estos resultados nos
Resultados y Discusión
67
indican que las proteínas Crc y Hfq son capaces de formar un complejo con el sitio CA que
se encuentra tanto el mRNA de gluP como el de eda-1.
Figura 16. Las proteínas Crc y Hfq son capaces de formar un complejo ribonucleoproteíco con el sitio
CA presente en el líder del mRNA de gluP y eda-1. (a) unión de las proteínas Crc y Hfq al ribonucleótido
de RNA que contiene el CA presente en el líder del mRNA de gluP. (b). Rango de molaridad de las proteínas
Crc y Hfq de A. vinelandii necesario para formar un complejo ribonucleoprotéico con el ribonucleótido de
RNA que contiene el CA presente en el líder del mRNA de gluP. (c). unión de las proteínas Crc y Hfq al
16
Figure S6. Hfq-Crc proteins form a complex with the eda-1 RNA A-rich Hfq-binding
motif. Binding of Hfq and Crc proteins from A. vinelandii (Av) (a), or from P. putida (pp)
(b), to an RNA oligonucleotide containing the A-rich motif present at the translation
initiation regions from eda-1 gene (Avin 27250). RNA and protein-RNA complexes were
resolved in a non-denaturing polyacrilamide gel. The concentration of Crc (expressed as
monomers) and Hfq (expressed as hexamers) is indicated. Arrows point to the position of
free RNA and of the ribonucleoprotein complex (RNP). (c) Sequence corresponding to the
eda-1 mRNA leader region. The underlined sequence corresponds to the RNA
oligonucleotide used in the band-shift assays, which contains the A-rich motif. The AUG
translation initiation codon is in bold face.
-!
-!
-!
+!
+!
-!
+!
+!
RNA!
1 μM Hfq (Pp)!
2 μM Crc (Pp)!
RNP
complex!
b
a
-!
-!
-!
+
+
-!
+
+
0.5 μM Hfq (Av)!
1 μM Crc (Av) !
RNP
complex!
RNA!
c
eda-1 (Avin 27250)!
5`-UGAACAGCAUCCAGAACAACAAACCGGCCACUUC
CCAGAGCGUGCCGAGCAUGGCCGACAAGGUCGCCC
gluP (Avin 04150)
5´-GGCAGGGGCCUCUCCUUGAAGCAACAAUCACAACAAGAGGAAAUGCACGAUGACGACGGUA
eda-1 (Avin 27250)
5´-UGAACAGCAUCCAGAACAACAAACCGGCCACUUCCCAGAGCGUGCCGAGCAUG
DmpR 6C mutant (control negativo)
5´- UUCCCCAUCUCCCCAUCCAUAGGGGC
a b
c d
e
Complejo
RNP
Complejo
RNP
Complejo
RNP
Resultados y Discusión
68
ribonucleótido de RNA que contiene el CA presente en el líder del mRNA de eda-1. (d). Ribonucléotido
carente del sitio CA utilizado como control negativo. (e). Secuencia de la región líder de gluP y eda-1, la
secuencia subrayada corresponde al los oligonucleótidos de RNA sintetizados para los ensayos de retardo, los
cuales contienen el sitio rico en adeninas. El codón de inicio de traducción (AUG) se indica en negritas. La
secuencia del oligonucleótido usado como control negativo también se indica en el panel (e). El RNA y los
complejos RNA-proteína, fueron resueltos en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. La posición del
RNA libre y los de los complejos ribonucleoprotéico (RPN) están indicados
6.1.7. Las proteínas Crc y Hfq de P. putida reconoceal mRNA de gluP y eda-1
de A. vinelandii
Debido al alto grado de conservación entre las proteínas Crc y Hfq de A. vinelandii y P.
putida, exploramos si estas son intercambiables funcionalmente tanto in vitro como in vivo
utilizando como gen blanco a gluP. Así mismo, esto nos ayudaría a establecer si,
efectivamente, gluP in vivo es blanco directo de regulación por estas proteínas, ya que,
como se recordará no pudimos generar mutantes crc en A. vinelandii. Con este propósito
exploramos la posibilidad que las proteínas Crc y Hfq de P. putida pudieran formar un
complejo ribonucleoproteíco in vitro con los oligonucleótidos de RNA marcados, tanto de
gluP como de eda-1. Los ensayos tipo EMSA mostraron que las proteínas Crc o Hfq de P.
putida por sí solas son incapaces de unirse al sitio CA del mRNA de gluP (Fig. 17a) o de
eda-1 (Fig. 17b), sin embargo, cuando ambas están presentes se forma un complejo estable.
Este resultado implica que in vitro las proteínas Crc y Hfq de P. putida son capaces de
unirse a los sitios CA presente en los mRNA de gluP y de eda-1 para formar un complejo
estable.
Resultados y Discusión
69
Figura 17. Las proteínas Hfq y Crc de P. putida son capaces de formar un complejo ribonucleoprotéico
con los sitios CA presentes en los ribonucleótidos de gluP y eda-1. (a) Unión de las proteínas Crc y Hfq de
P. putida al ribonucleótido gluP de A. vinelandii. (b) Unión de las proteínas Crc y Hfq de P. putida al
ribonucleótido eda-1 de A. vinelandii. El RNA y los complejos RNA-proteína, fueron resueltos en un gel de
poliacrilamida no desnaturalizante. La posición del RNA libre y los de los complejos ribonucleoprotéico
(RNP) están indicados
6.1.8 La proteína Crc de P. putida impide la traducción del mRNA de gluP
Una vez que comprobamos que el sistema Crc-Hfq de P. putida y A. vinelandii son
intercambiables in vitro, quisimos analizar el efecto de la proteína Crc de P. putida sobre la
traducción de gluP. Para este fin se construyó una fusión traduccional del líder de gluP
(incluido el sitio CA) en fase con el gen reportero lacZ, posteriormente dicho fragmento se
clonó en el plásmido pSEVA424 (Silva-Rocha et al., 2013), bajo la expresión del promotor
heterólogo Ptrc, el cual es inducible con IPTG. Este plásmido (llamado p pEQ424P), fue
introducido en las cepas de P. putida KT2440 y KTCRC (derivada de la KT2240 que porta
la mutación crc::Tc). La actividad de ß-galactosidasa fue cuantificada en células cultivadas
en medio rico (LB), en el cual se ha observado una fuerte represión catabólica. Dicha
actividad enzimática no se dectectó en ausencia del inductor (IPTG) en el medio de cultivo,
sin embargo esta aumentó considerablemente en presencia de 0.5 mM de IPTG (Fig. 18b).
Interesantemente, en presencia de IPTG, durante la fase exponencial media la actividad de
ß-galactosidasa en la mutante crc fue alrededor de 6 veces mayor en comparación con la
cepa silvestre. (Fig. 18c). Colectivamente estos resultados indican que las proteínas Crc y
16
Figure S6. Hfq-Crc proteins form a complex with the eda-1 RNA A-rich Hfq-binding
motif. Binding of Hfq and Crc proteins from A. vinelandii (Av) (a), or from P. putida (pp)
(b), to an RNA oligonucleotide containing the A-rich motif present at the translation
initiation regions from eda-1 gene (Avin 27250). RNA and protein-RNA complexes were
resolved in a non-denaturing polyacrilamide gel. The concentration of Crc (expressed as
monomers) and Hfq (expressed as hexamers) is indicated. Arrows point to the position of
free RNA and of the ribonucleoprotein complex (RNP). (c) Sequence corresponding to the
eda-1 mRNA leader region. The underlined sequence corresponds to the RNA
oligonucleotide used in the band-shift assays, which contains the A-rich motif. The AUG
translation initiation codon is in bold face.
-!
-!
-!
+!
+!
-!
+!
+!
RNA!
1 μM Hfq (Pp)!
2 μM Crc (Pp)!
RNP
complex!
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+
+
0.5 μM Hfq (Av)!
1 μM Crc (Av) !
RNP
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c
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5`-UGAACAGCAUCCAGAACAACAAACCGGCCACUUC
CCAGAGCGUGCCGAGCAUGGCCGACAAGGUCGCCC
a b
Complejo
RNP
Complejo
RNP
Resultados y Discusión
70
Hfq de P. putida son capaces de reconocer el sitio CA presente en el mRNA de gluP,
reduciendo su traducción.
Figura 18. Efecto de la proteína Crc en la expresión de la fusión traduccional gluP´-lacZ en P. putida.
Las cepas usadas fueron: la KT2440 (silvestre) y KTCRC (crc::Tet), ambas portando el plásmido gluP ́-lacZ.
Las cepas fueron cultivadas en medio rico y cuando se indica la expresión de gluP ́-lacZ fue inducida
mediante la adición de 0.5 mM de IPTG. (a) Cinética de crecimiento (cuantificada mediante Densidad Óptica
a 600 nm) de cada cepa. (b) Actividad de ß- galactosidasa en función del crecimiento celular (c) Valores de
actividad de ß-galactosidasa de la fusión traduccional de gluP en las cepas0KT2440 y KTCRC observadas a
una D.O. de 0.6 (fase exponencial media). La diferencia significativa fue analizada mediante t-test. y se
encuentra indicada (**p< 0.01).
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Crecimiento (A600)
ß-
G
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(U
M
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)
Resultados y Discusión
71
6.2 DISCUSIÓN
En este estudio reportamos que los sistemas de regulación CbrA/CbrB y Crc-Hfq controlan
el mecanismo de represión catabólica por carbono, específicamente la represión del
consumo de glucosa, bajo condiciones diazotróficas. Similar a lo reportado en el género
Pseudomonas, encontramos que el TCS CbrA/CbrB encabeza la cascada de regulación que
controla la represión catabólica por carbono, ya que la mutación en cbrA disminuye la
expresión de los sRNAs CrcZ y CrcY alrededor de cuatro veces (Fig. 10). Sin embargo, la
baja expresión de los sRNAs que aun está presente en la mutante cbrA podría deberse a una
fosforilación inespecífica del RR CbrB, pero también pudiera deberse a la existencia de
otro promotor independiente a CbrA/CbrB, el cual estaría dirigiendo la expresión basal de
crcZ y crcY en ausencia de cbrA. A este respecto cabe mencionar que se encontraron
secuencias consenso de un posible promotor σ70 en la región reguladora de ambos genes
(Fig. 8a y 9a), pero no se evaluó su funcionalidad ni su relevancia fisiológica.
Los ensayos tipo EMSA demostraron que CrcZ de A. vinelandii tiene la capacidad de
formar un complejo estable con las proteínas Crc y Hfq. Hfq fue capaz de reconocer los
sitios ricos en adeninas presentes en CrcZ, pero la presencia de Crc fue capaz de estabilizar
el complejo, además de modificar el patrón de migración del complejo Hfq-CrcZ (Fig. 11).
Este resultado indica que, efectivamente, CrcZ (y posiblemente CrcY) son capaces de
antagonizar la actividad represora de las proteínas Crc-Hfq sobre sus genes blanco.
Se encontró que la HK CbrA es necesaria para la asimilación de glucosa, ya sea como única
fuente de carbono o en una mezcla con acetato (Fig. 12), este fenotipo fue atribuido a la
baja expresión de los sRNAs en el fondo mutante cbrA, lo cual implica una mayor actividad
de Crc-Hfq, que se traduce como una fuerte represión catabólica sobre diversos genes, en
este caso los de metabolismo de glucosa. En efecto, cuando se realizó una sobre-expresión
de la proteína Crc bajo un promotor inducible en el fondo de la cepa AEIV de A. vinelandii,
el crecimiento de esta cepa se arrestó durante la fase exponencial media, cuando ésta fue
cultivada en presencia de glucosa (Fig. 13). Este resultado sugiere fuertemente que Crc es
capaz de reprimir el metabolismo de glucosa.
Por otra parte, encontramos que A. vinelandii asimila glucosa a través de un transportador
llamado GluP, una proteína ausente en la mayoría de las especies de Pseudomonas. GluP
Resultados y Discusión
72
fue esencial para el consumo de glucosaen A. vinelandii, además de que su expresión
heteróloga en una cepa mutante de E. coli (carente de los principales sistemas de transporte
de glucosa), fue capaz de restaurar el crecimiento en glucosa (Fig. 14). la presencia de este
transportador en A. vinelandii en lugar del transportador de tipo ABC GtsABC
comúnmente encontrado en la mayoría de las Pseudomonas resulta muy interesante. La
presencia de este tipo de transportador en A. vinelandii puede responder a las características
fisiológicas y metabólicas de esta bacteria. En condiciones de fijación de nitrógeno, A.
vinelandii presenta una de las tasas de respiración mas altas, ya que necesita proteger a la
nitrogenasa de la inactivación por el oxígeno (Kennedy et al., 2005; Oelze, 2000; Setubal et
al., 2009). De esta manera, la fuerza protón motriz generada por la gran actividad de la
cadena respiratoria podría explicar la presencia en A. vinelandii de un transportador de
glucosa dependiente de H+ y no de un transportador tipo ABC.
Aunque se sabe que el sistema Crc-Hfq ejerce una regulación post-transcripcional, se ha
reportado que también existe un efecto en la abundancia de los transcritos de sus genes
blanco, presumiblemente debido a un efecto en la estabilidad los mRNA (Sonnleitner et al.,
2014). De tal forma que, también podemos observar esta disminución en la cuantificación
del mRNA de gluP, ya que a pesar que los niveles de gluP aumentan aproximadamente 19
veces durante la asimilación de glucosa, éstos se reducen en la cepa que sobre-expresa Crc,
o en la cepa mutante cbrA, sugiriendo que gluP es uno de los blancos de la Crc-Hfq durante
la CCR (Fig. 15). En efecto, comprobamos que las proteínas Crc y Hfq tanto de A.
vinelandii como las de P. putida son capaces de formar un complejo ribonucleoprotéico con
el sitio CA presente en la región líder tanto de gluP como de eda-1 (Fig. 16 y 17). Además
de que la traducción de la fusión gluP´-lacZ en las cepas de P. putida se inhibió de manera
dependiente de Crc (Fig.18). Estos resultados indican que debido a su alto porcentaje de
identidad, las proteínas Crc y Hfq de A. vinelandii y P. putida son funcionalmente
intercambiables.
La presencia de posibles sitios CA en diversos genes del catabolismo de glucosa (Tabla 1),
se debe a una estrategia de represión catabólica que actúa a diferentes niveles descrita
previamente en P. putida (Hernández-Arranz et al., 2013), gracias a este tipo de regulación
el sistema Crc-Hfq es capaz de responder rápidamente a los cambios medioambientales,
ajustando de manera simultánea la expresión de genes que codifican transportadores,
Resultados y Discusión
73
activadores transcripcionales y enzimas de la vía, evitando la asimilación de la fuente de
carbono no preferida.
La mutante cbrA::mTn5 (AH1), fue capaz de crecer en sacarosa como única fuente de
carbono. Sin embargo, el crecimiento en este carbohidrato, se vio disminuido alrededor de
tres veces en comparación con la cepa parental (Fig. 12a). Este efecto podría deberse a que
las proteínas Crc-Hfq son capaces de impedir la traducción de genes involucrados en el
metabolismo de glucosa (por ejemplo eda-1), además de que un análisis in silico de la
región líder de lacY (Avin51800, el cual codifica la sacarosa permeasa), permitió identificar
un posible sitio CA (AAAAACA). En apoyo a esta hipótesis la cepa que sobre-expresa Crc
también mostró una disminución en el crecimiento de por lo menos dos veces en
comparación con la cepa sin inducir (Fig. 13), lo cual sugiere que los genes involucrados en
el transporte y metabolismo de sacarosa también se encuentran bajo el control del sistema
Crc-Hfq, pero que al mismo tiempo no son blanco de una represión tan fuerte como la que
se presenta en el caso del catabolismo de glucosa.
Para finalizar esta parte de nuestra investigación, podemos decir que presentamos evidencia
concluyente de que el transporte de glucosa en A. vinelandii ocurre a través del
transportador de glucosa GluP. También encontramos que la expresión de gluP es
controlada por los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq (Fig. 26). De hecho demostramos que
durante el crecimiento diazotrófico en condiciones de laboratorio los sistemas CbrA/CbrB y
Crc-Hfq de A. vinelandii operan de manera similar con respecto a lo reportado en
Pseudomonas spp. Este hallazgo refuerza la importancia de estos sistemas de regulación del
metabolismo en los miembros de la familia Pseudomonadaceae. Vale la pena mencionar
que esta es la primera caracterización reportada de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq en el
proceso de CCR, fuera del género Pseudomonas.
Resultados y Discusión
74
6.3 Efecto del sistema CbrA/CbrB sobre la síntesis de alginato en A.
vinelandii
6.3.1 Efecto de CbrA sobre la expresión de los genes de la biosíntesis de
alginato
En el apartado anterior se caracterizó el papel del TCS CbrA/CbrB sobre la asimilación de
fuentes de carbono en A. vinelandii. Sin embargo, es importante recordar que la mutante
cbrA::mTn5 (GG15) se identificó gracias a su fenotipo sobre-productor de alginato. Por
esta razón, en esta parte del trabajo nos enfocamos en investigar el mecanismo por el cual
este sistema regula la producción de alginato. Específicamente el efecto de este TCS sobre
la expresión de algD, debido a que, al ser el principal gen de la biosíntesis es un punto
importante donde convergen varios sistemas de regulación.
Resultados de trabajos anteriores, que iniciaron la caracterización de este sistema en la
producción de alginato, nos indicaron que el TCS CbrA/CbrB, regula negativamente la
síntesis del polímero. Como un primer acercamiento, nos dimos a la tarea de confirmar los
fenotipos de las mutantes en el sistema CbrA/CbrB sobre al síntesis de alginato. Como era
de esperarse, la mutación sitio dirigida en gen cbrA presentó el mismo fenotipo
hipermucoide que la cbrA::mTn5 (5170 μg de alginato por mg de proteína). Por otra parte,
la complementación con una copia silvestre del gen cbrA (cepa JS05) logró restablecer los
niveles silvestres de producción de alginato (Fig. 19a) Aunado a esto, la mutación en el
regulador de respuesta cbrB (cepa llamada CFB03), también aumentó la producción
específica del alginato, y como era de esperarse, en una proporción dos veces mayor que la
mutante en la HK CbrA (Fig.19a).
Cuando se realizó una cinética de crecimiento de las cepas AEIV, GG15, CFB03 y JS05 en
medio líquido Burk sacarosa (Fig. 19b), observamos que la mutante cbrB::Sp (CFB03)
mostró un retraso en el crecimiento durante la fase exponencial y alcanzó una menor
concentración de proteína total, en comparación con la cepa silvestre AEIV. Esto no
sucedió con la cepa cbrA::mTn5 (GG15), la cual mostró un crecimiento parecido al de la
cepa silvestre. Este resultado indica que la ausencia del RR CbrB es deletérea para el
Resultados y Discusión
75
crecimiento celular, por los menos en nuestras condiciones de laboratorio. Por esta razón
continuamos el análisis del papel del TCS CbrA/CbrB mediante la caracterización de la
mutante cbrA.
Como ya se mencionó anteriormente, en conjunto, estos resultados indican que el TCS
CbrA/CbrB es un regulador negativo de la producción de alginato. En este punto nos
preguntamos si el aumento en la síntesis de este polímero podría deberse a que en ausencia
de este TCS, se aumentara la expresión de los genes de la vía biosintética del alginato, por
lo cual, nuestra primera estrategia fue evaluar la expresión de estos genes.
Figura 19. Producción de alginato y cinética de crecimiento de diferentes cepas de A. vinelandii. (a)
Producción específica de alginato de las cepas silvestre AEIV y las mutantes GG15 (cbrA::mTn5), JS05
(cbrA::mTn5/ cbrA+), CFB03 (cbrB::Sp) y AErpoS (rpoS::Sp), crecidas en medio líquido Burk sacarosa
durante 48 h. La diferencia significativa fue analizada mediante t-test. y se encuentraindicada (***p< 0.001).
(b). Cinética de crecimiento de diversas cepas de A. vinelandii en medio mínimo Burk sacarosa. Las barras de
error indican la desviación estándar del promedio de tres ensayos independientes.
Para investigar la posibilidad antes mencionada, se realizaron ensayos de qRT-PCR para
cuantificar los niveles del los mRNAs de los genes algD, alg8 y algC. Se eligieron estos
genes por varias razones: algD, es el principal gen de la vía de la biosíntesis de alginato, ya
que codifica la enzima que cataliza el paso irreversible de la reacción (GMD), por lo cual
su expresión está finamente regulada. Por otra parte alg8 encabeza el operón alg8-44-K-J y
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Resultados y Discusión
76
algC al codificar una enzima bifuncional de la vía (PMM) también está altamente regulado.
Como se muestra en la Fig. 20a los niveles del mRNA de alg8 aumentaron
aproximadamente tres veces en la mutante cbrA::miniTn5, pero los niveles de los
transcritos de algD y algC, solo aumentaron aproximadamente dos veces en comparación
con la cepa silvestre; como era de esperarse en la cepa complementada JS05, la expresión
de los mRNA de los genes alg se restablecieron a niveles silvestres (Fig 20a).
Figura 20. Efecto de la HK CbrA en la expresión de los genes de la vía de la biosíntesis de alginato. (a).
qRT-PCR para cuantificar los niveles de mRNA de los genes algD, algC y alg8 en las cepas AEIV (barras
blancas), mutante GG15 (barras grises) y complementada JS05 (barras negras). El RNA total fue extraído de
células con 24 h de crecimiento (b) Cuantificación de los niveles de transcripción de algD, medidos como
actividad de ß- glucuronidasa en las cepas silvestre (barras blancas) y en la cepa mutante cbrA (barras grises),
las cuales portan la fusión transcripcional algD-gusA. (c). Cuantificación de los niveles de traducción de
algD, medidos como actividad de ß-glucuronidasa en las cepas silvestre (barras blancas) y en la cepa mutante
cbrA (barras grises), las cuales portan la fusión traduccional algD- ́gusA. Las cepas fueron cultivadas en
medio Burk-sacarosa, se tomaron alícuotas en los tiempos indicados La diferencia significativa fue analizada
mediante t-test. y se encuentra indicada (*p<0.05, **p<0.01 ó ***p< 0.001)
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Resultados y Discusión
77
El pequeño incremento en la expresión de algD en el fondo de la mutante cbrA fue algo
inesperado, debido a que comúnmente la sobreproducción de alginato está asociada a altos
niveles de expresión del gen algD (el principal gen de la vía de la biosíntesis) (Ahumada-
Manuel et al., 2017; Núñez et al., 2000a; Núñez et al., 2013). Por esta razón, decidimos
investigar la expresión del gen algD mediante el uso de una fusión transcripcional (algD-
gusA) y otra traduccional (algD-´gusA) de la región reguladora de algD con el gen
reportero gusA, que codifica para la enzima ß-glucuronidasa (García-Aguilar, 2016), Estas
fusiones fueron integradas en el cromosoma de la cepa silvestre AEIV y su derivada
mutante en cbrA. Como podemos observar en la Fig. 20b, la transcripción del algD en la
cepa mutante cbrA mostró un pequeño aumento, de tan solo 0.7 veces, en comparación con
la cepa silvestre. Por otra parte, la actividad de la fusión traduccional del algD en el fondo
de la cepa mutante cbrA aumentó a lo largo de la curva de crecimiento, sin embargo,
durante la fase exponencial de crecimiento (12 h), este incremento fue de alrededor de
cinco veces en comparación con la cepa AEIV (Fig. 20c). En conjunto, estos resultados
indican que la HK CbrA afecta negativamente la transcripción de alg8 y algC, además de la
expresión de algD principalmente a nivel traduccional.
6.3.2 El efecto del TCS CbrA/CbrB sobre la síntesis de alginato es a través de
regular la expresión de RsmA
Estudios previos han demostrado que en A. vinelandii, la proteína RsmA es capaz de unirse
al mRNA de algD probalemente impidiendo su traducción (Manzo et al., 2011). Por otra
parte, también se ha reportado que la actividad de RsmA es antagonizada por la acción de
las familias de sRNAs RsmZ y RsmY, los cuales son activados directamente por el sistema
de dos componentes GacS/GacA (Hernández-Eligio et al., 2012). Debido a que
encontramos que en el fondo de la mutante cbrA, la expresión de algD se encuentra
aumentada principalmente a nivel traduccional, nos preguntamos si este aumento podría
deberse a una disminución en la expresión de la proteína RsmA. Para evaluar el efecto del
TCS CbrA/CbrB sobre la expresión del gen rsmA, se cuantificaron mediante qRT-PCR los
Resultados y Discusión
78
niveles del mRNA de rsmA en células de las mutantes cbrA y cbrB, crecidas durante 24 h
en medio Burk sacarosa. Como se observa en la Fig. 21a los niveles del mRNA de rsmA
disminuyeron tanto en la mutante cbrA, como en la mutante cbrB, sin embargo esta
disminución fue aun más marcada en el fondo de la mutante cbrB, en la cual los niveles del
mRNA de rsmA disminuyeron aproximadamente un 70% con respecto a la cepa parental
AEIV. Este resultado es consistente con la alta producción de alginato de la mutante cbrB
(Fig. 19a).
Figura 21. Análisis de la expresión de rsmA en diferentes cepas. (a) Análisis qRT-PCR para determinar los
niveles de mRNA de rsmA en las cepas AEIV (silvestre) (barra blanca), y en las mutantes cbrA (barra gris),
cbrB (barra negra) y rpoS (barra rayada). El RNA total fue extraído de células con 24 horas de crecimiento en
medio Burk-sacarosa. La diferencia significativa fue analizada mediante t-test. y se encuentra indicada (***p<
0.001). (b) Niveles transcripcionales del promotor de rsmZ2, cuantificados como actividad de ß-glucuronidasa
en las cepas AEIV (barras blancas) y en las mutantes cbrA (barras grises) y AEgacA (mutante gacA) (barras
negras), las cuales portan la fusión transcripcional rsmZ2-gusA.
Adicionalmente,evaluamos la actividad del sistema GacS/GacA, ya que una mayor
actividad de este TCS afectaría negativamente la actividad de rsmA. La estrategia empleada
fue evaluar la actividad del TCS GacS/GacA mediante la cuantificación de la expresión de
rsmZ2, el cual se encuentra bajo el control directo de GacA (Hernández-Eligio et al., 2012;
Manzo et al., 2011). Con este propósito generamos una fusión transcripcional del promotor
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Resultados y Discusión
79
de rsmZ2 con el gen reportero gusA (prsmZ2-gusA), la cual fue introducida en los fondos
silvestre y mutante cbrA. La cuantificación de la actividad de ß-glucuronidasa en dichas
cepas no mostró cambios significativos en la actividad del promotor de rsmZ2 (Fig. 21b), a
excepción de la cepa mutante gacA (usada como control negativo), ya que como era de
esperarse, la expresión de rsmZ2, se abatió por completo. Este resultado indica que la
mutación en cbrA afecta positivamente la expresión de rsmA de una manera independiente
al sistema Gac/Rsm.
6.3.3 La transcripción del gen rsmA se inicia a partir de un promotor RpoS.
Debido a que encontramos que el TCS CbrA/CbrB fue necesario para una optima expresión
de rsmA, aunado a que CbrB es un activador transcripcional de promotores dependientes de
RpoN, pensamos en la posibilidad de que CbrB directamente fuera capaz de activar. Sin
embrago, el análisis in silico del promotor de rsmA no mostró secuencias consenso que
coincidieran con las regiones -12 y -24 típicas de un promotor σ54.
Paralelamente en nuestro laboratorio, mientras se investigaba la regulación de la expresión
de RpoS (Miguel Cocotl-Yañez, datos no publicados), se realizó un análisis de extensión
del iniciador del gen rsmA, usando RNA total extraído de la cepa ATCC de A. vinelandii,
donde se identificó un inicio de la transcripción a 83 nt rio arriba del codón de inicio de la
traducción (Fig. 22a). El análisis de la región permitió identificar una secuencia consenso
en la región -10 (CAATACT) para un posible promotor dependiente de RpoS (Hengge-
Aronis, 2002; Weber et al., 2008) (Fig. 22b). Por está razón se realizó un ensayo de
extensión del iniciador usando RNA extraído de la cepa mutante en rpoS, como se observa
en la Fig. 22a, el sitio de inicio de transcripción detectado en la cepa silvestre no se observa
en la mutante rpoS. Adicionalmente ensayos de qRT-PCR usando RNA total extraído de la
cepa AErpoS (rpoS::Sp) mostraron que la expresión de rsmA se disminuyó alrededor de un
40% en comparación con la cepa silvestre (Fig. 21a). �En conjunto, estos resultados indican
que en nuestras condiciones de cultivo rsmA se expresa a partir de un promotor dependiente
de RpoS. Por el contario, y como se mencionó anteriormente, no se lograron detectar
promotores dependientes de RpoN en la región reguladora de rsmA, por lo que
especulamos que el efecto positivo que el TCS CbrA/CbrB posee en la expresión de rsmA
Resultados y Discusión
80
podría deberse en parte, a una regulación indirecta al afectar negativamente la expresión de
RpoS. Por lo que enseguida decidimos explorar esta posibilidad.
Figura 22. La transcripción de rsmA es a partir de un promotor dependiente de RpoS. (a). Análisis de
extensión del iniciador del gen rsmA usando RNA toral extraído de las cepas silvestre ATCC y de su derivada
mutante rpoS (ATrpoS), crecidas en medio Burk sacarosa durante 20 h. (b). Secuencia de DNA de la región
reguladora de rsmA. El codón de inicio de la traducción (ATG), está señalado en negritas. El sitio de inicio de
la transcripción está indicado con una flecha. La secuencia usada en el diseño del primer se encuentra
subrayada.
6.3.4 El TCS CbrA/CbrB regula positivamente la expresión de RpoS
Como primera estrategia para investigar el posible efecto del TCS CbrA/CbrB en la
expresión de rpoS, se cuantificaron los niveles de mRNA de rpoS mediante qRT-PCR en
las cepas silvestre AEIV y mutantes cbrA y cbrB, usando RNA extraído de cepas crecidas
en medio mínimo BS durante 24 h. Como podemos observar en la Fig. 23a, la expresión de
Figure 4 Click here to download Figure Fig 4.tiff
Figure 4 Click here to download Figure Fig 4.tiff
a
b
Resultados y Discusión
81
rpoS se encuentra disminuía en las cepas mutantes cbrA y cbrB aproximadamente entre un
40 y un 80% respectivamente, en comparación con la cepa silvestre. Aunado a este
resultado, un análisis Western blot usando anticuerpos dirigidos contra la proteína RpoS de
A. vinelandii, en cepas que también fueron cultivadas en BS durante 24 h, mostró que los
niveles de este factor sigma disminuyeron alrededor de un 30% en la mutante cbrA, con
respecto a la cepa AEIV (Fig. 23b), mientras que en la cepa complementada JS05, se
restauraron los niveles silvestres de la proteína RpoS. El cambio en la acumulación de
RpoS fue aun más marcado en la cepa mutante cbrB, ya que esta mutante mostró una
disminución de aproximadamente 70%, lo cual concuerda con los resultados obtenidos
mediante qPCR (Fig. 23a). En conjunto estos resultados indican que el TCS CbrA/CbrB
ejercen un efecto positivo en la expresión del factor sigma alternativo RpoS.
Figura 23. Influencia del TCS CbrA/CbrB en la expresión de RpoS. (a) qRT-PCR para determinar los
niveles del mRNA de rpoS en la cepas AEIV (silvestre) (barra blanca), mutante cbrA (barra gris) y mutante
cbrB (barra negra). (b) Western blot para detectar los niveles de RpoS en las cepas AEIV (silvestre),
complementada JS05 (cbrA/cbrA+), AErpoS (mutante rpoS), GG15 (cbrA) y CFB03 (cbrB). Los extractos de
proteína (100 μg) fueron obtenidos de células cultivadas en Burk-sacarosa durante 24h. Se utilizó la cepa
AErpoS como control negativo. Los niveles de RpoS (*RpoS) de cada cepa fueron calculados mediante
densitometría usando el software ImageJ, los valores se encuentran indicados bajo la imagen.
Cabe resaltar que muy probablemente RpoS no sea el único intermediario de esta vía.
Aunque ya se ha reportado un aumento de producción de alginato de la cepa mutante en
rpoS (AErpoS), en comparación con la cepa silvestre AEIV (Fig. 19a) (Cocotl-Yañez et al.,
Figure 5 Click here to download Figure Fig 5.tiff
Figure 5 Click here to download Figure Fig 5.tiff
aa b
Ex
pr
es
ió
n
re
la
tiv
a
rp
oS
Resultados y Discusión
82
2011), este aumento no fue tan alto al compararlo con el de las cepas mutantes en cbrA o
cbrB, lo cual indica la existencia de alguna otra vía por la cual el TCS CbrA/CbrB regula
negativamente la síntesis de alginato.
6.3.5 Las mutantes cbrA y cbrB son incapaces de acumular PHB
En este punto es importante recordar que hemos logrado establecer que el TCS CbrA/CbrB
encabeza la cascada de CCR. Este TCS es el activador de los sRNAs que antagonizan la
actividad de las proteínas Crc-Hfq, quienes son las principales represoras de genes
involucrados en la asimilación de fuentes de carbono no preferidas. Además, el TCS
CbrA/CbrB es necesario para una óptima acumulación de la proteína RsmA, quien posee un
papel importante en el metabolismo central de bacterias como E. coli. La actividad de las
proteínas Crc-Hfq y de rsmA son elementos clave en el metabolismo y los flujos de carbono
en A. vinelandii.
Con el fin profundizar en el efecto positivo que el TCS CbrA/CbrB posee sobre la
expresión de rsmA, decidimos explorar el efecto del TCS CbrA/CbrBsobre la acumulación
de PHB, debido a que se ha comprobado que este proceso se encuentra directamente bajo el
control de la proteína RsmA (Hernández-Eligio et al., 2012). Por tal razón, la
cuantificación de este polímero se realizó durante la fase estacionaria de crecimiento (48 h),
de células cultivadas en medio líquido Burk sacarosa, ya que se ha reportado que es el
momento donde se presenta una mayor acumulación del polímero La cuantificación mostró
de manera inesperada que las cepas mutantes cbrA y cbrB fueron incapaces de acumular
PHB (Fig. 24a). Además, la producción del polímero se restauró a niveles silvestres en la
cepa complementada JS05, lo cual confirma el efecto positivo que el TCS CbrA/CbrB
posee en la acumulación de PHB bajo estas condiciones. Por otra parte, como era esperado,
la cepa mutante gacA (usada como control negativo) fue incapaz de acumular PHB. Este
resultado podría explicarse por el hecho de que tanto la de síntesis alginato como de PHB
compiten por la fuente de carbono disponible (Segura et al., 2003b), por lo que la hipótesis
mas sencilla seria que las mutantes cbrA o cbrB son incapaces de acumular PHB debido al
fenotipo de sobreproducción de alginato. Sin embargo, cuando en una mutante algD
(incapaz de producir alginato), se inactiva el gen cbrA, la cepa resultante también es
Resultados y Discusión
83
incapaz de acumular PHB (Fig. 24b), lo cual implica que CbrA regula la síntesis de PHB de
manera independiente a la producción de alginato.
Figura 24. Efecto del TCS CbrA/CbrB en la acumulación de PHB. (a) Cuantificación de PHB de las
cepas silvestre AEIV y las mutantes cbrA, JS05 (cbrA::mTn5/ cbrA+), cbrB::Sp y AEgacA (mutante gacA,
usada como control negativo), crecidas en medio líquido Burk sacarosa durante 48 h. (b). Crecimiento en
medio sólido PY-sacarosa de las cepas algD::gusATc y algD::gusATc/cbrA–. durante 48 h. (c) Región
reguladora del gen phbB, en negritas se señala el posible sitio CA, mientras que el inicio de la traducción está
indicado con mayúsculas y subrayado.
Figure 7
A B
WT ga
cA cbr
A
cbr
B
cbr
A
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0
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A
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tcgagcattctagctcctacggcaaatcccgcctcgccaagcgaccgggcccatgccgcg
tacatcacatgccagaaagtcgatatcaaaacacaggattctggcgccaggacgaccattc
atcgctctcggcattctccatccatcatcaattcggctcgtgcccttcagaagtcgcgccaag
tggatgtccccttccacacatctgcggcaatagctacagctacgccccatcaccgccatatc
agcccgatagcaaaaagccactggaaaaccttgcaaagggtgtcaccaatcgccagtac
gatgtcaccaacgggcactatccttaaagcgtgacccatcgagaatgagcctcgcgagtc
acgacacaaacgacgctgcgcagctacacgccattcagcagtgtgggcagccagggtct
ccgacaaaaaaggaagggaaatctATG
c
Resultados y Discusión
84
Cómo se mencionó anteriormente, la disminución de la acumulación de PHB, fue
inesperada, debido a que la disminución de la de expresión de rsmA, debería producir un
aumento en la acumulación de dicho polímero. Este resultado sugiere fuertemente que en el
fondo de las mutantes cbrA y cbrB existe algún otro tipo de control negativo de la síntesis
de PHB diferente a la proteína RsmA. Existe la posibilidad de que este represor pueda ser
Crc, ya que, le análisis in silico de la región reguladora de phbB, nos permitió identificar un
posible sitio CA (Fig. 24c). Aunado a esto, el aumento en la actividad de Crc propuesto en
el fondo de mutante cbrA explicaría la
6.3.6 El TCS CbrA/CbrB tiene un efecto negativo en la producción de
Alquilresolcinoles (ARs)
Al igual que la síntesis de PHB, la producción de ARs también se encuentra bajo el control
de la proteína RsmA (Romero et al., 2016), por lo cual evaluamos el efecto del TCS
CbrA/CbrB sobre la acumulación de estos lípidos. La síntesis de ARs se produce durante
condiciones de enquistamiento, es decir, durante el crecimiento en placas de medio
mínimo Burk suplementado con 2% de n-butanol como única fuente de carbono. La
cuantificación de ARs bajo estas condiciones, mostró que en la mutante cbrA la
acumulación de estos lípidos estaba aumentada alrededor del 70% en comparación con la
cepa silvestre AEIV (Fig. 25), mientras que en la cepa complementada los ARs se
restauraban a niveles silvestres. El incremento en la acumulación de ARs fue mucho más
marcado en el fondo de la cepa mutante cbrB, ya que en esta mutante se observó un
incremento de ARs tres veces mayor en comparación con la cepa silvestre (Fig. 25). Por
otra parte, como era esperado, la cepa mutante gacA (usada como control negativo) fue
incapaz de acumular ARs.
Resultados y Discusión
85
Figura 25. Efecto del TCS CbrA/CbrB en la síntesis de Alquilresolcinoles. Cuantificación de ARs de las
cepas silvestre AEIV y las mutantes GG15 (cbrA::mTn5), JS05 (cbrA::mTn5/ cbrA+), CFB03 (cbrB::Sp) y
AEgacA (mutante gacA, usada como control negativo), crecidas en medio líquido Burk butanol durante 5
días.
Colectivamente los datos presentados en este apartado sugieren la existencia de la cascada
de regulación CbrA/CbrB-RpoS-RsmA, la cual controla la producción de alginato, ARs y
parcialmente PHB (Fig. 26).
6.4 DISCUSIÓN
Durante este apartado presentamos evidencia que indica que el TCS CbrA/CbrB posee un
efecto negativo en la síntesis de alginato. Cabe mencionar que este TCS sobre la síntesis del
polímero no había sido descrito en Pseudomonas spp. A pesar de que la bioquímica de la
producción de alginato está bien conservada entre A. vinelandii y P. aeruginosa, existen
diferencias notables en la regulación de la síntesis de alginato entre ambas bacterias. Una
de las más sobresalientes es, que opuesto a lo que ocurre en P. aeruginosa, el gen algD en
Figure 7
A B
WT ga
cA cb
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cA cb
rA
cb
rB
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A
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Resultados y Discusión
86
A. vinelandii es blanco directo de la proteína RsmA, la cual probablemente impide su
traducción (Manzo et al., 2011) debido a esto, mutantes que presentan un aumento en la
actividad de RsmA (por ejemplo en cepas mutantes en gacA), no son capaces de sintetizar
alginato (Castañeda et al., 2001; Manzo et al., 2011). Las diferencias entre la regulación de
la producción de alginato podrían deberse a los diferentes papeles que el alginato tiene en la
fisiología de estos miembros de la familia Pseudomonadaceae. � Por ejemplo, en A.
vinelandii el alginato es esencial para formar las capas que rodean los quistes,
permitiéndoles resistir condiciones adversas (proceso que no ocurre en Pseudomonas spp).
Por otra parte, en P. aeruginosa el alginato es importante durante las infecciones crónicas,
ya que forma un barrera que les ayuda a contender contra la difusión de antibióticos y otros
compuestos que pudieran dañarlas.
En A. vinelandii, la mutante cbrA mostró un incremento de alginato de por lo menos 5
veces en comparación con la cepa silvestre AEIV, mientras que la mutante cbrB, mostró
una producción de alginato dos veces mayor que la de la cepa mutante cbrA (Fig. 19). Este
comportamiento es esperado, ya en ausencia de la HK su RR par podría ser fosforilado
inespecíficamente (Laub et al., 2007). Nuestros resultados también indican que el TCS
CbrA/CbrB tiene un efecto negativo en la transcripción de algunos genes de la vía de la
biosíntesis del alginato, concretamente en los genes algD, algC y alg8, los cuales
aumentaron su expresión entre 2 y 3 veces en el fondo de la mutante cbrA cuando se
compara con la cepa silvestre (Fig 20). Inesperadamente la transcripción de algD en el
fondo de la mutante cbrA no fuetan alto como se esperaba. Es decir, antecedentes previos
en nuestro grupo de investigación de cepas sobre-productoras de alginato mostraron
incrementos en la expresión de algD de por lo menos 4 veces en comparación con la cepa
silvestre (Ahumada-Manuel et al., 2017; Núñez et al., 2000b; Núñez et al., 2013), mientras
que en la mutante cbrA los niveles de este transcrito solo aumentaron el doble (Fig. 20b).
Este resultado nos llevó a investigar los niveles de traducción de rsmA en dicha cepa, donde
encontramos que la traducción de rsmA se aumentó hasta cinco veces durante la fase
exponencial de crecimiento en el fondo mutante cbrA (Fig. 20c). En conjunto, estos
resultados nos indican que la HK CbrA regula negativamente la expresión de algD
principalmente a nivel traduccional.
Resultados y Discusión
87
Como se ha mencionado previamente la traducción de algD en A. vinelandii está bajo el
control de la proteína de represión traduccional RsmA, la cual es capaz de unirse al líder
del mRNA de algD, impidiendo su traducción (Manzo et al., 2011). En concordancia con
el aumento en la traducción de algD en el fondo de la mutante cbrA, la expresión del
mRNA de rsmA se encontró disminuida alrededor de un 40%. Por otra parte la expresión de
rsmA en la mutante cbrB disminuyó considerablemente (aproximadamente un 70%) (Fig.
21), lo cual explicaría por qué esta mutante tiene una producción de hasta diez veces mayor
que la cepa parental AEIV y dos veces mayor que la mutante cbrA.
Al analizar la región reguladora de rsmA mediante un ensayo de extensión del iniciador, se
logró identificar un inicio de transcripción correspondiente a un posible promotor RpoS.
Sin embargo, nuestros datos sugieren la existencia de un promotor (o promotores) adicional
que también estaría dirigiendo la expresión de rsmA, ya que en la mutante rpoS la expresión
de rsmA solo disminuyó un 40% (Fig. 22). De hecho se ha reportado que el homólogo de
rsmA en E. coli (csrA), es transcrito a partir de 5 promotores, dos de ellos dependientes de
RpoS, otros dos de RpoD y el último no presentó una secuencia consenso que ayudara a
caracterizarlo. Este antecedente, nos sugiere fuertemente que en A.vinelandii al igual en E.
coli, la expresión de rsmA (csrA) debe estar finamente regulada.
El efecto positivo el TCS CbrA/CbrB sobre la expresión de rsmA, es indirecto, debido a
que no se logró identificar un posible sitio de unión a CbrB en la región reguladora de
rsmA. Por esta razón, y basados en el hallazgo del posible promotor RpoS se decidió
investigar el posible efecto que CbrA/CbrB pudiera tener en la expresión de RpoS.
Mediante Western blot y análisis de qPCR encontramos que el TCS CbrA/CbrB fue
necesario para una óptima expresión del mRNA rpoS y de la proteína RpoS, en los fondos
genéticos mutantes cbrA y cbrB (Fig. 23). A pesar de que el efecto positivo que CbrA/CbrB
poseen sobre la expresión de RpoS fue claro, éste es parcial y no explica por completo el
efecto de este TCS en la expresión de rsmA. En apoyo a este resultado, la producción
específica de alginato en la mutante rpoS no fue comparable con la de la mutante cbrA,
indicado que existe otra vía además de RpoS (Fig. 26). Cabe mencionar que existen
antecedentes en nuestro grupo de investigación que el sistema GacS/GacA también es
necesario para la expresión de rpoS, ya que mediante ensayos de Northen blot en la mutante
gacA no fue posible detectar el trancrito de este factor sigma durante la fase estacionaria
Resultados y Discusión
88
(Castañeda et al., 2001). No obstante, en este trabajo demostramos que si bien el TCS
CbrA/CbrB no afecta la actividad del TCS GacS/GacA, ambos sistemas son necesarios para
una máxima expresión del factor sigma RpoS.
En concordancia con los niveles reducidos de expresión de rsmA en el fondo de las
mutantes cbrA o cbrB, la síntesis de ARs se incrementó alrededor de dos y tres veces
(respectivamente) en dichas mutantes (Fig. 25). Este resultado es debido a que ya se ha
reportado que RsmA también regula negativamente la síntesis de ARs (Romero et al.,
2016). Por otra parte, la producción de PHB se abatió en el fondo de las mutantes en el
TCS (Fig. 24), este resultado fue inesperado, debido a que se ha reportado que la síntesis de
PHB también es regulada negativamente por RsmA (Hernández-Eligio et al., 2012; Manzo
et al., 2011), posiblemente esto podría deberse a que la síntesis de ambos polímeros
compite por la fuente de carbono disponible (Galindo et al., 2007) y que la mutación en
cbrA o cbrB favorecen el flujo de carbono hacia la producción de alginato. Sin embargo, en
la Fig. 24b podemos observar que una cepa incapaz de producir alginato (algD::Km) que
también tiene mutado el gen cbrA, tampoco es capaz de acumular PHB. En conjunto, estos
resultados sugieren fuertemente la presencia de una vía alternativa, independiente de RsmA
por la cual se esté regulando la acumulación de PHB en los fondos mutantes cbrA y cbrB.
En P. putida se ha reportado que la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) está
controlada por las proteínas Crc-Hfq, ya que estas proteínas son capaces de impedir la
traducción de phaC1 el cual codifica una PHA polimerasa, pero solo cuando existe una
proporción balanceada de C/N (La Rosa et al., 2014). El análisis del líder del gen phbB de
A. vinelandii, el cual encabeza la vía de la biosíntesis de PHB, mostró un posible sitio de
unión a Hfq-Crc (sitio CA) (Fig. 24c), por lo cual es posible que en la mutante cbrA la alta
actividad de Crc-Hfq esté reprimiendo la traducción de phbB, impidiendo la acumulación
de PHB. Sin embargo esta posibilidad tiene que ser demostrada experimentalmente.
El control que el TCS CbrA/CbrB muestra sobre la síntesis de los polímeros en A.
vinelandii concuerda con la propuesta de que el este sistema ayuda a mantener el balance
C/N en la célula (Li & Lu, 2007). Durante la primera parte de este proyecto comprobamos
que el sistema CbrA/CbrB encabeza la cascada de regulación de asimilación de fuentes de
carbono, y durante la segunda parte comprobamos que es necesario para la regulación de la
síntesis de polímeros como alginato y PHB (Fig. 26). Estos polímeros son sintetizados a
Resultados y Discusión
89
partir de las fuentes de carbono consumidas por la bacteria. Colectivamente estos resultados
indican que el sistema CbrA/CbrB además de jerarquizar la asimilación de nutrientes,
también se encarga de regular los flujos de carbono hacia la producción de dichos
polímeros, lo cual ayuda a mantener un correcto balance de carbono.
En E. coli se ha establecido la existencia de conexiones entre la represión catabólica por
carbono y el sistema Csr (Rsm). La proteína reguladora EIIAGlc del sistema PTS y el factor
transcripcional cAMP-CRP, con capaces de influir en la acumulación y la expresión delos
sRNAs CsrB y CsrC, los cuales antagonizan la actividad de la proteína CsrA (RsmA). Esto
permite al sistema Csr responder al estado nutricional de la bacteria y reorganizar el
metabolismo celular (Leng et al., 2016; Pannuri et al., 2016). Posiblemente en A.
vinelandii, al igual que en E. coli, el sistema de represión catabólica (Crc-Hfq) y el sistema
Rsm, también estén conectados, es decir, que las proteínas Crc-Hfq directamente (o
indirectamente) sean capaces de regular la expresión de RsmA.
Como se ha planteado a lo largo de este trabajo, rsmA es un regulador importante del
metabolismo secundario en A.vinelndii, y no sería raro que se encontrara debajo de la
cascada de regulación de los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq, quienes hemos comprobado
regulan metabolismo central. La posibilidad de integrar ambos sistemas nos permitiría
integrar los flujos de carbono tanto de metabolismo central como de metabolismo
secundario. Esto contribuiría a optimizar la producción de polímeros de interés industrial
como el alginato y el PHB,mediante ingeniería de vías metabólicas.
Resultados y Discusión
90
6.5 Modelo propuesto de la regulación del TCS CbrA/CbrB sobre la
represión catabólica por carbono y la síntesis de alginato en A. vinelandii
Figura 26. Modelo propuesto de regulación del TCS CbrA/CbrB sobre la síntesis de alginato y
asimilación de glucosa en A. vinelandii. El TCS CbrA/CbrB encabeza la cascada de CCR activando la
transcripción de CrcZ, el cual antagoniza la actividad de las proteínas Crc-Hfq liberando la presión catabólica
que éstas ejercen sobre sus genes blanco (por ejemplo gluP). Al mismo tiempo el TCS CbrA/CbrB controla la
síntesis de alginato, al afectar positivamente la expresión de rsmA, parcialmente a través del factor sigma
RpoS, ya que éste activa directamente la transcripción de rsmA. Nuestros resultados sugieren existencia de
una vía independiente de RpoS por la que el TCS CbrA/CbrB controla la expresión de rsmA. Flechas
continuas: efecto directo, flechas punteadas: efecto indirecto.
Figura 13. Modelo propuesto de regulación del TCS CbrA/CbrB sobre la síntesis de alginato y
asimilación de glucosa en A. vinelandii. El TCS CbrA/CbrB encabeza la cascada de RCC activando la
transcripción de CrcZ, el cual antagoniza la actividad de las proteinas Crc-Hfq liberando la presión
catabólica que éstas ejercen sobre sus genes blanco (por ejemplo gluP). Al mismo tiempo el TCS
CbrA/CbrB controla la síntesis de alginato, al afectar positivamente la expresión de rsmA, parcialmente a
través del factor sigma RpoS, ya que éste activa directamentea transcripción de rsmA. Nuestros resultados
sugieren existencia de una via independiente de RpoS por la que el TCS CbrA/CbrB controla la expresión
de rsmA. Flechas continuas: efecto directo, flechas punteadas: efecto indirecto.
Cabe señalar que la función del TCS CbrA/CbrB de controlar la síntesis de alginato no ha sido
descrita en P. aeruginosa, una bacteria que también es capaz de producir alginato. En general la
bioquímica de la producción de alginato se encuentra bien conservada entre P. aeruginosa y A.
vinelandii, pero existen diferencias significativas en términos de regulación. Opuesto a lo que
sucede en P. aeruginosa, en A. vinelandii el gen algD es blanco del represor traduccional RsmA
(Manzo et al., 2011). Las diferencias en la regulación de la síntesis de alginato podrían ser
atribuidas a los diferentes papeles que tiene éste polímero en los miembros de la familia
Pseudomonadaceae. En A. vinelandii el alginato es parte estructural de las capas que rodean los
quistes y es esencial para la resistencia a la desecación, pero esta función no existe en especies de
Pseudomonas
Colectivamente, nuestros resultados indican que los sistemas CbrA/CbrB y Hfq-Crc juegan un
papel importante en la reorganización del metabolismo de carbono en A. vinelandii. La clara
CbrA
PCbrB
P
RpoS
RsmA
algDrsmA
rpoS
mRNA
algD
?
crcZ/Y
mRNA gluP
Crc
Hfq
Control del proceso de RCC
(Asimilación de glucosa)
Síntesis de alginato
Conclusiones
91
7. CONCLUSIONES
o Los sistemas CbrA/CbrB y Crc-Hfq de A. vinelandii operan de manera muy similar
y están funcionalmente conservados con respecto al proceso de CCR reportado en
P. putida y otras especies de Pseudomonas
o El transporte de glucosa en A. vinelandii ocurre a través del transportador de
glucosa GluP
o La expresión de gluP está bajo el control del TCS CbrA/CbrB, ya que es blanco
directo del sistema Crc-Hfq
o El TCS CbrA/CbrB regula negativamente la producción de alginato, al ser necesario
para una óptima expresión de RsmA y del factor sigma RpoS.
o Colectivamente nuestros resultados indican que el TCS CbrA/CbrB posee un papel
central en el control del metabolismo del carbono en A. vinelandii.
Perspectivas
92
8. PERSPECTIVAS
. Investigar el regulón del TCS CbrA/CbrB mediante el uso de herramientas globales
(transcriptoma), lo cual nos brindaría amplia información sobre los
procesos �celulares controlados por este TCS.
. Explorar la posibilidad de que los sistemas Crc-Hfq y Rsm de A. vinelandii estén
relacionados, directa o indirectamente.
. Establecer el mecanismo por el cual TCS CbrA/CbrB afecta la acumulación del
polímero intracelular PHB y la síntesis de ARs en A. vinelandii. �
. Investigar el mecanismo por el cual TCS CbrA/CbrB es necesario para la expresión
del factor sigma RpoS �
Referencias
93
9. REFERENCIAS
Abdou, L., Chou, H. T., Haas, D. & Lu, C. D. (2011). Promoter recognition and
activation by the global response regulator CbrB in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol
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Ahumada-Manuel, C. L., Guzmán, J., Peña, C., Quiroz-Rocha, E., Espín, G. & Núñez,
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Role of the Transporter-Like Sensor Kinase CbrA in Histidine Uptake and Signal
Transduction. J Bacteriol 197, 2867-2878.
Anexo
10. ANEXO, ARTÍCULOS
Quiroz-Rocha E., Moreno R., Hernández-Ortíz A., Fragoso-Jiménez J.C., Muriel-Millán
L.F., Guzmán J., Espín G., Rojo F., Núñez C. (2017). Glucose uptake in Azotobacter
vinelandii occurs through a GluP transporter that is under the control of the
CbrA/CbrB and Hfq- Crc systems. Sci Rep. 2017 Apr 12;7(1):858. doi: 10.1038/s41598-
017-00980-5.
Quiroz-Rocha E., Bonilla-Badía F., García-Aguilar V., �López-Pliego L., Serrano-Román
J., Cocotl-Yañez M., Guzmán J., �Ahumada-Manuel C. L., Muriel-Millán L.F., Castañeda
M., Espín G. �and Núñez C. �(2017). The two-component system CbrA/CbrB controls
alginate production in �Azotobacter vinelandii. �Microbiology. En prensa, aceptado el 27
de Febrero del 2017.
1Scientific RepoRts | 7: 858 | DOI:10.1038/s41598-017-00980-5
. . /s s
Glucose uptake in Azotobacter
vinelandii occurs through a GluP
transporter that is under the
control of the CbrA/CbrB and Hfq-
Crc systems
Elva Quiroz-Rocha1, Renata Moreno2, Armando Hernández-Ortíz1, Juan Carlos Fragoso-
Jiménez3, Luis Felipe Muriel-Millán1, Josefina Guzmán1, Guadalupe Espín1, Fernando Rojo 2
& Cinthia Núñez 1
Azotobacter vinelandii, a strict aerobic, nitrogen fixing bacterium in the Pseudomonadaceae family,
exhibits a preferential use of acetate over glucose as a carbon source. In this study, we show that GluP
(Avin04150), annotated as an H+-coupled glucose-galactose symporter, is the glucose transporter
in A. vinelandii. This protein, which is widely distributed in bacteria and archaea, is uncommon in
Pseudomonas species. We found that expression of gluP was under catabolite repression control
thorugh the CbrA/CbrB and Crc/Hfq regulatory systems, which were functionally conserved between
A. vinelandii and Pseudomonas species. While the histidine kinase CbrA was essential for glucose
utilization, over-expression of the Crc protein arrested cell growth when glucose was the sole carbon
source. Crc and Hfq proteins from either A. vinelandii or P. putida could form a stable complex with an
RNA A-rich Hfq-binding motif present in the leader region of gluP mRNA. Moreover, in P. putida, the
gluP A-rich Hfq-binding motif was functional and promoted translational inhibition of a lacZ reporter
gene. The fact that gluP is not widely distributed in the Pseudomonas genus but is under control of the
CbrA/CbrB and Crc/Hfq systems demonstrates the relevance of these systems in regulating metabolism
in the Pseudomonadaceae family.
Azotobacter vinelandii is a gamma proteobacterium belonging to the Pseudomonadaceae family1. Although A.
vinelandii is phylogenetically related to Pseudomonas species, it possesses distinctive features that clearly separates
it from the genus Pseudomonas,such as its capacity to differentiate and form dormant cysts that are resistant to
drought, its strict aerobic metabolism and its capacity to fix nitrogen under aerobic conditions2, 3. A. vinelandii
produces two polymers of biotechnological importance, the exo-polysaccharide alginate and the intracellular
polyester polyhydroxybutyrate4. A. vinelandii can use many carbohydrates, alcohols and salts of organic acids for
growth; however, it is unable to grow using amino acids as the sole carbon source5. Similar to Pseudomonas spp.,
A. vinelandii does not have a functional glycolytic pathway, but instead relies on the Entner-Doudoroff pathway
(EDP) for glucose utilization6. This bacterium exhibited diauxic growth when grown in a medium containing
both acetate and glucose7–9. In this condition, acetate was used as the primary carbon source. Once the acetate
was exhausted, glucose uptake was initiated, indicating that acetate repressed the synthesis of the glucose trans-
port system. The tricarboxylic acid intermediates citrate, isocitrate and 2-oxo-glutarate also inhibited glucose
utilization9, suggesting the existence of a carbon catabolite repression (CCR) process in A. vinelandii similar to
that in Pseudomonas species.
1Departamento de Microbiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México,
. s 001 10 s . Departamento de Biotecnología
I D 3 8049 . 3Departamento
I s s I s s .
s 001 10 s . s s s s
s ss . . : . . )
Received: 15 December 2016
Accepted: 22 March 2017
Published: xx xx xxxx
OPEN
www.nature.com/scientificreports/
2Scientific RepoRts | 7: 858 | DOI:10.1038/s41598-017-00980-5
CCR is a global regulatory system that allows the selective assimilation of a preferred compound among a
mixture of several potential carbon sources. Unlike Escherichia coli and Bacillus subtilis, the preferred carbon
sources for bacteria in the genus Pseudomonas are some organic acids and amino acids rather than glucose10. In
Pseudomonas species the process of CCR is elicited mainly through a regulatory system based on the Crc and
Hfq proteins and one or more small RNAs (sRNAs) of the CrcZ, CrcY or CrcX family that antagonize the effect
of these regulatory proteins11–14. A two-component system, composed of the histidine kinase (HK) CbrA and the
response regulator (RR) CbrB, heads this regulatory pathway by directly activating the transcription of sRNAs
from RpoN-dependent promoters14, 15. The Crc and Hfq proteins play a central role in CCR in Pseudomonas
spp., promoting the inhibition of translation of RNAs containing an AAnAAnAA motif, called the CA motif (for
Catabolite Activity), which is close to the translation initiation site14, 16–19. The RNA chaperone Hfq recognizes
and binds these A-rich motifs, the role of Crc being to stabilize the ribonucleoprotein complexes formed12, 13, 20.
For this reason, the CA motifs are also known as A-rich Hfq-binding motif. As noted above, glucose is not the
preferred carbon source for Pseudomonas. In fact, Crc and Hfq inhibit the expression of the OprB1 porin for the
uptake of glucose, of the inner membrane glucose transporter GtsABC, and of several genes required for glucose
assimilation in P. putida when grown in a rich medium21.
In the present study, we investigated the regulation of glucose uptake in A. vinelandii and the role of the CbrA/
CbrB and Crc/Hfq systems in the CCR process. Analysis of the genome sequence revealed that A. vinelandii
lacks the inner membrane glucose transporter GtsABC that is present in Pseudomonas spp. Our results indicated
that the gene gluP encodes the glucose transporter and that translation of the gluP mRNA is under catabolite
repression control thorugh the CbrA/CbrB and Crc/Hfq regulatory systems in A. vinelandii. The gluP A-rich
Hfq-binding motif was functional when introduced into P. putida as its presence promoted translational inhibi-
tion of a lacZ reporter gene.
Results
The histidine kinase CbrA is necessary for the utilization of glucose. Previous studies demon-
strated the preferential use of acetate over glucose in the A. vinelandii strain OP8, 9, a derivative of the O strain
that is unable to produce the exo-polysaccharide alginate2. However, the underlying mechanism of this catabolic
repression was unknown. In a random miniTn5 mutant bank derived from the wild-type strain AEIV, we identi-
fied mutant GG15 by its alginate-over-producing phenotype on plates of minimal Burk’s-sucrose medium. This
mutant carries the miniTn5 insertion within codons 660 and 661 of a gene that is similar to cbrA, which encodes
an HK that forms part of the CbrA/CbrB two-component system present in Pseudomonas spp. As explained in the
Introduction, the CbrA/CbrB regulatory system plays a key role in Pseudomonas catabolite repression together
with Crc and Hfq proteins, and the CrcZ/CrcY sRNAs.
Genes encoding all components of the CbrA/CbrB and Crc/Hfq systems are present in the A. vinelandii
genome. A cbrB gene (Avin42680), encoding the CbrB cognated RR, and the gene for the sRNA CrcZ, are located
immediately downstream of cbrA (Avin42670) (Fig. 1). The predicted CbrA and CbrB proteins are highly similar
(>77% identity) to their homologues from P. aeruginosa and P. putida. An in-silico analysis identified a putative
σ70 promoter upstream of the cbrB gene, which has also been identified in P. aeruginosa22. The A. vinelandii
genome also contains genes for the sRNAs CrcZ and CrcY11. The CrcZ sRNA shows 68% identity to the P. putida
and P. aeruginosa CrcZ and contains six putative A-rich Hfq-binding motifs (AANAANAA) (Fig. 1). The pre-
dicted secondary structure shows that these A-rich motifs are located on the loops (Supplementary Fig. S1). The
A. vinelandii crcY gene was located in the intergenic region in between Avin04820 and Avin04790 ORFs, which
encode hypothetical proteins (Supplementary Fig. S2). CrcY contains five putative A-rich Hfq-binding motifs,
and four of them are predicted to be located on the loops (Supplementary Fig. S3).
Genes crc (Avin02870) and hfq (Avin07540) were also identified in the A. vinelandii genome. The Crc and Hfq
proteins showed 88 and 93% identity, respectively, to their P. aeruginosa homologues. The genes are in regions
highly conserved among several Pseudomonas species. A BLAST search indicated that crcZ, crcY, crc and the hfq
genes are present in the genome of the A. vinelandii strain CA-6 and in Azotobacter chroococcum within similar
genomic contexts.
As mentioned above, the CbrA-null strain GG15 over-produced alginate when cultivated on plates of minimal
Burk’s-sucrose medium. In fact, the GG15 mutant showed five-times higher alginate levels than the wild type
strain AEIV23. Since this polymer is synthesized from fructose-6-phosphate it competes for the available carbon
source affecting cell growth24. Thus, the alginate phenotype of mutant GG15 would prevent a reliable assessment
of the CbrA role on the growth on different carbon sources. For this reason, the effect of the HK CbrA on the CCR
process was evaluated in an alg-negative genetic background. We used strain AEalgD, a derivative of strain AEIV
that carries an algD::Km mutation, and mutant AH1, an AEalgD derivative carrying a cbrA::miniTn5 mutation.
As shown in Fig. 2a, both AEalgD and AH1 strains grew with sucrose as the sole carbon source. However,
strain AH1 was unable to grow on glucose, indicating that the CbrA HK was necessary for the utilization of this
compound in A. vinelandii. Figure 2b shows that the assimilation of glucose did not occur in the presence of ace-
tate in the AEalgD strain, which was consistent with previous reports indicating diauxic growth in A. vinelandii
in medium supplemented with acetate and glucose. However, after acetate consumption, glucose utilization was
initiated. In contrast, the cbrA mutant AH1 grew on acetate plus glucose, but glucose assimilation was abrogated
and growthceased as soon as acetate was consumed (Fig. 2b). The inability to use glucose was also observed for
an AEalgD derivative cbrA::Sp mutant constructed by reverse genetics (data not shown). These results indicate
that the HK CbrA was involved in the control of CCR in A. vinelandii. Because the CbrA/CbrB system is needed
in P. putida and P. aeruginosa for the synthesis of the CrcZ/CrcY sRNAs, which in turn antagonize the effects of
Crc/Hfq13, 20, 25, the lack of CbrA in A. vinelandii could be generating strong Crc/Hfq-dependent repression. We
next analysed this possibility.
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3Scientific RepoRts | 7: 858 | DOI:10.1038/s41598-017-00980-5
The two-component system CbrA/B was necessary for the transcription of the sRNAs CrcZ and
CrcY. To determine whether expression of the sRNAs CrcZ and CrcY in A. vinelandii was under the control
of the two-component system CbrA/CbrB, transcriptional fusions of the regulatory regions of crcZ and crcY with
the reporter gene gusA were constructed (PcrcZ-gusA and PcrcY-gusA, respectively). Derivatives of the wild type
strain AEIV and mutant cbrA carrying these gene fusions were cultured in Burk’s-sucrose medium, and the activ-
ity of ß-glucuronidase was measured at the exponential (8 h) and stationary (24 h) phases of growth. As shown
in Fig. 3, transcription of both sRNAs was dependent on the HK CbrA as in the cbrA mutant the activity of the
PcrcY-gusA and PcrcZ-gusA transcriptional fusions was reduced at least four-fold during the exponential and
stationary growth phases. Analysis of the CrcZ regulatory region allowed the identification of conserved residues
characteristic of RpoN dependent promoters located at 13 (−12) and 25 (−24) nt upstream of the first A-rich
Hfq-binding motif. Additionally, putative binding sites for the RR CbrB at positions −125 and −145 relative to
the first A-rich Hfq-binding motif were identified (Fig. 1a). The regulatory region of crcY also showed conserved
sequences for an RpoN-dependent promoter as well as sequences recognized by the RR CbrB at similar positions
(Supplementary Fig. S2). Together, these results imply that the two-component CbrA/CbrB system activates CrcZ
and CrcY transcription, as has been described in several Pseudomonas species.
The sRNA CrcZ can bind to the Hfq protein and Crc facilitates this interaction. We next investi-
gated the ability of CrcZ to form a complex with the purified His-Hfq and Crc proteins from A. vinelandii using
RNA electrophoretic-mobility shift assays (EMSAs). To avoid E. coli Hfq contaminations His-Hfq and Crc pro-
teins were purified from the Hfq-null E. coli expression strain MG165512. Radioactively labelled CrcZ was syn-
thesized by in vitro transcription. Binding reactions were performed using the protocols reported for P. putida,
in the presence of an excess of tRNA allowing specific binding of the Hfq and Crc proteins16, 18. Hfq generated a
stable complex with CrcZ at concentrations as low as 0.02 µM (Fig. 4a). As the concentration of Hfq increased,
the formed complex showed lower mobility consistent with the presence of several A-rich Hfq-binding motifs in
CrcZ. This complex also showed increased stability based on the intensity of the shifted band (Fig. 4a). The Crc
protein alone was unable to form a stable complex with CrcZ, even at high concentrations (Fig. 4b). However, at
0.2 µM Hfq, the presence of Crc changed the migration pattern of the Hfq-CrcZ complex, which showed a faster
electrophoretic mobility, suggesting the formation of a tripartite CrcZ-Hfq-Crc complex (Fig. 4b). At a lower Hfq
concentration (0.05 µM), the presence of Crc also stabilized the Hfq-RNA complex formed (Fig. 4c). The presence
of Crc but not that of bovine serum albumin (BSA) changed the migration pattern of the shifted band (Fig. 4d),
implying that Crc binds to the CrcZ-Hfq complex in a specific manner. Collectively these results indicate that
the CbrA/CbrB and Crc-Hfq systems in A. vinelandii and Pseudomonas spp. operate mechanistically in a similar
manner.
Figure 1. Genome context and nucleotide sequence of the A. vinelandii CrcZ sRNA. Terminators are indicated
by small stem-loops. The six CrcZ A-rich Hfq-binding motifs are indicated by red boxes. The −12 and −24
regions of the predicted RpoN promoter and putative sequences recognized by CbrB (black boxes) are
indicated. The predicted −10 and −35 regions of an RpoD promoter are underlined. Inverted repeats at the end
of CrcZ are denoted by solid arrows.
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4Scientific RepoRts | 7: 858 | DOI:10.1038/s41598-017-00980-5
Over-expression of Crc in trans diminishes growth on glucose. As shown above, the cbrA mutant
strain AH1 was unable to use glucose in the presence of acetate. Thus, we explored the possibility that the effect of
the CbrA/CbrB system on glucose assimilation was exerted through the Crc system. Efforts to construct strains
carrying crc or crcZ mutations were unsuccessful. The selection of such mutants was conducted using minimal
or rich medium supplemented with acetate, succinate, glucose or sucrose as carbon sources, either under diaz-
otrophic conditions or in the presence of fixed nitrogen. This result suggested that the Crc protein and the CrcZ
sRNA are necessary for the vegetative growth of A. vinelandii under laboratory conditions. Therefore, we evalu-
ated the effect of Crc over-expression on glucose assimilation by using plasmid pSRK-crc, a pSRK-Km derivative
Figure 2. The HK CbrA is necessary for glucose utilization. (a) Growth kinetics of the reference strain AEalgD
(algD::Km) (closed symbols) and its derivative mutant AH1 (cbrA::miniTn5) (open symbols) in liquid Burk’s
minimal medium amended with 50 mM glucose (dashed lines) or 2% sucrose (solid lines). (b) Growth kinetics
(circles), and acetate (triangles) or glucose (diamonds) consumption during the culture of the reference strain
AEalgD (algD::Km) (closed symbols) or its derivative mutant AH1 (cbrA::miniTn5) (open symbols) in Burk’s
minimal medium supplemented with both 30 mM glucose and 30 mM acetate as carbon sources. (c) gluP
mRNA levels determined by qRT-PCR analysis in strain AEalgD (white columns) and in mutant AH1 (grey
columns) in the diauxic growth of panel (b). Total RNA was extracted from cells at the indicated times. The bars
of standard deviation from three independent experiments are shown. Significant differences were analysed by
t-test. Statistical significance is indicated (***p < 0.001).
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5Scientific RepoRts | 7: 858 | DOI:10.1038/s41598-017-00980-5
vector carrying the A. vinelandii crc gene transcribed from a lac promoter induced only in the presence of IPTG26.
For this purpose we used the wild type strain AEIV because increasing levels of Crc did not affect alginate syn-
thesis (data not shown). Thus, pSRK-crc and the empty vector pSRK-Km were transferred to the AEIV strain,
and the ability of the resulting strains to grow with glucose as the sole carbon source was evaluated. As shown in
Fig. 5a, the AEIV strain carrying the empty vector exhibited normal growth and reached the stationary phase at
24 h of growth. This behaviour was similar for the AEIV strain carrying the pSRK-crc vector in the absence of
IPTG. In the presence of 1 mM IPTG, however, the AEIV strain harbouring the pSRK-crc vector showed a growth
lag during the first 10 h; after this time growth was resumed but started to decline at 16 h of culture reaching a
maximum protein concentration of 375 µgml−1, three-fold lower than the control strain. These data indicated a
negative effect of the Crc protein on glucose catabolism.
When cultivated with sucrose, Crc over-expression weakly diminished cell growth at the end of the expo-
nential phase, reaching twofold less protein concentration than the uninduced culture (Supplementary Fig. S4).
This result was somewhat expected given the effect that Crc showed on glucose catabolism. In contrast,growth
in the presence of preferred carbon sources such as acetate or succinate was not affected (Supplementary Fig. S4).
Altogether these results imply that higher levels of Crc simulate strong CCR conditions preventing the utilization
of glucose, a secondary carbon source for A. vinelandii.
Figure 3. Effect of the HK CbrA on crcZ and crcY gene expression. Expression of crcZ and crcY genes was
assessed by PcrcZ-gusA (a) and PcrcY-gusA (b) transcriptional fusions, respectively. These transcriptional
fusions were tested in wild type and cbrA genetic backgrounds. The strains used were: AE-Zgus (wild type;
black bars) and CbrA-Zgus (cbrA::Sp; white bars) (a); AE-Ygus (wild type; black bars) and CbrA-Ygus
(cbrA::Sp; white bars) (b). Cultures were developed in minimal Burk’s-sucrose medium. Aliquots were taken
at the indicated times and ß-glucuronidase activity was measured. The bars of standard deviation from three
independent experiments are shown. Significant differences were analysed by t-test. Statistical significance is
indicated (*p < 0.05, **p < 0.01 or ***p < 0.001).
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6Scientific RepoRts | 7: 858 | DOI:10.1038/s41598-017-00980-5
GluP is the glucose transporter in A. vinelandii. Analysis of the A. vinelandii genome allowed us to
identify several genes involved in glucose metabolism and that contain putative A-rich Hfq-binding motifs
near the translation start site (Supplementary Table S1). Of interest, the A. vinelandii genome lacks the typical
glucose ABC transporter GtsABC present in Pseudomonas spp. but contains the gene Avin04150 (gluP), which
was annotated as a transporter for glucose and galactose belonging to the Major Facilitator Superfamily of the
Fucose-Galactose-Glucose:H+ symporter (FGHS) family (Fig. 6a)27, 28. The gluP gene encodes a 429 amino acid
protein predicted to have 12 trans-membrane helices typical of the members of the MFS29. This protein showed
48% identity with the glucose-galactose transporter (GluP) from Brucella abortus30. Homologues of the A. vine-
landii GluP were also present in A. chroococcum and Azotobacter beijerinckii (showing 90% identity) and in a few
Pseudomonas species (some of them were associated with plants).
To determine the role of GluP in glucose assimilation, strain AHI30 carrying a gluP::Sp mutation was con-
structed and characterized. As shown in Fig. 6b, this mutant was able to grow on sucrose; however it failed to
grow on medium supplemented with glucose as the sole carbon source. Genetic complementation of AHI30
mutant with a wild type copy of gluP was conducted. To this end, gluP was cloned in the vector pSRK-Km, pro-
ducing plasmid pSRK-gluP. Growth with glucose as the sole carbon source was restored for the AHI30 mutant
harbouring plasmid pSRK-gluP only in the presence of 1 mM IPTG, implying that GluP is necessary for the
uptake of this carbohydrate (Fig. 6b).
An additional approach was used to confirm the role of GluP as the glucose transporter in A. vinelandii.
Heterologous genetic complementation of an E. coli strain devoid of the major glucose transporter systems
with the A. vinelandii gluP gene was conducted. We constructed an E. coli mutant carrying multiple deletions
of genes encoding the general components of the PTS system, the galactose:H+ symporter GalP and the Mgl
galactose/glucose ABC transporter and named it WHIPC. Plasmids pSRK-Km (control) and pSRK-gluP were
transferred to the WHIPC strain and the resulting transconjugants were tested for the ability to grow in M9
mineral medium amended with 2.5 gl−1 glucose. As shown in Fig. 6c, growth of the WHIPC mutant occurred
at a specific growth rate of 0.12 h−1 and a maximum specific rate of glucose consumption of 0.01 g g of dry cell
weight (DCW)−1 h−1. However, growth of the mutant WHIPC carrying the pSRK-gluP vector in M9 medium
supplemented with 2.5 gl−1 glucose and 0.1 mM IPTG was clearly improved, exhibiting a specific growth rate of
Figure 4. Hfq-Crc proteins form a stable ribonucleoprotein complex with CrcZ. Ribonucleoprotein complexes
formed in the presence of the sRNA CrcZ and increasing concentrations of Hfq (0, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 and
1 µM) (a) or in the presence of both Crc and Hfq (b and c). In (d) Crc was substituted by 1 µM of bovine serum
albumin (BSA). Crc and Hfq were added at the indicated concentrations (expressed as monomers and hexamers
respectively). RNA and protein-RNA complexes were resolved in a non-denaturing polyacrylamide gel. The
position of free RNA, and of the ribonucleoprotein (RNP) complexes detected, is indicated.
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0.34 h−1 and a maximum specific rate of glucose consumption of 0.1 g gDCW−1 h−1, which was ten-fold higher
compared with the WHIPC strains (Fig. 6c). Several unsuccessful attempts to grow strain WHIPC harbouring
the control plasmid pSRK-Km in liquid mineral M9 medium amended with glucose and kanamycin were made,
which implied that the vector itself represented a genetic load that prevented cell growth. These results indicated
that the A. vinelandii GluP protein functions as a glucose transporter in E. coli.
Expression of gluP is under the control of the CbrA/CbrB and Hfq-Crc systems. Because in A.
vinelandii the catabolism of glucose is prevented as long as acetate is still present in the culture medium, we
speculated that expression of the GluP encoding gene would be repressed under conditions of strong catabolite
Figure 5. Crc over-expression diminishes growth on glucose. (a) Growth kinetics of the wild type A. vinelandii
AEIV strain, harbouring the empty vector pSRK-Km (■) or the pSRK-crc (crc+) vector, in the presence (●) or
absence (○) of 1 mM IPTG. Cultures were developed in Burk’s minimal medium supplemented with 30 mM
glucose (BG) as the sole carbon source and 1.5 µgml−1 of kanamycin as a selection marker. 25 ml of Burk’s
medium supplemented with 30 mM sucrose were cultured for 18 h; cells were harvested by centrifugation,
washed with phosphate buffer 10 mM pH 7.2 and resuspended in the same solution. 400 µg of these cells
were used to inoculate 50 ml of BG medium and samples were collected at the indicated times for protein
quantification. Cell growth was estimated by determining protein concentration since the production of
the exo-polysaccharide alginate by the AEIV strain prevents assessment of growth by optical density. The
results represent the averages of the results of three independent experiments, and error bars depict standard
deviations. (b) Relative expression levels of gluP mRNA, quantitated by qRT-PCR analysis, in cells of the wild
type AEIV strain carrying the vector pSRK-crc in the absence (white colums) or presence (grey columns) of
1 mM IPTG. The growth conditions were as in panel (a). Total RNA was extracted from cells at the indicated
times. The bars of standard deviation from three independent experiments are shown. Significant differences
were analysed by t-test. Statistical significance is indicated (*p < 0.05 or ***p < 0.001).
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repression (i.e. in the presence of acetate). As expected, gluP mRNA levels, assessed by qRT-PCR analyses, were
low in the presence of acetate but increased 19-times during glucose catabolism in the AEalgD strain (Fig. 2c).
This response was dependent on the HK CbrA as in the cbrA mutant AH1 the levels of gluP were low throughout
the growth curve with respect to the parental strain AEalgD (Fig. 2c).
We next investigated whether the growth inhibition upon Crc over-expression was associated with reduced
expression of gluP. gluP mRNA levels were determined by qRT-PCR at two points of the growth kinetics (6
and 10 h), corresponding to the exponential growth phase of the reference strains. Interestingly, at 10 h Crc
over-expression lowered gluP mRNA levels by 20% whereasat 16 hr this effect was substantially greater as the
levels of gluP were reduced by 60%, thus confirming that the Crc protein has a negative effect on the transcript
abundace of gluP (Fig. 5b). Altogether these results suggested that gluP is a direct target of the Hfq-Crc proteins
in the process of CCR.
The A. vinelandii Hfq protein binds to the leader of gluP and Crc enhances this interaction. A.
vinelandii Crc and Hfq-His protein preparations were used in RNA electrophoretic mobility-shift assays (EMSAs)
to investigate their ability to recognize the putative A-rich Hfq-binding motif identified close to the AUG trans-
lation start codon of gluP mRNA. This analysis was achieved by using a 26 nt end-labelled RNA oligonucleotide
containing the gluP A-rich Hfq-binding target. Consistent with previous reports, the A. vinelandii Crc protein
alone was unable to bind to this A-rich motif (Fig. 7a), while Hfq-His could bind to the RNA oligonucleotide
forming a weak complex that dissociated during electrophoresis. However, when both proteins were present, a
clear ribonucleoprotein complex was formed (Fig. 7a). Based on the intensity of the shifted band, titration assays
showed that efficient formation of the ribonucleoprotein complex required approximately equimolar amounts of
Hfq and Crc (considering Hfq as a hexamer) (Fig. 7b). Complex formation was favoured when Hfq was in excess
relative to Crc, as has been shown for alkS mRNA in P. putida13. This stable complex was not observed with the
control RNA lacking an A-rich Hfq-binding motif (Fig. 7c). Based on these results, we concluded that Crc-Hfq
proteins form a complex with the gluP leader at the A-rich Hfq-binding motif.
Figure 6. The gene gluP of A. vinelandii encodes a glucose transporter. (a) Genomic context of the A. vinelandii
gluP gene. (b) Growth of the A. vinelandii glup::Sp mutant AHI30 and its derivative carrying the pSRK-gluP
plasmid (gluP+) on plates of solid Burk’s medium supplemented with 2% sucrose (BS) or 50 mM glucose (BG).
Where indicated, 1 mM IPTG was added to induce transcription of gluP from the lac promoter. (c) Growth
kinetic, measured as cell biomass (g l−1) (squares) and glucose consumption (circles) by the E. coli WHIPC
mutant (closed symbols) or its derivative carrying the pSRK-gluP (gluP+) plasmid (open symbols), in the
presence of 0.1 mM IPTG. Cultures were developed in M9 mineral medium supplemented with 2.5 g l−1 of
glucose.
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The P. putida Hfq and Crc proteins can bind to the leader of A. vinelandii gluP. Because we were
unable to obtain an A. vinelandii crc mutant derivative, we analysed whether the P. putida Crc and Hfq proteins
can regulate the expression of the A. vinelandii gluP gene. As a first approach, we explored whether the P. putida
proteins Hfq and Crc could form a complex with the leader of gluP mRNA in vitro. Band-shift assays were con-
ducted using purified P. putida Hfq-His and Crc proteins extracted from an Hfq-null E. coli expression strain and
the 26 nt end-labelled gluP RNA oligonucleotide used in the preceding section. When applied independently,
neither the P. putida Crc nor the Hfq protein could bind to the gluP A-rich Hfq-binding motif at the tested con-
centrations (Fig. 7d). However, when both proteins were present, a stable ribonucleoprotein complex was formed.
This result implies that the P. putida Hfq and Crc proteins are able to recognize and form a complex with the
A-rich motif of the gluP mRNA in vitro.
Effect of the P. putida Crc protein on the translation of gluP mRNA. To analyse the effect of the
P. putida Crc protein on gluP translation, a post-transcriptional reporter fusion was constructed as previously
reported31. This reporter fusion consists of a gluP’-lacZ translational fusion (60 nt of gluP relative to the ATG
Figure 7. Hfq-Crc proteins form a stable ribonucleoprotein complex with the A-rich Hfq-binding RNA motif
of gluP. (a) Binding of the A. vinelandii Crc and Hfq proteins to an RNA oligonucleotide containing the A-rich
Hfq-binding motif present at the translation initiation region from gluP. (b) Molar ratio of the A. vinelandii
Crc and Hfq proteins needed to form a ribonucleoprotein complex with the RNA containing the A-rich Hfq-
binding gluP motif. As a control an RNA oligonucleotide lacking an A-rich motif was used (c). (d) Binding of
the P. putida (Pp) Crc and Hfq proteins to the RNA A-rich Hfq binding motif of gluP. RNA and protein-RNA
complexes were resolved in a non-denaturing polyacrilamide gel. The concentration of Crc (expressed as
monomers) and Hfq (expressed as hexamers) is indicated. Arrows point to the position of free RNA and of the
ribonucleoprotein complex (RNP). (e) Sequence of the gluP mRNA leader region. The underlined sequence
corresponds to the RNA oligonucleotide used in the band-shift assays, which contains the A-rich motif. The
AUG translation initiation codon is in bold face. The sequence of the oligonucleotide used as control in panel
(c), named DmpR 6C, is also shown.
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translation initiation site, which includes the A-rich Hfq-binding motif and the first 8 codons of gluP, fused in
frame to lacZ) cloned into plasmid pSEVA424. The gluP’-lacZ sequence is transcribed from the heterologous Ptrc
promoter of the vector, which can be activated by addition of IPTG. The generated plasmid, named pEQ424P,
was introduced into P. putida strains KT2440 and KTCRC (a crc::tet derivative of KT2440). In cells growing
in LB medium, ß-galactosidase activity was not detected when no IPTG was added to the growth medium
and increased strongly in the presence of 0.5 mM IPTG (Fig. 8b). Interestingly, at the mid-exponential phase,
ß-galactosidase activity in the presence of IPTG was approximately 6-fold higher in the crc genetic background
than in the wild type strain (Fig. 8c). These results indicate that the Crc-Hfq proteins from P. putida recognize the
gluP A-rich Hfq-binding motif reducing translation in a Crc-dependent manner.
Discussion
One of the main characteristics of the free-living Azotobacter genus is its capacity for fixing nitrogen in aerobio-
sis5. In a previous study, the preference for acetate assimilation over glucose was shown in A. vinelandii cultivated
under nitrogen fixing conditions8, 9. In this study, we reported the characterization of the regulatory systems
CbrA/CbrB and Crc/Hfq in controlling the process of CCR, specifically the catabolic repression of glucose con-
sumption, under diazotrophic conditions. Similar to members of the Pseudomonas genus, we found that the
two-component system CbrA/CbrB is at the head of the regulatory cascade controlling CCR. Inactivation of the
gene encoding CbrA diminished expression of the sRNAs CrcZ and CrcY at least 4-fold under standard labora-
tory conditions, i.e., minimal Burk’s medium amended with 2% sucrose (Fig. 3). Consistent with this result, puta-
tive RpoN promoters and sites recognized by the CbrA cognate RR CbrB were identified in the regulatory region
of both crcZ and crcY genes. Our results revealed low expression levels of these sRNAs in the strain lacking CbrA.
These results could be attributed to non-specific phosphorylation of the CbrA-cognate RR CbrB. However, the
existence of alternative CbrA/CbrB-independent promoters driving crcZ and crcY expression cannot be ruled out.
Putative sequences for σ70 promoters were also identified in the regulatory regions of both crcZ and crcY (Fig. 1
and Supplementary Fig. S2), but their functionality and physiological relevance need to be further investigated.
RNA EMSAs demonstrated that CrcZ from A. vinelandii formed a stable ribonucleoprotein complex with
A. vinelandii proteins Hfq and Crc, as has been shown in P. putida13. Hfq was capable of recognizing the CrcZ
A-rich Hfq-binding motifs,but the presence of Crc changed the electrophoretic mobility of the shifted band and
enhanced the stability of the complex (Fig. 4b and c). This result implies that the sRNA CrcZ (and possibly CrcY)
antagonizes the repressing activity of Hfq and Crc and prevents them from controlling their target genes, as it
has been proposed to occur in several Pseudomonas species. The HK CbrA was necessary for the assimilation
of glucose either as the sole carbon source or when mixed with acetate (Fig. 2). This result was attributed to low
expression levels of the CrcZ and CrcY sRNAs in the cbrA genetic background that in turn allowed the Hfq-Crc
repressing activity. Indeed, we found that over-expression of the A. vinelandii Crc protein from an inducible
promoter in the wild type strain AEIV arrested cell growth at the mid-log phase when the strain was cultured in
the presence of glucose (Fig. 5a). This result further indicates the ability of Crc to repress glucose assimilation.
We found that A. vinelandii imports glucose using a GluP transporter, a protein that is absent in most
Pseudomonas spp. GluP was essential for glucose consumption in A. vinelandii, whilst expression of gluP in an
E. coli mutant (with inactivated or deleted genes encoding the major glucose transporters) restored the mutant’s
ability to grow in the presence of glucose (Fig. 6c). Similarly, the GluP homologue from B. abortus, a glucose and
galactose transporter, was functional in E. coli30. A. vinelandii GluP belongs to the FGHS family of H+-coupled
symporters. This finding is consistent with an early report describing active transport of D-glucose by membrane
vesicles prepared from A. vinelandii cells7. The transport of glucose was coupled to the oxidation of L-malate
and was induced by growth of the cells on D-glucose but arrested in cells grown on acetate. The presence of
GluP in A. vinelandii, rather than the GtsABC sugar ABC transporter commonly found in Pseudomonas species,
might be due to the intrinsic physiological and metabolic characteristics of this bacterium. A global compari-
son of transport capabilities among several bacterial species suggested that the preponderance of proton motive
force-driven transporters, versus ATP-driven permeases, seems to be explained by the type of energy source most
readily generated by the organism32. A. vinelandii exhibits a high respiratory rate which is needed to protect the
nitrogenase enzyme from inactivation by oxygen during aerobic nitrogen fixation, a process that has not been
reported in Pseudomonas species1, 2. Therefore, the proton motive force generated by the highly active respiratory
electron-transport chain in A. vinelandii can explain the presence of the GluP H+-dependent symporter.
Although the Hfq-Crc system in Pseudomonas spp. is known to exert a posttranscriptional effect it has been
reported that the transcript abundance of target genes could be also altered, presumably reflecting the effects
of translational control on mRNA stability20. Interestingly, gluP mRNA levels were reduced in the presence of
acetate and increased 19-fold during glucose assimilation. Moreover, the gluP mRNA levels were reduced by Crc
over-expression or in the absence of the HK CbrA, suggesting that gluP could be one of the Crc-Hfq targets dur-
ing CCR control. Indeed, we found that Crc and Hfq proteins from either A. vinelandii or P. putida cooperated to
form a stable ribonucleoprotein complex with the gluP RNA A-rich Hfq-binding motif (Fig. 7a and d). Moreover,
the presence of the gluP A-rich Hfq-binding motif at the leader region of the lacZ reporter gene inhibited trans-
lation in P. putida in a Crc-dependent manner. These results imply that the Crc-Hfq proteins from A. vinelandii
and P. putida are functionally interchangeable which is further reinforced by the fact that these two proteins are
highly conserved in these organisms (Supplementary Fig. S5).
The A. vinelandii eda-1 gene, encoding a KDPG-aldolase enzyme of the ED pathway for glucose assimilation,
is predicted to have an A-rich Hfq-binding motif (Supplementary Table S1). EMSAs showed that the Crc-Hfq
proteins from either A. vinelandii or P. putida could recognize this motif (Supplementary Fig. S6), implying that
the eda-1 gene is a target of these proteins. The genome of A. vinelandii has been shown to be abundant in highly
similar homologues among carbohydrate metabolism genes33. The eda-1paralogue eda-2 (Avin15720) shares 81%
identity with eda-1 but it lacks apparent A-rich Hfq-binding motifs. Taken together these results suggest that
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glucose uptake may constitute a key step during the CCR process for this carbohydrate in A. vinelandii. However,
other genes involved in the assimilation of glucose are also controlled by Crc/Hfq, a multi-tier strategy that has
also been observed in P. putida34.
Figure 8. Effect of the Crc protein on the expression of a gluP’-lacZ translational fusion in P. putida. The strains
used were KT2440 (wild type) and KTCRC (crc::tet) carrying plasmid pEQ424P (gluP’-lacZ). Cells were grown
in LB medium and where indicated, expression of the gluP’-lacZ translational fusion was induced from the Ptrc
promoter by addition of 0.5 mM IPTG. (a) Growth kinetic (measured as the turbidity at 600 nm) of each strain.
(b) Activity of ß-galactosidase as a function of cell growth. (c) ß-galactosidase activity values of the gluP’-lacZ
translational fusion observed at a turbidity of 0.6 (mid-exponential phase) for KT2440 or KTCRC strain. Three
independent assays were performed, and a representative one is shown. Significant difference was analyzed by
t-test. Statistical significance is indicated (**p < 0.01).
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The cbrA::miniTn5 mutant was able to utilise sucrose as the sole carbon source. Growth in this carbon source,
however, was compromised as the cbrA::miniTn5 mutant reached three-fold less biomass than the parental strain
(Fig. 2a). Given the reiteration of genes for the metabolism of glucose explained above, we speculated that the
uptake of this disaccharide might be subjected to CCR control. In agreement with this idea a putative A-rich
Hfq-binding motif (AAAAACAA) at the leader region of lacY (Avin51800; encoding the sucrose permease) was
identified. Since growth on sucrose was allowed in the absence of cbrA or upon Crc sobre-expression, two condi-
tions that clearly inhibited growth on glucose, it is likely that lacY is not subjected to a strong CCR control, as is
the case for the glucose transporter GluP.
In conclusion, in this study we presented evidence indicating that glucose transport in A. vinelandii occurs
through a GluP transporter, rather than through the GtsABC sugar transporter present in most Pseudomonas
spp. However, we found that gluP expression is under the control of the CbrA/CbrB and Crc/Hfq systems, as it
occurs with the gtsABC genes in Pseudomonas spp.21, 35, 36. In fact, we showed that during diazotrophic growth the
A. vinelandii CbrA/CbrB and Crc/Hfq systems operate in a similar manner and they are functionally conserved
with respect to P. putida and other Pseudomonas species in regulating the CCR process. This finding reinforces
the importance of these regulatory systems in the metabolism of members of the Pseudomonadaceae family.
Methods
Bacterial strains and culture conditions. Bacterial strains, plasmids and oligonucleotides used in this
study are listed in Tables S2, S3 and S4, respectively. A. vinelandii was grown in minimal Burk’s -sucrose medium
as previously reported37. E. coli DH5α38 and EC6779 strains12 were grown on Luria-Bertani (LB) medium at
37 °C39. The WHIPC strain was grown in Mineral M9 medium supplemented with 2.5 gl−1 of glucose. P. putida
wild type strain KT244040 and its derivative KTCRC were grown in LB as previouslyreported34. When needed,
the final antibiotic concentrations (in µgml−1) used for A. vinelandii and E. coli were as follows: kanamycin (Km)
1.5 and 10; spectinomycin (Sp), 100 and 100; tetracycline (Tc) 10 and 10. A. vinelandii transformation was carried
out as previously described41. The Supplementary Methods summarize general nucleic acid procedures.
Construction of plasmids pSRK-crc and pSRK-gluP. crc ORF flanked with SacI and HindIII restriction
sites was PCR amplified using primers SPcrc-F (SacI) and crc-R (HindIII). This fragment (1053 bp) was ligated
into corresponding sites of pSRKKm26, generating pSRK-crc. gluP ORF was PCR amplified with primers gluP-F
and gluP-R and was cloned into vector pJET 1.2 (Thermo Fisher Scientific), which produced plasmid pAH01. A
1.9 kb BglII-XhoI DNA fragment containing gluP was released from pAH01 and was cloned into the correspond-
ing sites of vector pSRKKm, which produced plasmid pSRK-gluP. Plasmids derived from pSRKKm were used to
express the cloned gene from an isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) inducible lac promoter.
Construction of plasmid pEQ424P. To generate a translational fusion of the gluP leader region with
lacZ, an EcoRI-BamHI fragment of 670 bp (−630 to +28 nt of the gluP gene) was PCR amplified using primers
gluPF-EcoR1 and gluPR-Bam and was cloned between the corresponding sites of plasmid pUJ942. pUJ9 contains
a promoterless lacZ gene, and generates plasmid pUJEQP. A post-transcriptional reporter fusion (Ptrc-gluP’-lacZ)
was constructed in plasmid pSEVA42443, in which the gluP’-lacZ translational fusion could be transcribed from
the Ptrc promoter of the vector upon addition of IPTG. To this end, the gluP’-lacZ was PCR-amplified with prim-
ers LgluP-FwEcoRI and LacZ-RevHindIII containing restriction sites for EcoRI and HindIII, respectively, and
using plasmid pUJEQP as a template. The amplified fragment was EcoRI-HindIII double digested and cloned into
the corresponding restriction sites of plasmid pSEVA424, producing plasmid pEQ424P. The correct construction
was verified by DNA sequencing. Plasmid pEQ424P was introduced by electroporation into P. putida wild type
strain KT244040 and its derivative KTCRC that carries an inactivated crc::tet allele34.
Generation of mutant GG15 (cbrA::miniTn5). Construction of a random miniTn5 mutant bank derived
from strain AEIV with the miniTn5SSgusA40 (Spr) transposon44 was previously reported45. Mutant GG15 was
identified in this mutant bank due to its highly mucoid phenotype on plates of Burk’s-sucrose medium. The
miniTn5 lacks PstI restriction sites. Therefore, the chromosomal region interrupted by the miniTn5 was cloned
as a PstI fragment into vector pBluescript KS+ (Stratagene), producing plasmid pGG15. Nucleotide sequencing
across the transposon insertion junction, using primers Tn5O and Tn5I45 and plasmid pGG15 as DNA template
was conducted and showed that the cbrA gene was disrupted in mutant GG15.
Construction of A. vinelandii mutants. A. vinelandii was transformed with linear DNA carrying the
desired mutation to ensure double reciprocal recombination and allelic exchange. Transformants were selected
on Burk’s-sucrose medium amended with the corresponding antibiotic. Gene inactivation was confirmed by
PCR analysis. For mutant AEalgD, AEIV cells were transformed with plasmid pJGD (algD::Km) linearized with
PstI. The resulting Kmr mutant was named AEalgD, and the corresponding gene inactivation was confirmed
by PCR analysis using oligonucleotides algDF and algDR. For mutant AH1, competent A. vinelandii cells of
mutant AEalgD were transformed with plasmid pGG15 (cbrA::miniTn5). Transformants Spr were selected, and
the presence of the cbrA::miniTn5 mutation and the absence of wild type copies of cbrA were verified by PCR
amplification using oligonucleotides F-1(cbrA) and R-1(cbrA). For the construction of mutant EQR02 (cbrA::Sp),
plasmid pJGEY2 (cbrA::Sp) was linearized with EcoRI and was used to transform A. vinelandii AEIV cells, and
double recombinants Spr were selected. The resulting cbrA::Sp mutant was named EQR02. PCR amplification of
the cbrA locus with oligonucleotides F-1(cbrA) and R-1(cbrA), confirmed the presence of the cbrA::Sp mutation
and the absence of wild type copies of the cbrA gene. Mutant AHI30 (gluP::Sp) was constructed by transforming
wild type AEIV cells with plasmid pAH03, previously linearized with XhoI, and transformants resistant to Sp
were selected. The presence of the gluP::Sp mutation and the absence of wild type gluP alleles were confirmed by
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PCR amplification patterns using primer pairs gluP-F and gluP-R. Construction of plasmids pJGD, pJGEY2 and
pAH03 is detailed in the Supplementary Methods.
Construction of chromosomal PcrcZ-gusA and PcrcY-gusA transcriptional fusions. For the construction of strains
carrying PcrcZ-gusA transcriptional fusions, plasmid pEY05 was generated. This plasmid carries a PcrcZ-gusA
transcriptional fusion that can be integrated into the scrX locus in the A. vinelandii chromosome. Construction
of plasmid pEY05 is described in the Supplementary Methods. Competent A. vinelandii cells of strains AEIV and
EQR02 (cbrA::Sp) were transformed with plasmid pEY05 (PcrcZ-gusA, Tcr) previously linearized with enzyme
NdeI. AEIV and EQR02 Tcr derivatives were iso lated and confirmed, by PCR amplification patterns to carry
the PcrcZ-gusA construction; the resulting strains were named AE-Zgus and CbrA-Zgus, respectively. For the
construction of strains carrying PcrcY-gusA transcriptional fusions plasmid pGJ112 was generated. This plasmid
is derived from plasmid pUMATcgusAT46 and carries the regulatory region of crcZ directing transcription of
the gusA reporter gene to be integrated into the melA locus. Construction of plasmid pGJ112 is described in the
Supplementary Methods. Competent A. vinelandii cells from strains AEIV and EQR02 (cbrA::Sp) were trans-
formed with plasmid pGJ112 (Tcr) previously linearized with enzyme NdeI. AEIV and EQR02 derivatives Tcr
were isolated and confirmed, by PCR amplification patterns to carry the PcrcY-gusA construction; the resulting
strains were named AE-Ygus and Cbr-Ygus, respectively.
Construction of the E. coli mutant WHIPC. Mutant WHIPC carries mutations in genes encoding
the major glucose transporter systems (∆ptsHIcrr, ∆mglABC::FRT-Cm-FRT, galP::FRT) and was constructed
from mutant WHIP47 which lacks the galactose:H+ symporter GalP transporter and genes encoding the general
components of the phosphoenol pyruvate:sugar phosphotransferase (Pts) system (galP::FRT; ∆ptsHIcrr). The
mglABC operon was inactivated in mutant WHIP as previously described48, employing PCR products amplified
with primers mglABCDtF and mglABCDtR and plasmid pKD3 as the DNA template47. Verification of the chro-
mosomal mglABC deletion in mutant WHIPC was accomplished by PCR using primers mglABF and mglABR as
previously reported47.
Quantitative real time reverse transcription (qRT-PCR). A. vinelandii strains were cultured in Burk’s
minimal medium supplemented with the indicated carbon source. Details of total RNA extraction, the primers
design, cDNA synthesis and qRT-PCR amplification conditions are reported in the Supplementary Methods.
The sequences of the primer pairs used for the genes gluP (gluP qPCR Fw and gluP qPCR Rv) and 16 s (16 S Fw
and 16 S Rv) are listed in Table S4. As in previous studies49, 16 s rRNA (Avin55110) was used as internal control
in the same sample to normalize the results obtained, as its expression was constant under the tested conditions.
The quantification technique used to analyze the generated data was the 2-∆,∆CT method reported previously50.
RNA band-shift assays. A. vinelandii Crc and Hfq-His proteins were expressed and purified as
described in the Supplementary Methods. RNA oligonucleotides containing the A-rich Hfq-binding motifs
of gluPand eda1, were synthesized by Sigma, labelled with T4 polynucleotide kinase and [γ-32P]-ATP
and purified through MicroSpin G-25 columns (GE Healthcare). Their sequences are as follows: gluP,
5′-AAGCAACAAUCACAACAAGAGGAAAU; eda-1, 5′-CAUCCAGAACAACAAACCGGCCACUU. CrcZ
sRNA was obtained by in vitro transcription. To this end, crcZ gene flanked with HindIII and EcoRI restriction
sites was obtained by PCR using primer pairs crcZHd-Fw and crcZEco-ROK and was ligated into the correspond-
ing sites of pTZ19r (Thermo Fisher Scientific), which generated pEQZIT. The insert was sequenced to ensure
that it contained the desired DNA fragment. Radioactively labelled CrcZ was obtained as previously described25.
EMSAs were conducted as described13.
Analytical methods. Protein levels were determined as previously reported51. β-Glucuronidase activity was
determined as previously described52. One U corresponds to 1 nmol of o-nitrophenyl-β-D-glucuronide hydro-
lysed per min per µg of protein. The β-galactosidase activity of P. putida cells was determined as follows: an
overnight culture of P. putida was diluted to a final turbidity (A600) of 0.05 in fresh LB medium. Where indicated,
0.5 mM IPTG was added to induce transcription from promoter Ptrc. Cells were allowed to grow at 30 °C with
vigorous aeration, and aliquots were taken at different time points. β-galactosidase activity was measured as pre-
viously described39 using o-nitrophenyl-β-D-galactoside as the substrate. Glucose and acetate quantification were
performed by HPLC using an Aminex HPX-87H column (300 9 7.8 mm) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The
eluent used was H2SO4 (7 mM) at a flow rate of 0.8 mlmin−1. Glucose and acetate detection were achieved using
a refractive index (RI) detector (Waters 2414 detector). All experiments were conducted at least three times, and
the results presented are the averages of independent runs. When required, the Figures show the mean values and
standard deviations among biological replicates.
Statistical analysis. Statistical analyses were performed using GraphPad Prism (version 7.0) software (GraphPad
Software, La Jolla, CA). Statistical significance was determined using two-tailed, unpaired Student’s t-test, and a
p-value ≤ 0.05 was considered significant.
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Acknowledgements
We thank A. Ocádiz, J. M. Hurtado, D.S. Castañeda and S. Becerra for computational support and for
oligonucleotides synthesis. We are grateful to G. Gosset for providing E. coli strain WHIP and to B.E. Uhlin
for providing the E. coli MG1655 Hfq-null strain. This work was supported by grants from Programa de Apoyo
a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, UNAM (PAPIIT IN208514) and from the Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT CB-240095 and INFR 253487) to Cinthia Núñez, and grants
BFU2012-32797 (MINECO, Spain), and BIO2015-66203-P (MINECO/FEDER) to Fernando Rojo. EQR was
recipient of a scholarship from CONACyT.
Author Contributions
C.N. and F.R. conceived the project; E.Q.R., R.M., A.H.O., J.C.F.J., L.F.M.M. and J.G. performed experiments;
C.N., E.Q.R., G.E. and F.R. wrote the manuscript. E.Q.R., R.M., J.C.F.J., L.F.M.M., G.E., F.R. and C.N. discussed
and reviewed the manuscript.
Additional Information
Supplementary information accompanies this paper at doi:10.1038/s41598-017-00980-5
Competing Interests: The authors declare that they have no competing interests.
Publisher's note: Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and
institutional affiliations.
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International
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copyright holder. To view a copy of this license, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© The Author(s) 2017
1
Supplementary Information
Glucose uptake in Azotobacter vinelandii occurs through a GluP
transporter that is under the control of the CbrA/CbrB and Hfq-Crc
systems
Elva Quiroz-Rocha1, Renata Moreno2, Armando Hernández-Ortíz1, Juan Carlos Fragoso-
Jiménez3, Luis FelipeMuriel-Millán1, Josefina Guzmán1, Guadalupe Espín1, Fernando
Rojo2 and Cinthia Núñez1*
1 Departamento de Microbiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad
Nacional Autónoma de México. Cuernavaca, Morelos, México
2 Departamento de Biotecnología Microbiana, Centro Nacional de Biotecnología, CSIC,
Darwin 3, Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain
3 Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de Biotecnología,
Universidad Nacional Autónoma de México. Cuernavaca, Morelos, México
* cinthia@ibt.unam.mx; Tel. (+52) 777 3290873; Fax (+52) 777 3172388.
2
Supplementary Methods
Nucleic acid procedures. The A. vinelandii genome sequence1 was used for designing the
primers used for PCR amplifications. The high fidelity Phusion DNA polymerase (Thermo
Scientific) was used for all PCR amplifications using chromosomal DNA from strain AEIV
as template.
Plasmids construction.
pJGD. Plasmid pMSD27, which carries the algD gene2 was partially digested with ScaI
enzyme disrupting algD in the codon 256; ends were refilled with Klenow enzyme and a
Kmr cassette, excised with EcoRV endonuclease from plasmid pBSL993, was ligated
producing plasmid pJGD (algD::Km).
pJGEY2. cbrA ORF was PCR amplified using oligonucleotides F-1(cbrA) and R-1(cbrA)
and was cloned into pMOS blue vector (GE Healthcare) producing plasmid pCN48. An Spr
cassette derived from plasmid pHP45Ω4 was inserted into the unique StuI site disrupting
the cbrA gene. The resulting plasmid, named pJGEY2 (cbrA::Sp).
pAH03. A fragment of 1.9 kb was PCR amplified using primers gluP-F and gluP-R and
cloned into plasmid pCR2.1-TOPO (Invitrogen) generating plasmid pAH01. The EcoRI
gluP fragment of 1.945 kb, derived from plasmid pAH01, was subcloned into vector
pBluescript KS+ (Stratagene) producing plasmid pAH02. pAH02 was excised with StyI
releasing a gluP internal fragment of 600 pb. The StyI cohesive ends were made blunt with
the Klenow enzyme and a SmaI fragment carrying a Spr cassette released from plasmid
pHP45Ω4 was then ligated, generating plasmid pAH03 (gluP::Sp).
pEY05. scrX was previously shown to be dispensable for vegetative growth5. A region of
3.5 kb containing the gene scrX was PCR amplified using primers scrX-F and scrX-R. The
resulting product was sub-cloned into vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) generating
plasmid pEY01. An inverse PCR was conducted to delete the regulatory and the structural
region of scrX, by using primers scrXInvF and scrXInv-R. The resultant product was
digested with enzyme StuI and ligated to a 5 kb fragment containing the crcZ promoter,
followed by the gusA gene and a Tcr cassette, generating plasmid pEY05 (PcrcZ-gusA).
The 5 kb fragment was obtained by PCR amplification using primers pJGgusF and pJGgus-
3
R and plasmid pEY02 as DNA template. Plasmid pEY02 is a pCN154 derivative (Tcr),
used for the construction of chromosomal transcriptional fusions with gusA in A. vinelandii
strain UW166, and carries an XbaI-EcoRI fragment of 500 bp comprising the regulatory
region of crcZ, amplified by PCR using primers pcrcZFXb and pcrcZRRI.
pGJ112. A fragment of 246 bp, carrying the crcY regulatory region, was amplified by PCR
using primers crcY-Xb-F and crcY-Pst-R, which include restriction sites for XbaI and PstI
endonucleases, respectively. This fragment was subcloned into vector pUMATcgusAT7
previously cut with XbaI and PstI enzymes generating plasmid pGJ112 (PcrcY-gusA).
Expression and purification of A. vinelandii Crc protein: The Crc protein was purified
with no His-tag using the Impact-CN intein system (New England Biolabs), as described8.
To construct a plasmid specifying the Crc-intein fusion, the crc gene was PCR amplified
using AEIV chromosomal DNA as template and primers crc-NdeFw and crc-XhoRv,
containing a restriction site for NdeI and XhoI enzymes, respectively. The resulting
fragment was cloned between the NdeI-XhoI sites of the PT7 expression vector pTYB1
(New England Biolabs), generating plasmid pEQEcrc. The amplified DNA segment was
sequenced to assure the absence of undesired mutations. Plasmid pEQEcrc was transformed
into the E. coli EC6779, an Hfq-null derivative of the E. coli T7 expression strain
BL21(DE3)9, and overproduction of the Crc-intein fusion was induced by addition of 0.5
mM IPTG to cells grown to mid-log phase (A600 of 0.6). After 4 h at 37°C, cells were
collected and disrupted by sonication in 20 mM Tris-HCl, pH 8, 500 mM NaCl, 0.1%
Triton X-100, 50 μM PMSF. After eliminating cell debris by centrifugation for 30 min at
20 000 × g at 4°C, the supernatant was loaded onto a chitin column. The column was
extensively washed with wash buffer (250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5). The Crc-
intein fusion was cleaved by an overnight treatment with wash buffer containing 100 mM
DTT. The Crc protein was eluted from the column, dialysed against 200 mM NaCl, 20 mM
Tris-HCl, pH 8. Protein concentration was determined from BCA (Pierce), and stored at
−70°C in 20 mM Tris-HCl, pH 8.0; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA; 20% glycerol.
Expression and purification of A. vinelandii Hfq-His. The A. vinelandii hfq gene
carrying in frame fusions to six consecutive histidine codons prior to the termination codon,
was synthesized as a 267 bp NdeI-XhoI fragment using primers exphfqFw and exphfqR.
4
This fragment, having a NdeI site overlapping the ATG initiation codon and a XhoI
downstream of the termination codon, was sub-cloned between these sites of the T7
expression vector pET22b (Novagen) to generate pET22::Hfq. Purification of A. vinelandii
Hfq protein was performed using expression plasmid pET22::Hfq. This plasmid was
introduced into EC6779 strain. Hfq-His protein was purified from crude cell lysates of a
culture grown to OD600 of 0.6 prior to overnight induction with 1 mM IPTG by Ni2+-
affinity chromatography using a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.0; 300 mM
NaCl, 5 mM imidazole and a protease inhibitor cocktail. The Hfq-His protein was
recovered by stepwise elution with the same buffer containing 20 to 250 mM imidazole
followed by extensive dialysis of a pool of the most concentrated fractions to remove
imidazole. Final preparations were stored at −20°C in storage buffer [20 mM Tris-HCl, pH
8.0; 300 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); 40% glycerol].
Quantitative real time reverse transcription (qRT-PCR). The cells were collected by
centrifugation, and the total RNA was extracted as described10. Genomic DNA
contamination in the total RNA samples was removed with DNase I (Thermo Scientific).
The RNA concentration was measured by 260/280 nm ratio absorbance. RNA integrity was
analyzed by agarose gel electrophoresis. The absence of DNA was verified by RT-PCR
using primers for rpoS. cDNA was synthesized using the Revert Aid TM H First Strand
cDNA Synthesis kit (Thermo Fisher Scientific) and a mixture of the specific DNA primers.
The primers were designed using the Primer3 program (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) with
an optimal lenght of 20 bases, and a melting temperature of 60oC. The cDNA generated
was used as template for qRT-PCR assays performed with a Light Cycler 480 II instrument
(Roche), using the Maxima TM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) kit (Thermo
Scientific). Each primer set was validated by verifying specific single product amplification
by melting-curve analyses. Then, the efficiency of PCR was assessed by developing
standard curves for each amplicon using dilution series of the cDNA corresponding to the
reference sample. cDNAs derived from the experimental and reference samples were
amplified using quantities within the linear range of the standard curve. Amplification
conditions were 10 min at 95° C, and a two-step cycle at 95° C for 15 s and 60° C for 60 s
for a total of 40 cycles. The size of all amplimers was from 95 -110 bp. Three biological5
replicates (independent cell cultures) were performed with three technical replicates for
each one generating similar results.
6
Supplementary Tables
Table S1. A. vinelandii genes involved in glucose transport and catabolism containing
putative A-rich Hfq-binding motifs.
Sequence Position (rel. to AUG) Gene ID number Description
ACAACAAGA -7 to -17 gluP Avin_04150 glucose/galactose transporter protein
AAAGAAAAA -5 to -13 zwf-3 Avin_16620 glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase
AAAAAGAACAA -6 to -16 zwf-2 Avin_17630 glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase
AACAACAAA -18 to -26 eda-1 Avin_27250 keto-hydroxyglutarate-aldolase/keto-deoxy-phosphogluconate aldolase
AAAAACAACAA -16 to -26 kguT Avin_26900 2-ketogluconate transporter
AAGAACA +3 to +9 kguD Avin_26910 2-ketogluconate 6-phosphate reductase
AACAACAA +1 to -8 eno Avin_38790 phosphopyruvate hydratase (enolase)
7
Table S2. Bacterial strains used in this study
Name Genotype/Relevant characteristics Reference
A. vinelandii strains
AEIV (also name E
strain) Wild type strain 11
EQR02 AEIV derivative carrying a cbrA::Sp mutation. Spr This work
AEalgD AEIV derivative carrying an algD::Km. Unable to produce alginate. Kmr This work
GG15 AEIV derivative carrying a cbrA::miniTn5 mutation. Highly mucoid. Spr This work
AE-Zgus AEIV derivative carries a chromosomal crcZ-gusA transcriptional fusion. Tcr This work
CbrA-Zgus EQR02 derivative carries a chromosomal crcZ-gusA transcriptional fusion. Spr, Tcr This work
AE-Ygus AEIV derivative carries a chromosomal crcY-gusA transcriptional fusion. Tcr This work
CbrA-Ygus EQR02 derivative carries a chromosomal crcY-gusA transcriptional fusion. Spr, Tcr This work
AH1 GG15 derivative carries an algD::Km mutation. Sp
r,
Kmr This work
AHI30 AEIV derivative carries a gluP::Sp mutation. Spr This work
P. putida strains
KT2440 Wild type strain 12
KTCRC KT2440 crc null mutant; Tcr 13
E. coli strains:
DH5a supE44 DlacU169 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 14
WHIP ∆ptsHIcrr, galP::FRT 15
WHIPC ∆ptsHIcrr, ∆mglABC::FRT-Cm-FRT, galP::FRT This work
EC6779 Hfq null derivative of BL21 (DE3), Cmr 9
Abbreviations: Cm, chloramphenicol; Tc, tetracycline; Sp, spectinomycin; Km, kanamycin.
8
Table S3. Plasmids used in this study
Plasmids Relevant characteristics Reference
pJET1.2 Cloning vector; Apr Thermo Fisher Scientific
pCR2.1-TOPO Clonning vector; Apr Kmr Invitrogen
pBluescript KS+ Used for subcloning of DNA; Apr Stratagene
pMOS Blue Clonning vector; Apr GE Healthcare
pMSD27 Plasmid containing 5.5 kb of A. vinelandii DNA including algD. Tcr, Apr, Cmr. 2
pUMATcgusAT Vector with the gusA gene for transcriptional fusions; Apr , Tcr 7
pCN154 Vector with the gusA gene for transcriptional fusions; Apr , Tcr 6
pHP45Ω Source of the Spr cassette 4
pUJ9 lacZ promoterless vector, for translational fusions, Apr 16
pTZ19r T7 promoter expression vector, Apr Thermo Fisher Scientific
pSEVA424 IPTG inducible Ptrc expression plasmid; Smr 17
pET22b T7 expression vector, C-terminal histidine tag; Apr NOVAGEN
pTYB1 T7 expression vector for in-frame fusion with an intein tag; Apr New England Biolabs
pKD3 FRT-Cm-FRT, Apr 18
pSRKKm Replicative vector in A. vinelandii contains an IPTG inducible promoter. Kmr 19
pCN48 pMOS Blue vector derivative carries a 2.8 kb fragment containing the cbrA gene This work
pJGD pMSD27 derivative carries an algD::Km mutation This work
pJGEY2 pCN48 derivative carries a cbrA::Sp mutation This work
pGG15
pBuescript KS+ derivative carrying a PstI fragment
containing the cbrA::miniTn5 insertion from strain
GG15
This work
pEY01 pCR2.1-TOPO derivative, carries a 3.5 kb fragment of scrX gene This work
pEY02 pCN154 derivative, carries a PcrcZ-gusA transcriptional fusion. This work
pEY03 pCR2.1-TOPO derivative, carries the crcZ locus of 1.8 kb This work
pEY05 pEY01 derivative, carries a PcrcZ-gusA transcriptional fusion This work
pGJ112 pUMATcgusAT derivative, carries a 0.246 kb fragment of the crcY regulatory region This work
pAH01 pCR2.1-TOPO derivative, carries a 1.9 kb fragment of gene gluP This work
pAH02 pBluescript KS+ derivative, carries an EcoRI gluP fragment of 1.945 kb, from plasmid pAH01 This work
pAH03 pAH02 derivarive carrying an insertion of a Sp
r
cassette within the gluP gene This work
9
pSRK-crc pSRKKm derivative carries a copy of the crc gene This work
pSRK-gluP pSRKKm derivative carries a copy of the gluP gene This work
pUJEQP pUJ9 derivative; carries a 0.67 kb fragment of the A. vinelandii gluP promoter This work
pEQ424P
pSEVA424 derivative; carries a gluP-lacZ
translational fusion under the control of the IPTG
inducible promotor
This work
pET22::Hfq pET22b derivative; carries the A. vinelandii hfq gene This work
pEQEcrc pTYB1 derivative; carries the A. vinelandii crc gene This work
pEQZIT pTZ19r derivative; carries the A. vinelandii crcZ gene This work
Abbreviations: Cm, chloramphenicol; Tc, tetracyclin; Sm, streptomycin; Ap, ampicillin; Sp,
spectinomycin; Km, kanamycin.
10
Table S4. Sequences of the primers used in this study.
Primer Name Nucleotide sequence (5′–3′)
UcrcZ-F2 CAG TTC CGT GAG GAC CTG
DcrcZ-R CAG TTC CGT GAG GAC CTG
scrX-F GAG CTC CGA TGA CGA TCG CTG GCA AC
scrX-R GAG CTC GCG TTC TCA GAT GGC TGG TC
scrXInvF AGGCCTCTATGTAGGTCCTCGCTTG
scrXInv-R AGGCCTTAGGGCAACCGTGCCAGAC
pJGgusF GACCAGTACGTTTCGGTTCTG
pJGgus-R CCCTTGAAAGACTCCAGGAAG
pcrcZFXb TCTAGAGACCTGGAGGACGATGATTTC
pcrcZRRI GAATTCATTGTGGGTGGTACGTCTTG
gluP-F CAT GTG GAT CGA CTC AGG AG
gluP-R CCA GGC ATT CGG TAT AGA AG
SPcrc-F AGGCCTCTATGTAGGTCCTCGCTTG
crc-R GAGCTCGCATCCTGATGATGCTCTGC
crcY-Pst-R CTGCAGTTGTTGTTCTTGAGATACCG
crcY-Xb-F TCTAGACGGTAACAAACGGACGTTAC
mglABCDtF AGC ATT TAT CTC AAG CAC TAC CCT GCA TAA GAA AAA CCG GAG ATA CCA TGG TGT AGG CTG GAG CTG CTT C
mglABCDtR TTT ATG ACC GAA TGC GGA CCA CAT TCA CAT CAT TTC TTA CGC GCG TAT TTA TGG GAA TTA GCC ATG GTC C
mglABF GCT TCG GCG TTC AGT AAC AC
mglABR TAT GAC CGA ATG CGG ACC AC
exphfqFw ATC CAT ATG TCA AAA GGG CAT TCG
exphfqRv ATC CTC GAG GGC GTT GCC GGG TTC GGG
crc-Nde Fw TTT TGG GGG CCA CAT ATG CGG
crc-Xho Rv ATC CTC GAG CAG GCT CAG CAG CCA GTC G
crcZHd-Fw GGA AAG CTT CGT ACA ACA ACA ATA ACA
crcZEco-ROK ACCGAATTCGAACGCAGAAAGGGAGCC
gluP F EcoR1 TTT TTG AAT TCT GAA ACG ATT CAT CAA TA
gluP R Bam TTTTTGGATCCTCTACCGTCGTCATCGTG
LgluP-FwEcoRI TTATTGAATTCGGCCTCTCCTTGAAGCAA
LacZ-RevHindIII TTATTAAGCTTTTATTTTTGACACCAGACCA
F-1(cbrA) GCA CCT ACC AAC TGT CGT CC
R-1(cbrA) GCT GAT GAT CAG GTC GAA GC
algDF CGATCAAGGACTACAACTTC
algDR TTGCTGTCGA AGATGCTCAG
16S Fw ACCGCATCCAAAACTACTGG
16S Rv GCCACTGGTGTTCCTTCCTA
gluP qPCR Fw GCGATTGAGCCTGTACGT TT
gluP qPCR Rv CTGAGGCTGAACAGGTCCTT
11
Supplementary Figures
Figure S1. Predicted secondary structure of the A. vinelandii small RNA CrcZ. It was
conducted using the RNAfold algorithm (http:/ rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi).
The predicted A-rich Hfq-binding motifs 1 to 6 are indicated.
G
U
A
C
A
A
C
A
A
C
AAUA
A
C
A
A
G
A
C G
U
A
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C
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CC
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C G A C
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G
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G
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G
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G
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G
U U U G C U
A
U U
G
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C
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C
C
C
C A
U
UG
G
G
G
G
C
C
A
U C C C G G
A
G C
C A
A
G
GA
GC
CAACCG
GGA
C G
G G
C
G
C A C A
A
C
A
A
G
A
ACAA
C
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AGCA
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GAUU
U
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G
G
G
A
G
C
U
UC
G
G
C
U
C
C
CU
U
U
CU
G
1
2 3
6
5
4
12
Figure S2. Genomic context and nucleotide sequence of the A. vinelandii crcY gene.
The six CrcY A-rich Hfq-binding motifs are indicated by red boxes. The -12 and -24
regions of the RpoN predicted promoter as well as putative sequences recognized by CbrB
(asterisks) are indicated. The predicted -10 and -35 regions of an RpoD promoter are
underlined.
Avin 04820 Avin 04790
c",y
Avín 04820 (stop)
CCGCIGAGCC CCGGCCGGGA TCGGTAACAA ACGGACGTTA CCCAGCGGAG
* *
CCGGACGGGC AACCGG1TGT TAC4CTCACC CCGGCCACGGIGTAGCAG~TC
TGGGTCGAAC GGAAACAGAA TTTCCCTCTC CGTGGGCTCC ACCAAAACAC
-35 -24
CACAAAATAT AAGCCTTTGA TTTTCAATGA CTTTAIIIII TTGGCACAGG
_10-12 1
T AA TG ( TCT A TCTCGCACAC ¡AAr-:-:CCC-AAAAA""'-'-:-::TCC-A -cAAAAA-'---'-'-'-'F GGTA TCT4AAGAAC I
2 3
IAACAAfACGA AACGACTCTG ACAj AACAAG AACA4GCACG GCAGAGACGG
CGCAAACTGA III I I I IGGA GAGGATTCGC GCTCCTGGGG TCTAGGCCCC
4
GCAGCCGGAC AGAqAACAAT AAA1CTACCT CGAGGTAGCG CCCGGACTGG
TTGGATCACT TGGTGATCAT CGCGATATCG GCGATCAAAG AAATACGTTT
GCTCTTGGCC CCGGCTGGGG CCGACTGAAG CACTTTCTTC AGAGTGGCGG
5 6
TCGAqAAAAA CAACAACA~A TCGAGCAc¡AA GAAGAACAAA IGCACAAAGTC
GATTTCGAGG GGAGCTCAGG CTCCCCTCTG TGCTTCGAGC GATCCCCCTT
Avín 04790 (stop)
TCCGGAAAAC CCGGCICACC CCC
13
Figure S3. Predicted secondary structure of the A. vinelandii sRNA CrcY. It was
conducted using the RNAfold algorithm (http:/ rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi).
The predicted A-rich Hfq-binding motifs are indicated by red numbers.
GC A
C
A
C
A
A
C
A
A
AAAU
A
A
A
A
A
A
C
G
GU
AUCU
C A A
G
A
A
C
A
A
C
A
AUAC
G
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A
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C
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G
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A
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C A C G
G
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CGGCGC
A
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U
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U GGAG
AGG
A
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C G C
G
C U
C CU
G
G
G
G
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G
C
C
C
C G
CAG
C C
GG
A
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G A G A A C
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A
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C
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G C C C G G A
C U
G G
UU
G G A U C
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C U
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C
C
C
C
G G
C
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G
G
G
C
C
G
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C
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G A
A G
C A
C
U
U U C U U C
AGA
G U G
G
C G G U C
G
A
C A A
A
A
A
C
A
A
CAA
C
A
GAUCG
AG
CAC
AA
GAAGAA
C
A
A
A
G
C
A
C
A
A
A
G
U
C
G
A
U
U
U
C
G
A
G
G
G
G
A
G
C
U
C
A
G
G
C
U
C
C
C
C
U
C
U
GUGCUUC
GAGCGA
UC
C
C
CC
UU
UC
CG
GAAA
5
3
2 1
14
Figure S4. Effect of Crc over-expression on A. vinelandii growth. Growth kinetics of the
wild type A. vinelandii AEIV strain, harbouring the empty vector pSRK-Km (!) or the
pSRK-crc (crc+) vector, in the presence (!) or absence (") of 1 mM IPTG. Cultures were
developed in Burk’s minimal medium supplemented with 30 mM of sucrose (a), acetate (b)
or succinate (c) as the sole carbon source and 1.5 µgml-1 of kanamycin as a selection
marker. 25 ml of Burk’s medium supplemented with 30 mM sucrose were cultured for 18
h; cells were harvested by centrifugation, washed with phosphate buffer 10 mM pH 7.2 and
resuspended in the same solution. 400 µg of these cells were used to inoculate 50 ml of the
culture medium and samples were collected at the indicated times for protein
quantification. The results represent the averages of the results of three independent
experiments, and error bars depict standard deviations.
0 10 20 30 40 50 60
1
10
100
1000
10000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
a b c
0 10 20 30
1
10
100
1000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
0 10 20 30
1
10
100
1000
Time (h)
Pr
ot
ei
n
µ
g
m
l-1
Empty vector
crc
crc+IPTG
15
Figure S5. Alignment of Hfq proteins from E. coli, P. putida and A. vinelandii. It was
conducted using the Clustal Omega multiple sequence alignment program
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). UniProtKB aligned sequences are E. coli
P0A6X3; P. putida, Q88DD3; A. vinelandii, C1DLQ2. Consensus is indicated below each
amino acid residue by symbols: asterisk, conserved residue; colon, residues with strongly
similar properties; period, residues with weakly similar properties; no symbol, no
conservation of properties. Amino acid residue Y25 involved in recognition of the A-rich
Hfq-binding motif of alkS mRNA in P. putida8 is indicated by a triangle.
16
Figure S6. Hfq-Crc proteins form a complex with the eda-1 RNA A-rich Hfq-binding
motif. Binding of Hfq and Crc proteins from A. vinelandii (Av) (a), or from P. putida (pp)
(b), to an RNA oligonucleotide containing the A-rich motif present at the translation
initiation regions from eda-1 gene (Avin 27250). RNA and protein-RNA complexes were
resolved in a non-denaturing polyacrilamide gel. The concentration of Crc (expressed as
monomers) and Hfq (expressed as hexamers) is indicated. Arrows point to the position of
free RNA and of the ribonucleoprotein complex (RNP). (c) Sequence corresponding to the
eda-1 mRNA leader region. The underlined sequence corresponds to the RNA
oligonucleotide used in the band-shift assays, which contains the A-rich motif. The AUG
translation initiation codon is in bold face.
-!
-!
-!
+!
+!
-!
+!
+!
RNA!
1 μM Hfq (Pp)!
2 μM Crc (Pp)!
RNP
complex!
b
a
-!
-!
-!
+
+
-!
+
+
0.5 μM Hfq (Av)!
1 μM Crc (Av) !
RNP
complex!
RNA!
c
eda-1 (Avin 27250)!
5`-UGAACAGCAUCCAGAACAACAAACCGGCCACUUC
CCAGAGCGUGCCGAGCAUGGCCGACAAGGUCGCCC
17
Supplementary References
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aerobe specialized to support diverse anaerobic metabolic processes. J
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dehydrogenase (algD) from Azotobacter vinelandii. J Bacteriol 178, 1793-1799
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bacteria: a family of DNA fragments designed for in vitro insertional
mutagenesis of gram-negative bacteria. Gene 52, 147-154 (1987).
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functional analysis of iron-sulfur cluster biosynthetic components within
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(2006).
6 Hernández-Eligio, A. et al. RsmA post-transcriptionally controls PhbR
expression and polyhydroxybutyrate biosynthesis in Azotobacter vinelandii.
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synthesis of alkylresorcinols in Azotobacter vinelandii. PLoS One 10, e0117184,
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and functional analysis of the TOL plasmid pWWO fromPseudomonas putida
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controls the Pseudomonas putida benzoate and alkane catabolic pathways
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coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic
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Environ Microbiol 74, 5053-5062, doi:10.1128/AEM.01098-08 (2008).
De: Rebecca E Parales em@editorialmanager.com
Asunto: BULK Your Submission Microbiology MIC-D-16-00432R1 - [EMID:3d02b5fc09a2fad7]
Fecha: 27 de febrero de 2017, 16:40
Para: elvaq@ibt.unam.mx
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CC: elvaq@ibt.unam.mx, ferbon2@outlook.com, valegmp90@hotmail.com, lili.pliego@gmail.com, jadita_9@hotmail.com,
miguel.cocotlyanez@iibiomedicas.unam.mx, josefina@ibt.unam.mx, leonelm@ibt.unam.mx, lfmuriel@ibt.unam.mx,
miguel.castaneda@correo.buab.mx, espin@ibt.unam.mx
Ms. No. MIC-D-16-00432R1
The two-component system CbrA/CbrB controls alginate production in Azotobacter vinelandii
Elva Quiroz-Rocha, Master of Science; Fernando Bonilla-Badía; Valentina García-Aguilar; Liliana López-Pliego; Jade Serrano-Román;
Miguel Cocotl-Yañez; Josefina Guzmán; Carlos L. Ahumada-Manuel; Luis Felipe Muriel-Millán; Miguel Castañeda; Guadalupe Espín;
Cinthia Nuñez
Dear Professor Dr Nuñez,
Thank you for carefully addressing the comments of the reviewers. I am pleased to tell you that your paper has now been accepted for
publication in Microbiology. The Editorial Office will now check that they have all the files needed for publication, and contact you if
anything else is required.
Please note that we cannot publish the accepted version of the manuscript without a completed Licence to Publish form. In addition,
for papers reporting new sequence data, papers will not be published online until the sequence data are released in public databases.
Thank you for submitting your paper to Microbiology. I hope that you will consider the journal for publication of future papers.
Yours sincerely,
Becky Parales
Microbiology
Microbiology
The two-component system CbrA/CbrB controls alginate production in Azotobacter
vinelandii
--Manuscript Draft--
Manuscript Number: MIC-D-16-00432R1
Full Title: The two-component system CbrA/CbrB controls alginate production in Azotobacter
vinelandii
Article Type: Standard
Section/Category: Regulation
Corresponding Author: Cinthia Nuñez
Instituto de Biotecnología
Cuernavaca, Mo MEXICO
First Author: Elva Quiroz-Rocha, Master of Science
Order of Authors: Elva Quiroz-Rocha, Master of Science
Fernando Bonilla-Badía
Valentina García-Aguilar
Liliana López-Pliego
Jade Serrano-Román
Miguel Cocotl-Yañez
Josefina Guzmán
Carlos L. Ahumada-Manuel
Luis Felipe Muriel-Millán
Miguel Castañeda
Guadalupe Espín
Cinthia Nuñez
Abstract: Azotobacter vinelandii, belonging to the Pseudomonadaceae family, is a free-living
bacterium that has been considered a good source for the production of bacterial
polymers such as alginate. In A. vinelandii the synthesis of this polymer is regulated by
the Gac-Rsm post-transcriptional regulatory system, in which the RsmA protein binds
to the mRNA of the biosynthetic algD gene, inhibiting translation. In several
Pseudomonas spp. the two-component system CbrA/CbrB has been described to
control a variety of metabolic and behavioural traits needed for adaptation to changing
environmental conditions. In this work, we show that the A. vinelandii CbrA/CbrB two-
component system negatively affects alginate synthesis a function that has not been
described in Pseudomonas aeruginosa or any other Pseudomonas species.
CbrA/CbrB was found to control the expression of some alginate biosynthetic genes,
mainly algD translation. In agreement with this result, the CbrA/CbrB system was
necessary for optimum rsmA expression levels. CbrA/CbrB was also required for
maximum accumulation of the sigma factor RpoS. This last effect could explain the
positive effect of CbrA/CbrB on rsmA expression, as we also showed that one of the
promoters driving rsmA transcription was RpoS dependent. However, although
inactivation of rpoS increased alginate production by almost 100%, a cbrA mutation
increased the synthesis of this polymer up to 500%, implying the existence of
additional CbrA/CbrB regulatory pathways for the control of alginate production. The
control exerted by CbrA/CbrB on the expression of the RsmA protein indicates a
central role of this system in regulating carbon metabolism in A. vinelandii.
Powered by Editorial Manager® and ProduXion Manager® from Aries Systems Corporation
1
The two-component system CbrA/CbrB controls alginate production in 1
Azotobacter vinelandii 2
Elva Y. Quiroz-Rocha1, Fernando Bonilla-Badía1 , Valentina García-Aguilar2, Liliana 3
López-Pliego2, Jade Serrano-Román1, Miguel Cocotl-Yañez1>, Josefina Guzmán1, 4
Carlos L. Ahumada-Manuel1, Luis F. Muriel-Millán1, Miguel Castañeda2, Guadalupe 5
Espín1 and Cinthia Núñez1. 6
1 Departamento de Microbiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad 7
Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, 8
Morelos. CP 62210, México 9
2 Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, 10
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Apdo. Postal 1622, CP 72000. 11
Present address: Departamento de Medicina. Centro Interdisciplinario de Ciencias 12
de la Salud- Unidad Milpa Alta. Instituto Politécnico Nacional. CICITEC, Ex-13
Hacienda del Mayorazgo, Km. 39.5 Carretera Xochimilco – Oaxtepec. Ciudad de 14
México, CP 12000. México. 15
> Present address: Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, Instituto de 16
Investigaciones Biomédicas. Universidad Nacional Autónoma de México. Ciudad de 17
México. CP 04510, México. 18
19
Corresponding Author: 20
Cinthia Núñez 21
e-mail: cinthia@ibt.unam.mx 22
(+52)7773290873 23
24
Key words: RsmA, CbrA, Azotobacter, alginate, algD translation 25
Subject Category: Regulation 26
27
Manuscript Including References (Word document) Click here to download Manuscript Including References
(Word document) QUIROZ-ROCHA 2017 MICROB.docx
mailto:cinthia@ibt.unam.mx
http://www.editorialmanager.com/mic/download.aspx?id=55049&guid=1884a11b-f62a-412b-adfc-ca9ccfea3ec9&scheme=1
http://www.editorialmanager.com/mic/download.aspx?id=55049&guid=1884a11b-f62a-412b-adfc-ca9ccfea3ec9&scheme=1
2
ABSTRACT 28
Azotobacter vinelandii, belonging to the Pseudomonadaceae family, is a free-living 29
bacterium that has been considered a good source for the productionof bacterial 30
polymers such as alginate. In A. vinelandii the synthesis of this polymer is regulated 31
by the Gac-Rsm post-transcriptional regulatory system, in which the RsmA protein 32
binds to the mRNA of the biosynthetic algD gene, inhibiting translation. In several 33
Pseudomonas spp. the two-component system CbrA/CbrB has been described to 34
control a variety of metabolic and behavioural traits needed for adaptation to changing 35
environmental conditions. In this work, we show that the A. vinelandii CbrA/CbrB 36
two-component system negatively affects alginate synthesis a function that has not 37
been described in Pseudomonas aeruginosa or any other Pseudomonas species. 38
CbrA/CbrB was found to control the expression of some alginate biosynthetic genes, 39
mainly algD translation. In agreement with this result, the CbrA/CbrB system was 40
necessary for optimum rsmA expression levels. CbrA/CbrB was also required for 41
maximum accumulation of the sigma factor RpoS. This last effect could explain the 42
positive effect of CbrA/CbrB on rsmA expression, as we also showed that one of the 43
promoters driving rsmA transcription was RpoS dependent. However, although 44
inactivation of rpoS increased alginate production by almost 100%, a cbrA mutation 45
increased the synthesis of this polymer up to 500%, implying the existence of 46
additional CbrA/CbrB regulatory pathways for the control of alginate production. The 47
control exerted by CbrA/CbrB on the expression of the RsmA protein indicates a 48
central role of this system in regulating carbon metabolism in A. vinelandii. 49
50
3
INTRODUCTION 51
Azotobacter vinelandii is a free-living bacterium member of the Pseudomonadaceae 52
family [1]. It has been considered a good source for the production of polymers of 53
industrial importance such as the polysaccharide alginate and the polyester poly-ß-54
hydroxybutyrate [2-4]. 55
Alginate, synthesized from fructose-6-phosphate, is a linear polymer composed of 56
variable amounts of ß-D-mannuronate and its C-5 epimer α-L-guluronate linked by 1-57
4 glycosidic bonds [2]. In Pseudomonas aeruginosa, the production of alginate has 58
been extensively studied due to its role in the pathogenesis of lung infection in cystic 59
fibrosis patients [5]. The biochemistry and the genetics of alginate biosynthesis are 60
highly conserved between P. aeruginosa and A. vinelandii [5, 6]. The main 61
biosynthetic alg gene cluster (algD-8-44-K-J-G-X-L-I-V-F-A) is headed by algD. In 62
addition to the algD promoters, internal promoters upstream of alg8 and algG have 63
been identified in A. vinelandii [3]. Transcription and translation of the A. vinelandii 64
algD gene, encoding a key enzyme in this pathway, are highly regulated. 65
Transcription is dependent on the stress response sigma factors AlgU and RpoS [7-9], 66
whereas algD translation is dependent on the Gac/Rsm posttranslational regulatory 67
system [10]. 68
In gamma-proteobacteria, the Gac/Rsm signal transduction pathway regulates primary 69
and secondary metabolism [11]. The GacS/GacA two-component system (TCS) 70
activates the transcription of several small RNAs (sRNAs) of the RsmZ-Y (CsrB-C) 71
family that antagonize the activity of the RsmA (CsrA) protein, a global repressor of 72
genes that are expressed in the stationary growth phase [12, 13]. In A. vinelandii, the 73
signal transduction pathway Gac/Rsm controls alginate production. RsmA was found 74
4
to bind to the algD mRNA at a site overlapping the ribosome binding site [10], and 75
the GacA activator is required for transcriptional activation of the RsmZ-Y sRNAs, 76
relieving the repressing activity of RsmA on algD translation [10, 14]. 77
The histidine kinase (HK) CbrA and the response regulator (RR) CbrB constitute a 78
TCS that, together with the Crc system, controls carbon metabolic flow in 79
Pseudomonas species, allowing the preferential utilization of good carbon sources and 80
establishing a healthy carbon/nitrogen balance [15-17]. CbrB, belonging to the NtrC 81
family of RRs, activates transcription of sRNAs of the CrcX, CrcY or CrcZ family 82
[18-20]. While the Crc protein, together with the chaperone Hfq, form a complex with 83
target mRNAs and inhibits translation [17, 21], the Crc sRNAs antagonize such 84
activity. There is evidence indicating that not all activities of the CbrA/CbrB TCS are 85
mediated by the Crc system, as cbrB and crcZ mutants of P. aeruginosa do not exhibit 86
identical phenotypes [15, 16]. The CbrA/CbrB system has several functions besides 87
the control of catabolic pathways. In Pseudomonas species such as P. aeruginosa and 88
P. putida, this system is involved in the regulation of swarming, biofilm formation, 89
cytotoxicity and antibiotic and stress resistance [22, 23]. 90
In the present work, we identified an A. vinelandii cbrA::miniTn5 mutant by its 91
alginate-overproducing phenotype. Its characterization showed that the TCS 92
CbrA/CbrB of A. vinelandii has a negative effect on alginate production by positively 93
affecting rsmA mRNA levels. In agreement with this result, algD translation was 94
found to be derepressed in a cbrA mutant. Moreover, we identified the sigma factor 95
RpoS as one of the intermediaries in the regulatory cascade controlling rsmA 96
expression by the CbrA/CbrB TCS. 97
98
5
METHODS 99
Strains and cultivation conditions. The bacterial strains and plasmids used in the 100
present work are listed in Table 1. The A. vinelandii wild type strain AEIV [24], was 101
used in this study. Mutant GG15 was identified in a random miniTn5 mutant bank 102
derived from strain AEIV due to its highly mucoid phenotype on plates of solid 103
medium. This mutant carries the miniTn5 transposon inserted within the gene cbrA 104
(Avin42670) [25]. 105
A. vinelandii was grown in Burk’s nitrogen-free salts supplemented with 20 g l-1 of 106
sucrose (Burk’s-sucrose medium) at 30 oC [26]. The composition of the growth 107
medium and the culture conditions have been reported elsewhere [27]. Escherichia 108
coli DH5a [28] was grown on Luria-Bertani (LB) medium at 37 oC [29]. The 109
antibiotic concentrations (in µg ml-1) used for A. vinelandii and E. coli, respectively, 110
were: spectinomycin, 50 and 100; tetracycline 15 and 10; ampicillin, 100 (not used for 111
A. vinelandii); gentamicin, 1 and 10. 112
A. vinelandii transformation was carried out as described [30]. To ensure double 113
reciprocal recombination and allelic exchange, mutants constructed by reverse 114
genetics were generated by transforming A. vinelandii cells with linear DNA carrying 115
the desired mutation. At least two independent transformation events were conducted, 116
and transformants were selected using the corresponding antibiotic. Three 117
representative transformants were confirmed by PCR analysis to carry the desired 118
mutation, and only one was chosen for further studies. Due to the polyploidy of A. 119
vinelandii, the absence of wild-type alleles in the resulting strains was verified by 120
PCR amplification of the corresponding locus. To this end, chromosomal DNA, 121
6
purified from candidates grown in the absence of the antibiotic, was used as the DNA 122
template to favour enrichment of possible wild-type chromosomes. 123
Standard techniques. DNA isolation and cloning were conducted as described [31]. 124
The A. vinelandii genome sequence is available [32] and this sequence was used for 125
designing the oligonucleotides used for PCR amplifications. The sequence of the 126
oligonucleotides used in this study is listed in Table 2. The high fidelity Phusion DNA 127
polymerase (Thermo Fisher Scientific) was used for all PCR amplifications and they 128
were confirmed by DNA sequencing. DNA sequencing was done with fluorescent 129
dideoxy terminatorsusing a cycle sequencing method and the 3130xl analyzer of 130
Applied Biosystems. 131
Construction of mutants CFB03 (cbrB::Sp). To construct an AEIV derivative 132
carrying a mutation within the cbrB gene (Avin42680), an internal fragment of cbrB 133
of 754 bp was PCR amplified using oligonucleotides cbrB-F and cbrB-R (Table 1) 134
and sub-cloned into the pMOSBlue vector (GE Healthcare). An Spr resistance cassette 135
derived from plasmid pHP45: [33] was inserted into the SmaI site located within the 136
cbrB fragment, producing plasmid pFB02. This plasmid was linearized with the PstI 137
restriction enzyme and was used to transform competent cells of the wild type strain 138
AEIV, selecting double recombinants Spr. A representative mutant was confirmed, by 139
PCR amplification of the cbrB locus, followed by sequencing or endonuclease 140
restriction patterns, to carry the cbrB::Sp mutation and to lack wild type copies of 141
cbrB (data not shown); this mutant was named CFB03 (Fig. S1, available in the online 142
Supplementary Material). 143
Genetic complementation of mutant GG15. To complement the GG15 144
cbrA::miniTn5 mutant with a wild-type copy of the gene cbrA, a Gm resistance 145
7
cassette, derived from plasmid pBSL141 [34] was ligated into the multiple cloning 146
site of plasmid pCN48 carrying the cbrA gene [25]. The resultant plasmid was named 147
pLS04. This plasmid, unable to replicate in A. vinelandii, was used to transform 148
competent cells of mutant GG15, selecting transformants Gmr. The presence of the 149
pLS04 plasmid integrated into the chromosome before the cbrA::miniTn5 insertion in 150
mutant GG15 was confirmed by PCR, followed by endonuclease restriction patterns 151
(data not shown). This mutant was named JS05 (Fig. S2, available in the online 152
Supplementary Material). 153
Construction of strains carrying a prsmZ2-gusA transcriptional fusion. A DNA 154
fragment carrying the promoter region of rsmZ2 (prsmZ2) was excised from plasmid 155
pSAHFUTs-Z2 [14] and cloned into the EcoRI site of pUMATcgusA-T, producing 156
plasmid pUMAZ2. The vector pUMATcgusA-T is useful for the construction of gusA 157
transcriptional fusions that can be directed to the chromosome after a double 158
recombination event within the melA locus. A Tcr cassette adjacent to the gusA gene 159
served as a selection marker [35]. The wild-type strain AEIV and the GG15 mutant 160
were transformed with pUMAZ2 previously linearized with the NdeI endonuclease, 161
and Tcr transformants were selected. The AEIV derivative carrying the prsmZ2-gusA 162
transcriptional fusion was named EQR101Z2, while that derived from mutant GG15 163
was named EQR103Z2. The presence of the prsmZ2-gusA transcriptional fusions in 164
the chromosome was confirmed by PCR amplification followed by endonuclease 165
restriction pattern. 166
Construction of transcriptional and translational algD-gusA fusions. To generate 167
algD-gusA transcriptional and translational fusions within the native algD gene, we 168
constructed gusA-Gm cassettes for transcriptional (gusA-Gm) or translational (‘gusA-169
Gm) fusions. A HindIII fragment carrying the Gm interposon from vector pBSL141 170
8
[34] was ligated to HindIII digested plasmids pUMATcgusAT [36] and 171
pUMATcgusAPT [35], to generated, plasmids pUMATcgusATGm and 172
pUMATcgusAPTGm, respectively (Fig. S3 and S4, available in the online 173
Supplementary Material). The generated transcriptional (gusA-Gm) and translational 174
(‘gusA-Gm) cassettes can be released with either the SacI or SacII restriction enzyme. 175
A 2.4 kb fragment containing algD was amplified by PCR using the primers UPalgD 176
and DSalgD and it was subsequently cloned into the pGEMT Easy Vector (Promega) 177
producing plasmid pGD2.4 (Table 1). SacI fragments carrying the gusA-Gm and 178
‘gusA-Gm cassettes were ligated to plasmid pGD2.4 previously digested with the 179
same enzyme, disrupting the algD gene within codon 96. The resulting plasmids, 180
called pGD-gusA and pGD-‘gusA, respectively, were verified by PCR analysis and 181
DNA sequencing to carry the cassettes inserted in the same orientation as that of algD 182
transcription. In the case of plasmid pGD-‘gusA, we also verified the correct 183
construction of the algD-gusA translational fusion. Plasmids pGD-gusA and pGD-184
‘gusA were made linear with SphI endonuclease and used to transform competent 185
cells of the strain AEIV. Double recombinants Gmr were selected and verified by 186
PCR analysis and DNA sequencing to carry the desired constructions within the algD 187
locus (data not shown). Furthermore, segregation of the algD-gusA fusions to all the 188
chromosomal copies was verified by PCR analysis using the primers UPalgD and 189
DSalgD, confirming the absence of wild-type algD alleles. The strains generated, 190
carrying transcriptional or translational algD-gusA fusions, were named AED-gusA 191
and AED-‘gusA, respectively. 192
To construct cbrA mutants carrying transcriptional and translational fusions of algD 193
with the reporter gene gusA, the strains AED-gusA and AED-‘gusA were employed. 194
The mutant EQR02 (cbrA::Sp) was transformed with chromosomal DNA from the 195
9
strains AED-gusA and AED-‘gusA and transformants Gmr were selected. The 196
resulting cbrA::Sp derivative strains were named CbrAD-gusA and CbrAD-‘gusA, 197
respectively. PCR amplification of the algD locus, followed by DNA sequencing, 198
confirmed the corresponding constructions and their segregation to all the 199
chromosomal copies of A. vinelandii (data not shown). 200
Quantitative real time reverse transcription (qRT-PCR). A. vinelandii strains were 201
cultured in Burk’s-sucrose liquid medium. The cells were collected by centrifugation, 202
and the total RNA was extracted as described [37]. Genomic DNA contamination was 203
removed with DNase I (Thermo Fisher Scientific). Details of cDNA synthesis and 204
qRT-PCR amplification conditions are reported elsewhere [30]. qRT-PCR assays 205
were performed with a Light Cycler 480 II instrument (Roche), using the Maxima TM 206
SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) kit (Thermo Scientific). The sequences of 207
the primer pairs used for genes algD (algD-RT-F and algD-RT-R), alg8 (alg8-RT-F 208
and alg8-RT-R), algC (algC-RT-F and algC-RT-R), rsmA (RT-2upRsmA and RT-209
2downRsmA), rpoS (upRT-rpoS and dwRT-rpoS) and gyrA (gyrAfw and gyrArev) 210
are listed in Table 2. These primers were designed using the Primer3 program 211
(http://bioinfo.ut.ee/primer3/) with an optimal length of 20 bases, and a melting 212
temperature of 60oC. Verifying specific single product amplification by melting-curve 213
analyses validated each primer set. Thereafter the efficiency of PCR was estimated by 214
developing standard curves for each amplicon using dilution series of the cDNA 215
corresponding to the reference sample. cDNAs derived from the reference and 216
experimental samples were amplified using quantities within the linear range of the 217
standard curve. Three biological replicates (independent cell cultures) were performed 218
with three technical replicates for each one. Similar results were obtained for the 219
transcription of all measured genes in the repetitions. As in previous reports relative 220
http://bioinfo.ut.ee/primer3/
10
mRNA transcript levels were determined in relation to gyrA (Avin15810) mRNA [27, 221
30, 38]. A non-template control of each reaction was included for each gene. The 222
quantification technique used to analyze the generated data was the 2-∆,∆CT method 223
reported previously [39]. 224
Primer extension assays. The transcriptional start site of rsmA was mapped by 225
primer extension analysis. Total RNA was prepared as previously reported [37] from 226
the A. vinelandii wild-type strain and itsrpoS mutant derivative grown in Burk’s-227
sucrose medium for 26 h. The oligonucleotide used as a primer for the extension 228
reaction, named RsmAprim (Table 2), was end- -32P]-ATP and T4 229
polynucleotide kinase. Primer extension was performed at 42 °C with AMV reverse 230
transcriptase (Roche) as indicated by the supplier. The extended cDNA product was 231
analysed by electrophoresis on a denaturing 6% urea-polyacrylamide gel, in parallel 232
with a DNA sequence ladder generated with the same primer by using a Thermo 233
Sequenase Cycle Sequencing kit (USB). Plasmid pJrsmA, carrying the regulatory 234
region of rsmA, was used as a template. Plasmid pJrsmA was constructed by PCR 235
amplification of a 275 bp fragment with the oligonucleotides UprsmAHind and 236
DwrsmAXho. The product was then ligated to vector pJET1.2/blunt (Thermo Fisher 237
Scientific), generating plasmid pJrsmA. 238
Analytical methods. Protein was determined by the Lowry method [40]. Alginate 239
production was measured by the spectrophotometric determination of uronic acids 240
with carbazole [41]. β-Glucuronidase activity was determined as reported elsewhere 241
[42]. One U corresponds to 1 nmol of O-nitrophenyl-ß-D-glucuronide hydrolyzed per 242
min per µg of protein. 243
11
Statistical analysis. Statistical analyses were performed using GraphPad Prism 244
(version 7.0) software (GraphPad Software, La Jolla, CA). Statistical significance 245
was
determined using two-tailed, unpaired Student’s t-test, and a p-value ≤0.05 was 246
considered significant.
247
Western Blot to detect RpoS. Detection of RpoS protein was determined by western 248
blot as described previously [43]. 100 µg of crude extracts from strains AEIV, JS05, 249
AErpoS, EQR02 and CFB03, grown at 30°C in Burk’s-sucrose medium for 24 h, 250
were mixed with SDS-PAGE loading Buffer and heated to 95ºC for 10 minutes. 251
Proteins were resolved in a 12% SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose 252
membrane (Amersham). The blots were blocked with 1% of BSA in TBS buffer over-253
night at 4 ºC. RpoS protein was detected using a polyclonal antiserum RpoS-6His at a 254
1:2000 dilution in Tris-buffered saline pH 7.5, amended with 0.1% Tween 20 (TBST), 255
followed by a goat anti-rabbit IgG antibody conjugated to alkaline phosphatase 256
(Abcam), at a dilution of 1:10000 in TBST [43]. Bands on the blotted membranes 257
were revealed by incubation with the BCIP/NBT substrate kit (Invitrogen). The 258
relative levels of RpoS were calculated by densitometry using the ImageJ program 259
[44].260
12
RESULTS 261
Mutants lacking the HK CbrA or the RR CbrB overproduce alginate 262
In a different work, we reported the characterization of the A. vinelandii TCS 263
CbrA/CbrB on carbon catabolite repression. It was achieved by characterizing a 264
cbrA::miniTn5 mutant, named GG15, generated by random mutagenesis of the wild-265
type strain AEIV. Our results demonstrated that the CbrA/CbrB system is conserved 266
between A. vinelandii and Pseudomonas species and heads a regulatory cascade that, 267
along with the translational regulatory system Hfq-Crc, controls carbon catabolite 268
repression [25]. 269
The A. vinelandii mutant GG15 (cbrA::miniTn5), was originally identified by its 270
alginate-overproducing phenotype under diazotrophic growth on plates of Burk’s-271
sucrose medium. In the present work, the effect of the TCS CbrA/CbrB on alginate 272
production was investigated. As shown in Fig. 1(a), there was a statistically 273
significant increase of approximately five-fold in specific alginate production by the 274
mutant GG15, in liquid Burk’s-sucrose medium, relative to its parental AEIV strain. 275
Genetic complementation of mutant GG15 with a wild-type copy of cbrA integrated 276
into the chromosome was conducted; the resulting strain, named JS05, showed wild-277
type levels of alginate. In addition, mutant EQR02 carrying a cbrA::Sp mutation and 278
generated by reverse genetics [25] showed alginate levels (5170 µg alginate per mg of 279
protein) similar to those of the mutant GG15, thus indicating that the HK CbrA exerts 280
a negative effect on the production of this polymer. 281
The A. vinelandii cbrA locus is highly conserved with respect to Pseudomonas species 282
[25]. The cbrB gene, encoding the CbrA cognate RR, is located immediately 283
downstream of cbrA. To investigate the role of the RR CbrB in alginate production, 284
13
the strain CFB03, carrying a cbrB::Sp mutation was also constructed. As shown in 285
Fig. 1(a), this mutant exhibited 10-fold higher levels of alginate production than the 286
wild-type strain and twofold higher levels than the cbrA mutant GG15. Collectively, 287
these data indicated that the TCS CbrA/CbrB negatively affects alginate production in 288
A. vinelandii. 289
Fig. 1(b) shows the growth kinetics of the strains AEIV, GG15, CFB03 and JS05 290
cultured in liquid Burk’s-sucrose medium. The cbrB::Sp mutant CFB03, but not the 291
cbrA::miniTn5 mutant GG15, showed an 8 h lag phase and reached a lower protein 292
concentration than the parental strain AEIV. This result indicated that the lack of the 293
RR CbrB is deleterious for cell growth under our assay conditions. For this reason, we 294
continued studying the role of the CbrA/CbrB system mainly by characterizing the 295
effect of the HK CbrA. 296
Effect of CbrA on the expression of alg genes 297
We next investigated whether the increase of alginate production observed in mutant 298
cbrA was due to higher expression of alginate biosynthetic genes. qRT-PCR assays 299
were conducted to estimate algD, alg8 and algC expression using total RNA extracted 300
from cells grown for 24 h. As shown in Fig. 2(a), alg8 mRNA levels increased 301
threefold in the cbrA::miniTn5 mutant, but the levels of algD and algC transcripts 302
were approximately twofold higher with respect to the wild-type strain; as expected, 303
in the complemented JS05 strain, expression levels of the mRNA of these alg genes 304
were reduced to wild-type levels. 305
The small increase of algD transcription in the cbrA mutant was somewhat 306
unexpected, as alginate overproduction is commonly associated with elevated algD 307
expression [27, 30, 45]. Therefore, expression of the algD gene was investigated 308
14
using transcriptional (algD-gusA) and translational (algD-‘gusA) fusions constructed 309
by inserting the corresponding gusA-Gm cassettes into the algD gene. As shown in 310
Fig. 2(b), with respect to the wild-type strain, transcription of algD showed a slight 311
increase in transcription, of less than twofold in the cbrA genetic background, whereas 312
the activity of the algD-‘gusA translational fusions was higher along the entire growth 313
curve in the cbrA genetic background, and such an increase was more pronounced 314
(about five-fold) at the exponential growth phase relative to the wild-type strain (Fig. 315
2c). Taken together, these data indicated that besides negatively affecting the 316
transcription of alg8 and algC, the HK CbrA negatively affects the expression of 317
algD, mainly at the translational level. 318
The TCS CbrA/CbrB is required for maximum transcription of the gene rsmA 319
It was previously shown that in A. vinelandii, RsmA binds to the algD mRNA, 320
inhibiting translation, and that the repressor activity of RsmA is antagonized by 321
sRNAs of the RsmZ and RsmY family [10, 14]. Because algD translation was 322
increased in the cbrA genetic background, we explored whether the control of algD 323
translation by the TCS CbrA/CbrB involved the RsmA protein. Therefore, the effect 324
of CbrA on rsmA gene expression was determined. rsmA mRNA levels were assessed 325
by qRT-PCR using total RNA extracted from cells grown in Burk’s-sucrose medium 326
at24 h. In both the cbrA and cbrB mutants, there were statistically significant 327
reduction in the levels of rsmA mRNA (Fig. 3a). However, this reduction was more 328
pronounced in the cbrB genetic background, in which the levels of the rsmA mRNA 329
were decreased approximately 70% with respect to the parental AEIV strain. This 330
result is consistent with the higher alginate levels observed for mutant cbrB when 331
compared to mutant cbrA (Fig. 1a). 332
15
In addition, the activity of the GacA/GacS system was evaluated by determining the 333
expression of rsmZ2, a gene under the control of GacA [10, 14]. To this end a 334
transcriptional fusion of the rsmZ2 promoter with the gusA reporter gene (prsmZ-335
gusA) was employed. Derivatives of the wild type strain AEIV and mutant EQR02 336
(cbrA::Sp) carrying this transcriptional fusion were cultured in Burk’s-sucrose 337
medium, and the activity of ß-glucuronidase was measured along the growth curve. 338
The activity of the rsmZ2 promoter in the cbrA genetic background was not affected 339
and showed an expression pattern similar to that in the wild-type strain (Fig. 3b). As 340
expected, such activity was abolished in a gacA genetic background. This result 341
indicated that the cbrA mutation, does not affect the activity of RsmA by means of 342
increasing rsmZ transcription. 343
The sigma factor RpoS directs the transcription of the gene rsmA 344
As the TCS CbrA/CbrB was necessary for maximum rsmA expression, and since 345
CbrB activates RpoN-dependent promoters, we investigated the nature of the 346
promoter(s) driving rsmA transcription. To this end, rsmA primer extension analysis 347
was conducted using total RNA extracted from the A. vinelandii wild type strain. As 348
shown in Fig. 4(a), a transcription start site was identified 83 nt upstream of the ATG 349
translation initiation codon. An analysis of the region allowed the identification of a 350
consensus sequence for putative RpoS-dependent promoters (CAATACT) at the -10 351
region [46, 47] (Fig. 4b). Thus, we carried out a primer extension assay using RNA 352
extracted from the rpoS mutant. As shown in Fig. 4(a), a transcription initiation at this 353
site was not detected. Additionally, qRT-PCR assays using total RNA extracted from 354
the strain AErpoS showed that expression of rsmA was diminished by 40% relative to 355
the wild-type strain (Fig. 3a). Taken together, these data indicate the existence of an 356
RpoS-dependent promoter driving rsmA transcription. 357
16
Because we were unable to detect RpoN-dependent promoters at the regulatory region 358
of rsmA, we hypothesized that the effect of the TCS CbrA/CbrB on rsmA transcription 359
could be due, in part, by indirectly affecting expression of RpoS. We next analysed 360
this possibility. 361
The TCS CbrA/CbrB is required for optimal accumulation of RpoS 362
To investigate the possible effect of the TCS CbrA/CbrB on rpoS expression, the 363
levels of the rpoS mRNA were assessed by qRT-PCR in the wild-type strain AEIV 364
and in its derivative mutants cbrA and cbrB. As shown in Fig. 5(a), there were 365
statistically significant reductions of approximately 40 and 80% in the rpoS mRNA 366
levels of the cbrA and the cbrB mutants, respectively, when compared to those of the 367
wild-type strain. 368
Western blot analysis using antibodies against the A. vinelandii RpoS protein were 369
also conducted. As shown in Fig. 5(b) RpoS protein levels were reduced 370
approximately 30% in the cbrA mutant with respect to the wild-type strain, whereas in 371
the JS05 complemented strain, the level of the RpoS protein was restored to a level 372
similar to that observed in the wild type. The change in RpoS expression was more 373
pronounced in the cbrB mutant, with a reduction of approximately 70% that was in 374
agreement with the results obtained by qPCR. Taken together, these results imply that 375
the TCS CbrA/CbrB exerts a positive effect on RpoS expression. 376
The data presented above suggest the functioning of a CbrA/B-RpoS-RsmA 377
regulatory cascade for the control of alginate production. Therefore, the question of 378
whether RpoS was the only intermediary in this regulatory pathway was raised. Thus, 379
the alginate phenotype was analysed in the rpoS mutant AErpoS. As has been 380
reported for other A. vinelandii strains [48], the levels of alginate in the rpoS mutant 381
17
AErpoS were significantly higher when compared to the wild-type strain (1685 vs 382
1090 µg mg of protein-1, respectively) (Fig. 1a). However, such increase was not as 383
high as that observed in the cbrA or cbrB mutants, thus indicating that in addition to 384
the CbrA/B-RpoS-RsmA cascade, the TCS CbrA/CbrB controls alginate production 385
by one or more additional pathways. 386
387
18
DISCUSSION 388
In the present work, we show that the A. vinelandii TCS CbrA/CbrB exerts a negative 389
effect on alginate synthesis. Interestingly, this role has not been described in 390
Pseudomonas spp. Although the biochemistry of alginate production is well 391
conserved between P. aeruginosa and A. vinelandii, there exist remarkable 392
differences in terms of its regulation. As opposed to P. aeruginosa, the algD gene in 393
A. vinelandii is a target of the translational repressor protein RsmA [10]. GacA is 394
necessary to activate transcription of the sRNAs of the Rsm family, which counteract 395
RsmA activity [14]. Therefore, in A. vinelandii gacA mutants, alginate production is 396
blocked due to translational repression of algD by RsmA [7, 10]. Differences in the 397
regulation of alginate synthesis could be attributed to the different roles that alginate 398
plays in the physiology of these members of the Pseudomonadaceae family. In A. 399
vinelandii, alginate is a structural part of the layers surrounding differentiated cells 400
called cysts and is essential for their resistance to desiccation. However, this 401
differentiation process does not occur in Pseudomonas spp. 402
In A. vinelandii, the cbrA mutant showed a significant 5-fold increase in alginate 403
production when compared to the parental AEIV strain, while the cbrB mutant 404
exhibited twofold higher alginate levels relative to those of mutant cbrA. This 405
behaviour is expected, as in the absence of an HK the cognate RR could be 406
phosphorylated non-specifically [49]. Our results also indicated that CbrA/CbrB 407
exerts a negative effect on the transcription of some alg genes such as algD, algC and 408
alg8, as their mRNA levels increased from 1.5-fold to 3-fold in the cbrA mutant. 409
However, it remains unclear whether this effect is a direct consequence of 410
transcriptional regulation of alg genes by CbrA/CbrB or whether it is indirectly 411
derived from some effect of the lower rsmA expression levels on the stability of these 412
19
mRNAs (see below). The low increase in algD transcription in the cbrA mutant 413
contrasted with other alginate-overproducing mutants of A. vinelandii previously 414
characterized, in which the levels of algD transcripts observed were at least 4-fold 415
higher with respect to the wild-type strain [27, 30, 50]. However, we found that algD 416
translation was positively affected in the absence of CbrA, showing increases of five- 417
and threefold relative to the wild-type strain during the exponential and stationary 418
phases of growth, respectively. Therefore, the high alginate levels of the cbrA mutant 419
could be attributed to increased transcription of some alg genes, such as alg8 and 420
algD, but mainly to increased algD translation. 421
As mentioned above, translation of algD in A. vinelandii is under the control of the 422
RsmA translational repressor protein, which binds to the leader of the algD mRNA, 423
forming a stable ribonucleoproteincomplex [10]. Accordingly, in the cbrA mutant, 424
showing from two- to fivefold higher algD translational levels along the growth 425
curve, rsmA transcripts were 40% reduced. The difficulty of isolating an rsmA null 426
mutant in A. vinelandii has been previously reported [10]. The observed growth defect 427
of the mutant cbrB in Burk’s-sucrose medium might be related to the strong reduction 428
in rsmA mRNA levels (of approximately 70%) causing 10-fold higher alginate 429
production levels relative to its parental AEIV strain. 430
Primer extension analysis indicated that rsmA transcription initiates from an RpoS 431
promoter. However, our data suggests the existence of additional promoter(s) driving 432
rsmA expression, as in an rpoS mutant rsmA mRNA levels were reduced only 40%. In 433
fact, the rsmA gene in E. coli is transcribed from 5 promoters, one of them RpoS-434
dependent [51]. 435
20
The positive effect of the CbrA/CbrB system upon rsmA expression might be indirect 436
since we did not identify putative CbrB binding sites in the operator/promoter region 437
of rsmA. Therefore, the effect of CbrA/CbrB on RpoS expression was investigated. 438
Both Western Blott analysis and qPCR assays indicated that the TCS CbrA/CbrB was 439
necessary for maximum expression of RpoS, as the rpoS mRNA and RpoS protein 440
levels were reduced in the cbrA and cbrB mutants. Although the positive effect of 441
CbrA/CbrB on RpoS was clear, this effect was partial and would not completely 442
explain the effect of CbrA/CbrB on rsmA transcription. In support of this result, 443
specific alginate production by the rpoS mutant AErpoS was not comparable to that of 444
mutant cbrA. Taken together, these data revealed the existence of the regulatory 445
cascade CbrA/CbrB-RpoS-RsmA for the control of alginate production but also 446
provided evidence suggesting that CbrA/CbrB controls RsmA expression through an 447
alternative mechanism (Fig. 6). 448
In a different study, we reported that the CbrA/CbrB-Crc/Hfq system is functionally 449
conserved in A. vinelandii with respect to its role in the process of carbon catabolite 450
repression in Pseudomonas spp. [25]. Although glucose uptake in A. vinelandii occurs 451
through a novel GluP transporter uncommon in Pseudomonas species, we found that 452
its expression was under the control of the CbrA/CbrB-Crc/Hfq system [25]. In E. 453
coli, the existence of regulatory connections between the carbon catabolite repression 454
and Csr (Rsm) systems has been established. The EIIAglc regulatory protein of the 455
PTS system and the cAMP-CRP transcriptional factor influence the expression and 456
accumulation of the sRNAs CsrB and CsrC, which antagonize the activity of CsrA 457
(RsmA) protein. This allows the Csr system to respond to the carbon nutritional status 458
of the bacterium and to reorganize the metabolism of the cell [52, 53]. Whether in A. 459
21
vinelandii the Crc-Hfq system is an intermediary in the regulation of rsmA expression 460
and alginate production by the TCS CbrA/CbrB remains to be investigated. 461
The concerted action of the signalling systems CbrA/CbrB and GacS/GacA to control 462
the activity and the amount of the RsmA protein, which in turn regulates alginate 463
production, indicates a central role of these systems in regulating carbon metabolism 464
in A. vinelandii. Exploring the function of the A. vinelandii CbrA/CbrB-Crc/Hfq 465
system on alginate production would contribute to our understanding of the regulation 466
of the carbon metabolic flow in this bacterium. 467
468
22
ACKNOWLEDGEMENTS 469
This work was supported by grants from Programa de Apoyo a Proyectos de 470
Investigación e Innovación Tecnológica, UNAM (PAPIIT IN208514) and from the 471
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT CB-240095 and INFR 472
253487) to Cinthia Núñez. EQR was recipient of a scholarship from CONACyT. 473
We thank J.M. Hurtado, A. Ocadiz and P. Gaytán for technical assistance. 474
The authors declare that there is no conflict of interest. 475
476
477
478
479
480
481
482
483
484
485
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491
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676
677
678
31
FIGURELEGENDS 679
Figure 1. Alginate production and growth kinetics of different A. vinelandii strains. 680
(a) Specific alginate production by the wild type A. vinelandii strain AEIV and by the 681
mutants GG15 (cbrA::miniTn5), JS05 (cbrA::miniTn5/cbrA+), CFB03 (cbrB::Sp) and 682
AErpoS (rpoS::Sp) grown for 48 h in liquid Burk’s-sucrose medium. Significant 683
differences were analysed by t-test.
Statistical significance is indicated (** p< 0.01 684
or *** p< 0.001).
(b) Growth kinetics of several A. vinelandii strains in minimal 685
Burk’s-sucrose medium. Errors bars indicate standard deviations from the mean from 686
three independent assays. 687
Figure 2. Effect of the HK CbrA on the expression of alg genes. (a) qRT-PCR 688
analysis to determine algD, algC and alg8 mRNA levels in the wild-type strain AEIV 689
(white bars), in the GG15 mutant (grey bars) and in the complemented strain JS05 690
(black bars). Total RNA was extracted from cells grown for 24 h. (b) algD 691
transcriptional levels, measured as ß-glucuronidase activity, in the strains AED-gusA 692
(wild type) (white bars) and CbrAD-gusA (cbrA) (grey bars) carrying an algD-gusA 693
transcriptional fusion. (c) algD translational levels, measured as ß-glucuronidase 694
activity, in strains AED-‘gusA (wild type) (white bars) and CbrAD-‘gusA (cbrA) (grey 695
bars) carrying an algD-‘gusA translational fusion. Cultures were developed in liquid 696
Burk’s-sucrose medium and aliquots were taken at the indicated times. Error bars 697
representing the standard deviation from three
independent experiments are shown. 698
Significant differences were analysed by t-test.
Statistical significance is indicated 699
(* p< 0.05, ** p< 0.01 or *** p< 0.001).
700
Figure 3. rsmA mRNA levels in different A. vinelandii strains. (a) qRT-PCR analysis 701
to determine the levels of rsmA mRNA in the wild-type strain AEIV (white bar) and 702
32
in the mutants EQR02 (cbrA) (grey bar), CFB03 (cbrB) (black bar) and AErpoS 703
(rpoS) (hatched bar). Total RNA was extracted from cells grown for 24 h in liquid 704
Burk’s-sucrose medium. Significant differences were analysed by t-test.
Statistical 705
significance is indicated (***, p< 0.001). (b) rsmZ2 transcriptional levels, measured 706
as ß-glucuronidase activity, for cultures of the parental strain AEIV (white bars) and 707
the mutants EQR02 (cbrA) (grey bars) and AEgacA (gacA) (black bars) carrying an 708
rsmZ2-gusA transcriptional fusion. Error bars representing the standard deviation 709
from three
independent experiments are shown. 710
Figure 4. Transcription of rsmA is initiated from an RpoS-dependent promoter. (a) 711
Primer extension analysis of rsmA transcription using total RNA extracted from the A. 712
vinelandii wild-type strain (WT) and from its rpoS derivative mutant (rpoS-) grown in 713
Burk’s-sucrose medium for 20 h. (b) DNA sequence of the rsmA regulatory region. 714
The rsmA ATG start codon is in bold. The transcription initiation site is indicated by 715
an arrow. The sequence used to design the primer used is underlined. 716
Figure 5. The TCS CbrA/CbrB influences the level of RpoS expression. (a) qRT-PCR 717
analysis to determine rpoS mRNA levels in the wild type strain AEIV (white bar) and 718
in the mutants EQR02 (cbrA) (grey bar) and CFB03 (cbrB) (black bar). Total RNA 719
was extracted from cells grown for 20 h in liquid Burk’s-sucrose medium. Error bars 720
representing the standard deviation from three
independent experiments are shown. 721
Significant differences were analysed by t-test.
Statistical significance is indicated 722
(***, p< 0.001). (b) Western blot analysis to detect RpoS levels in the strains AEIV 723
(WT), JS05 (cbrA/cbrA+), AErpoS (rpoS), GG15 (cbrA) and CFB03 (cbrB). Protein 724
extracts (100 µg) were obtained from cells cultivated in Burk’s-sucrose medium for 725
24 h. AErpoS was run as a negative control. RpoS levels (*RpoS) for each strain 726
were calculated with respect to the wild type strain, by densitometry analysis using 727
33
the ImageJ software and are indicated at the bottom. This experiment was repeated 728
twice with essentially the same result, and a representative blot is shown. 729
Figure 6. Proposed model for the regulation of algD translation by the regulatory 730
cascade CbrA/CbrB-RpoS-RsmA. The TCS CbrA/CbrB exerts a positive effect on 731
rsmA transcription. The sigma factor RpoS, whose expression was positively 732
influenced by CbrA/CbrB, is an intermediary in this regulation as it recognizes one of 733
the promoters driving rsmA transcription. Our data suggest the existence of an RpoS-734
independent pathway for the regulation of rsmA by the TCS CbrA/CbrB. In cbrA or 735
cbrB mutants a reduction of RsmA enhances the rate of algD translation thereby 736
increasing alginate synthesis. Dashed arrows: indirect effect. 737
738
739
34
Table 1. Relevant strains and plasmids used in the present work 740
Name Genotype/Relevant characteristics Reference
Strains
A. vinelandii
AEIV (also name
E strain) Wild type strain [24]
GG15 miniTn5 AEIV derivative, identified by its highly mucoid phenotype. cbrA::miniTn5, Spr [25]
JS05 GG15 derivative, complemented with a wild type copy of cbrA integrated into the chromosome. Gmr This work
CFB03 cbrB::Sp mutant derived from AEIV This work
EQR02 AEIV derivative carrying an insertion of a Sp
r
cassette within the cbrA gene [25]
AED-gusA AEIV derivative carries a chromosomal algD-gusA transcriptional fusion. Gmr This work
CbrAD-gusA EQR02 derivative carries a chromosomal algD-gusA transcriptional fusion. Gmr This work
AED-‘gusA AEIV derivative carries a chromosomal algD-gusA translational fusion. Gmr This work
CbrAD-‘gusA EQR02 derivative carries a chromosomal algD-gusA translational fusion. Spr; Gmr This work
EQR101Z2 AEIV derivative carries a chromosomal prsmZ2-gusA transcriptional fusion. Tcr This work
EQR103Z2 EQR02 derivative carries a chromosomal algD-gusA transcriptional fusion. Spr; Tcr This work
AErpoS AEIV derivative carries an rpoS::Sp mutation. Spr [36]
AEgacA AEIV derivative carries a gacA::Gm mutation
[10]
E. coli
DH5a supE44 DlacU169 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 [28]
Plasmids
pJET1.2/blunt PCR cloning vector, Apr
Thermo
Fisher
Scientific
pMOS Blue Clonning vector; Apr GE Healtcare
pGEMT Easy Cloning vetor; Apr Promega
pBSL141 Source of the Gmr cassette [34]
pHP45Ω -Sp Source of the Ω Sp cassette [33]
pCN48 pMOS Blue vector derivative carries a 2.8 kb fragment containing the cbrA gene [25]
35
pLS04 pCN48 derivative carries a Gm
r cassette as a
selection marker at a BamHI site of the polylinker This work
pFB02 pMOS blue derivative carries a cbrB::Sp mutation. This work
pUMAZ2 pUMATcgusAT vector derivative carries a prsmZ2-gusA transcriptional fusion This work
pUMATcgusAT Vector for the construction of gusA transcriptional fusions into the A. vinelandii chromosome [36]
pUMATcgusAPT Vector for the construction of gusA translational fusions into the A. vinelandii chromosome [35]
pUMATcgusATG
m
pUMATcgusAT derivative. Source of the gusA-
Gm cassette. Carries a Gm cassette cloned into
the HindIII site downstream the gusA gene
This work
pUMATcgusAPT
Gm
pUMATcgusAPT derivative. Source of the ‘gusA-
Gm cassette. Carries a Gm cassette cloned into the
HindIII site downstream the gusA gene
This work
pGD2.4 pGEMT Easy derivative carries a 2.4 kb fragment containing algD This work
pGD-gusA pGD2.4 derivative carries an algD-gusA transcriptional fusion. Gmr This work
pGD-‘gusA pGD2.4 derivative carries an algD-‘gusA translational fusion. Gmr This work
pJrsmA pJET1.2/blunt derivative, carries the regulatory region of rsmA This work
741
742
36
Table 2. Sequence of the oligonucleotides used in this study. 743
Name Nucleotide sequence(5′–3′)
RT-2 upRsmA GTCGGAGAGACCCTCATGG
RT-2
downRsmA GACCTCTTTTGGTGCATTGA
upRT-rpoS AGGATGTCCTGGACGATGAG
dwRT-rpoS TCCAGCGCCCTAGTGTAGTC
F-1(cbrA) GCA CCTACCAACTGTCGTCC
R-1(cbrA) GCTGATGATCAGGTCGAAGC
cbrB-F CTCGCACTGGTCTATTCG
cbrB-R GCAGTTCACCGAGATCAGC
RsmAPrim GACTGTCACATCATCACC
UprsmAHind CAAAGCTTGTGGGTGATGAT
DwrsmAXho CACTCGAGGTGGCTTGGCT
algD-RT3-F TTCGGACTGGGCTATGTAGG
algD-RT3-R GCCCTGATTGATCATGTCG
alg8-RT-F CCATGGGAATCATCCATTTC
alg8-RT-R GAAACACATGGGAAGGATCG
algC-RT-F GAGCTGGTCGAGCAGTTGAT
algC-RT-R ATGTTGGCCGCGTAGTAGAG
UpalgD GACTGACGTCGCGTGATG
DSalgD GTCGGGCATGTGGCGGGAGAT
744
(a)
0 10 20 30 40 50
1
10
100
1000
Time (h)
P
ro
te
in
m
g
m
L-
1
AEIV
JS05
GG15
CFB03
AE
IV
GG
15
JS
05
CF
B0
3
AE
rp
oS
0
1000
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
A
lg
in
at
e μ
g
(m
g
Pr
ot
ei
n)
-1
***
***
***
**
(b)
Figure 1 Click here to download Figure Fig 1.pptx
http://www.editorialmanager.com/mic/download.aspx?id=55043&guid=ba85bdc8-84cf-4491-b962-2b851701e8a3&scheme=1
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12 24 48
0.0
0.5
1.0
1.5
Time (h)
U
β
-G
lu
c *
**
*
12 24 48
0.0
0.1
0.2
0.3
0.8
1.0
1.2
Time (h)
U
β
-G
lu
c
***
***
**
(b)
algD-gusA
algD-´gusA
(c)
algD algC alg8
0
1
2
3
4
R
el
at
iv
e e
xp
re
ss
io
n
**
***
***
(a)
Figure 2 Click here to download Figure Fig 2.pptx
http://www.editorialmanager.com/mic/download.aspx?id=55044&guid=d9358451-b1f3-41ac-b518-5ae7ecca5ab0&scheme=1
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12 24 48
0
5
10
15
20
Time (h)
U
β
-G
lu
c
(b)
prsmZ2-gusA
(a)
WT cbrA cbrB rpoS
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
rs
m
A
R
el
at
iv
e e
xp
re
ss
io
n
***
***
***
Figure 3 Click here to download Figure Fig 3.pptx
http://www.editorialmanager.com/mic/download.aspx?id=55045&guid=9bb517e6-9621-49a0-bb78-8d36aea86ce0&scheme=1
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Figure 4 Click here to download Figure Fig 4.tiff
(a)
(b)
T
T
e
rpoS- WT e T A G
CGCGTCTICATCG I 1"1 I GCCAGGGGGCGGCGGGCI 1"1 CCI"I I CG
-10 +1 ..
CCAGCCCTGGTCAATACTTGGGTGTATATTCCTCGAGGCAGGCT
GGGAATAGTGCCAITI'I'CATlI"l IGCAGACTGTTGTCCTGTTGA
so
CTTCCCTAAAApG~GAAAGGAATGCTGATTCTGACTCGT
CGGGTCGGAGAGACCCTCATGGTGGGTGATGATGTGACAGTCA
http://www.editorialmanager.com/mic/download.aspx?id=55046&guid=484c352e-04ec-4a3e-af0f-1aa0ff166580&scheme=1
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Figure 5 Click here to download Figure Fig 5.tiff
(a)
I
e I $ :::$ o .-
~ I
Q.
" '" '" > .--'" -'" " '" '" ~
WT cbrA cbrB
(b) +
~
~
'"' ...... •
~
v:¡ ~ 9::
kDa C> ~ ¡:. ~ ~
'"' '"' '"'
55-
35 - • RpoS
28 -
100 91 o 72 30
http://www.editorialmanager.com/mic/download.aspx?id=55047&guid=0d1543eb-0083-41c1-a981-b81bd8c250ec&scheme=1
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CbrA
CbrB P
P
RpoS
RsmA
algD�rsmA�
rpoS�
mRNA
?
Fig 6 Click here to download Figure Fig 6.pptx
http://www.editorialmanager.com/mic/download.aspx?id=55197&guid=5029810b-880d-49e8-9a8b-e4376d73e46d&scheme=1
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Supplementary Information
The two-component system CbrA/CbrB controls alginate production in
Azotobacter vinelandii
Elva Y. Quiróz-Rocha1, Fernando Bonilla-Badía1, Valentina García-Aguilar2, Liliana
López-Pliego2, Jade Serrano-Román1, Miguel Cocotl-Yañez1, Josefina Guzmán1, Carlos
L. Ahumada-Manuel1, Luis F. Muriel-Millán1, Miguel Castañeda2, Guadalupe Espín1
and Cinthia Núñez1.
1 Departamento de Microbiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad
Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca,
Morelos. CP 62210, México
2 Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias,
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Apdo. Postal 1622, CP 72000.
Corresponding Author:
Cinthia Núñez
e-mail: cinthia@ibt.unam.mx
(+52)7773290873
Supplementary Figures Click here to download Supplementary Material Files
Supplementary Figures.pdf
http://www.editorialmanager.com/mic/download.aspx?id=54912&guid=692ba81e-a2be-4504-a4a5-0208acebe38d&scheme=1
http://www.editorialmanager.com/mic/download.aspx?id=54912&guid=692ba81e-a2be-4504-a4a5-0208acebe38d&scheme=1
Sp!
cbrA! cbrB! crcZ! pcnB!
SmaI!
cbrB!
AEIV!
CFB03!
Figure S1. Genentic organization of the cbrA locus in the wild-type strain
AEIV and in mutant CFB03 (cbrB::Sp). The Spr cassette is represented by
a triangle and is not shown at scale.
Avin42650! cbrA! cbrB! crcZ!
cbrA!
Gm!
mTn5!
GG15!
JS05!
pLS04
Avin42650! cbrA! cbrB! crcZ!
mTn5!
cbrA!
Gm!
Figure S2. Genetic complementation of the cbrA::miniTn5 mutant GG15
with plasmid pLS04 carrying a wild-type copy of the cbrA gene. The final
genetic arrangement of the cbrA locus in the chromosome of the resulting
strain, JS05, is shown. The Gmr cassette and the miniTn5 (mTn5) are not
shown at scale.
gusA
Tcr
Gmr
+
Figure S3. Construction of plasmid pUMATcgusATGm which carries a gusA-Gm cassette
useful in the construction of transcriptional fusions with the reporter gene gusA. This
cassette can be obtained as a SacI or SacII fragment. The Gmr cassette, derived from
plasmid pBSL141 (Alexeyev et al., 1995), was ligated into the HindIII site of plasmid
pUMATcgusAT (Cocotl-Yáñez et al., 2014).
gusA
Tcr
Hind III
Hind III SacII
SacI
Gmr
SacI
SacI
Gmr gusA
‘gusA
Tcr
‘gusA
Tcr
Gmr
+
Hind III
Hind III SacII
SacI
Gmr
SacI
SacI
Gmr gusA
Figure S4. Construction of plasmid pUMATcgusAPTGm which carries a ‘gusA-Gm
cassette useful in the construction of translational fusions with the reporter gene gusA. This
cassette can be obtained as a SacI or SacII fragment. The Gmr cassette, derived from
plasmid pBSL141 (Alexeyev et al., 1995), was ligated into the HindIII site of plasmid
pUMATcgusAPT (Muriel-Millán et al., 2015).
‘gusA
Portada
Índice
Resumen
1. Introducción
2. Antecedentes
3. Hipótesis
4. Objetivos
5. Material y Métodos
6. Resultados y Discusión
7. Conclusiones
8. Perspectivas
9. Referencias
10. Anexos