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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA Andamios de Poli (alcohol vinílico)/SiO2-CaO-P2O5 obtenido mediante electrohilado para estudios in vitro y de sincronía de células ventriculares de corazón de pollo. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: QUÍMICO PRESENTA: ESQUIVEL POSADAS HÉCTOR TOMÁS CIUDAD DE MÉXICO 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Chávez García María de Lourdes VOCAL: Rivera Torres Filiberto SECRETARIO: Tavizón Alvarado Gustavo 1er. SUPLENTE: Arcos Ramos Rafael Omar 2° SUPLENTE: Ordoñez Hernández Javier SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: Instituto De Investigaciones En Materiales, UNAM. ASESOR DEL TEMA: Dr. Filiberto Rivera Torres. SUPERVISOR TÉCNICO: Dr. Ricardo Vera Graziano. SUSTENTANTE: Esquivel Posadas Héctor Tomás. AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES. A la universidad Nacional Autónoma de México por brindarme la formación académica y personal. Al instituto de Investigaciones en Materiales de la UNAM por permitirme desarrollar mi proyecto de investigación en sus instalaciones y así permitirme la realización de este trabajo. Al Dr. Filiberto Rivera Torres (Facultad de Química) por sus valiosos consejos y puntos de vista de este trabajo. Al Dr. Ricardo Vera Graziano (Instituto de Investigaciones en Materiales) por permitirme desarrollar mi proyecto de investigación en su laboratorio y por sus valiosos comentarios respecto a este proyecto de investigación. Al Dr. Alfredo Maciel Cerda (Instituto de Investigaciones en Materiales) por los conocimientos que me brindó y por sus valiosos comentarios respecto a este proyecto de investigación. A la Dra. Gertrudis Hortensia González Gómez (Facultad de Ciencias) por su apoyo con los cultivos biológicos que involucraron las células de cardiomiocitos de corazón de pollo, así como la interpretación de resultados obtenidos. A la QFB. María Alicia Falcón Neri (Facultad de Ciencias) por su apoyo con los cultivos biológicos que involucraron las células de cardiomiocitos de corazón de pollo, así como la interpretación de resultados obtenidos. A la I.Q Karla Eriseth Reyes Morales responsable del laboratorio de Análisis Térmico por su apoyo con las pruebas térmicas. Al Q. Miguel Ángel Canseco (Instituto de Investigaciones en Materiales) por su apoyo en los análisis de espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier. A la Dra. Adriana Tejeda Cruz (Instituto de Investigaciones en Materiales) por su apoyo en los análisis de difracción de rayos X. Al Dr. Omar Novelo Peralta (Instituto de Investigaciones en Materiales) por apoyarme con el análisis de microscopia electrónica de barrido (SEM). Al Dr. Josué Esau Romero Ibarraa (Instituto de Investigaciones en Materiales) por el apoyo con el análisis de microscopia electrónica de transmitancia (TEM). Al Ing. Gerardo Cedillo Valverde (Instituto de Investigaciones en Materiales) por su apoyo con los análisis de resonancia magnética nuclear de carbono 13 y RMN de protón. Al Laboratorio C-202 del Instituto de Investigaciones en Materiales por brindarme el espacio para la realización de este trabajo. Al proyecto PAPITT-UNAM: IN108116 por los recursos otorgados para este proyecto. A los compañeros de laboratorio en el que se desarrolló este trabajo de investigación en el Instituto de Investigaciones en Materiales: Linda Martínez, Erick Robles, Denise Altamirano, Andrés Usi, Antonio Avilés, Emmanuel Arce, Josué David, Eliza Miranda. AGRADECIMIENTOS PERSONALES. Este trabajo lo dedico a mis padres que con mucho cariño los sigo apreciando y queriendo a pesar de las dificultades que hemos afrontado. A mis hermanos que me han apoyado en las tantas dificultades pero que siempre hemos salido adelante. A mi hermana Clara Esquivel Posadas por brindarme su apoyo para continuar con mis estudios y darme valiosos consejos para continuar con mi formación académica, a mi hermana Gisela Esquivel Posadas por sus consejos en la vida y el tiempo que me dedico, a mi hermana Sherezada Esquivel Posadas por el tiempo que hemos convivido y, a mi hermano Jacobo Esquivel Posadas por sus consejos y la ayuda que me ha brindado. Al Dr. Filiberto Rivera Torres que ha sido un amigo y un apoyo para poder seguir adelante y no renunciar. A los compañeros de por su amistad y apoyo: Linda Martínez, Erick Robles, Denise Altamirano, Andrés Usi, Antonio Avilés, Emmanuel Arce, Josué David, Eliza Miranda. Por último y no menos importante a mi padrino Don Ángel por la motivación que me brindo para seguir a delante con este trabajo. Índice General I. Índice de Figuras. .......................................................................................................................... 1 II. Índice de Tablas. .......................................................................................................................... 9 III. Abreviaturas y símbolos........................................................................................................... 11 1. Resumen. .................................................................................................................................... 12 2. Justificación. ............................................................................................................................... 14 2.1. Enfermedades cardíacas en México. .............................................................................. 14 3. Objetivos...................................................................................................................................... 17 4. Introducción. ............................................................................................................................... 18 4.1. Biomateriales. ...................................................................................................................... 18 4.1.1. Biopolímeros. ............................................................................................................... 18 4.1.2. Biocerámicos. ............................................................................................................... 20 4.1.3. Metales. ......................................................................................................................... 23 4.1.3. Biomateriales híbrido (O/I). ........................................................................................ 23 4.2. Ingeniería Tisular. ............................................................................................................... 25 4.2.1. Ingeniería tisular en tejido cardiaco. ......................................................................... 25 4.2.2. Propiedades de los andamios destinados para la regeneración de tejido cardiaco........................................................................................................................................ 26 4.3 Tejido muscular cardíaco. ............................................................................................. 28 4.3.1.Células cardiacas. ....................................................................................................... 29 4.3.2. Falla cardíaca............................................................................................................... 29 4.3.3. Acoplamiento excitación-contracción cardiaca. ..................................................... 31 4.4. Proceso sol-gel. .................................................................................................................. 33 4.4.1. Hidrólisis en medio ácido. .......................................................................................... 33 4.4.2. Condensación en medio ácido. ................................................................................ 34 4.5. Técnica de electrohilado. ................................................................................................... 35 4.5.1 Concentración. ............................................................................................................. 37 4.5.2 Peso molecular. ........................................................................................................... 38 4.5.3 Viscosidad. .................................................................................................................. 38 4.5.4. Tensión superficial. ................................................................................................... 39 4.5.5. Diferencia de potencial. ............................................................................................. 39 4.5.6. Velocidad de flujo. ...................................................................................................... 40 4.5.7. Distancia entre el colector y la punta de la jeringa. .............................................. 40 4.5.8. Parámetros ambientales. ........................................................................................... 40 4.6 Descripción del equipo de electrohilado que se utilizó en el proceso experimental. 41 4.7. Revisión de trabajos realizados respecto de este tema, en los cuales se ha utilizado biovidrio para la regeneración de tejido cardiaco. ................................................................. 42 5. PARTE EXPERIMENTAL. ........................................................................................................ 45 5.1. Materiales. ........................................................................................................................... 45 5.1.1 Reactivos para la síntesis del biovidrio SiO2-CaO-P2O5, andamios de PVA y andamios híbridos O/I. ........................................................................................................... 45 5.1.2. Reactivos para cultivo de cardiomiocitos de corazón de pollo............................. 45 5.2. Técnicas de caracterización. ............................................................................................ 51 5.2.1. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) y análisis de los diámetros para los andamios electrohilados de PVA/biovidrio. ........................................................................ 51 5.2.2. Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM). .................................................... 55 5.2.3. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). .................... 56 5.2.4. Difracción de rayos-X (DRX). .................................................................................... 58 5.2.5. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). .............................................................. 60 5.2.7. Análisis Temogravimétrico (TGA). ............................................................................ 62 5.3 Procedimiento experimental............................................................................................... 64 5.3.1 Síntesis del biovidrio 58%SiO2-33%CaO-9%P2O5 por el método sol-gel. .......... 64 5.3.2. Método para la formación de andamios de PVA. ................................................... 66 5.3.3. Método para la formación de andamios electrohilados de PVA/biovidrio. ......... 67 5.3.4. Método para estabilizar el andamio de PVA y los híbridos PVA/biovidrio. ........ 69 5.3.5. Pruebas biológicas. ..................................................................................................... 71 5.3.5.7. Incorporación del colorante a cultivos celulares ................................................. 79 6. Resultados y su discusión. ....................................................................................................... 81 6.1 Andamios electrohilados de PVA. ..................................................................................... 81 6.1.1. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y análisis de los diámetros para los andamios electrohilados de PVA. ........................................................................................ 81 6.1.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). .................... 87 6.1.3. Difracción de Rayos-X (DRX). ................................................................................... 88 6.1.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). .............................................................. 89 6.1.5. Análisis Termogravimétrico (TGA)............................................................................ 91 6.2. Andamio electrohilado de PVA estabilizado con glutaraldehído (GA). ...................... 93 6.2.1. Microscopia electrónica de barrido (SEM). ............................................................. 93 6.2.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). .................... 94 6.2.3. Difracción de rayos-X (DRX). .................................................................................... 96 6.2.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). .............................................................. 97 6.2.5. Análisis Termogravimétrico (TGA) . ....................................................................... 100 6.3 Biovidrio de composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. ................................ 102 6.3.1. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM). ........................................................... 102 6.3.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier. ............................... 103 6.3.3. Difracción de rayos-X (DRX). .................................................................................. 104 6.3.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). ............................................................ 105 6.3.5. Análisis Termogravimétrico (TGA).......................................................................... 106 6.4. Andamios híbridos O/I electrohilados de PVA/biovidrio (58%SiO2-33%CaO- 9%P2O5) % mol. ........................................................................................................................ 107 6.4.1. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM). ........................................................... 107 6.4.2. Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) y mapeo de los componentes del biovidrio en las fibras de PVA/biovidrio. ..................................................................... 111 6.4.3. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). .................. 113 6.4.4. Difracción de Rayos-X (DRX). ................................................................................. 118 6.4.5. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). ............................................................ 120 6.4.6. Análisis Termogravimétrico (TGA).......................................................................... 121 6.5. Andamios híbridos O/I electrohilados de PVA estabilizado con GA/biovidrio (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol.....................................................................................126 6.5.1. Microscopia electrónica de barrido (SEM). ........................................................... 126 6.5.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). .................. 130 6.5.3. Difracción de Rayos-X (DRX). ................................................................................. 132 6.5.4. Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) de los andamios electrohilados de PVA estabilizado con GA/biovidrio. ................................................................................... 134 6.5.5. Análisis Termogravimétrico (TGA).......................................................................... 136 6.6. Pruebas biológicas. ......................................................................................................... 140 6.6.1. Cultivos celulares de cardiomiocitos ventriculares de corazón de pollo sobre los andamios electrohilados de PVA estabilizado con GA y PVA estabilizado con GA/biovidrio. .......................................................................................................................... 140 6.6.2. Comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. .................................................................................................................. 142 7. Conclusiones. ........................................................................................................................... 155 8. Recomendaciones. .................................................................................................................. 157 9. Apéndice. ..................................................................................................................................... 158 10. Referencias. ............................................................................................................................ 166 1 I. Índice de Figuras. Figura 2.1. Principales causas de defunción en 2015. Defunciones y porcentaje respecto al total. No suman 100 % debido a que sólo se muestran las principales causas. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales…………………………………………………………………………….…15 Figura 2.2. Defunciones por enfermedades cardiovasculares específicas en 2015. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales [1]…………………………………………………...15 Figura 2.3. Defunciones por enfermedades del corazón, según sexo y grupo de edad en 2015. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales [1]……………………...……………………………16 Figura 4.1. Estructura molecular de poli (alcohol vinílico). (a) Parcialmente hidrolizado y (b) totalmente hidrolizado.……………………..…………………………………………….…..20 Figura 4.2. Daño causado por infarto al miocardio en un corazón humano. Figura tomada de la referencia [30]………...……………………………………………….……………………30 Figura 4.3. Modelo de regulación de Ca2+ en cardiomiocitos. La despolarización del sarcolema provoca la apertura de los canales de Ca2+, dependientes del voltaje y la entrada de Ca2+ en el medio extracelular. El flujo de Ca2+ activa los canales de liberación de Ca2+ activados por Ca2+ en el retículo sarcoplásmico cercano (SR) causando aumentos adicionales en Ca2+ y ciclos de liberación de Ca2+ inducida por Ca2+. El aumento de Ca2+ interactúa con los miofilamentos para mejorar la interacción entre actina y miosina y así aumentar la contractilidad. El Ca2+ se reduce mediante la recaptación en la SR a través de la Ca2+ ATPasa. El Ca2+ también se expulsan a través del intercambiador de Na+ / Ca2+ y otras bombas de Ca2+. Figura tomada de la referencia [32]…………………………………32 Figura 4.4. Hidrólisis de TEOS en medio ácido. (a) Ataque nucleofílico de la molécula de agua a la molécula de TEOS, (b) la molécula de H2O forma un sustrato hipervalente con la molécula de TEOS, (c) transferencia del protón del agua al grupo alcóxido adyacente, (d) ruptura del enlace O-Si y formación del alcohol correspondiente.………………………….34 Figura 4.5. Etapas de condensación de TEOS en la producción de oligómeros de sílice. La condensación entre grupos silanol entre dos moléculas de TEOS hidrolizadas (a y b) y entre un grupo silanol y un grupo alcoxi adyacente (c y d) da como resultado la producción de H2O libre y etanol, respectivamente. ……………………………..……….………………..35 Figura 4.6. Diagrama esquemático de la configuración básica de electrohilado. Figura tomada de la referencia [36]…………………………………………………...………………..36 2 Figura 4.7. Imágenes SEM de la evolución de los productos con diferentes concentraciones de baja a alta durante el electrohilado. Figura tomada de la referencia [37]………………………………………………………………………………………………….38 Figura 4.8. Fotografía del equipo de electrohilado que se utilizó para la generación de los andamios híbridos O/I. En esta fotografía se muestra: (a) el sistema de inyección, (b) la caja de acrílico que aísla el sistema, (c) el colector y (d) la fuente de poder…………………………………………………………………………………………….…41 Figura 5.1. Contornos de la deposición de energía en un sólido de número atómico bajo (polimetilmetacrilato) como función de la posición, medida experimentalmente mediante grabado y según lo calculado por la simulación de trayectoria de electrones Monte Carlo [52]...…………………………………………………………………………………………….….52 Figura 5.2. Diagrama de los componentes de un sistema SEM [52]……………………….53 Figura 5.3. Microscopio electrónico de barrido JOEL JSM-7600F………………………….53 Figura 5.4. Microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1200 EX……..…………..56 Figura 5.5. Equipo de infrarrojo con transformada de Fourier. Espectrómetro Thermo Scientific Nicolet 6700……………………………………….…………………………………...58 Figura 5.6. Planos de un cristal para la obtención de la ley de Bragg……….…………….59 Figura 5.7. Equipo de difracción de rayos-X. Defractómetro Siemens D500…….………..60 Figura 5.8. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). (a) Aparato (S= muestra; R= referencia), (b) curva DSC típica, una respuesta endotérmica está representada por un pico positivo, es decir, ascendente ……………………...……………………………………..61 Figura 5.9. Equipo de DSC modulado TA Instruments DSC 2910…………..……………..62 Figura 5.10. Equipo analizador termogravimétrico de alta resolución TA Instruments TGA 2950…………………………………………………………………………………….……….….63 Figura 5.11. La figura a) muestra la separación de fases tolueno – HCl(ac) para la estabilización de los andamios de PVA y los andamios de PVA/biovidrio, la fase superior es la fase de tolueno - GA y la fase inferior es la fase de HCl(ac). La figura b) muestra la forma de los andamios que se cortaron circularmente para su posterior estabilización con GA.……………………………………………………….……………………………………..….70 Figura 6.1. Imágenes obtenidas por SEM de los andamios electrohilados de poli (alcohol vinílico). a) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 13 kV. b) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 15 kV. c) concentración de 20 % m/m, distancia inyector- colector de 15cm y diferencia de potencial de 13 kV. d) concentración de 20 % m/m, 3 distancia inyector-colector de 15cm y diferencia de potencial de 15 kV. e) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 20 cm y diferencia de potencial de 15 kV. f) concentración de 25 % m/m, distancia inyector-colector de 10cm y diferencia de potencial de 15 kV..…………………………………………………………………………………...……..83 Figura 6.2. Histogramas de los andamios híbridos de PVA para obtener las mejores condiciones de electrohilado. a) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 13 kV.b) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 15 kV. c) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 15 cm y diferencia de potencial de 13 kV. d) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 15 cm y diferencia de potencial de 15 kV. e) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 20 cm y diferencia de potencial de 15 kV. f) concentración de 25 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 15 kV…………………………...…………………………………84 Figura 6.3. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR de la muestra electrohilada de PVA. Parámetros de electrohilado: concentración de 20% m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y una diferencia de potencial aplicado de 15 kV...……………..…………………………87 Figura 6.4. Patrón de difracción de rayos-X para el andamio electrohilado de PVA. Parámetros de electrohilado: concentración de 20% m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y una diferencia de potencial aplicado de 15 kV………..………………………………...88 Figura 6.5. Análisis DSC del andamio electrohilado de PVA…………………………….....89 Figura 6.6. Análisis DSC del andamio electrohilado de PVA obtenido mediante ciclos de calentamiento. a) ciclo de calentamiento y enfriamiento que se realiza para descastar la presencia de disolventes. b) análisis DSC obtenido después del ciclo de calentamiento y enfriamiento realizado en a)……………… ………………………………………………..…..90 Figura 6.7. Termograma (TGA) del andamio de PVA electrohilado……….…………….....91 Figura 6.8. Mecanismo de descomposición del polímero de PVA. Descomposición del polímero en la primera etapa……………………………………………………………………92 Figura 6.9. La figura a) muestra la micrografía obtenida mediante SEM del andamio de PVA estabilizado con GA. La figura b) muestra el histograma de los diámetros del andamio de PVA estabilizado...…………………………………………………………………93 Figura 6.10. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR de la muestra electrohilada de PVA estabilizada con GA. Parámetros de electrohilado: concentración de 20% m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y una diferencia de potencial aplicado de 15 kV.……..……………………………………………………………………………………………95 Figura 6.11. Propuesta de reacción entre los grupos -OH superficiales del polímero de PVA con GA.……………………………………………………………………………………....96 4 Figura 6.12. Patrones de difracción de rayos-X. a) andamio de PVA. b) andamio de PVA estabilizado con GA.…………………… ………………………………………………………..97 Figura 6.13. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA…....…………….....98 Figura 6.14. Análisis DSC del andamio de PVA y del andamio de PVA estabilizado con GA…………………………………………………………………………………………………..99 Figura 6.15. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA estabilizado con GA…………………………….……………………………………………….………………….100 Figura 6.16. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA y del andamio de PVA estabilizado con GA……………………………………….…………………………………….101 Figura 6.17. Micrografías tomadas por SEM de la muestra de biovidrio con una composición de (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. a) Micrografía de biovidrio con un aumento de 500 veces. b) Micrografía de biovidrio con un aumento de 2 500 veces..…102 Figura 6.18. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR de biovidrio con una composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol…………………..……………………………………...103 Figura 6.19. Patrón de difracción de rayos-X del Biovidrio (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol………………….……………………………………………………………………………..104 Figura 6.20. Análisis DSC del biovidrio con una composición (58%SiO2-33%CaO- 9%P2O5) % mol………………………………………………………………………………….105 Figura 6.21. Análisis termogravimétrico (TGA) de la muestra de biovidrio con una composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol…………………………………………..106 Figura 6.22. Micrografías tomadas por SEM de los andamios híbridos de PVA/biovidro. a) híbrido al 5 %, b) híbrido al 10 %, c) híbrido al 15 %, d) híbrido al 20 %, e) híbrido al 25 % y f) híbrido al 30 %..........…………………………………………………………………..…..108 Figura 6.23. Histogramas de frecuencias absolutas de los andamios híbridos de PVA/biovidro. a) híbrido al 5 %, b) híbrido al 10 %, c) híbrido al 15 %, d) híbrido al 20 %, e) híbrido al 25 % y f) híbrido al 30 %. ……………………………………………………….109 Figura 6.24. Imágenes tomadas por Microscopia (TEM) del andamio híbrido al 20 %. a) micrografía que muestra la superficie de una fibra del andamio híbrido al 20 %. b) mapeo de los componentes del Biovidrio (silicio, calcio y cloro) en la fibra de PVA……………..112 Figura 6.25. Mapeo de los componentes del biovidrio (silicio, calcio y fósforo) en la fibra de PVA que se presentó en la figura 6.18 a. a) mapeo de silicio en la fibra de PVA. b) mapeo de calcio en la fibra de PVA y c) mapeo de fósforo en la fibra de PVA.…………112 5 Figura 6.26. Espectros de infrarrojo obtenido por FTIR de los andamios de PVA/biovidrio. a) andamio de PVA/biovidrio al 5 %, b) andamio de PVA/biovidrio 10 % y c) andamio de PVA/biovidrio 15 %. ………………………………………………………………………..…..113 Figura 6.27. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR del andamio electrohilado de PVA/ biovidrio al 20 %. Caracterización de las principales bandas...........................................115 Figura 6.28. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR del andamio electrohilado de PVA/ biovidrio al 25 %. Caracterización de las principales bandas.……………………………..116 Figura 6.29. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR del andamio electrohilado de PVA/ Biovidrio al 30 %. Caracterización de las principales bandas.……………………………117 Figura 6.30. Patrones de difracción de rayos-X obtenidos por el método de polvos para los andamios híbridos electrohilados de PVA/58%SiO2-33%CaO-9%P2O5, análisis realizado para los andamios de PVA/biovidrio al 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % y 30 %..................................................................................................................................119 Figura 6.31. Comparación de los análisis DSC del andamio de PVA y los andamios de PVA/biovidrio. a) andamio de PVA, b) andamio de PVA/biovidrio 5 %, c) andamio de PVA/biovidrio 10 %, d) andamio de PVA/biovidrio 15 %, e) andamio de PVA/biovidrio 20 %, f) andamio de PVA/biovidrio 25 %, g) andamio de PVA/biovidrio 30 %......................120 Figura 6.32. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA, el andamio de PVA/biovidrio al 5 % y al 10 %..........................................................................................122 Figura 6.33. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA y del andamio de PVA/biovidrio al 15 %.......................................................................................................123 Figura 6.34. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA y de los andamios de PVA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 %.................................................................................125 Figura 6.35. Micrográfias tomadas mediante SEM de los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA/biovidro. a) híbrido al 5%, b) híbrido al 10%, c) híbrido al 15%, d) híbrido al 20%, e) híbrido al 25% y f) híbrido al 30%........................................................127 Figura 6.36. Histogramas de los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA/biovidro. a) híbrido al 5%, b) híbrido al 10%, c) híbrido al 15%, d) híbrido al 20%, e) híbrido al 25% y f) híbrido al 30%.............................................................................................................128 Figura 6.37. Espectros de infrarrojo obtenido por FTIR de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. a) andamio de PVA/biovidrio al 5 %, b) andamio de PVA/biovidrio al 10 %, c) andamio de PVA/biovidrio al 15 %, d) andamio de PVA/biovidrio al 20 %, e) andamio de PVA/biovidrio al 25 % y f) andamio de PVA/biovidrio al 30 %...131 6 Figura 6.38. Patrones de difracción de rayos-X obtenidos por el métodode polvos para los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio, análisis realizado para los andamios de PVA/biovidrio al 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % y 30 %....………………………………133 Figura 6.39. Comparación de los análisis DSC de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. a) andamio de PVA/biovidrio 5 % , b) andamio de PVA/biovidrio 10 %, c) andamio de PVA/biovidrio 15 %, d) andamio de PVA/biovidrio 20 %, e) andamio de PVA/biovidrio 25 %, f) andamio de PVA/biovidrio 30 %...................................................134 Figura 6.40. Termograma TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5 % ………………………………………………………………………………………..…………...136 Figura 6.41. Termograma TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10 % …………………………………………………………………………………………….……....137 Figura 6.42. Termograma TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15 % ………………………………………………………………………………………………...…..138 Figura 6.43. Termogramas TGA de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 % ……………………………………………………………………………..139 Figura 6.44. Imágenes reveladas por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamios de PVA y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. a) y a’) células en el andamio de PVA, b y b’) células en el andamio al 5%, c y c’) células en el andamio al 10%, d y d’) células en el andamio al 15 %, e y e’) células en el andamio al 20 % y f y f’) células en el andamio al 25 %. Las figuras a), b), c), d), e) y f) muestran las células de cardiomiocitos en reposo. Las figuras a’), b’), c’), d’), e’) y f’) muestran las células de cardiomiocitos en contracción…………140 Figura 6.45. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]…………………..……….143 Figura 6.46. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 5 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]…………………………………………………………………………………………...…144 Figura 6.47. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 10 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de 7 fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]…………………………………………………………………………………..………….146 Figura 6.48. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 15 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]…………………………………………………………………………………….………..148 Figura 6.49. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 20 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ, b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+] y c) muestra la alineación o desfase de los máximos de contracción………………………….149 Figura 6.50. Secuencia de contracción revelada por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular en cardiomiocitos de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20%. a) la región iluminada corresponde a la región de alta concentración de [Ca2+] y que está relacionada con la contracción celular de los cardiomiocitos. b) diagramas de la propagación de onda correspondientes a la figura a)…………………..150 Figura 6.51. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25%. a) Áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ, b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+] y c) muestra la alineación o desfase de los máximos de contracción……………………..…..151 Figura 6.52. Secuencia de contracción revelada por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular en cardiomiocitos de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25%. a) la región iluminada corresponde a la región de alta concentración de [Ca2+] y que está relacionada con la contracción celular de los cardiomiocitos. b) diagramas de la propagación de onda correspondientes a la figura a)……….…………..152 Figura A-1. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 5%.......................................158 Figura A-2. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 10 %....................................158 Figura A-3. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 15 %....................................159 Figura A-4. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 20 %....................................159 Figura A-5. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 25 %....................................160 Figura A-6. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 30 %....................................160 8 Figura A-7. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 5 %......161 Figura A-8. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 5 %......161 Figura A-9. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 10 %....162 Figura A-10. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 15 %..162 Figura A-11. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5 %...163 Figura A-12. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10 % ………………………………………………………………………………………………….....163 Figura A-13. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15 %. …………………………………………………………………………………………………….164 Figura A-14. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 %.. …………………………………………………………………………………………………….164 Figura A-15. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25 %.. …………………………………………………………………………………………………….165 9 II. Índice de Tablas. Tabla 4.1. Propiedades mecánicas de algunos biomateriales usados en ingeniería tisular para tejido cardiaco [23]……………… …………………………………………………………27 Tabla 4.2. Principales iones liberados de biovidrio que se consideran para la ingeniería de tejidos blandos [48]………… ……………………………………………………………………44 Tabla 5.1. Cantidades necesarias para obtener 500 mL de la disolución de Hanks……………………………………………………………………………….…………..….46 Tabla 5.2. Cantidades necesarias para preparar la solución enzimática de T (inhibidores de tripsina……………………………………………………………….……..…………………..47 Tabla 5.3. Cantidades de DMS8 (10x) y Trypsina para preparar la disolución de DesOxyRibonucleasa I (DMI)……… …………………………………………………………...47 Tabla 5.4. Cantidades de DMS8 (10x) y DNasa para preparar la disolución DMII…………………………………………………………………………………….……….….48 Tabla 5.5. Sustancias y cantidades necesarias para preparar elMedio 818A……….…...48 Tabla 5.6. Cantidades de sales y glucosa para preparar la disolución DBSK (10x)…...…49 Tabla 5.7. Sustancias y cantidades necesarias para preparar la disolución DBSK (100x)…………………………………………………………………………………………..…..49 Tabla 5.8. Sustancias y cantidades necesarias para preparar la disolución DMS8 (10x)……. ………………………………………………………………………………………....50 Tabla 5.9. Parámetros estudiados para el electrohilado de poli (alcohol vinílico)………...66 Tabla 5.10. Parámetros de electrohilado que han sido establecidos a partir de los experimentos con PVA…………………………………………………………………………..68 Tabla 5.11. Nombre y descripción del andamio de PVA y los andamios híbridos O/I……………………………………………………………………………………………..…...69 Tabla 5.12. Identificación de los andamios de PVA y PVA/Biovidrio, cantidades en porciento de cada componente. Agente estabilizante y tiempo de inmersión……………..70 Tabla 6.1. Identificación de las pruebas para los andamios de PVA electrohilados..…….81 Tabla 6.2. Diámetros de las fibras de los andamios híbridos de PVA.……………….…….86 Tabla 6.3. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio de PVA………………………………………………………………………………………………...87 Tabla 6.4. Valores de Tg y Tm para el andamio electrohilado de PVA…………………….91 Tabla 6.5. Comparación del diámetro de las fibras de PVA con las fibras de PVA estabilizadas con GA. Los valores se reportan con su incertidumbre absoluta……………94 10 Tabla 6.6. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del Biovidrio (58%SiO2- 33%CaO-9%P2O5) % mol.………… ………………………………………………………..…103 Tabla 6.7. Diámetros de las fibras de los andamios híbridos de PVA/biovidrio………………………………………………………………………………..…...110 Tabla 6.8. Principales bandas observadas en los espectros de FTIR de los andamios híbridos de PVA/biovidrio al 5 %, 10 % y 15 %.……………………………………………..114 Tabla 6.9. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio híbrido PVA/biovidrio al 20%.………………………………………………………………….………..115 Tabla 6.10. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio híbrido PVA/biovidrio al 25 %.…………………………………………………………………………..116 Tabla 6.11. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio híbrido PVA/biovidrio al 30 %………………………………………………………………………......118 Tabla 6.12. Intervalos de temperatura para los procesos endotérmicos de los andamios de PVA/biovidrio…………………………………………………………………………………121 Tabla 6.13. Diámetros de las fibras de los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA/biovidrio.…………….………………………………………………...……………….…….129 Tabla 6.14. Principales bandas observadas en los espectros de FTIR de los andamios de PVA establizado con GA/biovidrio al 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % y 30 %……………..131 Tabla 6.15. Intervalos de temperatura para los procesos endotérmicos de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio ………………………………………………….….…135 Tabla 6.16. Actividad de los cardiomiocitos ventriculares de corazón de pollo sobre el andamio de PVA y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio ………….……..164 11 III. Abreviaturas y símbolos. PVA: Poli (alcohol vinílico) TEOS: Tetraetilortosilicato TEP: Trietilfosfato FTIR: Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier DRX: Difracción de rayos-X SEM: Microscopia Electrónica de Barrido TEM: Microscopia Electrónica de Transmisión TGA: Análisis Termogravimétrico DSC: Calorimetría Diferencial de Barrido OMS: Organización Mundial de la Salud SS: Secretaría de Salud ECV: Enfermedades cardiovasculares INEGI: Instituto Nacional de Estadística y Geografía Híbrido (O/I): Híbrido orgánico/inorgánico GA: Glutaraldehído Bv: Biovidrio (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol CM: Cardiomiocitos VEGF: Expresión del factor de crecimiento endotelial vascular 12 1. Resumen. La ingeniería de tejidos en miocardio intenta superar los obstáculos para prolongar la vida de los pacientes después de un infarto de miocardio. Comprende la manufactura de un andamio (estructura tridimensional que favorece la proliferación y adhesión celular) basado en un biomaterial, ya sea un andamio poroso o un parche denso, hecho de materiales poliméricos naturales o sintéticos, para ayudar al transporte de las células a la región enferma del corazón. Se han sugerido muchos tipos de células para la terapia celular y la ingeniería de tejidos aplicada al miocardio, estos incluyen tanto células madre autólogas como embrionarias. Los biomateriales sugeridos para esta aplicación específica de ingeniería de tejidos deben ser biocompatibles con las células cardíacas y tener propiedades mecánicas que coincidan con las del miocardio nativo. Recientemente se ha prestado mucha atención a diferentes familias de biovidrios con respecto al tratamiento de afectaciones que involucran al tejido cardíaco, como el infarto al miocardio. Las propiedades inherentes de los biovidrios incluyen su capacidad para unirse a tejidos duros y blandos, estimular la angiogénesis y provocar efectos antimicrobianos, junto con su excelente biocompatibilidad. Estas propiedades respaldan las estrategias propuestas en este trabajo, además, los biovidrios también pueden actuar como una fase bioactiva y que provee una mayor hidrofilicidad a los polímeros usados para reparar el tejido cardíaco. En el presente trabajo se sintetizó un biovidrio con la composición 58%SiO2- 33%CaO-9%P2O5 en % mol (Bv), utilizando la ruta de síntesis sol gel, para lo cual se utilizaron los reactivos: tetraetilortosilicato (TEOS), trietilfosfato (TEP) y cloruro de calcio dihidratado (CaCl∙2H2O) y H2O deionizada. Se obtuvieron andamios de poli (alcohol vinílico)/biovidrio por electrohilado y la ruta de síntesis sol gel. La composición del biovidrio se mantuvo constante en todos los andamios sintetizados, sin embargo, se varió la relación poli (alcohol vinílico) (PVA) /biovidrio en porcentaje masa/masa y se generó una serie de 13 composiciones de: 100 PVA/0 Bv, 95 PVA/5 Bv, 90 PVA/10 Bv, 85 PVA/15 Bv, 80 PVA/20 Bv, 75 PVA/25 Bv y 70 PVA/30 Bv. En la serie de composiciones, el PVA se estabilizó con glutaraldehído para disminuir su hidrofilicidad y para un posterior uso en cultivos de células cardiacas. Los andamios híbridos (O/I) estabilizados y sin estabilizar, así como el biovidrio, se caracterizaron por Microscopia Electrónica de Barrido (SEM), Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM), Espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR), Difracción de Rayos X (DRX), Análisis Termogravimétrico (TGA) y Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). Sobre los andamios híbridos estabilizados se depositaron cultivos de células embrionarias de corazón de pollo, los cuales provienen de la granja (ALPES) Aves Libres de Patógenos Específicos. S. A. de C. V. Con el objetivo de analizar la influencia de la composición química de los andamios híbridos en los estímulos eléctricos del tejido cardiaco. Se realizó el seguimiento de la contracción celular mediante un fluoróforo, utilizando el registro de imágenes se realizó un gráfico de la intensidad de la señal del fluoróforo en función del tiempo, con los resultados se pudo llegar a una conclusión que relaciona la frecuencia e intensidad de los estímulos cardiacos con la composición y estructura del andamio híbrido. 14 2. Justificación. 2.1. Enfermedades cardíacas en México. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades cardiovasculares (ECV) son desórdenes del corazón y de los vasos sanguíneos, estas se han convertido en la principal causa de muerte en todo el mundo, a continuación se mencionan algunas: Cardiopatía coronaria: enfermedad de los vasos sanguíneos que irrigan el músculo cardiaco. Enfermedades cerebrovasculares: enfermedades de los vasos sanguíneos que irriganel cerebro. Arteriopatías periféricas: enfermedades de los vasos sanguíneos que irrigan los miembros superiores e inferiores. Cardiopatía reumática: lesiones del músculo cardiaco y de las válvulas cardíacas debidas a la fiebre reumática, una enfermedad causada por bacterias denominadas estreptococos. Cardiopatías congénitas: malformaciones del corazón presentes desde el nacimiento. Trombosis venosas profundas y embolias pulmonares: coágulos de sangre (trombos) en las venas de las piernas, que pueden desprenderse y alojarse en los vasos del corazón y los pulmones. Del total de defunciones por ECV, según la OMS, más de tres cuartas partes se producen en los países de bajos y medios ingresos. De acuerdo con información del Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI), en México, las enfermedades del corazón representaron casi 20 % de las defunciones totales en el país en 2015 como se observa en la figura 2.1. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs317/es/ 15 Figura 2.1. Principales causas de defunción en 2015. Defunciones y porcentaje respecto al total. No suman 100 % debido a que sólo se muestran las principales causas. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales. De las enfermedades del corazón, las isquémicas ocupan el primer lugar como causas del defunción con 68.5 %, como se muestra en la figura 2.2. Figura 2.2. Defunciones por enfermedades cardiovasculares específicas en 2015. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales [1]. 16 Del número de muertes causadas en 2015 por enfermedades del corazón, la mayoría tuvieron lugar en personas del sexo masculino con 68,052 muertes, es decir, 7,382 más que el sexo femenino que registró 60,670 defunciones. Cabe mencionar que, si bien el número de muertes por ECV en hombres es mayor, en las mujeres representan 20.8% del total de defunciones, mientras que en los hombres representan 18.7%. Es a partir de 65 años en adelante donde las ECV se convierten en la principal causa de mortalidad en ambos sexos, como se muestra en la figura 3. Figura 2.3. Defunciones por enfermedades del corazón, según sexo y grupo de edad en 2015. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales [1]. Cabe destacar que de acuerdo con el boletín de prensa publicado el 24 de septiembre de 2016 por la Secretaría de Salud (SS), tener una enfermedad cardiovascular reduce en siete años la esperanza de vida [1]. Este panorama sobre ECV me permite, a través de este trabajo, proponer un andamio tisular con propiedades eléctricas y mecánicas tal que se pueda colocar en el tejido cardíaco con la finalidad de regenerar la zona afectada. https://www.gob.mx/salud/prensa/una-de-cada-tres-defunciones-en-el-pais-es-por-enfermedades-cardiovasculares-68612 17 3. Objetivos. 3.1. Objetivo general. Crear un andamio híbrido (O/I) compuesto de poli (alcohol vinílico)/58%SiO2- 33%CaO-9%P2O5, utilizando la técnica de electrohilado y la ruta de síntesis sol gel in situ para su aplicación en cultivos de células cardiacas embrionarias provenientes de corazón de pollo. 3.2. Objetivos particulares. Definir las condiciones que permitan obtener la mejor morfología de las fibras en los andamios electrohilados de PVA, contemplando los parámetros de concentración, diferencia de potencial y distancia inyector-colector. Obtener mediante la ruta de síntesis sol gel un biovidrio en el sistema ternario de 58%SiO2-33%CaO-9%P2O5 en % mol, a partir de tetraetilortosilicato (TEOS), trietilfosfato (TEP) y cloruro de calcio dihidratado (CaCl2∙2H2O). Obtener una serie de andamios electrohilados de PVA/58%SiO2-33%CaO- 9%P2O5, realizando una serie de composiciones de: 100 PVA/0 Bv, 95 PVA/5 Bv, 90 PVA/10 Bv, 85 PVA/15 Bv, 80 PVA/20 Bv, 75 PVA/25 Bv y 70 PVA/30 Bv Estabilizar el PVA de la serie de andamios (O/I) para proporcionarle resistencia a la disolución en agua. Caracterizar por (SEM), (TEM), (FTIR), (DRX), (DSC) y (TGA) la serie de los andamios híbridos (O/I) sin estabilizar y estabilizados con GA. Realizar cultivos con células embrionarias de corazón de pollo en los andamios híbridos (O/I) estabilizados para demostrar su biocompatibilidad con las células. Realizar un perfil de respuesta en función del tiempo de las células embrionarias de corazón de pollo, para demostrar que los andamios son aptos en cuanto a la sincronía del pulso eléctrico y conectividad celular. 18 4. Introducción. 4.1. Biomateriales. "Un biomaterial es cualquier sustancia, que no sea un medicamento, y que puede ser una combinación de sustancias, de origen sintético o natural, es usado durante cualquier período de tiempo, como un todo o como parte de un sistema que trata, aumenta o reemplaza cualquier tejido, órgano o función del cuerpo". [2] Los materiales que son biocompatibles se denominan biomateriales. La biocompatibilidad es un término descriptivo que indica la capacidad del material para funcionar con una respuesta apropiada del tejido circundante, en una aplicación específica. En términos sencillos, implica la compatibilidad del biomaterial con los sistemas vivos. Los biomateriales de la primera generación se desarrollaron en las décadas de 1960 y 1970, cuyo objetivo principal era lograr las propiedades físicas y químicas que coincidan con la del tejido del huésped (con una respuesta citotóxica mínima o nula). La característica principal de estos biomateriales era la 'inercia' para evitar cualquier rechazo biológico. Durante 1980-1990, el énfasis de la investigación se desplazó hacia el desarrollo de materiales bioactivos, lo que provocó una respuesta biológica en la interfaz entre el biomaterial y el huésped. Los biomateriales convencionales se clasifican en cuatro categorías [3]: 1. Biopolímeros. 2. Biocerámicos. 3. Metales. 4. Biocompuestos. 4.1.1. Biopolímeros. Los biopolímeros generalmente se clasifican en naturales y sintéticos. Ambas categorías tienen ventajas e inconvenientes. 19 4.1.1.1. Biopolímeros naturales. Los biopolímeros naturales poseen propiedades químicas intrínsecas necesarias para la unión y la proliferación de las células. Sus productos de degradación no son tóxicos, con una respuesta inmune baja. Sin embargo, la mayoría de esta categoría de polímeros requiere una etapa adicional de estabilización para volverse insoluble en soluciones acuosas, tales como los medios de cultivo. Los polímeros naturales comúnmente utilizados en la ingeniería del tejido cardíaco incluyen colágeno, fibrinógeno, quitosano, gelatina, elastina y seda [4]. 4.1.1.2. Biopolímeros sintéticos. Los biopolímeros sintéticos tienen reproducibilidad alta así como un proceso sencillo de control de calidad. Por otra parte, su costo es menor en comparación con los naturales y sus propiedades mecánicas se ajustan de manera efectiva a las propiedades del tejido, carecen de moléculas de señalización bioquímica que deberían introducirse agregando un paso adicional de funcionalización o combinándolas con polímeros naturales. Su ventaja es su facilidad para electrohilarse y su bajo costo, pero por otro lado, el tratamiento y modificación de su superficie suele ser necesaria para fines de cultivo celular [5]. 4.1.1.1. Poli (alcohol vinílico). El poli (alcohol vinílico) (PVA), es un polímero sintético, hidrofóbico, con grupos -OH en su estructura; es utilizado desde principios de la década de 1930 en una gama de aplicaciones industriales, comerciales, médicas y alimentarias, incluidas resinas, lacas, hilos quirúrgicos y aplicaciones de contacto con alimentos. El polímero de PVA se prepara en dos etapas debido a la inestabilidad de las unidadesmonoméricas de alcohol vinílico (pronta tautomerización en acetaldehído). En una primera etapa, se prepara el polímero poli (acetato de vinilo); polimerizando acetato de vinilo en una solución alcohólica y en una segunda etapa, se lleva a cabo la hidrólisis parcial de poli (acetato de vinilo) para https://en.wikipedia.org/wiki/Vinyl_acetate 20 dar lugar al PVA. El PVA generalmente se clasifica en dos grupos: parcialmente hidrolizado (a) e hidrolizado por completo (b), como se muestra en la figura 4.1 [6]. OH O O CH3 n m OH n Figura 4.1. Estructura molecular de poli (alcohol vinílico). (a) Parcialmente hidrolizado y (b) totalmente hidrolizado [6]. Al variar la longitud inicial de la cadena del poli (acetato de vinilo) y el grado de hidrólisis en condiciones alcalinas o ácidas, se obtienen productos de PVA que difieren en el peso molecular; que varía entre (20 000 - 400 000) g/mol, solubilidad en agua, flexibilidad y resistencia a la tracción. Se miden diversas propiedades para caracterizar el PVA, como el pH, viscosidad, pérdida de peso en el secado, punto de fusión e índice de refracción en los productos finales. El PVA con un bajo grado de hidrólisis, posee una mayor solubilidad en agua a baja temperatura en comparación con el PVA que posee un alto grado de hidrólisis. Lo anterior se debe a que los grupos de acetato residual (hidrofóbico en naturaleza) debilitan los enlaces de hidrógeno intra e intermoleculares de los grupos adyacentes -OH y para el PVA con alto grado de hidrólisis, la temperatura debe elevarse a 70 °C o más para disolver en agua [7]. 4.1.2. Biocerámicos. Los biocerámicos, es un campo relativamente nuevo; no existía hasta comienzos de 1970, cuando estos materiales fueron utilizados para restaurar las funciones osteoarticulares y dentales, también como material de reemplazo para autoinjertos (a) (b) 21 y aloinjertos en la reconstrucción de hueso. Numerosos materiales sintéticos para injertos óseos están disponibles como alternativos al hueso autógeno (hueso obtenido a partir de un mismo individuo con fines de reparación, sustitución y aumento). Incluidos en estos biomateriales sintéticos se encuentran las vitrocerámicas especiales, que se describen como vidrios bioactivos y fosfatos cálcicos (fosfato de calcio, hidroxiapatita cálcica, fosfato tricálcico, y fosfato cálcico bifásico). Las biocerámicas usadas para reemplazar, reparar o reconstruir partes del cuerpo humano o tejidos vivos complejos tienen diferencias en su naturaleza química, propiedades y aplicaciones [8]. 4.1.2.1. Biovidrios. La palabra «biovidrio» significa el vidrio que, es compatible con los tejidos vivos circundantes, no mutágeno, no carcinogénico y no antigénico, para evitar cualquier efecto adverso sobre las células. Los biovidrios poseen una estructura amorfa, resistencia mecánica y poseen un carácter hidrofílico. Los biovidrios se utilizan en la reparación ósea y se están desarrollando para aplicaciones en ingeniería de tejidos. Las características importantes de los biovidrios, que los convierte en candidatos adecuados para la ingeniería de tejido óseo, es su capacidad para mejorar la revascularización, la adhesión de los osteoblastos, la actividad enzimática y la diferenciación de las células madre mesenquimales, así como las células osteoprogenitoras [9]. El primer biovidrio fue inventado por Larry Hench en la Universidad de Florida en 1969. El profesor Hench comenzó su trabajo para encontrar un material que pudiera unirse al hueso, el problema que se tenía era que todos los materiales de implantes disponibles en ese momento, por ejemplo, metales y polímeros que se diseñaron con el propósito de ser bioinertes, desencadenaban la encapsulación fibrosa después de la implantación, en lugar de formar una interfaz estable con los tejidos. Hench decidió hacer un vidrio degradable en el sistema Na2O-CaO-SiO2- P2O5. 22 Este material se procesa usando temperaturas de fusión en el intervalo de (1300 – 1450) °C, este proceso es una ruta de síntesis por fundición de los reactivos. Desde su descubrimiento se han estudiado diversas composiciones utilizando la síntesis sol gel para demostrar sus propiedades bioactivas en cultivos biológicos [10]. Los biovidrios pertenecen a una categoría especial de materiales bioactivos, un material bioactivo representa un material que sigue un proceso después de su implantación dentro del cuerpo. Algunos de los requisitos que deben tener los biovidrios para desempeñarse exitosamente como biomaterial dentro de un huésped son: 1. Los biovidrios deben exhibir las propiedades mecánicas requeridas para resistir cualquier tipo de presión o tensión para prevenir cualquier falla estructural durante las actividades rutinarias normales del paciente, así como durante la manipulación del material. 2. La biocompatibilidad de los biovidrios es una propiedad indispensable, lo que significa que no deben ser tóxicos y, por lo tanto, favorecer la adhesión celular y la proliferación celular. 3. Los vidrios bioactivos no deberán exhibir ninguna respuesta inflamatoria. 4. La arquitectura de los andamios preparados con biovidrio debe tener una estructura porosa tridimensional (3 D) para promover la proliferación celular, la vascularización y la difusión de nutrientes, lo que proporciona un microambiente regulado para la síntesis de nuevos tejidos. 5. Para la ingeniería ósea, los andamios tridimensionales preparados a partir del biovidrio deben poseer porosidad interconectada para soportar la vascularización con el fin de dirigir a las células a crecer en la estructura física requerida. Se requiere una porosidad típica del 90% junto con un diámetro de poro de al menos 100 μm para la vascularización adecuada del tejido [11]. 23 4.1.3. Metales. Los biomateriales metálicos son uno de los grupos de biomateriales más utilizados junto con la cerámica, polímeros sintéticos y productos naturales. La utilidad de estos materiales metálicos se basa en la formación de una capa de óxido fina protectora. La capa de óxido se forma al exponerse al oxígeno y vuelve a formarse en milisegundos después del daño. Esta capa reduce la corrosión, uno de los requisitos de un biomaterial. Los otros requisitos incluyen biocompatibilidad, bioadhesión, bioactividad y procesabilidad [12]. En la práctica, cada metal o aleación, es decir, aleaciones de titanio, acero inoxidable y aleaciones Co-Cr, tienen sus propias ventajas para diferentes aplicaciones basadas en propiedades mecánicas, químicas y biofuncionales. Generalmente, los biomateriales metálicos se usan para aplicaciones estructurales tales como implantes, clavos y andamios para huesos debido a sus excelentes propiedades mecánicas; como el módulo de Young, la resistencia a la tracción, la ductilidad, la resistencia a la fatiga y la resistencia al desgaste. Sin embargo, se pueden usar para dispositivos completamente funcionales y sin carga, como válvulas y marcapasos cardíacos. La primera generación de biomateriales metálicos fue diseñada para una toxicidad mínima. La segunda generación ha sido diseñada para la funcionalidad tanto a nivel mecánico como molecular para mejorar la integración del material en el entorno biológico y aumentar la longevidad del implante. La tercera generación se ha centrado no solo en la funcionalidad, sino también en la regeneración del tejido circundante junto con el material bioactivo [13]. 4.1.3. Biomateriales híbrido (O/I). Una definición de lo que es un material híbrido es dada por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada, por sus siglas en inglés (IUPAC) y dice: "Un material 24 híbrido se compone de una mezcla íntima de componentes inorgánicos, componentes orgánicos o ambos tipos de componentes. Nota: los componentes suelen interpenetrarse en escalas demenos de 1 μm" [14]. La clasificación de la IUPAC tiene la desventaja de que cubre una gama de materiales, incluidos los materiales cristalinos inorgánicos, mezclas de polímeros y nanocompuestos. Una definición específica sería: “un material híbrido consiste en al menos dos componentes, generalmente un componente orgánico y otro inorgánico, que se dispersan molecularmente”. Siguiendo esta definición, los materiales híbridos son un caso especial de compuestos que muestran una mezcla de los diferentes componentes en la escala molecular [15]. 4.1.3.1. Híbridos basados en polímeros. Los componentes orgánicos en materiales híbridos orgánicos/inorgánicos son moléculas orgánicas llamadas polímeros o compuestos macromoleculares. Los híbridos basados en polímeros se obtienen mediante diferentes procesos. Una ruta de síntesis es el proceso de sol gel, que se aplica en presencia de un polímero en disolución y que podría o no formar un enlace químico entre los dos componentes. En el caso de no formar un enlace químico entre los componentes orgánicos y los inorgánicos, los componentes inorgánicos se incorporan al polímero como bloques moleculares [16]. La mayoría de las veces se prefieren las interacciones químicas entre el polímero orgánico y el componente inorgánico, lo que generalmente conduce a materiales estables y altamente homogéneos. Se usan diversas estrategias para formar tales sistemas, uno de los enfoques aplicados es la polimerización in situ del polímero orgánico en presencia del componente inorgánico. Para obtener sistemas homogéneos, es importante que el polímero y los componentes inorgánicos muestren una compatibilidad alta que generalmente se logra mediante algún tipo de interacción química, de tipo fuerzas van-der-Waals, puentes de hidrógeno, enlaces coordinados o covalentes [17]. 25 4.2. Ingeniería Tisular. La ingeniería tisular implica el desarrollo de reemplazos funcionales para tejidos u órganos dañados. Un enfoque común para producir andamios tisulares es agregar células a una matriz extracelular natural o sintética, que proporciona soporte mecánico y señales bioquímicas. El andamio tisular puede prepararse total o parcialmente antes de la implantación para activar la capacidad regenerativa del cuerpo. La ingeniería tisular es un subconjunto del amplio campo de la medicina regenerativa, que busca reparar o reemplazar los órganos dañados. Esto podría ocurrir por inyección directa de células o modificando procesos celulares para iniciar la reparación y proliferación. A pesar de los avances importantes de investigación en biología celular y biomateriales, algunos productos han surgido de estos esfuerzos hasta la fecha, lo que apunta a los desafíos para desarrollar tejidos funcionales [18]. La clave en el diseño para producir tejidos funcionales in vitro son reproducir la estructura del tejido y la densidad celular in vivo , identificar fuentes adecuadas de células, promover el crecimiento y la diferenciación de las células, diseñar un constructo que reproduzca la matriz extracelular, con las señales moleculares apropiadas y las propiedades mecánicas adecuadas; así como, crear una vasculatura dentro del constructor para permitir la oxigenación y la integración del andamio con el tejido después de la implantación [19]. 4.2.1. Ingeniería tisular en tejido cardiaco. El andamio ideal para la ingeniería del tejido cardíaco es el que combina las características siguientes. I. Propiedades mecánicas apropiadas que coincidan con las propiedades mecánicas del tejido cardíaco nativo (anisotropía, elasticidad, contractibilidad, entre otras). 26 II. Estructura apropiada que imita el microambiente del tejido cardíaco nativo (alineación anisotrópica fibrosa característica del miocardio, porosidad, morfología y porosidad del andamio). III. Propiedades superficiales apropiadas para promover la adhesión, proliferación y viabilidad de las células cardíacas, similar a la del tejido cardiaco nativo (biocompatibilidad, humectabilidad). IV. Conductividad eléctrica apropiada del andamio para permitir la propagación de la estimulación eléctrica, que ha demostrado tener un efecto positivo sobre el comportamiento celular [20]. El objetivo de la ingeniería del tejido cardíaco es reparar, regenerar o reemplazar tejidos nativos dañados mediante: I. El trasplante de células. II. La ingeniería in vitro de tejidos cardíacos para la implantación y reparación del tejido cardiaco. III. El diseño de biomateriales bioactivos para su uso en reparación cardíaca in situ mediante la promoción de la vascularización del material, la supervivencia y el crecimiento celular [21]. 4.2.2. Propiedades de los andamios destinados para la regeneración de tejido cardiaco. 4.2.2.1. Propiedades mecánicas. En cuanto a las propiedades mecánicas, debe tenerse en cuenta que el mejor andamio para la regeneración del tejido cardíaco debe tener un módulo de Young entre decenas de kPa y 1 MPa, ya que se ha informado que la rigidez del ventrículo izquierdo es de aproximadamente (10-20) kPa en el inicio de la diástole y en el intervalo (0.2-0.5) MPa al final de la diástole [22]. Otros estudios indicaron 27 que el módulo de Young del tejido cardíaco nativo está en el intervalo de (10-15) kPa, mientras que en el caso de tejido isquémico (se produce cuando el flujo de sangre que va al corazón se reduce, lo que impide que este reciba oxígeno suficiente) asociado con fibrosis, aumenta hasta (30-50) kPa. Además, Engler et al. Al aislar las células cardíacas, mostró que los cardiomiocitos solamente podían formar sarcómeros maduros con pulsaciones regulares sobre geles de poliacrilamida con un módulo de Young de aproximadamente 10 kPa [23]. Tabla 4.1. Propiedades mecánicas de algunos biomateriales usados en ingeniería tisular para tejido cardiaco [23]. Biomaterial Módulo de Young Resistencia a la tracción PGA sintético (7-10) GPa 70 MPa PLLA o PDLLA sintético (1-4) GPa (30-80) MPa Alginato natural (2.25-2.4) GPa (24.72) MPa Fibras de colágeno (2-46) GPa (1-7) MPa Gel de colágeno (0.002-0.022) MPa (1-7) KPa Miocardio de Humano (0.2-0.5) MPa (al finalizar la diástole) (3-15) KPa 4.2.2.2. Interacción entre las células cardiacas y los biomateriales con propiedades conductoras. El ventrículo del corazón en el cuerpo humano muestra una notable contractibilidad, y el mecanismo que controla esta capacidad de contracción celular, está impulsado por la contracción sincrónica de los cardiomiocitos. Para que los cardiomiocitos (CM), se contraigan con éxito, una señal eléctrica impulsa la contracción y es respaldada por las propiedades mecánicas del miocardio humano [24]. Los andamios conductores podrían regular la expresión de los marcadores específicos de cardiomiocitos, incluyendo la tropónina cardiaca T, tropónina cardiaca I y conéxina 43, lo que lleva a la funcionalización mejorada de los CM y una excelente contracción sincrónica. Los cardiomiocitos sembrados en un andamio conductivo, no sólo exhiben un comportamiento contráctil sincrónico sino 28 que aumentan los niveles de las proteínas relacionadas con la contracción cardíaca y el acoplamiento eléctrico. Por lo tanto, se afirma que uno de los problemas para la ingeniería del tejido cardíaco es, la mejora en la conductividad eléctrica del andamio (velocidad de conducción eléctrica adecuada). El control de la conductividad eléctrica en los andamios electrohilados ayudará a promover la funcionalización y la maduración de los tejidos regenerados. Los materiales que han sido tradicionalmente usados para la producción de los andamios electrohilados, no combinan las propiedades mecánicas y eléctricas apropiadas. Esta es la razón detrás de la incapacidad de la ingeniería tisular para mantenerse y promover el ritmo sincrónico de la contraccióndel miocardio nativo [25]. 4.3 Tejido muscular cardíaco. El tejido muscular cardíaco es un tipo especial de musculo que forma exclusivamente el corazón. El miocardio, junto con el endocardio y el pericardio, son los tres tejidos que forman el órgano. Este musculo debe ser capaz de contraerse y relajarse de forma ininterrumpida, desde antes del nacimiento de la persona y hasta el momento de su muerte. El miocardio se caracteriza por transmitir el impulso nervioso; además, el corazón genera una diferencia de potencial eléctrico propio, que es el responsable de su contracción [26]. El tejido miocárdico muestra una estructura jerárquica con células fibrosas alineadas, inmersas en estructuras 3D tipo panal, formados por fibras de colágeno perimisial onduladas y diferentes proteínas de la matriz extracelular. Por lo tanto, un andamio con estructura fibrosa es crucial para la organización celular, la supervivencia y la función de las células cardíacas sembradas. Para respetar la organización anisotrópica del tejido cardíaco y promover el desarrollo de un tejido cardiaco funcional, la estructura fibrosa necesita alinearse. Varios estudios demostraron que la presencia de una superficie alineada, facilita la orientación y la organización de los cardiomiocitos. Además, una alta relación superficie-volumen 29 y porosidad son elementos indispensables para la migración de las células y la vascularización [27]. 4.3.1. Células cardiacas. Los cardiomiocitos son células que forman el órgano del corazón, que deben contraerse al unísono para proporcionar una acción efectiva del bombeo sanguíneo que asegure una perfusión adecuada en los diversos órganos y tejidos. La función principal del corazón es bombear sangre eficientemente mediante un ciclo de contracción-relajación dirigido por los cardiomiocitos que trabajan. La regulación de la contractilidad de estas células individuales se logra mediante la activación de canales iónicos especializados e intercambiadores que controlan con precisión la entrada y salida de Ca2+ en la célula [28]. Las características principales de los cardiomiocitos son: I. Son las células responsables de generar la fuerza contráctil en el corazón. II. Forman el sistema de conducción cardíaca, responsable del control del latido rítmico del corazón. III. Experimentan un agrandamiento (hipertrofia) en respuesta a la demanda crónica de una mayor fuerza contráctil, la incapacidad de satisfacer estas necesidades conduce a un gasto cardíaco suficiente para la demanda en comparación con el organismo (insuficiencia cardíaca), una de las causas comunes de muerte en el mundo occidental. Una característica distintiva de los cardiomiocitos adultos es que tienen dos núcleos separados [29]. 4.3.2. Falla cardíaca. La inhibición del corazón para administrar suficiente sangre y cumplir con los requisitos metabólicos del cuerpo provocará insuficiencia cardíaca. Es una de las 30 principales causas de muerte en las naciones industrializadas, y es el resultado de cualquier enfermedad que dañe al miocardio, lo que da como resultado una menor capacidad para bombear sangre. Los daños más comunes son la enfermedad arterial coronaria y la hipertensión (presión arterial alta), pero el daño a cualquier parte de la intrincada estructura del corazón puede afectar el rendimiento cardíaco y provocar insuficiencia cardíaca. Esto incluye a las válvulas cardíacas, el sistema de conducción eléctrico del corazón o la presión externa alrededor del corazón, debido a la constricción del saco pericárdico en el que se encuentra el corazón. El infarto al miocardio es causado por una reducción significativa del suministro de sangre coronaria a un área del corazón durante un período sostenido, eventualmente formando tejido cicatricial fibroso no contráctil, con capacidad contráctil reducida o ausente en comparación con el resto del corazón sano. En la figura 4.2, se muestra un diagrama esquemático, representando el área dañada después de un ataque al corazón debido a una arteria coronaria bloqueada. Figura 4.2. Daño causado por infarto al miocardio en un corazón humano. Figura tomada de la referencia [30]. El miocardio es un tejido diferenciado que no se regenera. No puede compensar la pérdida celular que ocurre con el infarto al miocardio, lo que finalmente, lleva a una remodelación ventricular izquierda incapaz de responder a los estímulos eléctricos y a una insuficiencia cardíaca terminal. Por esta razón, el interés en desarrollar métodos nuevos para reparar y regenerar el área infartada del miocardio [30]. 31 4.3.3. Acoplamiento excitación-contracción cardiaca. El acoplamiento de excitación-contracción cardiaca es el proceso desde la excitación eléctrica de los cardiomiocitos, hasta la contracción del corazón (que impulsa la salida de la sangre). El segundo mensajero presente en el sistema contráctil es el ion Ca2+, que es esencial en la actividad eléctrica cardíaca y es el activador directo de los miofilamentos, que causa la contracción. El mal manejo del ion Ca2+ por los cardiomiocitos es una causa central de disfunción contráctil y arritmias en condiciones fisiopatológicas. Durante el potencial de acción cardíaco, el Ca2+ ingresa a la célula a través de los canales de Ca2+ activados por la despolarización como corriente de Ca2+ (ICa), lo que contribuye a la meseta del potencial de acción, como se muestra en la figura 4.3. La entrada de Ca2+ desencadena la liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplásmico (RS). La combinación de Ca2+ que entra y que, posteriormente promueve la liberación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico, aumenta la concentración de Ca2+ intracelular libre ([Ca2+]i), permitiendo que el Ca 2+ se una a la proteína del miofilamento (tropónina C), que luego enciende la maquinaria contráctil. Para que ocurra la relajación, la concentración de Ca2+ intracelular libre ([Ca2+]i), debe disminuir, permitiendo que el Ca2+ se disocie de la tropónina C. Esto requiere el transporte de Ca2+ fuera del citosol por cuatro vías: (1) RS Ca2+ -ATPasa, (2) intercambio sarcolemal de Na+ / Ca2+, (3) Ca2+ -ATPasa sarcolemal y (4) uniportador mitocondrial de Ca2+ [31]. 4.3.3.1. Requisitos de Ca2+ para la activación de miofilamentos. ¿Cuánto Ca2+ se requiere para activar los miofilamentos y que se produzca la contracción? Por lo general, la respuesta del miofilamento al Ca2+ se muestra como una función de [Ca2+]i libre, figura 4.3, y los miofilamentos responden 32 cooperativamente a [Ca2+]i. En el músculo ventricular, un promedio de la concentración de Ca2+ para la media activación es de 600 nmol/L. La fuerza contráctil del cardiomocito está en función de la concentración de [Ca2+]i, sin embargo, no indica cuánto Ca2+ total se requiere para activar los miofilamentos. Este problema se complica por el hecho de que hay otros receptores de unión de Ca2+ en la célula que, están en competencia dinámica con la tropónina C. De hecho, la concentración del ion calcio libre ([Ca2+]i), está tamponado, de manera que toma >100 μmol Ca2+/L citósol para elevar [Ca2+]i desde un nivel diastólico de 100 nmol/L a un nivel sistólico máximo de 1 μmol/L [32]. Figura 4.3. Modelo de regulación de Ca2+ en cardiomiocitos. La despolarización del sarcolema provoca la apertura de los canales de Ca2+, dependientes la diferencia de potencial y la entrada de Ca2+ en el medio extracelular. El flujo de Ca2+ activa los canales de liberación de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico cercano, causando aumentos adicionales en Ca2+ y ciclos de liberación de Ca2+. El aumento de Ca2+ interactúa con los miofilamentos para mejorar la interacción entre actina y miosina y así aumentar la contractilidad. El Ca2+ se reduce mediante la recaptación en la SR a través de la Ca2+ ATPasa. ElCa2+ también se expulsa a través del intercambiador de Na+ / Ca2+ y otras bombas de Ca2+ [32]. Miofilamento Mitocondria 33 4.4. Proceso sol-gel. El proceso sol gel comienza con un precursor molecular, que forma una red en 3D inorgánica a lo largo del tiempo. En otras palabras, los compuestos moleculares reaccionan entre sí para construir un material conectado, por fuertes enlaces químicos. Comparado con las reacciones de estado sólido clásicas, el método tiene la ventaja de que los precursores, que en este trabajo son TEOS, TEP y CaCl2∙2H2O, reaccionan entre sí en un entorno líquido que reduce los problemas de difusión que existen en los procesos de estado sólido. Por lo tanto, estos últimos a menudo requieren tiempos de reacción largos y temperaturas altas. Los alcóxidos de silicio representan los principales agentes formadores de red utilizados en los métodos de preparación de sol gel. El proceso sol gel proporciona beneficios clave, tales como las temperaturas bajas de síntesis y la amplia gama de precursores de alcóxido disponibles. Sin embargo, la eficiencia proporcionada por la síntesis a temperatura baja y la precisión con la que se logran composiciones específicas, tienen el potencial de superar cualquier aspecto negativo del proceso. La síntesis a temperatura baja, se logra a través de la formación de fuertes enlaces covalentes entre elementos que, de otro modo requerirían temperaturas excesivamente altas para ser formados [33]. 4.4.1. Hidrólisis en medio ácido. La hidrólisis se produce como una reacción de sustitución nucleofílica bimolecular SN2, por lo que la adición de H2O da como resultado un sustrato hipervalente. El átomo central del sustrato (por ejemplo, el silicio en el caso de TEOS) adquiere una carga parcial negativa, mientras que el oxígeno en la molécula de H2O se vuelve parcialmente positivo. La variación de carga causa inestabilidad en la molécula de sustrato hipervalente que, se rectifica mediante la transferencia de un protón del nucleófilo (H2O) al enlace éster de un grupo alcoxi opuesto. La ruptura del enlace σ entre el alcoxi opuesto (es decir, el grupo saliente) y el sustrato, se produce por la adición del protón del propio nucleófilo. Esto da como resultado, la 34 formación de un grupo -OH disponible sobre el sustrato y un alcohol del grupo saliente alcoxi. El hecho de que, ambas reacciones ocurran simultáneamente define la hidrólisis de alcóxidos como reacciones tipo SN2. En la figura 4.4 se muestra el proceso de hidrólisis de la molécula de TEOS. Figura 4.4. Hidrólisis de TEOS en medio ácido. (a) Ataque nucleofílico de la molécula de agua a la molécula de TEOS, (b) la molécula de H2O forma un sustrato hipervalente con la molécula de TEOS, (c) transferencia del protón del agua al grupo alcóxido adyacente, (d) ruptura del enlace O-Si y formación del alcohol correspondiente. 4.4.2. Condensación en medio ácido. En la condensación ocurre una reacción en la que se pierde un grupo –OH del sustrato. Por lo tanto, este mecanismo es una reacción de sustitución nucleofílica unimolecular SN1, y puede ocurrir mediante una reacción en la que se genera agua o el alcohol correspondiente, que para el caso del TEOS se genera etanol. Para que lo primero ocurra, dos grupos -OH deben tomar parte en la formación de un enlace Si-O-Si, mientras que el último resulta de la transferencia directa de protón al grupo saliente en un sustrato vecino. A partir de estas reacciones, una disminución en el pH promueve la hidrólisis a través de la protonación de los grupos salientes [34]. En la figura 4.5 se muestra la reacción de condensación en medio ácido de la molécula de TEOS. Si O O O O H2C C H2 CH3 H2 C CH2 H3C CH3 H3C Si O O O O H2 C C H2 CH3 H2C H2C CH3 CH3 CH3 O H H Catálisis ácida H Si O O O O H2 C C H2 CH3 H2C H2C CH3 CH3 CH3 O H H Si O O O CH2 C H2 CH3 CH2 H3C CH3 HO H3C H2 C OH+ (a) (b) (c) (d) 35 Figura 4.5. Etapas de condensación de TEOS en la producción de oligómeros de sílice. La condensación entre grupos silanol de dos moléculas de TEOS hidrolizadas (a y b) y entre un grupo silanol y un grupo alcoxi adyacente (c y d) da como resultado la producción de H2O libre y etanol, respectivamente. 4.5. Técnica de electrohilado. El proceso de electrohilado fue patentado por primera vez por J. F. Gooley en 1900 (Cooley, J. F. Patent GB 06385), cuyo nombre registrado fue '' Métodos y aparatos mejorados para electricidad, separando el componente líquido relativamente volátil del componente de sustancias relativamente fijas de fluidos compuestos '' [35]. La configuración básica de electrohilado contiene tres componentes principales: una fuente de alimentación de alto voltaje, una jeringa de plástico o metálica y un colector. El conjunto de componentes para electrohilado se encuentran en la figura 4.6. La jeringa es para alojar la solución de polímero. A medida que se aplica una Si O O O CH2 C H2 CH3 CH2 CH3 CH3 HOSi O O O H2C CH2H3C H2C H3C H3C OH Si O O O CH2 H2 C CH3 CH2 CH3 CH3 SiO O O C H2 H2 CH3C H2C H3C H3C H O H+ Si O O O C H2 H2C CH3 CH2 CH3 CH3 HO Si O O O H2C CH2H3C H2C H3C H3C O CH2 CH3 Si O O O CH2 H2 C CH3 CH2 CH3 CH3 SiO O O C H2 H2 CH3C H2C H3C H3C (c) (d) H3C H2 C OH+ (a) (b) (d) (c) 36 diferencia de potencial, la gota de solución de polímero en la punta de la jeringa se polariza y las cargas inducidas se distribuyen en la superficie de la gota. Debido al campo electrostático generado por la fuente de corriente continua, el polímero cargado se acelerará hacia el colector. Dentro del proceso de electrohilado, el papel de las fuerzas electrostáticas es complementar o reemplazar a las fuerzas mecánicas convencionales (hidrostática, neumática) utilizadas para formar el chorro y para reducir el tamaño de la fibra. El colector, por lo general, es un conductor eléctrico para la neutralización de la carga eléctrica transportada por las fibras. Figura 4.6. Diagrama esquemático de la configuración básica de electrohilado. Figura tomada de la referencia [36]. Doshi and Reneker, clasificaron los parámetros que controlan el proceso en términos de propiedades de la solución, variables del equipo que se controlan, y parámetros ambientales [36]. 37 Las propiedades de la solución incluyen la viscosidad, conductividad, tensión superficial, peso molecular del polímero, momento dipolar y constante dieléctrica. Los efectos de las propiedades de la solución son difíciles de aislar, ya que al variar un parámetro, afecta otras propiedades de la solución (cambiar la conductividad también puede cambiar la viscosidad). Las variables controladas incluyen la velocidad de flujo, la diferencia de potencial aplicado, la distancia entre la punta de la jeringa y el colector, el diseño de la punta de la aguja y la composición y geometría del colector. Los parámetros ambientales incluyen temperatura, humedad y presión [36]. 4.5.1 Concentración. Las concentraciones de solución de polímero desempeñan un papel importante en la formación de fibras durante el proceso de electrohilado. Deben observarse cuatro concentraciones críticas de menor a mayor y su efecto en la morfología de las fibras, estos efectos se ilustran en la figura 4.7. 1. Como la concentración es muy baja, se obtendrán micropartículas. En este momento, se produce electrospray en lugar de producir el fenómeno de electrohilado debido a la baja viscosidad y altas tensiones superficiales de la solución. 2. Cuando la concentración es un poco más alta, se obtendrá una mezcla de bulbos y fibras. 3. Cuando la concentración es adecuada, se pueden obtener nanofibras. 4. Si la concentración es muy alta, no se obtienenfibras definidas y de tamaño nanométrico, se obtienen fibras de tamaño micrométrico en forma de cintas helicoidales. 38 Para ver claramente la evolución de los productos con diferentes concentraciones críticas de menor a mayor, cuatro imágenes SEM típicas se han utilizado para ilustrar el cambio completo (Figura 4.7). Figura 4.7. Imágenes SEM de la evolución de los productos con diferentes concentraciones de baja a alta durante el electrohilado. Figura tomada de la referencia [37]. Por lo general, al aumentar la concentración de solución, el diámetro de la fibra aumenta si la concentración de la solución es adecuada para el proceso de electrohilado. Adicionalmente, la viscosidad de la solución también se puede modificar ajustando la concentración de la solución [37]. 4.5.2 Peso molecular. El peso molecular del polímero también tiene un efecto importante sobre las morfologías de la fibra. En principio, el peso molecular refleja el entrelazamiento de cadenas de polímeros en soluciones, concretamente la viscosidad de la solución. Manteniendo fija la concentración y bajando el peso molecular del polimérico, tiende a formar bulbos en lugar de fibras definidas. Aumentando el peso molecular, se obtendrá una fibra definida [38]. 4.5.3 Viscosidad. La viscosidad de la solución es la clave crítica para determinar la morfología de la fibra. Se ha demostrado que las fibras continuas y definidas no son obtenidas a 39 muy baja viscosidad, mientras que una viscosidad muy alta da como resultado la inyección dura de los chorros de la solución, es decir, existe la necesidad de una viscosidad adecuada para el electrohilado. En general, la viscosidad de la solución se ajusta modificando la concentración del polímero en la solución. Es importante, tener en cuenta que la viscosidad, la concentración del polímero y el peso molecular, están relacionados entre sí. Para la solución de baja viscosidad, la tensión superficial es el factor dominante en la formación de bulbos en las fibras. Si la solución es de viscosidad adecuada, se obtienen fibras continuas [39]. 4.5.4. Tensión superficial. La tensión superficial, como la función de las composiciones de disolventes de la solución, es un factor bastante importante en el electrohilado. En 2004, Yang y Wang investigaron sistemáticamente la influencia de las tensiones superficiales sobre la morfología de las fibras electrohiladas a base de PVP (polivinilpirrolidona) con disolventes como: metanol y dimetilformamid. Descubrieron que diferentes solventes pueden contribuir con diferentes tensiones superficiales. Cuando la concentración se fija, se reduce la tensión superficial de la solución, las fibras con bulbos se convierten en fibras definidas. Básicamente, la tensión superficial determina los límites superior e inferior de la ventana de electrohilado si todas las demás condiciones son fijas [40]. 4.5.5. Diferencia de potencial. Dentro del proceso de electrohilado, la diferencia de potencial aplicada es el factor crucial. Sin embargo, el efecto de la diferencia de potencial sobre el diámetro de las fibras electrohiladas es un poco controvertido. Por ejemplo, Reneker y Chun han demostrado que no hay un efecto considerable del campo eléctrico en el diámetro de nanofibras electrohiladas de óxido de polietileno (PEO). Varios grupos sugirieron que los voltajes más altos (15 – 20) kV, facilitaron la formación de fibras con diámetros mayores a 1 μm [41]. 40 Además de esos fenómenos, algunos grupos también demostraron que al aplicar una diferencia de potencial elevada se tiene una mayor probabilidad de formación de gotas en las fibras, por lo tanto, se encontró que la diferencia de potencial influye en el diámetro de la fibra [42]. 4.5.6. Velocidad de flujo. La velocidad de flujo de la solución de polímero dentro de la jeringa es otro parámetro importante del proceso. En general, se recomienda una velocidad de flujo baja ya que la solución de polímero tendrá suficiente tiempo para la polarización. Si la velocidad de flujo es muy alta, se formarán gotas en las fibras con diámetros gruesos en lugar de fibras definidas con diámetro fino debido al tiempo corto de secado, antes de llegar al colector y las fuerzas bajas de estiramiento. Yuan et al., investigaron el efecto de la tasa de flujo sobre las morfologías de las fibras de PSF (polisulfona) a partir de una solución de PSF / DMAC (dimetilacrilamida) al 20% a 10 kV (figura 2.12). En su estudio, las fibras con gotas y diámetros gruesos, son obtenidas cuando la velocidad de flujo es de 0.66 mL / h. 4.5.7. Distancia entre el colector y la punta de la jeringa. La distancia (H) entre el colector y la punta de la jeringa también afecta el diámetro y la morfología de la fibra. En resumen, si la distancia es demasiado corta, la fibra no tendrá tiempo suficiente para solidificarse antes de llegar al colector, mientras que si la distancia es demasiado larga, se puede obtener fibras con formaciones de gotas. Es sabido que un aspecto físico importante de la fibra electrohilada es la facilidad de secarse del disolvente, por lo que se recomienda una distancia óptima [43]. 4.5.8. Parámetros ambientales. Los parámetros ambientales afectan los diámetros y morfologías de las fibras, como la humedad y la temperatura. Mituppatham et al., han demostrado que el 41 aumento de la temperatura favorece la producción de fibras más delgadas, esto fue observado con disoluciones de poliamida-6 [44]. En cuanto a la humedad, la humedad baja puede aumentar la velocidad de evaporación del solvente. Por el contrario, la humedad alta conducirá a la obtención de fibras gruesas. Casper et al., [45] demostraron que las variaciones de humedad afecta la morfología de la superficie de las fibras electrohiladas. 4.6 Descripción del equipo de electrohilado que se utilizó en el proceso experimental. El equipo de electrohilado de la figura 4.8, cuenta con un sistema de inyección de la marca New Era Pump Systems, Inc NE-1600; este sistema programa la cantidad de disolución en mililitros/hora que se suministra para la formación de las fibras. El equipo también cuenta con una caja de acrílico, que actúa como un sistema que aísla parcialmente el proceso de electrohilado de la humedad, sin embargo, no se mantiene la temperatura constante dentro de la caja de acrílico, por lo que, la temperatura dentro de la caja depende del ambiente. El sistema que aplica la diferencia de potencial es una fuente de poder con una capacidad de hasta 40 kV. Figura 4.8. Fotografía del equipo de electrohilado que se utilizó para la generación de los andamios híbridos O/I. En esta fotografía se muestra: (a) el sistema de inyección, (b) la caja de acrílico que aísla el sistema, (c) el colector y (d) la fuente de poder. (a) (b) (c) (d) 42 A continuación, se describe el proceso de electrohilado que se llevó a cabo. Cuando la disolución polimérica sale de la punta de la jeringa, con su respectiva velocidad de flujo, y se aplica una diferencia de potencial entre la punta de la aguja y el colector metálico, pueden generarse fibras del polímero. La formación de fibras se debe a la generación de un campo eléctrico entre la punta de la aguja y el colector metálico, lo que hace que la disolución del polímero se dirija hacia el colector y en el proceso se evapore el disolvente. En el proceso para la obtención de nanofibras de PVA, se realizó un balance entre los parámetros de distancia inyector-colector, deferencia de potencial y concentración de PVA/agua. Una vez establecidos los parámetros anteriores, se formaron los andamios O/I, basándonos en los resultados en los que se obtuvieron las mejores morfologías de fibras de PVA. 4.7. Revisión de trabajos realizados respecto de este tema, en loscuales se ha utilizado biovidrio para la regeneración de tejido cardiaco. Los productos de disolución de biovidrio estimulan diversos fibroblastos, similares a células para secretar grandes cantidades de factores angiogénicos y citoquinas, que dan como resultado la generación de los vasos sanguíneos en los andamios destinados para la regeneración del tejido. Para evaluar este potencial en las estrategias de ingeniería del tejido cardíaco, Barabadi et al., [46] fabricaron andamios de nanocompuestos a base de hidrogel, que contenían nanopartículas de biovidrio para la ingeniería de tejidos del miocardio. Explicaron que uno de los principales problemas en la ingeniería del tejido miocárdico es la falta de vasos sanguíneos funcionales que, en última instancia, da como resultado una tasa baja de supervivencia de células en los andamios. En el trabajo de Barabadi et al [46], sintetizaron biovidrio, cuya composición es 45%SiO2-24.5%CaO-24.5%Na2O-6%P2O5 (mol%) y, fabricaron dos tipos de 43 andamios a base de hidrogel, un hidrogel de gelatina-colágeno y un hidrogel de gelatina-colágeno con nanopartículas de biovidrio. Para mostrar la efectividad de las nanopartículas de biovidrio en la angiogénesis, evaluaron la capacidad de diferenciación de células madre embrionarias humanas indiferenciadas, dentro de la población de células tratadas hacia el linaje endotelial. Sus resultados indicaron que, la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular, por sus siglas en inglés (VEGF), se incrementó significativamente en las células incubadas con los medios que contenían el andamiaje gelatina, colágeno y nanopartículas de biovidrio en comparación con el control (hidrogel de gelatina- colágeno). Estos datos indican que la inclusión de biovidrio en el andamio de hidrogel, promueve la expresión de VEGF y por lo tanto mejora la angiogénesis. Los autores finalmente concluyeron que los andamios de hidrogel que contienen nanopartículas de biovidrio son adecuados para la ingeniería de tejidos de miocardio ya que son biocompatibles y promueven la angiogénesis [46]. Cohrs et al., [47] evaluaron la función de incorporar nanopartículas y micropartículas de biovidrio, con una composición de 45%SiO2-24,5%CaO- 24,5%Na2O-6%P2O5 (% mol), en elastómeros de silicona para mejorar las características de las líneas motrices del dispositivo de asistencia ventricular izquierda (DAVI). Los autores prepararon nanopartículas y micropartículas de biovidrio, mediante el uso de la síntesis por aspersión de llama, luego las incorporaron al elastómero de silicona de grado médico para preparar películas delgadas. Mostraron que la incorporación de nanopartículas de biovidrio en compuestos de silicona, condujo a una bioactividad más alta y al menor hinchamiento en las muestras después de realizarse el cultivo celular; sin embargo, las nanopartículas disminuyeron tanto las propiedades mecánicas como la citocompatibilidad. Por el contrario, las partículas de biovidrio de tamaño micrométrico mostraron menor compatibilidad que las partículas de tamaño nanométrico, con mejores propiedades mecánicas. Sin embargo, los autores de este estudio concluyeron que, el uso de nanopartículas de biovidrio en el caso del 44 material de la línea motriz para la implantación, era mejor que las micropartículas debido a una mayor bioactividad y menor hinchazón dentro del cuerpo [47]. En la tabla 4.2 se muestran los elementos principales que constituyen el biovidrio y el efecto que promueven al interactuar con los tejidos vivos. Tabla 4.2. Principales iones liberados de biovidrio que se consideran para la ingeniería de tejidos blandos [48]. Elemento Efecto promovido al interactuar con tejidos vivos. Si - Promueve la neovascularización. - Estimula la formación de colágeno tipo I. Ca - Promueve la migración y proliferación de células epiteliales. - Acelera la coagulación de la sangre. B - Estimula la vascularización y la angiogénesis. - Incrementa la síntesis de RNA en fibroblastos. Cu - Estimula la angiogénesis. - Posee propiedades bactericidas. Ag + - Posee propiedades antiinflamatorias. - Posee propiedades bactericidas. Zn - Estimula la angiogénesis. - Mejora la regeneración nerviosa. - Posee propiedades antiinflamatorias. 45 5. PARTE EXPERIMENTAL. 5.1. Materiales. 5.1.1 Reactivos para la síntesis del biovidrio SiO2-CaO-P2O5, andamios de PVA y andamios híbridos O/I. Los reactivos para la síntesis del biovidrio, los andamios de PVA y así como los andamios híbridos O/I fueron adquiridos de Sigma Aldrich Co. Tetraetilortosilicato TEOS (Si(OC2H5)4) de peso molecular de 208.33 g/mol, con una densidad de 0.933 g/mol y una pureza mayor o igual a 99.9% (Aldrich Co); trietilfosfato TEP ((C2H5)3PO4) de peso molecular de 208.33 g/mol, con una densidad de 0.993 g/mol y una pureza mayor o igual a 99.8 %; cloruro de calcio dihidratado (CaCl2∙2H2O) de peso molecular de 236.15 g/mol y una pureza mayor o igual a 99%; ácido clorhídrico (HCl) 1M, el cual es obtenido de una dilución de ácido clorhídrico concentrado de una pureza de 37%; poli (alcohol vinílico) con masa molecular promedio de (31 000 - 50 000) g/mol; grado de hidrólisis de (98 – 99) %; para realizar la estabilización se utilizó glutaraldehído, grado I, con una concentración 25 % en H2O. 5.1.2. Reactivos para cultivo de cardiomiocitos de corazón de pollo. I. Solución de Hanks (Hank´s Balanced Salt Solution o HBSS). La solución de Hanks es una solución salina, utilizada en una amplia variedad de tejidos y/o cultivos celulares. Se le considera un medio de cultivo estándar para la conservación celular (no es tóxica y tiene un pH ≈ 7.2). En esta se pueden mantener fibroblastos viables durante 24 horas. 46 Tabla 5.1. Cantidades necesarias para obtener 500 mL de la disolución de Hanks. Compuesto (pH=7.2) Peso molecular (g/mol) Cantidad a pesar para tener una concentración en g/500 mL NaCl (125 mM) 58.47 3.653 g KCl (0.9 mM) 74.6 0.0335 g NaHCO3 (3.6 mM) 84 0.151 g Na2HPO3 (0.3 mM) 142 0.0213 g KH2PO4 (0.4mM) 136.1 0.0272 g MgCl2 (0.5 mM) 203.3 0.050 8 g MgSO4.7H2O (0.4 mM) 246.5 0.049 3 g Glucosa (10 mM) 180.16 0.901 g Sacarosa (2.9 mM) 342.3 0.496 g Hepes (9.9 mM) 110.99 1.180 g CaCl2.H2O (2.2 mM) 128.99 0.1996 g Los compuestos requeridos para preparar la disolución de Hanks, que aparecen en la tabla 5.1, se disuelven en 400 mL de agua estéril. Posteriormente se completa la disolución de los compuestos, el pH se ajusta 7.2 con NaOH 1N, por último se lleva al aforo a 500 mL. Se filtra dentro de una campana y se almacena para su uso posterior. II. Medio M-199. El Médium 199 Gibco BRL catálogo 10468-018, es un medio de cultivo nutritivo desarrollado por Morgan et. al, en 1950. Destinado para el estudio de fibroblastos musculares de embrión de pollo. Sus componentes principales son purinas (adenina, guanina, xantina e hipoxantina), pirimidinas (timina y uracilo) y compuestos como vitaminas, factores de crecimiento, aminoácidos y entre otros. III. T (inhibidores de tripsina). Proteasa inhibidora de serpentinas, controla la activación y catabolismo de proteínas por la inhibición de serina (proteasa in vivo), es decir, detiene la actividad proteolítica. 47 La aplicación atribuida en un cultivo celular es inhibir la actividad proteolítica o disociación celular, para prevenir el daño celular o su muerte. Los reactivos de la tabla 5.2 son mezclados en agitación constante con agua deionizada y se lleva al aforo a 400 mL. Por último se filtra y se almacena para usos posteriores. Tabla 5.2. Cantidades necesarias para preparar la solución enzimática de T (inhibidores de tripsina). DBSK (10x) 21 mL NaHCO3 27.4 mL M-199 (1x) 80 mL HS 40 mL DBSK (100x) 9.6 mL Gentamicina 0.4 mL IV. DesOxyRibonucleasaI (DMI). Es una enzima peptidasa llamada tripsina, encargada de disociar o romper los tejidos mediante hidrólisis, así obtenemos estructuras de tamaño menor, esta enzima es utilizada para remover adherentes celulares. Sin embargo, la incubación por periodos largos con esta enzima, puede dañar a las membranas celulares e incluso ocasionar su muerte, se utilizan concentraciones bajas (las concentraciones varian de lote a lote). Para su preparación es importante utilizar soluciones amortiguadoras libres de Ca2+ y Mg2+, con un pH de 7.4 a 7.6. Los reactivos de la tabla 5.3 son mezclados en agua deionizada, se ajusta el pH a 7.33 con NaOH 1M, la disolución se lleva al aforo a 500 mL. La disolución se filtra y se almacenan para su uso posterior. Tabla 5.3. Cantidades de DMS8 (10x) y Trypsina para preparar la disolución de DesOxyRibonucleasa I (DMI). DMS8 (10x) 80 mL Trypsina 0.953 g (TRL3 Worthington Biochemical Corporation) catálogo 3707 48 V. DMII. Es una desoxirribonucleasa (DNasa), la cual se encarga de catalizar la ruptura por hidrólisis de enlaces fosfodiester, elimina DNA no deseado de lisados celulares, mejora la eficacia y extracción de proteínas por la eliminación de polipéptidos no deseados, por lo que esta enzima es agregada en reactivos de lisis celular. La disolución DMII es preparada disolviendo los reactivos de la tabla 5.4 en agua deionizada y llevada al aforo hasta 500 mL, se ajusta al pH a 7.35 con NaOH 1N. Se filtra dentro de la campana y se hacen muestras de 10 mL para su uso posterior. Tabla 5.4. Cantidades de DMS8 (10x) y DNasa para preparar la disolución DMII. DMS8(10x) 80 mL DNasa 2.8 mL (reconstiruido) VI. Medio 818 A. El Medio 818 A es preparado con los reactivos y las cantidades presentadas en la tabla 5.5, las disoluciones son mezcladas y almacenadas para su posterior uso. Tabla 5.5. Sustancias y cantidades necesarias para preparar el Medio 818 A. DBSK (10x) 23.2 mL NaHCO3 (262 nM) 40 mL M-199 (1x) 80 mL FBS 16 mL HS 8 mL Gentamicina 0.4 mL Catálogo Gibco BRL 15750-060 (50 mg/mL) VII. Suero Fetal Bovino (FBS). El Suero Fetal Bovino, por sus siglas en inglés (FBS), es un suplemento de crecimiento para las células, presenta factores que promueven el crecimiento y requerimientos para el metabolismo celular en cultivo. 49 Se hacen alícuotas de 8 mL en cada tubo, aproximadamente 13 tubos (100 mL) y se almacenan a -20 °C hasta su posterior uso. VIII. Suero de Caballo (HS). El suero de caballo, por sus siglas en inglés (HS), es un suplemento para mejorar el crecimiento de las células en el cultivo. Para realizar la disolución de suero de caballo, se toman 8 mL y se vierten en tubos, aproximadamente 13 tubos, se almacenan a -20 °C, se llevan al aforo con agua deionizada a 400 mL, se filtran y se almacenan para su posterior uso. IX. DBSK (10x). La disolución DBSK (10x), se realiza con los reactivos y cantidades presentados en la tabla 5.6. Los reactivos se mezclan con agua deionizada y se lleva al aforo a 500 mL, se filtra y se almacena para su uso posterior. Tabla 5.6. Cantidades de sales y glucosa para preparar la disolución DBSK (10x). NaCl 42.5 g MgSO4.7H2O 1.25 g Na2HPO4 0.82 g Glucosa 6.25 g CaCl2∙H2O 1.688 g X. DBSK (100x). La disolución DBSK (100x) se prepara con la disolución DBSK (10x) y KCl, las cantidades están presentadas en la tabla 5.7. Las sustancias son disueltas en agua deionizada, se lleva al aforo a 100 mL, se filtra y se almacena para su posterior uso. Tabla 5.7. Sustancias y cantidades necesarias para preparar la disolución DBSK (100x) KCl 0.746 g DBSK (10X) 10 mL 50 XI. DMS8 (10x). La disolución DMS8 (10x) se prepara con los reactivos y cantidades presentados en la tabla 5.8. Los reactivos se llevan al aforo a 200 mL con agua desionizada, la disolución se filtra y se almacena para su uso posterior. Tabla 5.8. Sustancias y cantidades necesarias para preparar la disolución DMS8 (10x). NaCl 20.4 g KCl 1.2 g Na2HPO4∙H2O 0.4075 g NaH2HPO4 0.1675 g Glucosa 3.0 g XII. Gelatina 100 µg/mL. La disolución de gelatina se prepara con 50 mg de gelatina en 500 mL de agua deionizada, se calienta para que se disuelva la gelatina, se hacen alícuotas de 25 mL en tubos (10 tubos) que se almacenan a -20 °C hasta su posterior uso. XIII. Huevos de ALPES. Los huevos libres de patógenos específicos provienen de parvadas extensamente monitoreadas, con lo cual, demuestran que estos son libres de patógenos y que cumplen los lineamientos de calidad (USDA Memo 800.65). Esta empresa garantiza que el 95% de sus huevos libres de patógenos contienen un embrión bien desarrollado. 51 5.2. Técnicas de caracterización. 5.2.1. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) y análisis de los diámetros para los andamios electrohilados de PVA/biovidrio. La Microscopia Electrónica de Barrido por sus siglas en inglés (SEM), proporciona información de la topografía superficial, composición química, cristalinidad y comportamiento de la muestra. En la microscopia SEM, los electrones incidentes tienen una energía de 2- 40 keV, para la generación de estos electrones hay tres tipos de cañones: I. El más común es el filamento de tungsteno, el cual es calentado por encima de 2550 °C para producir la emisión térmica de los electrones. II. EL filamento de hexaboruro de lantano (LaB6), que también funcionan por emisión termoiónica, pero una de las ventajas es la producción de un haz con mayor energía debido a que el filamento de LaB6 tiene una función de trabajo menor que el tungsteno. III. Los cañones de emisión de campo producen un haz de electrones de alta energía debido a un campo eléctrico aplicado a una punta (que generalmente está constituida por wolframio), hasta que se produce el efecto cuántico de túnel. En el análisis SEM los electrones penetran la muestra en forma de gota, cuyas dimensiones generales están determinadas por la energía del haz de electrones, las masas atómicas de los elementos en la muestra y el ángulo en el cual el haz de electrones golpea la muestra. La interacción del haz de electrones con la muestra produce electrones secundarios, electrones retrodispersados, electrones tipo Auger y rayos X, como se muestra en la figura 5.1. I. Electrones secundarios. Los electrones secundarios se producen a partir de la emisión de los electrones de valencia de los átomos de la muestra, son de baja energía (< 50 eV) y solo logran 52 salir de la muestra los más superficiales. Estos electrones proporcionan información acerca de la topografía de la superficie. II. Electrones retrodispersados. Los electrones retodispersados poseen mayor energía que los electrones secundarios, por tanto, proporcionan información de regiones más profundas de la muestra; son sensibles a la composición de la muestra, a mayor número atómico, mayor emisión de electrones retrodispersados, por lo que las áreas con elementos pesados aparecen brillantes en la imagen [52]. Figura 5.1. Contornos de la deposición de energía en un sólido de número atómico bajo (polimetilmetacrilato) como función de la posición, medida experimentalmente mediante grabado y según lo calculado por la simulación de trayectoria de electrones Monte Carlo [52]. En la figura 5.2 se muestra un diagrama de los componentes de un sistema de SEM, a continuación se describen de manera breve los componentes que lo conforman. El ánodo atrae y acelera a los electrones aplicando un voltaje positivo. Las lentes magnéticas crean un campo magnético rotacional y simétrico que actúa sobre el haz de electrones, la intensidad de la lente varía según la corriente que pasa por ella. La lente condensadora expande o condensa el haz. El lente objetivo enfoca y determina el tamaño final del haz. Lasbobinas mueven el haz sobre la muestra en X e Y, están sincronizadas con el monitor en el que se registra la imagen. 53 Figura 5.2. Diagrama de los componentes de un sistema SEM [52]. El análisis por TEM se realizó para estudiar la morfología y diámetro tanto de las fibras de los andamios como de las partículas de biovidrio. Figura 5.3. Microscopio electrónico de barrido JOEL JSM-7600F Las micrografías SEM de los andamios de PVA, de biovidrio, híbridos estabilizados y no estabilizados, se obtuvieron con un equipo Fiel Emission Scanning Electron Microscope JOEL JSM-7600F. 54 Los diámetros de las fibras se midieron a través del programa “Image J”, los datos obtenidos se procesaron estadísticamente con el programa llamado “R” y por último se realizó un histograma para cada micrografía de los andamios electrohilados. Para la elaboración de los histogramas de frecuencias absolutas vinculados al diámetro de las fibras en los diferentes materiales híbridos, se han considerado 30 mediciones por muestra, logradas bajo condiciones de repetibilidad. A continuación se proporciona el modelo estadístico que se utilizó para conocer el valor del diámetro de las fibras de los andamios, también se proporciona el modelo para conocer la incertidumbre absoluta asociada al valor del diámetro de las fibras. Modelo para determinar la incertidumbre absoluta del diámetro de las fibras. uC (x)= √uA 2 (x) + uB 2 (x)………………………………………………………….……(5.1) uA(x)= s(x)/√n ……………………………………………………………..………….(5.2) s(x)= √ ∑ (𝑥𝑖−�̅�) 230 𝑖=1 𝑛−1 ……………….…………………….…………………..….. (5.3) Dónde: uA(x)= Incertidumbre tipo A. uB(x)= Incertidumbre tipo B. Es la resolución obtenida de las lecturas por “Imege J”, este valor es: 0.001 μm. uc(x)= Incertidumbre absoluta. s(x)= Desviación estándar del diámetro de las fibras. Xi = i-ésimo diámetro de fibra �̅�= valor promedio del diámetro de las fibras. n= 30, son el número de mediciones que se realizaron en cada andamio electrohilado. 55 5.2.2. Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM). La Microscopia Electrónica de Transmisión por sus siglas en inglés (TEM) es capaz de mostrar imágenes ampliadas de una muestra delgada, típicamente con un aumento en el intervalo de 103x a 106x. Además, el instrumento puede usarse para producir patrones de difracción de electrones útiles para analizar las propiedades de una muestra cristalina. Esta flexibilidad general se logra con un sistema de electrones ópticos que contiene un cañón de electrones (que produce el haz de electrones) y varias lentes magnéticas apiladas verticalmente para formar una columna de lentes. Es conveniente dividir el instrumento en tres secciones. El sistema de iluminación comprende el cañón de electrones, junto con dos o más lentes de condensador que enfocan los electrones en la muestra. Su diseño y funcionamiento determinan el diámetro del haz de electrones (a menudo denominado “iluminación”) en la muestra y el nivel de intensidad en la imagen obtenida por TEM. La etapa de la muestra permite que las nuestras se mantengan estacionarias o se muevan intencionalmente, y también se inserten o retiren del TEM. La estabilidad mecánica de la muestra es un factor importante que determina la resolución espacial de la imagen obtenida por TEM. El sistema de imágenes contiene al menos tres lentes que producen una imagen apilada (o un patrón de difracción) de la muestra en una pantalla fluorescente, en película, o en la pantalla del monitor de un sistema de cámara electrónica. Este sistema de imágenes determina la ampliación de la imagen TEM, mientras que el diseño de las lentes de imagen determina en gran medida la resolución espacial que se puede obtener del microscopio [53]. El análisis por TEM se realizó para estudiar la morfología de las fibras y para conocer la distribución de los componentes (silicio, calcio y fósforo) del biovidrio en las fibras del polímero de PVA. 56 Figura 5.4. Microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1200 EX. 5.2.3. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). La Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier, por sus siglas en inglés (FTIR) es el estudio de la interacción de la luz infrarroja con la materia. La radiación infrarroja no tiene la suficiente energía para producir la clase de transiciones electrónicas que se encuentran en las radiaciones ultravioleta y visible; por esa razón, la absorción de radiación infrarroja se limita en gran parte a especies moleculares para las cuales existen pequeñas diferencias de energía entre los distintos estados vibracionales y rotacionales. Cuando la radiación infrarroja interactúa con la materia, puede ser absorbida, lo que hace que los enlaces químicos en el material vibren. La presencia de enlaces químicos en un material es una condición necesaria para que ocurra la absorción infrarroja. Los fragmentos químicos estructurales dentro de las moléculas, conocidas como grupos funcionales, tienden a absorber radiación difusa en el mismo intervalo de número de onda, independientemente de la estructura del resto de la molécula en la que se encuentra el grupo funcional. Por ejemplo, el grupo funcional C=O (carbonilo) absorbe a 1700 cm-1 en cetonas, aldehídos y 57 ácidos carboxílicos. Esto significa que hay una correlación entre los números de onda a los que una molécula absorbe la radiación infrarroja y su estructura. Esta correlación permite identificar la estructura de moléculas desconocidas a partir del espectro infrarrojo de la molécula. Esto es lo que hace que la espectroscopia infrarroja sea una herramienta útil de análisis químico. La gráfica de intensidad de radiación infrarroja contra número de onda, se conoce como espectro infrarrojo, en el eje Y está la absorbancia y en eje X está el número de onda. Tradicionalmente, los espectros de infrarrojo se grafican con un número de onda alto a la izquierda y un número de onda bajo a la derecha. En adición a la estructura química, un espectro de infrarrojo puede proveer información cuantitativa, como la concentración de una molécula en la muestra. La base del análisis cuantitativo en FTIR es la ley de Beer, la cual relaciona la concentración con la absorbancia, como se muestra en la siguiente ecuación [54] A= ԑlc ………………………………………….……………………………………….(5.4) Donde: A= Absorbancia ԑ= Coeficiente de absortividad l= espesor de la muestra por donde atraviesa el haz incidente. c= concentración 58 Figura 5.5. Equipo de infrarrojo con transformada de Fourier. Espectrómetro Thermo Scientific Nicolet 6700. Todas las muestras sintetizadas de biovidrio, andamios de PVA, híbridos estabilizados y no estabilizados, se analizaron en el intervalo de 4000- 400 cm-1, con un espectrómetro ATR-FTIR, Thermo Scientific Nicolet 6700. 5.2.4. Difracción de rayos-X (DRX). Los rayos-X son haces de radiación electromagnética de longitud de onda relativamente corta y de alta energía. Cuando un haz de rayos-X se ve como una onda, se puede pensar en él como un campo eléctrico oscilante sinusoidal con un ángulo de campo magnético que varía de manera similar con el tiempo. Otra descripción de los rayos-X es como partícula de energía llamada fotones. Toda la radiación electromagnética se caracteriza por su longitud de onda λ (es decir, la distancia entre crestas o picos) o por su frecuencia ν (es decir, el número de picos que pasan por un punto en una unidad de tiempo) o por medio de su energía de fotones E. Las siguientes ecuaciones representan las relaciones entre estas cantidades: 𝜈 = 𝑐 𝜆 …………..………………………………………………………………………..(5.5) 59 𝐸 = ℎ𝜈 ………………………………………………………………………………….(5.6) Donde c es la velocidad de la luz y h es la constante de Planck. La región de los rayos-X normalmente se considera que es laparte del espectro electromagnético que se encuentra entre 0.1 y 100 Å. En términos de energía, la región de rayos-X cubre el intervalo de aproximadamente 0.1 a 100 keV [55]. William Henry Bragg y su hijo Lawrence Bragg desarrollaron una forma simple de entender y predecir el fenómeno de difracción en un cristal. En la figura 5.6, tres planos cristalográficos muestran que pueden describirse con los índices de Miller (hkl). Figura 5.6. Planos de un cristal para la obtención de la ley de Bragg [56]. La analogía de Bragg considera que los rayos-X incidentes, vienen desde la izquierda y se reflejan en cada uno de los planos de la familia. Si suponemos que las ondas iniciales están en fase la una con la otra y que las ondas se reflejan desde cada plano de la familia. En la figura 5.6, la onda reflejada desde el segundo plano debe recorrer una distancia ABC más allá de la onda que se refleja desde el plano superior. De manera similar, la onda que se refleja desde el tercer plano debe viajar hacia DEF. Por lo tanto, todas las ondas que se reflejan desde planos debajo de la superficie estarán en fase retardada con respecto a la primera onda, causando interferencia. La geometría del plano muestra que cuando la distancia ABC es exactamente igual a la longitud de onda (λ), la distancia DEF será igual a 2λ y la reflexión de 60 todos los planos a cualquier profundidad en el cristal emergerá en fase, produciendo la interferencia constructiva conocida como difracción [56]. La distancia AB puede obtenerse tomando el seno de ϴ: AB= dhklsenϴ ………………………………………………………………………………………....(5.7) Cuando ocurre la difracción ABC= λ, entonces, la ecuación de Bragg resultante es. λ= 2dhklsenϴ …………….…………………………………………………..………..(5.8) Los difractogramas fueron obtenidos con un difractómetro Rigaku Ultima-IV con línea K-alfa 1 de Cu (λ= 1.5406 Angstrom). El análisis por difracción de rayos-X, se llevó a cabo en un ángulo 2ϴ y en un intervalo de (0 - 80) °. Figura 5.7. Equipo de difracción de rayos-X. Defractómetro Siemens D500. 5.2.5. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). La Calorimetría Diferencial de Barrido por sus siglas en inglés (DSC), es la técnica térmica de análisis más popular. Una característica común es que puede determinar la capacidad calorífica, temperaturas de fusión y cristalización, y el calor de fusión, así como los diversos parámetros que térmicos de reacción 61 química que se pueden determinar a velocidades constantes de calentamiento o enfriamiento. En DSC, la muestra y un material de referencia se mantienen a la misma temperatura (∆T Tmuestra-Treferencia= 0) en todo el programa de temperatura controlada. Cualquier diferencia de energía en los suministros independientes a la muestra y la referencia se registra contra la temperatura del programa. El aparato se muestra esquemáticamente en la figura 5.4.a, y un ejemplo de una curva de DSC resultante en la figura 5.4.b. Figura 5.8. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). (a) Aparato (S= muestra; R= referencia), (b) curva DSC típica, una respuesta endotérmica está representada por un pico positivo, es decir, ascendente. Los eventos térmicos en la muestra aparecen así como desviaciones de la línea base del DSC, en una dirección endotérmica o exotérmica, dependiendo de si se debe suministrar más o menos energía a la muestra con relación al material de referencia. En DSC, las respuestas endotérmicas usualmente se representan como positivas, es decir, por encima de la línea base, lo que corresponde a una mayor transferencia de calor a la muestra en comparación con la referencia [57]. 62 Figura 5.9. Equipo de DSC modulado TA Instruments DSC 2910. Las mediciones se obtuvieron mediante un equipo de DSC modulado TA Instruments DSC 2910. Las muestras se calentaron con una rapidez de calentamiento de 10 °C/min. Las muestras se corrieron desde temperatura ambiente (aproximadamente de 25 °C) hasta los 500 °C. 5.2.7. Análisis Temogravimétrico (TGA). El Análisis Termogravimétrico por sus siglas en inglés (TGA), es una técnica en donde la masa de una muestra se mide en función de la temperatura o el tiempo mientras la muestra se somete a un programa de temperatura y atmósfera controlada. La representación del porcentaje de masa en función del tiempo o de la temperatura se denomina termograma o curva de descomposición térmica, la curva es normalmente graficada con el cambio de masa (∆m) expresado en porcentaje en el eje vertical y la temperatura o el tiempo en el eje horizontal. 63 No todos los eventos térmicos involucran un cambio en la masa de la muestra (por ejemplo, la fusión de la muestra, cristalización o transición vítrea) pero hay algunas excepciones muy importantes que incluyen desorción, absorción, sublimación, vaporización, oxidación, reducción y descomposición. El análisis es usado para caracterizar la descomposición y estabilidad térmica de materiales bajo diferentes condiciones, las características de cambio de masa de un material dependen en gran medida de las condiciones experimentales empleadas. Factores como cantidad de muestra, volumen y forma, la forma y naturaleza del portamuestras, la naturaleza y presión de la atmósfera en la cámara de muestra y la velocidad de barrido tienen influencias importantes sobre las características de las curvas de TGA registradas [58]. Figura 5.10. Equipo analizador termogravimétrico de alta resolución TA Instruments TGA 2950. Las mediciones se obtuvieron mediante un equipo analizador termogravimétrico de alta resolución TA Instruments TGA 2950. Las muestras se calentaron con una rapidez de calentamiento de 10 °C/min. Las muestras se corrieron desde temperatura ambiente (aproximadamente de 25 °C) hasta los 600 °C. 64 5.3 Procedimiento experimental. 5.3.1 Síntesis del biovidrio 58%SiO2-33%CaO-9%P2O5 por el método sol-gel. 5.3.1.1. Reacción general para la formación de biovidrio a partir de los precursores. Se propuso la reacción general para la formación de biovidrio, para tener una composición final de 58%SiO2-33%CaO-9%P2O5 en % mol. Esta reacción contempla una relación de H2O:TEOS de 4:1 moles, la reacción se propone en medio ácido. Si(OCH2CH3)4 + 2 PO(OCH2CH3)3 + CaCl2∙2H2O + 4H2O SiO2-CaO-P2O5 + 10 CH3CH2OH + 2HCl 5.3.1.2. Cálculos para obtener 5 gramos de biovidrio 58%SiO2-33%CaO- 9%P2O5 en % mol. Se considera el % en mol de cada componente en el biovidrio. 0.58 x 60.0843 g/mol = 34.8489 g/mol 0.33 x 56.0773 g/mol = 18.5055 g/mol 0.09 x 141.9446 g/mol = 12.7750 g/mol 66.1294 g/mol de biovidrio Donde 66.1294 g/mol de biovidrio se refiere a los gramos por mol de biovidrio. Cálculo para determinar la cantidad de TEOS. 5 g de biovidrio x 1 mol de biovidrio 66.1294 g de biovidrio x 34.8489 g de SiO₂ 1 mol de biovidrio x 1 mol de SiO₂ 60.0843 g de SiO₂ x 1 mol de biovidrio 1 mol de SiO₂ x 1 mol de TEOS 1 mol de biovidrio x 208.33 g de TEOS 1 mol de TEOS x 100 g de TEOS 98 g de TEOS x 1 mL de TEOS 0.933g de TEOs = 9.9918 mL de TEOS H+ 65 Cálculo para determinar la cantidad de TEP. 5 g de biovidrio x 1 mol de biovidrio 66.1294 g de biovidrio x 12.7750 g de P₂O₅ 1 mol de biovidrio x 1 mol de P₂O₅ 141.9446 g de P₂O₅ x 1 mol de biovidrio 1 mol de P₂O₅ x 2 mol de TEP 1mol de biovidrio x 182.15 g de TEP 1 mol de TEP x 100 g de TEP 99.8 g de TEP x 1 mL de TEP 1.072 g de TEP = 2.3171 mL de TEP Cálculopara determinar la cantidad de CaCl∙2H2O. 5 g de biovidrio x 1 mol de biovidrio 66.1294 g de biovidrio x 18.5055 g de CaO 1 mo de biovidrio x 1 mol de CaO 56.0778 g de CaO x 1 mol de biovidrio 1 mol CaO x 1 mol de CaCl∙2H₂O 1 mol de biovidrio x 147.01 g de CaCl∙2H₂O 1 mol de CaCl∙2H₂O = 3.6681 g de CaCl∙2H2O 5.3.1.3. Procedimiento experimental de síntesis de biovidrio 58%SiO2- 33%CaO-9%P2O5 por el método sol-gel. La síntesis se inició con la etapa de hidrólisis de TEOS en medio ácido, por lo que en un vaso de polipropileno se agregó 15 mL de HCl a pH=1, a una concentración de 0.1 M. La disolución de HCl con TEOS se tapó, con agitación constante y vigorosa durante 45 minutos. Se agregó TEP a la disolución, se tapó y se dejó en agitación durante 45 minutos. Por último, se agregó CaCl2∙2H2O y se dejó en agitación durante 45 minutos. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente y en todo momento el sistema permaneció cerrado. La disolución final se dejó tapada y en reposo durante 10 días a temperatura ambiente, para llevar a cabo la etapa de policondensación, gelación y envejecimiento. Al término de este periodo, se estabilizó a 70 °C durante 3 días y a 120 °C durante 2 días más. El producto obtenido se molió en un mortero, con la finalidad de obtener partículas pequeñas y que se utilizaron para las caracterizaciones de SEM, DSC, TGA, FTIR y DRX. 66 5.3.2. Método para la formación de andamios de PVA. En una primera etapa se utilizó la técnica de electrohilado para generar andamios de PVA, se definieron las condiciones de electrohilado con la finalidad de establecer los parámetros que permitan la mejor morfología de las fibras de poli (alcohol vinílico) y a partir de estas condiciones llevar a cabo la formación de los andamios híbridos O/I para una posterior aplicación en células cardiacas de corazón de pollo. Para la generación de los andamios de PVA, se disolvió cierta cantidad del polímero en agua destilada y deionizada durante una hora, con agitación constante a 70 °C y en un sistema cerrado. Para esta primera etapa se utilizaron dos concentración diferentes de polímero/agua, las cuales fueron de 20 % y 25 % (m/v); se varió la distancia inyector-colector de 10 cm a 20 cm con incrementos de 5 en 5 cm; se aplicó una diferencia de potencial de 13 y 15 kV y se manejó una velocidad de flujo de 0.2 mL/hora. Por lo anterior, se realizaron las pruebas indicadas en la tabla 5.9. Tabla 5.9. Parámetros estudiados para el electrohilado de poli (alcohol vinílico). Concentración de la disolución de polímero (% m/v) Distancia inyector- colector (cm) Diferencia de potencial aplicado ∆E (kV) Rapidez de flujo (mL/h) Si / No electrohila 20 10 13 0.2 Si 15 0.2 Si 15 13 0.2 Si 15 0.2 Si 20 13 0.2 No 15 0.2 Si 25 10 13 0.2 No 15 0.2 Si 15 13 0.2 No 15 0.2 No 20 13 0.2 No 15 0.2 No 67 En la tabla 5.9, no se definieron la temperatura y el porcentaje de humedad, debido a que no se mantuvieron constantes durante el experimento, sin embargo, estos parámetros también son importantes para el proceso de electrohilado. Para la deposición de las fibras de poli (alcohol vinílico), se utilizaron colectores de aluminio recortados en forma cuadrada y con dimensiones de 8 x 8 cm2. Los colectores se limpiaron por ambas caras con acetona antes de ser utilizados. Los andamios producidos, se secaron en un horno a vacío, durante 24 horas a una temperatura de 70 °C y a una presión de 5 Bar para eliminar los residuos de agua. 5.3.3. Método para la formación de andamios electrohilados de PVA/biovidrio. En la formación de andamios de PVA/biovidrio, se partió de una disolución de PVA al 20 % m/v en agua, esta disolución se reserva mientras se realiza la síntesis de biovidrio. En un recipiente de vidrio se vertió 1 mL de ácido clorhídrico (HCl) a pH=0, 0.999 mL de (TEOS), se tapó y se dejó en agitación constante y vigorosa, durante 30 minutos. A la disolución se adicionó 0.232 mL de (TEP) y se dejó durante 20 minutos en agitación y con el recipiente cerrado, por último se adicionó 0.3668 g de CaCl2∙4H2O y se dejó en agitación, durante 20 minutos. Se tomó la cantidad correspondiente de disolución de biovidrio, para generar el andamio al porcentaje correspondiente, la cantidad que se toma de la disolución de biovidrio está en base al cálculo correspondiente para cada híbrido. Se ilustra el cálculo para el andamio híbrido al 20%. %m/m = x g de biovidrio 0.4000 g de PVA+x g de biovidrio x 100 = 20 % 68 En donde X g de biovidrio son los gramos de biovidrio que se deben de adicionar para tener el porcentaje deseado. X g de biovidrio = 20 100 (0.4000 g + X g de biovidrio); X g de biovidrio = 0.08 g + 0.2 X g de biovidrio X g de biovidrio - 0.2 X g de biovidrio = 0.08 g; X g de biovidrio (1 -0.2) = 0.08 g X g de biovidrio = 0.08 1−0.2 ; X g de biovidrio = 0.1000 g Para la síntesis de 0.5 gramos de biovidrio se tiene 2.171 mL de disolución, por lo que se realiza lo siguiente. 0.1000 g de biovidrio x 2.171 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 0.5 𝑔 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑣𝑖𝑑𝑟𝑖𝑜 = 0.434 mL de disolución de biovidrio. La disolución de biovidrio se adicionó a la disolución del polímero, se calientó a 70 °C durante una hora, con agitación constante y vigorosa. Al término del tiempo, la solución se vierte en una jeringa para posteriormente ser electrohilado. Se utilizaron los parámetros para electrohilado siguientes, tabla 5.10. Tabla 5.10. Parámetros de electrohilado que han sido establecidos a partir de los experimentos con PVA. Distancia inyector-colector 10 cm Voltaje 15 kV Flujo 0.2 mL/hora Tiempo de electrohilado 5 horas Área del colector 8 cm x 8 cm En la tabla 5.11 se da la descripción de cada andamio, formado en este trabajo, con el porcentaje en peso de polímero PVA y de biovidrio que componen cada andamio. 69 Tabla 5.11. Nombre y descripción del andamio de PVA y los andamios híbridos O/I. Nombre del andamio Descripción de la composición PVA/Bv (% m/m) PVA 100 Híbrido 5 % 95/5 Híbrido 10 % 90/10 Híbrido 15 % 85/15 Híbrido 20 % 80/20 Híbrido 25 % 75/25 Hibrido 30 % 70/30 Los andamios producidos, se secarón en un horno a vacío, a una temperatura de 70 °C durante 24 horas, para eliminar los residuos de agua y residuos orgánicos volátiles. Po último se guardaron e identificaron para análisis posteriores. 5.3.4. Método para estabilizar el andamio de PVA y los híbridos PVA/biovidrio. La estabilización del PVA se realizó poniendo 5 mL de HCl a pH=2 en un embudo de separación, se agregaron 500 microlitros de glutaraldehído (GA) al 25 % en agua y se colocaron 25 mL de tolueno. Se agitó vigorosamente liberando la presión que se generó en el interior del embudo de separación, este procedimiento se realizó tres veces. Se dejó reposar durante 20 minutos y se procedió a separar las fases. Se obtuvo tolueno-glutaraldehído en la fase superior y en la fase inferior se obtuvo la disolución de HCl [50]. Los andamios fueron cortados circularmente, como se muestra en la figura 5.11, e introducidos en vasos de precipitados de 50 mL, posteriormente se les introdujo 4.5 mL de la fase tolueno-glutaraldehído (GA), procurando que estén cubiertas en su totalidad y por arriba del andamio. Los vasos de precipitados se taparón durante 24 horas. Transcurrido el tiempo, se retiraron y se dejaron secar a temperatura ambiente, durante 24 horas, para evaporar la mayor cantidad de tolueno. Por último, se introdujeron en un horno de vacío durante a 70 °C, a una presión de 5 Bar durante 24 horas. 70 Figura 5.11. La figura a) muestra la separación de fases tolueno – HCl(ac) para la estabilización de los andamios de PVA y los andamios de PVA/biovidrio, la fase superior es la fasede tolueno - GA y la fase inferior es la fase de HCl(ac). La figura b) muestra la forma de los andamios que se cortaron circularmente para su posterior estabilización con GA. En la tabla 5.12 se proporcionan la composición del andamio estabilizado y el tiempo que permanecen inmersos en la fase tolueno - GA. Tabla 5.12. Identificación de los andamios de PVA y PVA/biovidrio, cantidades en porciento de cada componente. Agente estabilizante y tiempo de inmersión. Nombre del andamio Descripción de la composición PVA/Bv (% m/m) Tiempo en que el andamio permanece sumergido en la disolución para la estabilización (horas) PVA 100 24 Híbrido 5% 95/5 24 Híbrido 10% 90/10 24 Híbrido 15% 85/15 24 Híbrido 20% 80/20 24 Híbrido 25% 75/25 24 Híbrido 30% 70/30 24 a) b) 71 5.3.5. Pruebas biológicas. 5.3.5.1. Cultivo de células embrionarias ventriculares de corazón de pollo y consideraciones previas al cultivo primario de cardiomiocitos. Los estudios con animales fueron llevados a cabo bajo la norma oficial mexicana NOM-062-1999. Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio. Se colocaron 30 huevos de gallina en una incubadora de desarrollo, con humedad, temperatura y oscilaciones controladas. Puede variar el tiempo de incubación de acuerdo al experimento, desde 24 horas hasta el momento de la eclosión. I .Se esterilizó el material 3 horas antes de la disección (para evitar la contaminación del cultivo). - 2 pinzas de punta fina (número 5). - 1 pinza de punta roma mediana. - 1 pinza curva de punta fina (número 7). - Tijeras de muelle oftálmicas. II. Una hora antes de la disección, se coloca en el horno de 37 °C las disoluciones enzimáticas, (estas se encuentran congeladas para su conservación) DMI (Trypsina) y DMII (DNase). Su preparación se anota más abajo. III. Media hora antes de la disección se prepara la campana con: Material de disección. 2 matraces Erlenmeyer de 25 mL. 1 matraz Erlenmeyer de 50 mL. 1 matraz de bola, fondo plano de 50 mL. 3 medias cajas de Petri de 10 cm. 72 1 jeringa de 20 mL. Pipetas de 10 y 20 mL. Pipetas Pasteur estándar y cortas (3-4). 1 filtro microporo estéril. Cajas de Petri para cultivo (35 mm x 10 mm) de poliestireno y anillos de plástico. Una charola con bolsa para depositar los desechos. La luz U. V. se enciende durante 30 minutos. IV. Se limpia la zona de trabajo y las manos con alcohol al 70%, nos debemos quitar todo tipo de joyería o reloj que tengamos en las muñecas, brazos o en las manos. Nota: Apagar la lámpara de luz U. V. (las exposiciones a radiaciones nos pueden causar daños graves). V. Se toma la charola con los embriones de la incubadora de desarrollo. VI. En los matraces Erlenmeyer se colocan de (30-50) mL de medio de cultivo (M-199) y 20 mL de medio enzimático llamado tripsina (T) solución inhibidora. Se colocan dentro de la incubadora de cultivos con CO2 al 5 % y a 37 °C, se dejan destapados. Nota: Es importante flamear los frascos y sus tapones antes de taparlos para impedir una contaminación. VII. Tomar las soluciones enzimáticas (DMI y DMII), estas se manejan dentro de la campana, alícuotas 10 mL de cada alícuota en un tubo Falcón. Se colocan en un matraz Erlenmeyer 10 mL de la nueva alícuota y se lleva al agitador con una temperatura de 37 °C. Los 10 mL restantes se regresan a la estufa a 37 °C. VIII. En seguida se rocían los huevos con alcohol al 70% (usar guantes de látex). 73 5.3.5.2. Inicio de la disección. Para este proceso es deseable que una persona colabore con sus manos limpias, para aproximar los embriones uno por uno, y evitar retirarla de la campana para reducir el riesgo de la contaminación. Si esto no es posible, después de rociar los huevos con alcohol al 70 %, se limpian nuevamente y, se introducen a la campana en un recipiente limpio, esto con el fin de mantener nuestro entorno estéril. I. Se llevaron uno por uno los embriones al interior de la campana y se rompió el cascarón, tomándolo por la base más aguda y golpeándolos superficialmente con cuidado, usando las pinzas de punta roma (ya dentro de la campana). II. Se extrajo el embrión, desprendiéndolo de sus membranas embrionarias con cuidado, sin maltratarlo sujetándolo o soportándolo por el cuello y se coloca en una de las medias cajas Petri. Descartar los de apariencia enferma o subdesarrollados (menor a 7 días de desarrollo en nuestro caso). Este proceso debe durar alrededor (15-20) minutos. III. A uno o dos de los embriones se les rompió el saco amniótico, para tomar un poco de líquido amniótico con una pipeta Pasteur, sólo si es trasparente o solución fisiológica (Hanks, Ringer etc.) y se colocaron varias gotas en extremos diferentes en una media caja Petri limpia (este líquido es para colocar los corazones después de su extracción y mantenerlos en un medio balanceado). IV. Una vez que se extrajeron los embriones, se procedió a diseccionar rápidamente los corazones y depositarlos en una de las gotas de líquido amniótico de las cajas Petri. Sólo depositar los corazones en una porción de líquido amniótico, debido a que la otra será útil en los pasos posteriores. 74 V. Para retirar los corazones, primero se tomó al embrión, se decapitó (por ética) con las pinzas de punta fina. Ubicamos al corazón guiándonos por sus latidos y posición anatómica en la parte superior de la caja torácica (la ubicación del corazón es evidente porque presenta contracciones). Éste se retiró, sujetándolo con las pinzas curvas de punta fina y jalándolo al exterior del cuerpo, mientras con otras pinzas se sujetó el cuerpo para tener un mejor punto de apoyo. Estos pasos (5) aplican a todos los embriones (30 aproximadamente), de manera rápida, hay que recordar que no deben durar más de 30 minutos. VI. Posteriormente y de manera rápida se ubicó la zona de interés del corazón (ventrículos, aurículas) con ayuda de un microscopio de disección, esto es para ubicar las estructuras de interés. Con las tijeras oftálmicas de muelle y las pinzas de punta fina se retiró el área. VII. Los ventrículos se ubican en el tercio inferior del corazón, por el contrario las aurículas se ubican en la parte superior del corazón. VIII. Una vez disectados los corazones o las áreas de interés; éstas fueron cortadas en porciones más pequeñas, para posteriormente con ayuda de una pipeta Pasteur extraer estos cortes y colocarlos en la solución enzimática (DMI + DMII) previamente almacenada en el matraz. IX. El matraz con 10 mL de enzimas se coloca en el agitador a velocidad media durante 10 minutos, a una temperatura de 37 °C con el fin de mantener lo mejor posible a las células que serán cultivadas posteriormente. X. Al término de la agitación se retiró el sobrenadante (tener cuidado de no tomar los fragmentos de tejido), el sobrenadante extraído se desecha. Posteriormente, se colocaron 3.3 mL de enzima (DMI + DMII) y nuevamente se realizó la agitación a velocidad media a 37 °C, durante 7 minutos. 75 XI. Al término de la agitación se retiró el sobrenadante, el cual contenía células disociadas, este sobrenadante se deposita en el tubo con disolución inhibidora de la acción enzimática (T). XII. Al término del cuarto lavado celular, las células disociadas se encontraron en la solución inhibidora (T), ésta se agitó con la mano o con un vortex a una velocidad baja para ser filtrada. Para la filtración se utilizó una jeringa de 20 mL conectada a un porta filtro (es importante revisar antes el filtro, que no se encuentre tapado y que sus poros sean de 20 µm), en la jeringa se depositó la solución inhibidora (T), con las células para ser filtrada, la solución cae por gravedad. De no ser así, nos podemos ayudar conel émbolo de la jeringa para presionar la salida de nuestra disolución. XIII. Es importante revisar que los filtros no se encuentren tapados y que sea el tamaño de poro adecuado (20 µm), de lo contrario podríamos perder todas las células, por lo que ya no serviría el experimento. XIV. Una vez filtrada, la solución será centrifugada a 500 rpm durante 20 minutos. Con el fin de evitar todas nuestras células al fondo del tubo Falcón XV. Al término del centrifugado se descartó el sobrenadante, extrayéndolo con ayuda de una pipeta o por decantación rápida; este se suspendió con 500 µL de medio para cultivo (M-199). XVI. Se tomó 10 µL del medio de cultivo (M-199) con células, esta gota se depositó en un cubreobjetos, posteriormente se tomó 10 µL de azul trypan que también son colocados en el cubre objetos. Las dos gotas se mezclan con ayuda de la micropipeta. Esta mezcla se tomó y se colocó en la cámara de Neubauer (Hemocitómero). 76 XVII. Una vez colocada la nuestra muestra en la cámara de Neubauer, se realizó el conteo celular. XVIII. Una vez realizado el conteo celular se prepararon las cajas Petri para cultivo (35 mm x 10 mm), se tuvieron listas las cajas Petri para monocapa o para agregados con anillos de plástico (acrílico), para confinar las células. XIX. Se debe obtener una densidad de 5x105 células/mililitro (esta densidad es ideal para la obtención de agregados y monocapas), por lo que no hay que elaborar ninguna disolución. De 30 embriones se obtuvo una densidad suficiente para 4 cajas Petri con cultivo celular. 5.3.5.3. Corte de andamios para cultivo celular y esterilización. Los andamios se cortaron en cuadros de 0.5 cm x 0.5 cm, con ayuda de unas tijeras inoxidables perfectamente limpias para, evitar la contaminación de la células por algún patógeno. La esterilización se llevó a cabo poniendo los andamios cortados debajo de una lámpara de luz UV durante 5 minutos. 5.3.5.4. Cultivo celular en el andamio de PVA y en los andamios híbridos O/I de PVA estabilizado con GA/ biovidrio. I. Las células se depositaron con ayuda de una micropipeta (100 µL) con lentitud, una vez depositadas en las cuadros de los andamios, se esperó alrededor de 5 minutos para que se precipiten y se mantengan dentro de nuestros límites 77 establecidos, no se debe de rebasar este tiempo, ya que podrían morir debido a que se resecan y no hay una temperatura controlada. II. Una vez transcurrido el tiempo, se colocó el medio de cultivo (M-199). Se depositó con lentitud para remover lo menos posible a las células, ya que la matriz (los andamios de diferentes relaciones PVA estabilizado con GA/biovidrio) no se unen al instante las células. El medio se cambió cada 24 horas y sólo se coloca un poco para que sobrepase el nivel de las células. III. En el proceso anterior, se guardaron las cajas Petri con células en la incubadora a 37 °C con 5 % CO2 y humedad controlada. IV. Pasadas 24 horas se comienzó a establecer las uniones estrechas (Gap Junctison), sin embargo, el medio (M-199) se cambió y se colocó nuevo (estéril), cuidando que las células no sean arrastradas cuando cambiemos el medio de cultivo. Nota: el medio de cultivo se cambió cada 24 horas hasta el día de registro, por lo que se mantuvieron las condiciones de limpieza ya que es fácil que se contamine. V. Los cultivos se registraron a partir de las 24 horas, a pesar de que en la literatura se recomienda que sea a las 24 horas ya que se encuentran más acopladas las uniones. 5.3.5.5. Consideraciones previas al registro óptico. I. Antes de realizar el registro óptico se revisó si la preparación biológica presenta actividad. En las células cardiacas se logra mediante la visualización al microscopio óptico, donde se observa si éstas presentan contracciones, de lo 78 contrario se intenta la estimulación adrenérgica o eléctrica, antes de descartar la muestra. II. Se deben cuidar las condiciones de registro: prender previamente un calentador para mantener una temperatura óptima, de ser posible colocar la muestra sobre una platina con temperatura regulada. Este paso debe de ser aproximadamente 5 minutos antes para que la temperatura se estabilice en el área de trabajo y poder colocar las muestras inmediatamente en el momento en que se vamos a usarlas. III. Tomar las muestras de la incubadora y observar al microscopio, para verificar que se encuentran viables. Nota: Las muestras que no se utilizan, se guardan inmediatamente, ya que corren el riesgo de sufrir daños o morir. La inspección al microscopio de las células tiene que realizarse en el menor tiempo posible y con cautela, debido a que podrían morir, contaminarse o desprenderse de nuestro sustrato. 5.3.5.6. Preparación de reactivos para el registro de fluorescencia. I. Tomar una alícuota de Calcium-Green para registro (éstas deben estar previamente preparadas) diluir con 10 μL de DMSO + ácido plurónico. La alícuota se sónica durante 15 minutos. Durante este paso preparó el material para el registro óptico: tubos Falcón de 50 mL para los desechos. pipetas Pasteur (para el cambio de soluciones). Solución de registro (Hanks), con la que se per-fundirá los cultivos celulares. Colocar previamente en la incubadora. II. Al término del periodo de sonicación, se aforó la alícuota a 500 μL con solución de registro. Sonicar durante 15 minutos. 79 Nota: durante este periodo prender el equipo que va a ser utilizado: computadora, lámpara de fluorescencia, calentadores, obturador, cámara e intensificador, entre otros. 5.3.5.7. Incorporación del colorante a cultivos celulares. I. Se retiró el medio de cultivo y desechó (con una pipeta). II. Se colocó el fluoróforo con una pipeta nueva, cuidando que cubra la superficie total de nuestras muestras durante 15 a 20 minutos. El cambio de medio a fluoróforo debe ser rápido y con cuidado para evitar daños a nuestras muestras. III. Se preparó el sistema de perfusión. Que suplementa constantemente la solución salina con carbógeno de manera continua. IV. Se utilizó el programa Win View, se ajustó los parámetros para el registro (número de imágenes y velocidad de captura, la cual se sincronizó con el obturador). Se emplearon 300 ms, como tiempo de exposición por 300 imágenes, los dos parámetros se ajustaron en función a la fluorescencia presente y la actividad de las muestras. V. Al término del tiempo de incubación, se retiró el fluoróforo de las muestras y se cambió por solución salina (Hanks). La muestra teñida con fluoróforo es observada al microscopio, buscando enfocar la zona de interés, ajustamos aumento y foco. VI. Una vez localizada el área de interés se procedió a hacer pruebas preliminares para enfocar, así como tiempos de exposición que consisten en pruebas de velocidad de captura y número de imágenes, es importante ajustar la distancia focal de la cámara para que el registro tenga resultados claros. Nota: se evitaron las exposiciones a la luz innecesarias, para reducir el fenómeno de fotoblanqueo y fototoxicidad. VII. Si no se distingue adecuadamente la fluorescencia, las nuestras muestras se incuban durante unos minutos más. 80 VIII. Para obtener diferentes registros, localizamos diferentes áreas de interés en el cultivo. El ajuste de foco se debe realizar en cada área y cultivo. 5.3.5.8. Win View (pasos para el registro óptico). II. Para el registro óptico, se utilizó el programa “Win View 32”. Una vez abierto el programa de registro, en la barra de opciones se seleccionó la pestaña llamada “Adquisición” posteriormente, se seleccionó “Experiment Setup”; se establecieron los parámetros (mencionados previamente). III Se seleccionó la pestaña llamada “MAIN” en donde se ajustan los tiempos de exposición “Exposure Time”. Posteriormente, se establecióel número de imágenes “Number of Images” de la misma manera, el número es variable. IV. En la pestaña “Data corrections, se indica el “Background” o un fondo, el cual se le restará a la película que tomamos, con el fin de eliminar la fluorescencia de fondo que provoque ruido o interferencia de nuestra película. V. Una vez establecidos los parámetros mencionados, se seleccionó la opción de aceptar y se enfocó la muestra en el microscopio, ubicando el área de interés. VI. Se seleccionó la opción de “Acquisition”, después la opción de “Focus” para ajustar el foco en la pantalla (el foco de la cámara con respecto al nuestro es diferente), se ajustó la sensibilidad de la cámara con el intensificador, para mejorar la recepción y revisar que todo funcione adecuadamente. VII. Finalizado este proceso, en la barra de menú “Acquisition”, posteriormente la opción “Acquire”; en la barra inferior de la ventana inicia la captura de imágenes y se indica el avance en porcentaje hasta su finalización. VIII. Al término de la captura, se guardó el archivo. En la barra de menú seleccionamos la opción “File” posteriormente “Save As” en donde seleccionaremos o crearemos un carpeta para almacenar los archivos, los cuales se deben de guardar en formato “TIFF” para su análisis posterior con “Image J”. 81 6. Resultados y su discusión. 6.1 Andamios electrohilados de PVA. 6.1.1. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y análisis de los diámetros para los andamios electrohilados de PVA. Los andamios de PVA que se electrohilaron, se caracterizaron mediante SEM, en una primera instancia para determinar los diámetros y la morfología de las fibras de PVA, para identificar las muestras y las condiciones con las que se obtuvieron, los andamios de PVA se nombraron en orden alfabético como se muestran en la tabla 6.1. Tabla 6.1. Identificación de las pruebas para los andamios de PVA electrohilados. Concentración de la disolución de polímero (% m/v) Distancia inyector- colector (cm) Diferencia de potencial aplicado ∆E (kV) Rapidez de flujo (mL/h) Nombre de la prueba 20 10 13 0.2 a 15 0.2 b 15 13 0.2 c 15 0.2 d 20 15 0.2 e 25 10 15 0.2 f El parámetro que se mantuvo constante en el proceso de electrohilado fue la velocidad de flujo, debido a que se realizó una búsqueda bibliográfica del proceso de electrohilado para PVA en agua y se encontró que en la mayoría de los artículos se trabajó con una rapidez de flujo de 0.2 mL/ h [49,50,51], además, en lo experimental se observó que al aumentar a una rapidez de flujo a 0.3 mL/h o 0.4 mL/h, después de cierto tiempo comenzó a gotear la disolución polimérica, debido a lo anterior solo se mantuvo la rapidez de flujo en 0.2 mL/h. La columna que está identificada con “Nombre de la prueba” en la tabla 6.1, está relacionada con las micrografías de la figura 6.1. La prueba “a” de la tabla 6.1 corresponde a la micrografía (a) de la figura 6.1. 82 Figura 6.1. Imágenes obtenidas por SEM de los andamios electrohilados de poli (alcohol vinílico). a) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 13 kV. b) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 15 kV. c) concentración de 20 % m/m, distancia inyector- colector de 15 cm y diferencia de potencial de 13 kV. d) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 15 cm y diferencia de potencial de 15 kV. e) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 20 cm y diferencia de potencial de 15 kV. f) concentración de 25 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 15 kV. a) b) c) d) e) f) 83 Las fibras de los andamios de PVA de la figura 6.1 muestran un diámetro de fibra uniforme y se analizarán en términos cuantitativos, los diámetros de las fibras se midieron a través del programa “Image J”, los datos obtenidos se procesaron estadísticamente con el programa llamado “R” y por último se construyó un histograma para cada micrografía de la figura 6.1. En la figura 6.2 se presentan los histogramas de las fibras presentadas en la figura 6.1, los histogramas de la figura 6.2 están relacionados con las imágenes de la figura 6.1; el histograma de la figura 6.2 (a) corresponde a la figura 6.1 (a) y así respectivamente. En cada caso se han considerado 30 mediciones para garantizar que el resultado sea representativo de cada muestra. A cada diámetro de fibra obtenido para cada andamio se le ha asociado su incertidumbre absoluta uc (x) como medida directa. . 84 Figura 6.2. Histogramas de frecuencias absolutas de los diámetros para los andamios de PVA. a) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 13 kV. b) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 15 kV. c) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 15 cm y diferencia de potencial de 13 kV. d) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 15 cm y diferencia de potencial de 15 kV. e) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 20 cm y diferencia de potencial de 15 kV. f) concentración de 25 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 15 kV. medidas de muestras micras (um) F re c u e n c ia 0 5 1 0 1 5 12 12 5 1 0.06925 0.08875 0.10825 0.12775 a) PVA c) PVA d) PVA e) PVA f) PVA b) PVA Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) 85 A continuación se muestra un cálculo de la incertidumbre asociada al diámetro de fibra de la prueba a) (concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 13 kV). Donde. Los valores de diámetros de las fibras que constituyen al andamio de PVA (prueba a)) obtenidos con el programa “ImageJ” son: (0.106, 0.100, 0.100, 0.087, 0.086, 0.091, 0.098, 0.081, 0.101, 0.094, 0.089, 0.091, 0.089, 0.089, 0.091, 0.083, 0.086, 0.079, 0.083, 0.079, 0.097, 0.097, 0.097, 0.092, 0.118, 0.100, 0.083, 0.086, 0.081, 0.087) μm. �̅�= 0.091 μm. n= 30. uB (x)= 0.001 μm. Al sustituir los valores en la ecuación 5.3, se tiene que el valor para s(x) es. s(x)= √ ∑ (𝑥𝑖−�̅�) 230 𝑖=1 𝑛−1 s(x)= 0.009 μm. Al sustituir el valor de s(x) en la ecuación 5.2, la incertidumbre tipo A (uA (x)) es. uA(x)= s(x)/√n uA(x)= 0.009 √30 = 0.002 μm. Por ultimo calculamos la incertidumbre absoluta (uC (x)), para lo cual se sustituyen los valores de uA (x) y uB (x) en la ecuación 5.1. uC (x)= √uA 2 (x) + uB 2 (x) uC (x)= √(0.002)2 + (0.001)2 uC (x)= 0.002 μm. Por lo que el valor del diámetro de las fibras de PVA para la prueba a) con su incertidumbre asociada es: (0.091± 0.002) μm 86 Los cálculos anteriores se realizaron para determinar los diámetros de las fibras, a cada medición se le asoció su incertidumbre absoluta uC (x). Tabla 6.2. Diámetros de las fibras de los andamios híbridos de PVA. Nombre de la prueba Diámetro de las fibras (μm) a 0.091 ± 0.002 b 0.127 ± 0.002 c 0.129 ± 0.003 d 0.140 ± 0.002 e 0.245 ± 0.003 f 0.206 ± 0.005 Las fibras que mostraron un diámetro menor son las de la prueba “a” (figura 6.1 (a)), las fibras con el mayor diámetro son las de la prueba “e” (figura 6.1 (e)). Las imágenes SEM presentadas en la figura 6.1 no mostraron la formación de bulbos ni la presencia de defectos superficiales en ninguna de las micrografías, lo que sí se observó es un aumento en el diámetro de las muestras (figura 6.1 (e)) y (figura 6.1 (f)), de prácticamente el doble, comparadas con las muestras (figura 6.1 (a)), (figura 6.1 (b), (figura 6.1 (d))y (figura 6.1 (c)). Sin embargo, se trató de buscar que en el proceso de electrohilado no se desperdiciara la disolución polimérica. Se observó que al aumentar la distancia inyetor - colector, también aumentó el diámetro de las fibras de PVA, por lo que se sugiere que el diámetro de las fibras de PVA está en función de la distancia inyector-colector. Se observó que durante el proceso de electrohilado al trabajar con los parámetros de concentración de PVA al 20 % m/m en agua; 10 cm de distancia inyector- colector y una diferencia de potencial de 15 kV, no desperdiciaba disolución polimérica sino que se electrohilaba por completo. Por esta razón, se eligieron los parámetros de concentración 20 % m/m, 10 cm de distancia inyector-colector y una diferencia de potencial de 15 kV, para elaborar los andamios híbridos de PVA/biovidrio, en este caso es la muestra de la figura 6.1 (b) y que tiene diámetro de (0.127 ± 0.002) nm. 87 6.1.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). Una vez establecidas las condiciones de electrohilado, se procedió a analizar mediante FTIR el andamio de PVA con los parámetros de 20 % m/m, 10 cm de distancia inyector-colector y una diferencia de potencial de 15 kV. En la figura 6.3 se presenta el espectro de infrarrojo obtenido por FTIR de la muestra electrohilada de PVA. Figura 6.3. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR de la muestra electrohilada de PVA. Parámetros de electrohilado: concentración de 20% m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y una diferencia de potencial aplicado de 15 kV. En la tabla 6.3 se indican las señales de los grupos funcionales importantes que identifican al PVA e inmediatamente después un análisis de las señales relacionadas con los grupos funcionales del PVA. Tabla 6.3. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio de PVA. Muestra Principales señales observadas (cm -1 ) -OH -CH2 H2C-CO HC-OH C-O C-C PVA 3300 2940 Y 2909 1420 1327 1087 840 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 20 40 60 80 100 120 % d e t ra n sm ita n ci a cm -1 PVA 3300 2940 2909 1087 1420 1327 OH n 840 Número de onda (cm-1) 88 En el espectro de infrarrojo se observó una señal a un número de onda de 3300 cm-1, corresponde a los estiramientos de los grupos -OH del polímero de PVA. Las señales a (2940 y 2909) cm-1, corresponden a los estiramientos del grupo -CH2 de los grupos metileno. La señal en 1420 cm-1, corresponde al estiramiento del enlace H2C-CO. La señal que se encuentra en 1327 cm -1, se relacionó con los estiramientos del enlace HC-OH. La señal observada en 1087 cm-1 corresponde al estiramiento del enlace C-OH. La señal en 840 cm-1 corresponde a los estiramientos del enlace C-C. 6.1.3. Difracción de Rayos-X (DRX). El patrón de difracción de rayos-X para la muestra de PVA electrohilada se muestra en la figura 6.4. En la literatura se ha reportado que la señal que aparece alrededor de 2ϴ = 20° corresponde al plano (1 0 1) y que el patrón de difracción indica que el polímero de PVA presenta una estructura semicristalina [59]. Figura 6.4. Patrón de difracción de rayos-X para el andamio electrohilado de PVA. Parámetros de electrohilado: concentración de 20% m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y una diferencia de potencial aplicado de 15 kV. 89 6.1.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). Mediante el análisis DSC, se determinaron las transiciones térmicas del andamio electrohilado de PVA; la temperatura de transición vítrea (Tg) y la temperatura de fusión (Tm). El análisis DSC se llevó a cabo desde una temperatura ambiente (20 °C) hasta 300 °C, en atmósfera de nitrógeno y con una rampa de calentamiento de 10 °C/min. Figura 6.5. Análisis DSC del andamio electrohilado de PVA. La figura 6.5 presenta el análisis DSC del andamio de PVA electrohilado, este análisis muestró tres procesos endotérmicos, el primero de ellos comienza en 22.29 °C y finaliza en 102.64 °C, este proceso corresponde a la evaporación de agua residual en el andamio de PVA. El segundo proceso endotérmico, inició en 178.23 °C y finalizó en 228.40 °C, corresponde a la fusión del polímero de PVA. Por último, el fenómeno que ocurre después de la temperatura de 228.40 °C es la degradación térmica del polímero. Para confirmar que el proceso endotérmico que se muestra en el intervalo de temperatura de (22.29 - 102.64) °C corresponde a la evaporación de agua, se Temperatura (°C) E n d o té rm ic oF lu jo d e c a lo r (W /g ) 90 realizó un calentamiento y enfriamiento cíclico acompañado de un posterior análisis DSC hasta 320 °C. Figura 6.6. Análisis DSC del andamio electrohilado de PVA obtenido mediante ciclos de calentamiento. a) ciclo de calentamiento y enfriamiento que se realiza para descastar la presencia de disolventes. b) análisis DSC obtenido después del ciclo de calentamiento y enfriamiento realizado en a). En la figura 6.6 a) muestra el ciclo de calentamiento y enfriamiento que se le dio a la muestra del andamio de PVA, el ciclo inicio a temperatura ambiente (20.35 °C) y se lleva a una temperatura de 119.26 °C para eliminar el agua residual sin llegar a la fusión del polímero, por último, la muestra se enfrió hasta una temperatura de 1.21 °C y en la cual se inicia el análisis DSC hasta los 320 °C. A C B a) b) Proceso de fusión del polímero. Primera etapa de degradación térmica. Temperatura (°C) Temperatura (°C) E n d o té rm ic o E n d o té rm ic o F lu jo d e c a lo r (W /g ) F lu jo d e c a lo r (W /g ) 91 P e s o ( % ) La figura 6.6 b) muestra el análisis DSC obtenido después del ciclo de calentamiento y enfriamiento realizado anteriormente, en este análisis no se observa el proceso endotérmico en el intervalo de (22.29 - 102.64) °C, los procesos de fusión y descomposición del polímero se siguen observando. Por lo que, se concluye que el proceso endotérmico observado en el intervalo de (22.29 - 102.64) °C corresponde a la evaporación de agua. Tabla 6.4. Valores de Tg y Tm para el andamio electrohilado de PVA. Muestra DSC (Tg) (Tm) Andamio de PVA 88.1 °C 220.59 °C 6.1.5. Análisis Termogravimétrico (TGA). El análisis termogravimétrico (TGA) fue usado para conocer la estabilidad térmica del polímero. El análisis TGA se llevó a cabo desde una temperatura ambiente (≈ 25 °C) hasta 600 °C, en atmósfera de nitrógeno, con una rampa de calentamiento de 10 °C/min. La figura 6.7 muestra el análisis TGA del andamio de PVA. Figura 6.7. Termograma (TGA) del andamio de PVA electrohilado. Primera etapa de degradación Segunda etapa de degradación Temperatura (°C) 92 El análisis termogravimétrico del andamio de PVA muestra tres regiones de pérdida de peso. El TGA del andamio muestró una primera pérdida en el intervalo de (33.68 – 85.56) °C causada por la evaporación de agua, en este proceso se perdió 2.823 % de peso del andamio. La segunda pérdida, se relacionó con una primera etapa de degradación, se observó en el intervalo de (181.92 – 316.72) °C, muestró una pérdida del 65.28 % y corresponde a la pérdida de los grupos hidroxilo del polímero de PVA, este proceso se llevó a cabo mediante una reacción de eliminación para dar lugar a la formación de polienos conjugados y no conjugados, este mecanismo se ilustra en la figura 6.8 para PVA (98 – 99) % hidrolizado. La tercera pérdida se relacionó con una segunda etapa de degradación, se produjo después de los 414.04 °C y corresponde a la combustión del polímero de PVA. Figura 6.8. Mecanismo de descomposición en la primera etapa del polímero de PVA [60]. El mecanismo de degradación de la segunda etapa, no se presenta en este trabajo, debido a que involucra mecanismos de mayor complejidad ydiversos productos generados. Debido a que el objetivo de este trabajo difiere de conocer a mayor detalle la degradación del polímero, se reserva una mayor explicación de estos mecanismos. Una una explicación detallada de la degradación del polímero de PVA se encuentra en la literatura [60-64]. HO OH HO OH Elimicación de nH20 HO HO + + H2O 93 6.2. Andamio electrohilado de PVA estabilizado con glutaraldehído (GA). 6.2.1. Microscopia electrónica de barrido (SEM). El andamio de PVA que se estabilizó fue con los parámetros de concentración 20 % m/m, 10 cm de distancia inyector-colector y una diferencia de potencial de 15 kV. El objetivo del análisis SEM para las fibras de PVA estabilizadas, es determinar si existe alguna modificación en la morfología y diámetro de las fibras después del tratamiento con GA. En la figura 6.9, a) es una micrografía del andamio de PVA después de la estabilización con GA y b) es el histograma de los diámetros de las fibras que constituyen el andamio de PVA de la figura 6.9 a). Figura 6.9. La figura a) muestra la micrografía obtenida mediante SEM del andamio de PVA estabilizado con GA. La figura b) muestra el histograma de los diámetros del andamio de PVA estabilizado. La micrografía de la figura 6.9 a), no muestró la formación de bulbos ni el hinchamiento de las fibras de PVA. Al comparar las micrografías de las fibras de PVA con las fibras de PVA estabilizadas con glutaraldehído, no se observa ninguna modificación en la morfología de las fibras por lo que se confirma que el tratamiento con GA no modifica la morfología de las fibras de PVA. medidas de muestras micras (um) F re c u e n c ia 0 2 4 6 8 1 0 1 2 8 10 7 5 0.07325 0.10675 0.14025 0.17375 b) a) Diámetro de fibra (μm) PVA estabilizado 94 En la tabla 6.5 se proporciona el diámetro de las fibras del andamio de PVA y las fibras del andamio de PVA estabilizadas con GA, esto con el fin de determinar cuantitativamente si se produjo algún cambio en las fibras debidas a la estabilización. Tabla 6.5. Comparación del diámetro de las fibras de PVA con las fibras de PVA estabilizadas con GA. Los valores se reportan con su incertidumbre absoluta. Muestra Diámetro de las fibas (μm) Andamio de PVA sin estabilizar 0.127 ± 0.002 Andamio de PVA estabilizado con GA 0.129 ± 0.004 Los resultados de la tabla 6.5, no muestran un cambio significativo en el diámetro de las fibras de PVA después del tratamiento con GA. El incremento en el diámetro de las fibras es de 0.002 μm, además, hay que destacar que no se observó la formación de bulbos ni cambios en la morfología de las fibras. 6.2.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). La estabilización del polímero de PVA se realizó con GA después de obtener las fibras por electrohilado. En la figura 6.10, se muestra en el espectro obtenido por FTIR del andamio de PVA estabilizado con GA, se observó una disminución de la intensidad en la señal característica del grupo -OH en un número de onda de 3300 cm-1. En la literatura se encontró que ocurre una reacción química, tal como se muestra en la figura 6.11, en donde se ha propuesto que al reaccionar el PVA con el GA sucede un entrecruzamiento químico y los grupos –OH del PVA disminuyen, por lo que se infiere que la señal debida al grupo –OH del PVA disminuye cuando el polímero se ha entrecruzado con GA [50, 65, 66]. 95 En el espectro de FTIR observó que no hay residuos de tolueno, que fue el disolvente que se utilizó para la estabilización, tampoco se observan las señales de glutaraldehído por sí solo. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20 40 60 80 100 120 % d e t ra n s m it a n c ia cm -1 PVA PVA entrecruzado 3300 O O OH OHOO PVA entrecruzado Figura 6.10. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR de la muestra electrohilada de PVA estabilizada con GA. Parámetros de electrohilado: concentración de 20% m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y una diferencia de potencial aplicado de 15 kV. Para mayor comprensión de lo anterior, se propone el siguiente mecanismo de reacción que se lleva a cabo en las fibras electrohiladas de PVA (figura 6.11). Número de onda (cm-1) PVA PVA estabilizado PVA estabilizado 96 OH OH OH OH OH OH + PVA O O H H GA O O OH OHOO PVA entrecruzado Figura 6.11. Propuesta de reacción entre los grupos -OH superficiales del polímero de PVA con GA. En este mecanismo se propone que los grupos –OH del polímero de PVA reaccione con los grupos aldehído del GA y que se formen enlaces C-O-C, lo cual disminuye la hidrofilicidad del polímero de PVA y que permite utilizarlo para posteriores pruebas bilógicas de sembrado de células de cardiomiocitos ventriculares de pollo. La reacción de los grupos –OH del polímero de PVA con GA dieron una explicación a la disminución de la señal en 3300 cm-1. En la región de (2000 – 400) cm-1 no se observó un cambio en las señales entre el FTIR del andamio de PVA y el andamio de PVA estabilizado, para asegurar una reacción química entre el PVA y el GA se esperaba un cambio en el espectro, debido a que esto no ocurrió, se le denominó “estabilización” al efecto del tratamiento de las fibras de PVA con GA y el cual le infirió una mayor resistencia a la disolución en medios acuosos. 6.2.3. Difracción de rayos-X (DRX). En la figura 6.12 se presentan los difractogramas del andamio de PVA y del andamio de PVA estabilizado con GA. El análisis de difracción de rayos-X se llevó a cabo para determinar si el tratamiento de las fibras con GA modifica la cristalinidad del polímero. PVA estabilizado 97 Figura 6.12. Patrones de difracción de rayos-X. a) andamio de PVA. b) andamio de PVA estabilizado con GA. En la comparación de los análisis obtenidos mediante difracción de rayos-X, se observó la aparición de una señal en el intervalo de 9° a 17°, esta señal no es interpretable debido a que no es una señal definida ni característica de una alta cristalinidad. La señal en 20° la presentan tanto el andamio de PVA como el andamio de PVA estabilizado, esta señal ya se ha analizado en la sección 6.1.3. Del análisis anterior, se infirió que la estabilización del polímero de PVA generó una cristalinidad diferente a la del PVA puro. 6.2.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). El análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA es presentado en la figura 6.13, el análisis DSC se llevó a cabo, desde una temperatura ambiente (≈ 25 °C) hasta 300 °C, en atmósfera de nitrógeno y con una rampa de calentamiento de 10 °C/min. La figura 6.13 muestra el análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA. a) b) 98 Figura 6.13. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA. El análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA mostró tres procesos endotérmicos, el primero de ellos comenzó en 22.28 °C y finalizó en 111.21 °C, este proceso corresponde a la evaporación de disolventes residuales. El segundo proceso endotérmico que inició en 176.21 °C y finalizó en 228.16 °C, este proceso se asoció a la fusión del polímero de PVA. Por último, el fenómeno que ocurre después de la temperatura de 228.16 °C se debió a la degradación del polímero. El proceso endotérmico debido a la evaporación de disolventes residuales en el andamio de PVA estabilizado, es el mismo que, se dió en el andamio de PVA, para obtener un mejor comparativo de estos procesos en los dos andamios, se presenta la figura 6.14. En la figura 6.14 se presenta el análisis DSC del andamio de PVA y del andamio de PVA estabilizado con GA, ambos análisis DSC se llevaron a cabo desde una temperatura ambiente (≈ 25 °C) hasta 300 °C, en atmósfera de nitrógeno, con una rampa de calentamiento de 10 °C/min. Temperatura (°C) E n d o té rm ic oF lujo d e c a lo r (W /g ) 99 Figura 6.14. Análisis DSC del andamio de PVA y del andamio de PVA estabilizado con GA. Al realizar la comparación de los análisis DSC del andamio de PVA y del andamio de PVA estabilizado con GA, se observó que los procesos endotérmicos debido a la evaporación de disolventes residuales se dieron en intervalos de temperatura prácticamente iguales, los procesos endotérmicos debidos a la fusión del polímero se encontraron en un intervalo de temperatura igual, tanto para el andamio de PVA como para el andamio de PVA estabilizado. Del análisis DSC de los procesos endotérmicos para ambos andamios, se infiere que el estabilizado del polímero de PVA, no modificó los intervalos de temperatura a los cuales se dan los procesos de evaporación de disolventes residuales y la fusión del polímero, sin embargo, en el apartado 6.2.5 se realizó una comparación en cuanto al análisis termogravimétrico, esto para conocer si la estabilización con GA proporciona al andamio una mayor resistencia a la degradación térmica por efecto de la temperatura. Evaporación de disolventes residuales Fusión del polímero PVA PVA estabilizado Temperatura (°C) E n d o té rm ic o F lu jo d e c a lo r (W /g ) 100 P e s o ( % ) 6.2.5. Análisis Termogravimétrico (TGA) . En la figura 6.15 se muestra el análisis termogravimétrico del andamio de PVA estabilizado con GA, en el análisis se indican las dos etapas de degradación térmica que se observan. El análisis TGA se llevó a cabo desde una temperatura ambiente (≈ 25 °C) hasta 600 °C, en atmósfera de nitrógeno, con una rampa de calentamiento de 10 °C/min. Figura 6.15. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA estabilizado con GA. El análisis termogravimétrico del andamio de PVA estabilizado con GA muestró tres regiones de pérdida de peso. El TGA del andamio muestra una primera pérdida en el intervalo de (32.82 – 75.15) °C causada por la evaporación de agua, en este proceso se perdió 2.654 % del peso del andamio. La segunda pérdida se asoció a una primera etapa de degradación, se observó en el intervalo de (168.07 – 311.39) °C, mostró una pérdida del 65.99 % de peso de PVA, esto se asocia a la formación de polienos conjugados y no conjugados como se presentó en la sección 6.1.5. La tercera pérdida se asoció a una segunda etapa de degradación, se produjo después de los 430.88 °C y corresponde a la combustión del polímero de PVA. Primera etapa de degradación Segunda etapa de degradación Temperatura (°C) 101 P e s o ( % ) En la figura 6.16 se presenta un comparativo entre los análisis TGA del andamio de PVA y el andamio de PVA estabilizado con GA, como se puede observar, la primera pérdida de peso debida a la evaporación de agua es la misma, la cual se dio en un intervalo de temperatura de (32.82 - 75.15) °C y en donde ambos perdieron aproximadamente 2.5 % del peso total. Figura 6.16. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA y del andamio de PVA estabilizado con GA. En los análisis TGA de la figura 6.16 se observaron diferencias en la primera y segunda etapa de degradación, el andamio de PVA estabilizado con GA presentó una resistencia menor a la degradación térmica, se infiere que esta disminución se debió a que la estabilización (propuesta en la sección 6.2.2) generó la interrupción de los puentes de hidrógeno intra e intermoleculares del polímero de PVA. PVA estabilizado PVA Primera etapa de descomposición Segunda etapa de descomposición Temperatura (°C) 102 6.3 Biovidrio de composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. 6.3.1. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM). Se realizó un análisis mediante SEM de las muestras de biovidrio para determinar el tamaño de las partículas que se generaron en la síntesis sol gel. El análisis por SEM se realizó después de llevar a cabo una estabilización del biovidrio a 70 °C durante 3 días y a 120 °C durante 2 días más. El producto obtenido se molió en un mortero, con la finalidad de obtener partículas más pequeñas. A continuación, en la figura 6.17 se muestran las micrografías de la muestra de biovidrio sintetizada con una composición de (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. Figura 6.17. Micrografías tomadas por SEM de la muestra de biovidrio con una composición de (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. a) Micrografía de biovidrio con un aumento de 500 veces. b) Micrografía de biovidrio con un aumento de 2 500 veces. La micrografía 6.17 (a) muestra una morfología del biovidrio con un aumento de 500 veces. La micrografía 6.17 (b) muestra un aumento de 2 500 veces. Como se observa, el tamaño de las partículas tiene un amplio intervalo de longitud, además, se observó que presenta irregularidades en la superficie de las partículas como la formación de aglomerados y rugosidades. El diámetro de las partículas de biovidrio, después de la molienda mecánica, se encuentró en un intervalo de (0.300 – 18.000) μm. a) b) 103 6.3.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier. La figura 6.18 muestra el espectro de infrarrojo del biovidrio, que fue utilizado para generar los andamios de PVA/biovidrio. A continuación se da un análisis de las señales observadas en el espectro. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 20 40 60 80 100 120 % d e t ra n s m it a n c ia cm -1 Biovidrio 1042 932 7893493 3443 1628 1612 SiO2-CaO-P2O5 Figura 6.18. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR de biovidrio con una composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. Tabla 6.6. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del Biovidrio (58%SiO2- 33%CaO-9%P2O5) % mol. Muestra Principales señales observadas (cm -1 ) SiO-H -OH Si-O-Si (asimétrico) Si-O-Si (simétrico) Si-O-Si (vibración de flexión) Biovidrio 3493 Y 3443 1628 Y 1612 1042 932 789 Número de onda (cm-1) 104 2ϴ Las señales que se observron en las longitudes de onda de (3493 y 3443) cm-1, corresponden a los estiramientos de los enlaces SiO-H. Las señales en (1628 y 1612) cm-1 son atribuidas a las moléculas de agua adsorbidas en el interior de los poros del biovidrio, la señal en 1042 cm-1 se asocia al estiramiento asimétrico de los enlaces Si-O-Si. La señal en 932 cm-1 corresponde al estiramiento simétrico de los enlaces Si-O-Si. Por último, la señal observada en 789 cm-1 pertenece a la vibración de flexión del enlace Si-O-Si. Las señales presentes en el espectro, confirman que se produjeron enlaces Si-O- Si en la estructura del biovidrio. 6.3.3. Difracción de rayos-X (DRX). En la figura 6.19 se presenta el patrón de difracción del biovidrio, el patrón de difracción se realizó de en un ángulo 2ϴ con un intervalo de (0 - 80)°. Figura 6.19. Patrón de difracción de rayos-X del biovidrio (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. El patrón de difracción de rayos-X indicó que la muestra de biovidrio, con composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol, es un compuesto amorfo, con señales pequeñas de cristalinidad. La ausencia de cristalinidad es una 105 característica que se busca en los biovidrios para que puedan desempeñar una mejor reparación del tejido para el que sean destinados. 6.3.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). La figura 6.20 muestra el análisis DSC del biovidrio, se hace notar que en el análisis no se observa una línea base, lo cual es un comportamiento general para los biovidrios sintetizados mediante la ruta sol gel. El análisis DSC se llevó a cabo desde una temperatura ambiente (≈ 25 °C) hasta 300 °C, en atmósfera de nitrógeno y con una rampa de calentamiento de 10 °C/min. Figura 6.20. Análisis DSC del biovidrio con una composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. El primer proceso endotérmico comenzóa 21.97 °C y terminó en 178.86 °C, la señal se relacionó con la evaporación de agua, etanol (que se produce en la reacción de hidrólisis) y TEOS sin reaccionar. El segundo proceso endotérmico se Temperatura (°C) E n d o té rm ic o F lu jo d e c a lo r (W /g ) 106 P e s o ( % ) observó en un intervalo de (224.59 -296.69) °C, este proceso endotérmico se relacionó con la expulsión de residuos de agua y etanol dentro de los poros cerrados del biovidrio. 6.3.5. Análisis Termogravimétrico (TGA). El análisis termogravimétrico se llevó a cabo para la muestra de biovidrio, el análisis inicio desde una temperatura de 33.78 °C hasta 600 °C, en atmósfera de nitrógeno y con una rampa de calentamiento de 10 °C/min. Figura 6.21. Análisis termogravimétrico (TGA) de la muestra de biovidrio con una composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. En la figura 6.21 se presenta el termograma de la muestra de biovidrio, en el cual se observa una pérdida inicial de peso de 13.53 % en un intervalo de temperatura de (33.78 - 165.90) °C, esta pérdida de masa es debido a la evaporación superficial de agua (agua adsorbida), etanol (que se produce en la reacción de hidrólisis) y precursores sin reaccionar como TEOS y TEP. En el termograma se Temperatura (°C) 107 presentó una pérdida de 11.04 % en un intervalo de (241.08 - 296.40) °C y que se asoció con la expulsión de residuos de agua dentro de los poros cerrados del biovidrio, llamada agua intersticial. En total se perdió un 27.51 % en peso del biovidrio, debida a disolventes y precursores sin reaccionar, la pérdida de total de peso que se registró, se midió desde el inicio hasta el final del análisis (33.78 – 600) °C. 6.4. Andamios híbridos O/I electrohilados de PVA/biovidrio (58%SiO2- 33%CaO-9%P2O5) % mol. 6.4.1. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM). La figura 6.22 muestra las micrografías de los andamios electrohilados de PVA/biovidrio a un voltaje de 15 kV, a una distancia de 10 cm y una concentración de PVA al 20 % m/m. El parámetro que se varió fue la cantidad de biovidrio respecto a la cantidad de polímero. 108 Figura 6.22. Micrografías tomadas por SEM de los andamios híbridos de PVA/biovidro. a) híbrido al 5%, b) híbrido al 10%, c) híbrido al 15%, d) híbrido al 20%, e) híbrido al 25% y f) híbrido al 30%. En la figura 6.23 se presentan los histogramas de frecuancias absolutas de los andamios híbridos de PVA/biovidrio a los diferentes porcentajes de concentración. b) a) c) d) e) f) 109 Figura 6.23. Histogramas de frecuencias absolutas de los andamios híbridos de PVA/biovidro. a) híbrido al 5%, b) híbrido al 10%, c) híbrido al 15%, d) híbrido al 20%, e) híbrido al 25% y f) híbrido al 30%. Híbrido al 5% Híbrido al 10% Híbrido al 15% Híbrido al 20% Híbrido al 25% Híbrido al 30% a) b) c) d) e) f) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) 110 En la tabla 6.7 se indica el diámetro de las fibras de los andamios de PVA/biovidrio a los diferentes porcentajes de concenttración. Tabla 6.7. Diámetros de las fibras de los andamios híbridos de PVA/biovidrio. Muestra Diámetro de las fibras (μm) Híbrido al 5 % 0.140 ± 0.004 Híbrido al 10 % 0.125 ± 0.003 Híbrido al 15 % 0.148 ± 0.003 Híbrido al 20 % 1.138 ± 0.041 Híbrido al 25 % 0.288 ± 0.009 Híbrido al 30 % 0.338 ± 0.020 En la figura 6.23, el diámetro y morfología de las fibras fue diferente para cada muestra, el diámetro menor de fibra lo muestró el andamio de PVA/biovidrio al 5 % y el diámetro mayor de fibra, lo muestra el andamio de PVA/biovidrio al 20 %. El diámetro del andamio híbrido al 20 % presentó una anomalía, debido a que mostró un aumento de diámetro de cuatro a nueve veces, con respecto a los otros andamios híbridos, la hipótesis que se tiene es que los parámetros de humedad y temperatura (parámetros que no se controlan) aumentaron el diámetro de las fibras. Los andamios al 5 % (figura 6.22 (a)), 10 % (figura 6.22 (b)) y 15 % (figura 6.22 (c)) mostraron diámetros homogéneos, además, la superficie de las fibras no presentó irregularidades, como lo son la formación de bulbos. Se hace la observación de que los diámetros de las fibras se mantienen constantes a lo largo de las fibras. Los diámetros de las fibras para el andamio híbrido al 5 % se encontraron en un intervalo de (0.103 - 0.174) nm. Los diámetros para las fibras del andamio híbrido al 10 % se encontraron en un intervalo de (0.084 -0.159) nm, se destaca que el diámetro de las fibras se obtuvo principalmente en el intervalo de (0.121 - 0.140) nm. Los diámetros para las fibras del andamio híbrido al 15 % se encontraron en 111 un intervalo de (0.120 - 0.175) nm, se observó en el histograma que el diámetro de las fibras se obtuvo principalmente en el intervalo de (0.133 - 0.147) nm. Los andamios híbridos al 20 % (figura 6.22 (d)), 25 % (figura 6.22 (e)) y 30 % (figura 6.22 (f)) muestran una mayor irregularidad en la morfología de sus fibras, se observó que las fibras no presentan una forma tubular recta y homogénea, por el contrario presentan aumentos y disminuciones respecto a sus diámetros a lo largo de las fibras. Los diámetros de las fibras para el andamio híbrido al 20 % se obtuvieron en un intervalo de (0.874 - 1.787) nm y se destaca que los diámetros se encontraron principalmente en el intervalo de (0.874 - 1.102) nm. Los diámetros de las fibras para el andamio híbrido al 25 % se encontraron en el intervalo de (0.188 - 0.394) nm y se destaca que los diámetros se obtuvieron principalmente en el intervalo de (0.239 - 0.342) nm. Por último, los diámetros de las fibras para el andamio híbrido al 30 % se encontraron en el intervalo que comprende (0.161 - 0.544) nm. 6.4.2. Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) y mapeo de los componentes del biovidrio en las fibras de PVA/biovidrio. Por medio del análisis TEM, se realizó un mapeo de los elementos que constituyen al biovidrio, esto se realizó para conocer la distribución de biovidrio en los andamios de PVA. Solo se realizó la Microscopia TEM para el andamio híbrido al 20 %. Se hace destacar que no se obtienen micrografías por medio de la Microscopia (TEM) para el andamio de PVA debido a que el haz incidente de electrones destruye la muestra, el híbrido al 20 % logó resistir el haz de electrones para ser analizado. 112 Figura 6.24. Imágenes tomadas por Microscopia (TEM) del andamio híbrido al 20 %. a) micrografía que muestra la superficie de una fibra del andamio híbrido al 20 %. b) mapeo de los componentes del Biovidrio (silicio, calcio y cloro) en la fibra de PVA. Figura 6.25. Mapeo de los componentes del biovidrio (silicio, calcio y fósforo) en la fibra de PVA que se presentó en la figura 6.18 a. a) mapeo de silicio en la fibra de PVA. b) mapeo de calcio en la fibra de PVA y c) mapeo de fósforo en la fibra de PVA La figura 6.24 (a) muestra una micrografía de un segmento de fibra que corresponde al andamio al 20 % (80 % PVA y 20 % biovidrio), en la cual se observó una superficie regular, sin la formación de cúmulos o rugosidades. Para conocer la distribución del biovidrio en las fibras de PVA se realizó un mapeo de los elementos que constituyen el biovidrio, para lo cual se obtuvo la micrografía 6.24 (b). La figura 6.24 (b) muestra que la distribución de los elementos del a) b) a) b) c) 113 biovidrio (silicio, calcio y fósforo), se distribuyen homogéneamente en la fibra de PVA. Las figuras 6.25 (a), (b) y (c), mostraron una distribución de los elementos de biovidrio (silicio, calcio y fósforo) por separado para tener una mejor visualización de cada uno deellos en la fibra del híbrido al 20 %. Se observó que la distribución de silicio, calcio y fósforo es homogénea a lo largo de la fibra. El silicio y el calcio mostraron mayor intensidad en la distribución, debido a que la fórmula del biovidrio contiene una mayor cantidad de los componentes silicio y calcio, por el contrario, el fósforo se encuentra en menor cantidad y debido a esto tiene una menor intensidad en el mapeo elemental de la figura 6.25 (c). 6.4.3. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). Los andamios electrohilados híbridos orgánico/inorgánico, se caracterizaron mediante FTIR. En los espectros de los híbridos se asocian las señales más relevantes con las vibraciones de los grupos funcionales a los que corresponden. 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Número de onda (cm -1 ) Híbrido al 15% Híbrido al 10% Híbrido al 5% 3300 2945 2916 1422 1327 1084 840 Figura 6.26. Espectros de infrarrojo obtenido por FTIR de los andamios de PVA/biovidrio. a) andamio de PVA/biovidrio al 5 %, b) andamio de PVA/biovidrio 10 % y c) andamio de PVA/biovidrio 15 %. Número de onda (cm-1) a b c 114 En la figura 6.26, se muestra los espectros de FTIR de los andamios de PVA/biovidrio al 5 %, 10 % y 15 %, en los tres espectros no se observó un cambio significativo en las señales que presentan. A continuación se asignan las señales observadas con los grupos funcionales correspondientes. Tabla 6.8. Principales bandas observadas en los espectros de FTIR de los andamios híbridos de PVA/biovidrio al 5 %, 10 % y 15 %. Muestra Principales señales observadas (cm -1 ) O-H -CH2 H2C-CO HC-OH C-O C-C. Híbrido al 5 % 3300 2945 Y 2916 1422 1327 1084 840 Híbrido al 10 % 3300 2945 Y 2916 1422 1327 1084 840 Híbrido al 15 % 3300 2945 Y 2916 1422 1327 1084 840 Las señales de los espectros de FTIR para los andamios de PVA/biovidrio que se identifican son: una señal a un número de onda de 3300 cm-1, corresponde al estiramiento del enlace O-H del polímero de PVA. Las señales que se ubican en (2945 y 2916) cm-1 corresponden a las estiramientos del grupo metileno (–CH2). La señal en 1422 cm -1 corresponde al estiramiento del enlace H2C-CO. La señal que se encontró en 1327 cm-1 corresponde a los estiramientos del enlace HC-OH. La señal observada en 1087 cm-1 corresponde al estiramiento del enlace C-O. La señal en 840 cm-1, corresponde a los estiramientos del enlace C-C. Las señales Si-O-Si del biovidrio no se observaron en los andamios híbridos electrohilados al 5 %, 10 % y 15 %, esto se bebió a que la cantidad de biovidrio es baja y no es detectable en el equipo, los enlaces Si-O-Si comienzan a observarse a partir del andamio al 20 % hasta el andamio al 30 %. Los andamios de PVA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 % presentaron diferencias con los espectros de FTIR de los andamios de PVA/biovidrio al 5 %, 10 %y 15 %, debido a esto, se les da un análisis por separado a las señales que cada espectro presenta. 115 En la figura 6.27 se presenta el espectro de FTIR del andamio de PVA/biovidrio al 20% (80 % PVA y 20 % biovidrio), en el espectro se identifican las principales señales. Figura 6.27. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR del andamio electrohilado de PVA/ biovidrio al 20 %. Caracterización de las principales bandas. Tabla 6.9. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio híbrido PVA/biovidrio al 20%. Muestra Principales señales observadas (cm -1 ) O-H -CH2 -OH H2C-CO HC-OH C-O Si-O-Si (asimétrico) Si-O-Ca C-C Híbrido al 20% 3300 2944 Y 2907 1659 1422 1326 1089 1037 957 832 Se identificó una señal a un número de onda de 3300 cm-1 y que corresponde al estiramiento del enlace O-H del polímero de PVA. Las señales que se ubican en (2944 y 2907) cm-1 corresponden a los estiramientos del grupo metileno (–CH2). La señal en 1659 cm-1 se asocia a moléculas de agua adsorbidas en los poros cerrados del biovidrio. La señal en 1422 cm-1 corresponde al estiramiento del 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 20 40 60 80 100 120 % d e t ra n s m it a n c ia cm -1 Híbrido al 20% 3300 2944 2907 1089 1422 832 1037 1659 957 1326 Número de onda (cm-1) 116 enlace H2C-CO. La señal en 1326 cm -1 corresponde a los estiramientos del enlace HC-OH. La señal observada en 1089 cm-1 corresponde al estiramiento del enlace C-O. En el espectro aparece una nueva señal en 1037 cm-1, la cual corresponde al estiramiento asimétrico de los enlaces Si-O-Si del biovidrio. La señal en 957 cm-1 corresponde al estiramiento del enlace Si-O-Ca, lo que confirma una adición química de calcio a la red de silicio. La señal en 832 cm-1 corresponde a los estiramientos del enlace C-C. En la figura 6.28 se presenta el espectro de FTIR del andamio híbrido al 25 % (75 % PVA y 25 % biovidrio), en el espectro se identifican las principales señales. Figura 6.28. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR del andamio electrohilado de PVA/ biovidrio al 25 %. Caracterización de las principales bandas. Tabla 6.10. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio híbrido PVA/biovidrio al 25 %. Muestra Principales señales observadas (cm -1 ) O-H -CH2 O-H H2C-CO HC-OH C-O Si-O-Ca C-C Híbrido al 25 % 3300 2942 Y 2908 1659 1416 1327 1085 958 845 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 20 40 60 80 100 120 % d e t ra n s m it a n c ia cm -1 Híbrido al 25% 3300 2942 2908 1085 1659 845 1416 1327 958 Número de onda (cm-1) 117 Se observó una señal en 3300 cm-1, la que se relacionó con los estiramientos del enlace O-H de los grupos hidroxilo del polímero. Las señales que se ubican en (2942 y 2908) cm-1 corresponden a los estiramientos del grupo metileno (–CH2) del polímero. La señal en 1659 cm-1 pertenece a moléculas de agua adsorbidas en los poros cerrados del biovidrio. La señal en 1416 cm-1 se relaciona al estiramiento del enlace H2C-CO del polímero. La señal en 1327 cm -1 corresponde al estiramiento del enlace HC-OH. La señal observada en 1085 cm-1 se debe al estiramiento del enlace C-O del polímero. La señal en 958 cm-1 pertenece al estiramiento del enlace Si-O-Ca, lo que confirma una adición química de calcio a la red de silicio. La señal en 845 cm-1 corresponde a los estiramientos del enlace C-C. La figura 6.29 presenta el espectro de infrarrojo obtenido por FTIR del andamio electrohilado de PVA/biovidrio al 30 % (70 % PVA y 30 % biovidrio), en la figura se identifican las principales señales. Figura 6.29. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR del andamio electrohilado de PVA/ biovidrio al 30 %. Caracterización de las principales bandas. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 20 40 60 80 100 120 % d e t ra n s m it a n c ia cm -1 Híbrido al 30% 3272 2938 2913 1416 825 955 1031 1080 1655 1327 Número de onda (cm-1) 118 Tabla 6.11. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio híbrido PVA/biovidrio al 30 %. Muestra Principales señales observadas (cm -1 ) O-H -CH2 O-H H2C- CO HC-OH C-O Si-O-Si (asimétrico) Si-O-Ca C-C Híbrido al 30% 3272 2938 Y 2913 1655 1416 1327 1080 1031 955 825 El espectro de FTIR del híbrido al 30 % (70 % PVA y 30 % biovidrio), se observa que hay un corrimiento del máximo de la señal que antes se observaba en 3300 cm-1 a un máximo que a hora se observa a 3272 cm-1, esta señal se debe a los estiramientos del enlace O-H de los grupos hidroxilo del polímero. Las señales en (2938 y 2913) cm-1 se asocian a los estiramientos del grupo metileno (–CH2). La señal en 1655 cm-1 se debe a moléculas de agua adsorbidas en los poros cerrados del biovidrio. La señal en 1416 cm-1 corresponde al estiramiento del enlace H2C-CO. La señal en 1327 cm -1 pertenece al estiramiento del enlaceHC- OH. La señal observada en 1080 cm-1 corresponde al estiramiento del enlace C-O. En el espectro aparece una nueva señal en 1031 cm-1, la cual corresponde al estiramiento asimétrico de los enlaces Si-O-Si del biovidrio, se infiere que esta señal presenta una mayor intensidad debido al aumento del porcentaje de biovidrio en el andamio. La señal en 957 cm-1 corresponde al estiramiento del enlace Si-O-Ca, esto confirma la adición química de calcio a la red de silicio. La señal en 825 cm-1 corresponde a los estiramientos del enlace C-C. 6.4.4. Difracción de Rayos-X (DRX). En la figura 6.30 se muestra los patrones de difracción de rayos-X para los andamios de PVA/biovidrio, esto se llevó a cabo con el fin de conocer el efecto de la adición de biovidrio en la estructura del polímero. 119 Figura 6.30. Patrones de difracción de rayos-X obtenidos por el método de polvos para los andamios híbridos electrohilados de PVA/58%SiO2-33%CaO-9%P2O5, análisis realizado para los andamios de PVA/biovidrio al 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % y 30 %. En la figura 6.30, el patrón de difracción del híbrido al 5 % (95 % PVA y 5 % biovidrio) muestró una señal alrededor de 2ϴ= 20°, esta señal corresponde al plano (101) del polímero de PVA, el cual es semicristalino y se encontró en mayor cantidad en comparación con las demás composiciones. La señal que se observa en el híbrido al 5 % va disminuyendo al aumentar la concentración de biovidrio hasta el híbrido al 30 %, este resultado indica que la cristalinidad disminuye, debido a que las nanopartículas de biovidrio interrumpen la cristalinidad del PVA. Otra justificación que se le dio a la disminución de la cristalinidad, es una reacción entre los grupos hidroxilo del polímero y las especies de alcóxidos de silicio, que se generan en la hidrólisis de TEOS. La estructura amorfa de los andamos híbridos de PVA/biovidrio, es una característica que se busca en la regeneración de tejidos, debido a que promueve la proliferación celular, al tener una mayor liberación de iones comparado con una estructura cristalina. 5 % 15 % 10 % 20 % 25 % 30 % 120 6.4.5. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). A continuación se presenta la figura 6.31, en la cual se realizó un comparativo entre los análisis DSC de los andamios híbridos de PVA/biovidrio. El comparativo que se presenta en esta figura, se realizó con el objetivo de visualizar los cambios ocurridos en los procesos endotérmicos debido al aumento de biovidrio en los andamios. Figura 6.31. Comparación de los análisis DSC del andamio de PVA y los andamios de PVA/biovidrio. a) andamio de PVA, b) andamio de PVA/biovidrio 5 %, c) andamio de PVA/biovidrio 10 %, d) andamio de PVA/biovidrio 15 %, e) andamio de PVA/biovidrio 20 %, f) andamio de PVA/biovidrio 25 %, g) andamio de PVA/biovidrio 30 %. En la figura 6.31, el proceso endotérmico debido a la evaporación de gua y etanol aumentó su intervalo de temperatura, este incremento de temperatura está en función del aumento del porcentaje de biovidrio en el andamio, a mayor porcentaje de biovidrio, el intervalo de temperatura aumentó. Se observó un desplazamiento de la temperatura de fusión del polímero hacia temperaturas mayores, esto se Proceso endotérmico debido a la evaporación de agua, etanol y reactivos sin reaccionar a e d c b f g Temperatura (°C) E n d o té rm ic o 121 debió al aumento de la cantidad de biovidrio en el andamio, a mayor cantidad de biovidrio aumentó la temperatura de fusión del polímero. Por lo anterior, se infiere que el biovidrio proporcionó una mayor resistencia a la degradación térmica del polímero de PVA, sin embargo, este efecto se comenzó a percibirse después del andamio de PVA/biovidrio al 5 % y fue aumentando hasta el andamio PVA/biovidrio 30 %. Para corroborar la resistencia a la degradación térmica, se procedió con el análisis TGA de los andamios. En la tabla 6.12 se presentan los intervalos de temperatura a los cuales se producen los procesos endotérmicos observados en la figura 6.31, así como el proceso y el nombre de la muestra a que corresponden. Tabla 6.12. Intervalos de temperatura para los procesos endotérmicos de los andamios de PVA/biovidrio. Nombre de la muestra Evaporación de agua y etanol (°C) Fusión del PVA (°C) Híbrido al 5 % (22.29 – 101.05) (178.54 – 228.40) Híbrido al 10 % (20.36 – 120.26) (158.36 – 211.90) Híbrido al 15 % (20.39 – 104.86) (212.52 – 281.76) Híbrido al 20 % (20.70 – 120.11) (225.55 – 280.81) Híbrido al 25 % (22.61 – 133.76) (217.50 – 280.37) Híbrido al 30 % (22.76 – 136.25) (221.10 – 277.63) Los análisis DSC de cada andamio de PVA/biovidrio se presenta en el apéndice, cada análisis DSC es presentado con su respectivas temperaturas en las cuales se dan los procesos endotérmicos que se presentan en esta sección. 6.4.6. Análisis Termogravimétrico (TGA). A continuación, se presentan los análisis termogravimétricos de los andamios electrohilados de PVA/biovidrio a los diferentes porcentajes. El análisis TGA de los andamios de PVA/biovidrio se llevó a cabo desde una temperatura ambiente (≈25°C) hasta 600 °C, en atmósfera de nitrógeno, con una rampa de calentamiento de 10 °C/min. 122 P e s o ( % ) En la figura 6.32 se presenta un comparativo entre los análisis TGA del andamio de PVA, el andamio de PVA/biovidrio al 5 % y al 10 %. La comparación se realizó, con el fin de obtener un mayor detalle la pérdida de peso en función de la temperatura, el incremento de la resistencia a la degradación térmica de los andamios de PVA/biovidrio, y la conservación o ausencia de los procesos en los que se produce la pérdida de peso. Figura 6.32. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA, el andamio de PVA/biovidrio al 5 % y al 10 %. En el comparativo de la figura 6.32, se observaron tres intervalos de temperatura en los cuales se produce una pérdida de peso. La primera pérdida de peso es causada por la evaporación de agua y etanol, la segunda pérdida se asoció a una primera etapa de degradación del polímero, por último, la tercera pérdida se asoció a la combustión del polímero. En la figura 6.32 se observó que el andamio de PVA/biovidrio al 5 % muestró una degradación térmica parecida a la degradación del andamio de PVA, por lo cual, 0 20 40 60 80 100 120 W e ig h t (% ) 0 100 200 300 400 500 600 Temperature (°C) Universal V4.5A TA Instruments PVA Híbrido al 5 % Híbrido al 10 % Primera pérdida de peso. Segunda pérdida de peso. Tercera pérdida de peso. Temperatura (°C) 123 P e s o ( % ) la cantidad de biovidrio en este andamio no modificó sustancialmente la resistencia a la degradación térmica. El andamio de PVA/biovidrio al 10 % mostró una mayor resistencia a la degradación térmica, tanto en la primera como en la segunda etapa de descomposición del polímero, como se puede observar en la figura 6.32. Como se observó en el análisis DSC de los andamios de PVA/biovidrio al 5% y 10 %, la resistencia a la degradación térmica comenzó a partir del andamio de PVA/biovidrio al 10 %. En la figura 6.33 se presenta un comparativo entre los análisis TGA del andamio de PVA y el andamio de PVA/biovidrio al 15 %, este análisis se realizó por separado, debido a que presentó diferencias con los análisis de los demás andamios de PVA/biovidrio. Figura 6.33. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA y del andamio de PVA/biovidrio al 15 %. PVA Híbrido al 15 % Primera pérdida de peso. Segunda pérdida de peso. Tercera pérdida de peso. Temperatura (°C) 124 El análisis TGA del andamio de PVA/biovidrio al 15 % mostró una pérdida constante y gradual de peso, esto es causado por la evaporación de agua y etanol, así comoa la degradación del polímero. Una segunda pérdida de peso se le atribuyó a la degradación del polímero. En este punto, se hace la observación de que la primera etapa de degradación del polímero se efectúa en dos etapas, la tercera pérdida de peso inicia en una temperatura se asocia con la combustión del polímero. Como se muestra en la figura 6.33, la primera etapa de degradación del polímero de PVA en el andamio de PVA/biovidrio al 15% se dio en dos etapas, como se observa en la figura, la diferencia en la degradación de ambos andamios comenzó a darse a una temperatura de 254.19 °C. Se hace énfasis que a una temperatura de 275.15 °C el andamio de PVA conservó 42.04 % de su peso, el andamio de PVA/biovidrio al 15 % conservó un 73.52 % de su peso, esto indica que el biovidrio le proporcionó al polímero una resistencia a la degradación térmica en su primera etapa. La tercera etapa de degradación del polímero corresponde a su combustión, este proceso comienzó en aproximadamente 406 °C, sin embargo, se destaca que a esta temperatura el andamio de PVA conservó un peso de 26.67 % mientras que el andamio de PVA/biovidrio al 15 % conservó un 42.25 %, esto indica que el biovidrio le proporcionó al polímero una resistencia a la degradación térmica en su segunda etapa de degradación térmica (combustión). Los análisis TGA los andamios de PVA/biovidrio al 5 %, 10 % y 15 % se presentan en el apéndice, cada análisis TGA es presentado con sus respectivas temperaturas en las cuales se dieron las pérdidas de peso. El análisis TGA de los andamios de PVA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 % se realizó de manera conjunta debido a que presentaron prácticamente el mismo 125 P e s o ( % ) comportamiento de pérdida de peso en función de la temperatura, sin embargo, su comportamiento difiere con los andamios de PVA/biovidrio de menor porcentaje. En la figura 6.34 se presentan los análisis TGA de los andamios de PVA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 %, solo se destacan las regiones de pérdida de peso para los andamios de PVA/biovidrio, se excluyen las regiones del andamio de PVA, el termograma del andamio de PVA solo se presentó para diferenciar los cambios que se produjeron al agregar cierto porcentaje de biovidrio. Figura 6.34. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA y de los andamios de PVA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 %. Los análisis TGA de los andamios de PVA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 % presentarón tres regiones de pérdida de peso. La primera pérdida de peso se da en un intervalo de (33.68 – 76.34) °C, en este proceso se perdió aproximadamente 5.11 % de la masa en los andamios, esta pérdida se debe a la evaporación de agua y metanol. La segunda pérdida ocurrió en un intervalo de (134.78 - 181.14) °C, en este proceso se perdió aproximadamente 6.53 % del peso del andamio y se propone que es debida a la evaporación de TEOS sin reaccionar. La tercera pérdida observada en el TGA está asoció a la primera etapa de degradación 76.34°C 134.78°C 181.14°C 251.65°C 320.25°C 33.68°C 0 20 40 60 80 100 120 W e ig h t (% ) 0 100 200 300 400 500 600 Temperature (°C) Universal V4.5A TA Instruments PVA Híbrido al 20 % Híbrido al 25 % Híbrido al 30 % Primera pérdida de peso. Segunda pérdida de peso. Tercera pérdida de peso. Temperatura (°C) 126 térmica del polímero de PVA, se observó en el intervalo de (251.65 - 302.25) °C y mostró una pérdida del 47.66 % de masa de PVA. La segunda etapa de degradación térmica del polímero de PVA, dejó de observarse en el análisis TGA para estos andamios de PVA/biovidrio. Se propone que la cantidad de biovidrio que se adicionó en este andamio, desplazó la primera y segunda degradación del polímero de PVA hacia temperaturas mayores, proporcionándole una mayor resistencia a la degradación térmica. Después de los 302.25 °C se observó una pérdida gradual y constante de peso, esta pérdida se asoció a dos procesos que ocurren simultáneamente; uno de ellos es la evaporación de agua en los poros cerrados del biovidrio, el otro proceso se debe a la paulatina degradación térmica del polímero. Los análisis TGA de cada andamio de PVA/biovidrio se presenta en el apéndice, cada análisis TGA es presentado con su respectivas temperaturas en las cuales se producen las pérdidas de peso y el porcentaje de peso que se pierde. 6.5. Andamios híbridos O/I electrohilados de PVA estabilizado con GA/biovidrio (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. 6.5.1. Microscopia electrónica de barrido (SEM). En la figura 6.35 se presentan las imágenes obtenidas por SEM de los andamios de PVA/biovidrio después de la estabilización con GA, este análisis se realizó para determinar si el tratamiento de las fibras con GA modifica el diámetro y morfología de las fibras. Las figuras 6.35 a), b) y c) se presentan con un aumento de 25 000 veces, sin embargo, las figuras 6.35 d), e) y f) se presentan con un aumento de 10 000 veces, la diferencia de los aumentos se debe a que los diámetros de las fibras 127 presentan un tamaño mayor y para lograr visualizarlo se requiere de un aumento menor. Figura 6.35. Micrográfias tomadas mediante SEM de los andamios híbridos de PVA estabilizados con GA/biovidro. a) híbrido al 5%, b) híbrido al 10%, c) híbrido al 15%, d) híbrido al 20%, e) híbrido al 25% y f) híbrido al 30%. En la figura 6.36 se presentan los histogramas de frecuancias absolutas de los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA/biovidrio a los diferentes porcentajes de concenttración. b) c) a) d) e) f) 128 Figura 6.36. Histogramas de los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA/biovidrio. a) híbrido al 5%, b) híbrido al 10%, c) híbrido al 15%, d) híbrido al 20%, e) híbrido al 25% y f) híbrido al 30%. medidas de muestras micras (um) F re c u e n c ia 0 2 4 6 8 1 0 1 2 5 7 10 8 0.05325 0.08875 0.12425 0.15975 medidas de muestras micras (um) F re c u e n c ia 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 4 10 11 5 0.0695 0.0950 0.1205 0.1460 0.1715 0.1970 0.2225 medidas de muestras micras (um) F re c u e n c ia 0 5 1 0 1 5 1 12 14 3 0.052 0.072 0.092 0.112 0.132 0.152 0.172 medidas de muestras micras (um) F re c u e n c ia 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 2 9 11 8 0.20925 0.30475 0.40025 0.49575 medidas de muestras micras (um) F re c u e n c ia 0 2 4 6 8 1 0 1 2 5 9 9 7 0.38475 0.47525 0.56575 0.65625 medidas de muestras micras (um) F re c u e n c ia 0 5 1 0 1 5 5 13 8 4 0.44625 0.79175 1.13725 1.48275 c) f) d) e) a) b) Híbrido al 10% Híbrido al 15% Híbrido al 5% Híbrido al 5% Híbrido al 20% Híbrido al 25% Híbrido al 30% Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) Diámetro de fibra (μm) 129 A continuación, se presenta la tabla 6.13 en la que se indican el diámetro de las fibras de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio a las diferentes concentraciones. Tabla 6.13. Diámetros de las fibras de los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA /biovidrio. Muestra Diámetro de las fibras (μm) Híbrido al 5 % 0.111 ± 0.003 Híbrido al 10 % 0.148 ± 0.001 Híbrido al 15 % 0.115 ± 0.003 Híbrido al 20 % 0.369 ± 0.007 Híbrido al 25 % 0.527 ± 0.008 Híbrido al 30 % 0.938 ± 0.031 En la figura 6.35, el diámetro y morfología de las fibras fue diferente para cada híbrido, el menor diámetro de fibra lo muestran los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5 % y al 15 %, el mayor diámetro de fibra lo muestra el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 30 %. Se observó que las fibras de los andamios presentan irregularidades, como la formación de curvaturas. En cuanto a los diámetros de las fibras, no presentaron una forma tubularrecta y homogénea, por el contrario, presentaron aumentos y disminuciones respecto a sus diámetros a lo largo de las fibras. Los diámetros de las fibras para el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5% se encontraron en un intervalo de (0.887 - 0.142) μm. Los diámetros para las fibras del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10% obtuvieron en un intervalo de (0.120 - 0.171) μm. Los diámetros para las fibras del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15% se encontraron en el intervalo de (0.092 - 0.132) μm. Los diámetros de las fibras para el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 % obtuvieron en el intervalo de (0.304 - 0.400) nm. Los diámetros de las fibras para el andamio híbrido al 25 % obtuvieron en el intervalo de (0.475 - 0.565) nm. Por último, los diámetros de las fibras del andamio de PVA estabilizado con 130 GA/biovidrio al 30 % se encontraron en el intervalo de que comprende (0.791 – 1.137) nm. Se observó una anomalía en el diámetro del andamio al 30 %, debido a que mostró un aumento de diámetro, alto con respecto a los andamios al 5 %, 10 %, 15 % y 20 %, la hipótesis que se tiene es que las fibras adsorbieron moléculas de agua debido a que, es un material hidrofílico tanto el polímero como el biovidrio, como se observa en la tabla 6.13, el aumento del diámetro de fibra está en función del porcentaje de biovidrio, a mayor cantidad de biovidrio aumenta el diámetro de fibra. Se infiere que las fibras de los andamios de PVA/biovidrio aumentaron su tamaño antes de la estabilización con GA. 6.5.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). Los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA/biovidrio se caracterizaron mediante espectroscopia FTIR. En la figura 6.37 se presentan los espectros de los andamios de PVA/biovidrio después de la estabilización con GA, en la figura se indican las principales señales. 131 Figura 6.37. Espectros de infrarrojo obtenido por FTIR de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. a) híbrido al 5 %, b) híbrido al 10 %, c) híbrido al 15 %, d) híbrido al 20 %, e híbrido al 25 % y f) híbrido al 30 %. En la tabla 6.14 se presentan las principales señales observadas en los espectros FTIR de la figura 6.37, las señales se asociaron con el grupo funcional correspondiente. Tabla 6.14. Principales bandas observadas en los espectros de FTIR de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % y 30 %. Grupo funcional Principales señales observadas (cm -1 ) O-H -CH2 -OH H2C-CO HC-OH C-O Si-O-Si C-C Señal 3300 2942 Y 2904 1657 1422 1327 1084 983 840 Se observó una señal en común para los andamios en 3300 cm-1, esta señal corresponde a los estiramientos del enlace O-H de los grupos hidroxilo del polímero. Las bandas que se ubican en (2942 y 2904) cm-1 corresponden a los estiramientos del grupo metileno (–CH2) del polímero. a b c d e f 132 La banda en 1657 cm-1 corresponde a moléculas de agua alojadas en los poros del biovidrio, se hace la observación de que esta señal solo se presentó en los andamios al 20 %, 25 % y 30 %, se infiere que al aumentar el biovidrio respecto al polímero, aumentó la cantidad de agua alojada en el andamio. Esto confirmó lo inferido en la sección 6.5.1, en relación al aumento del diámetro de fibra debido a la adsorción del agua, la adsorción de agua aumenta al aumentar el porcentaje de biovidrio. La señal en 1422 cm-1 corresponde al estiramiento del enlace H2C-CO del polímero. La señal en 1327 cm-1 está relacionada a los estiramientos del enlace HC-OH, la señal observada en 1084 cm-1 corresponde al estiramiento del enlace C-O del polímero, la señal en 983 cm-1 corresponden al estiramiento asimétrico de los enlaces Si-O-Si, por último, la señal en 845 cm-1 corresponde a los estiramientos del enlace C-C. 6.5.3. Difracción de Rayos-X (DRX). En la figura 6.38 se muestran los patrones de difracción de rayos-X, para los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. El patrón de difracción del híbrido al 5 % mostró una señal alrededor de 2ϴ= 20°, esta señal corresponde al plano (1 0 1) del polímero de PVA, el cual es semicristalino y se encuentra en mayor cantidad en comparación con las demás composiciones. 133 Figura 6.38. Patrones de difracción de rayos-X obtenidos por el método de polvos para los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio, análisis realizado para los andamios al 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % y 30 %. La señal que se observó en el andamio de PVA entrecruzado con GA/biovidrio al 5 % va disminuyendo al aumentar el porcentaje de biovidrio hasta el andamio de PVA entrecruzado con GA/biovidrio al 30 %, este resultado indica que la cristalinidad es influenciada por el contenido de biovidrio en el polímero de PVA. Se infiere que la disminución de la cristalinidad del PVA es debido a que las nanopartículas de biovidrio interrumpen la cristalinidad del PVA, este efecto también es observado para los andamios de PVA/biovidrio de la sección 6.4.4. 5 % 15 % 10 % 25 % 20 % 30 % 134 6.5.4. Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) de los andamios electrohilados de PVA estabilizado con GA/biovidrio. A continuación se presenta la figura 6.39, en la cual se realizó un comparativo entre los análisis DSC de los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA/biovidrio. El comparativo que se presenta en esta figura, se realizó con el objetivo de visualizar los cambios ocurridos en los procesos endotérmicos debido al aumento de biovidrio en los andamios. Las condiciones en las que se realizó el análisis DSC de los andamios, comenzaron desde una temperatura ambiente (≈20 °C) hasta 300 °C, en atmósfera de nitrógeno y con una rampa de calentamiento de 10 °C/min. Figura 6.39. Comparación de los análisis DSC de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. a) híbrido al 5 % , b) híbrido al 10 %, c) híbrido al 15 %, d) híbrido al 20 %, e) híbrido al 25 %, f) híbrido al 30 %. f e d b a c Proceso endotérmico debido a la evaporación de agua, etanol y reactivos sin reaccionar Temperatura (°C) E n d o té rm ic o 135 En la tabla 6.15 se presentan los intervalos de temperatura a los cuales se produjeron los procesos endotérmicos observados en la figura 6.39, así como el proceso y el nombre de la muestra a que corresponden. Tabla 6.15. Intervalos de temperatura para los procesos endotérmicos de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. Nombre de la muestra Evaporación de agua y etanol (°C) Proceso generado por la estabilización con GA (°C) Fusión del PVA (°C) Híbrido al 5 % (21.16 – 110.14) -- (182.87 – 227.62) Híbrido al 10 % (21.43 – 139.98) (139.98 – 158.09) (225.49 – 279.57) Híbrido al 15 % (20.36 – 112.54) (112.54 – 127.46) (157.83 – 212.70) Híbrido al 20 % (20.90 – 144.77) (144.77 – 178.34 -- Híbrido al 25 % (21.43 – 145.04) (145.04 – 172.74) (229.22 – 273.98) Híbrido al 30 % (21.97 – 161.08) (161.08 – 180.13) -- El comparativo de los análisis DSC de los andamios mostró un primer proceso endotérmico debido a la evaporación de agua, etanol y reactivos sin reaccionar como el TEOS y el TEP, al aumentar la cantidad de biovidrio, el intervalo de temperatura a la cual se produce el primer proceso endotérmico, aumentó hacia temperaturas mayores, esta tendencia también se observó en los andamios de PVA/biovidrio sin estabilizar (sección 6.4.5). Se infiere que este aumento en el intervalo de temperatura en el proceso endotérmico de evaporación, se debe a una mayor cantidad de disolventes alojados en los poros cerrados del biovidrio, por lo que se requiere de una mayor temperatura para expulsar los disolventes en los poros cerrados. La degradación térmica del PVA seda por diversos mecanismos que se dan de forma secuencial o simultánea, sin embargo, se halló que los procesos endotérmicos del polímero de PVA son afectados por el biovidrio y la estabilización con GA. En la figura 6.39 se observó la aparición de un proceso endotérmico después del proceso endotérmico correspondiente a la evaporación, se infiere que corresponde a un mecanismo de degradación del polímero, generado por la estabilización con GA. 136 P e s o ( % ) Los procesos endotérmicos correspondientes a la fusión del polímero se desplazan a temperaturas mayores, se infiere que este desplazamiento es debido al aumento de la cantidad de biovidrio en el andamio, a mayor cantidad de biovidrio aumenta la temperatura de fusión del polímero. Los análisis DSC de cada andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio, se presentan en el apéndice, cada análisis DSC es presentado con sus respectivas temperaturas en las cuales se dan los procesos endotérmicos. 6.5.5. Análisis Termogravimétrico (TGA). Se presentan los análisis TGA de los andamios electrohilados de PVA estabilizado con GA/biovidrio. Los análisis se llevaron a cabo desde una temperatura ambiente (≈25°C) hasta 600 °C, en atmósfera de nitrógeno y con una rampa de calentamiento de 10 °C/min. En la figura 6.40 se muestra el análisis TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5 %, se destacaron las principales regiones en las que ocurrió la pérdida de peso. Figura 6.40. Termograma TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5 %. Temperatura (°C) 137 P e s o ( % ) En el análisis TGA del andamio se observaron tres principales pérdidas de peso, la primera pérdida se dio en un intervalo de temperatura de (32.08 - 62.57) °C, en este intervalo se produjo una pérdida del 3.42 % del peso del andamio, está pérdida es atribuida a la evaporación de agua y etanol adsorbidas físicamente. La segunda pérdida se dio en un intervalo de (180.85 - 289.01) °C, se pierde 63.99 % del peso del andamio y está asociada con la primera etapa de descomposición térmica del polímero. La tercera pérdida que se observó, se asocia a la combustión del polímero y comienzó a darse a una temperatura de 401.05 °C. En la figura 6.41 se muestra el análisis TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10 %, se destacan las principales regiones en las que ocurrió la pérdida de peso. Figura 6.41. Termograma TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10 %. En el análisis TGA del andamio se presentaron tres pérdidas de peso, la primera pérdida se dio en un intervalo de temperatura de (32.93 - 65.13) °C y se asoció con la evaporación de agua y etanol. La segunda pérdida se debe a la primera etapa de descomposición del polímero, se dio en un intervalo de (203.37- 308.18) Temperatura (°C) 138 P e s o ( % ) °C y se pierde un 48.20 % del peso del andamio. Después de los 308.18 °C se produce una pérdida de peso gradual hasta los 600 °C, la pérdida de peso que se dio desde los 308.18 °C hasta los 600 °C, es de 31.22 %. Se hace la observación de que no es perceptible la segunda etapa de descomposición, la cual se asocia con la combustión del polímero. En la figura 6.42 se muestra el análisis TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15 %, se destacan las principales regiones en las que ocurrió la pérdida de peso. Figura 6.42. Termograma TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15 %. En el análisis TGA del andamio se observaron tres principales regiones de pérdida de peso, la primera pérdida de peso se dio en un intervalo de temperatura de (32.99 - 63.0) °C, se perdió un 3.7 % del eso del andamio y se asocia con la evaporación de agua y etanol. La segunda pérdida se dio en un intervalo de (192.58 - 317.71) °C, se perdió un 58.54 % del peso del andamio y se asocia con la primera etapa de degradación del polímero. La tercera pérdida comienzó a darse a una temperatura de 408.52 °C y se asocia con la combustión del polímero Temperatura (°C) 139 P e s o ( % ) En la figura 6.43 se presenta de manera conjunta los termogramas de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 %, se muestran de manera conjunta debido a que presentan prácticamente el mismo perfil termogravimétrico. Figura 6.43. Termogramas TGA de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 %. En el análisis de los TGA de los andamios se presentaron dos pérdidas de peso, la primera pérdida se da en un intervalo de temperatura de (32.38 - 70.08) °C y se asocia con la evaporación de agua y etanol. La segunda pérdida se debe a la primera etapa de descomposición del polímero, se dio en un intervalo de (196.71 - 296.00) °C y se perdió un 37.97 % del peso del andamio. Después de los 296 °C se produjo una pérdida de peso gradual hasta los 600 °C, se observó que no es perceptible la segunda etapa de descomposición del polímero, la cual se asocia con su combustión. 32.38°C 78.08°C 196.71°C 296.00°C 0 20 40 60 80 100 120 W e ig h t (% ) 0 100 200 300 400 500 600 Temperature (°C) Universal V4.5A TA Instruments Híbrido al 20 % Híbrido al 25 % Híbrido al 30 % Temperatura (°C) 140 6.6. Pruebas biológicas. 6.6.1. Cultivos celulares de cardiomiocitos ventriculares de corazón de pollo sobre los andamios electrohilados de PVA estabilizado con GA y PVA estabilizado con GA/biovidrio. A continuación, se presentan imágenes representativas del comportamiento de los cardiomiocitos ventriculares de corazón de pollo sobre el andamio de PVA y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. Figura 6.44. Imágenes reveladas por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamios de PVA estabilizado y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. a) y a’) células en el andamio de PVA, b y b’) células en el andamio al 5%, c y c’) células en el andamio al 10%, d y d’) células en el andamio al 15 %, e y e’) células en el andamio al 20 % y f y f’) células en el andamio al 25 %. Las figuras a), b), c), d), e) y f) muestran las células de cardiomiocitos en reposo. Las figuras a’), b’), c’), d’), e’) y f’) muestran las células de cardiomiocitos en contracción. c b a c’ ) b’ ) a’ ) f e d e’ ) f d’ ) 141 Las pruebas biológicas se realizaron sobre los andamios de PVA estabilizado con GA y PVA estabilizado con GA/biovidrio, los andamios que se utilizaron para las pruebas biológicas fueron del 5 %, 10 %, 15 %, 20 % y 25 %, esto se realizó con la finalidad de analizar el comportamiento celular en función del aumento del porcentaje de biovidrio en cada andamio. Los andamios de PVA estabilizado con GA (figura 6.44 a), PVA estabilizado con GA /biovidrio al 5% (figura6.44 b) y PVA estabilizado con GA /biovidrio al 10 % (figura 6.44 c), mostraron que las células forman principalmente aglomerados con actividad contráctil independiente entre ellos. La formación de aglomerados dificulta la propagación del frente de onda a través de las células que se encuentran más lejanas, además, los aglomerados poseen actividad independiente e intermitente, por lo que no presentan una actividad homogénea, sincrónica y periódica. En la figura 6.44 d) se observó la formación de aglomerados y monocapa de células sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15 %, estas monocapa comienzan a conectar los agregados de células que aún se alcanzan a observar, sin embargo, la conectividad de las células no es lo suficiente para mejorar la propagación de la actividad contráctil a través de todo el andamio. Los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 % (figura 6.44 e) y PVA estabilizado conGA/biovidrio al 25 % (figura 6.44 f) presentaron la formación de capas de células altamente conectas y sin la formación de aglomerados, debido a esto, la actividad contráctil de las células se propaga a lo largo del andamio, esto facilita que las células presentan una actividad homogénea, sincrónica y periódica. 142 6.6.2. Comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. El comportamiento contráctil de las células sobre los andamios se realizó para las imágenes de la sección 6.6.1 (sección anterior), para el análisis de las regiones de interés, se delimitó con un área circular las imágenes de las células que mostraron contracción. En cada andamio las células de cardiomiocitos mostraron un comportamiento diferente, por lo cual, se analizarán cada uno por separado. La secuencia de imágenes que demostraron el comportamiento contráctil de las células (está relacionado con el cambio de intensidad de fluorescencia), fueron analizadas con el programa ImageJ v 1.6.0_20 (National Institute of Healt). Las áreas de interés se seleccionaron con ayuda de la herramienta Time Series Analizar V3.2, la selección se realizó de manera circular tratando de seguir la propagación de la contracción. Por último, la matriz de datos generada, se analizó con el programa OriginPro 9.0 32Bit y con el cual se obtuvieron las gráficas del comportamiento contráctil de las áreas de interés. Las gráficas que resultan de del programa OriginPro 9.0 32Bit, representan los cambios de fluorescencia en función del tiempo de toda la serie de imágenes superpuestas. Estas gráficas se asociaron con la actividad contráctil de la célula. 6.6.2.1. Comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA. En la figura 6.45 a), se muestran las áreas de interés seleccionadas sobre el andamio de PVA estabilizado con GA. En el análisis se observó la formación de aglomerados de células, sin embargo, la mayoría de los aglomerados no mostraron un cambio de intensidad de fluorescencia. En la figura 6.45 b) se presentan registros representativos de la actividad de [Ca2+], obtenidos del cultivo presentado en la figura 6.45 a). 143 Figura 6.45. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]. El área de interés 1 mostró actividad intensa en un intervalo de (0 – 120) s, después de este intervalo se presentó un intervalo de inactividad de (120 – 160) s. Las áreas de interés 2, 3, 4 y 5 no mostraron actividad en todo el intervalo de tiempo que duró el análisis, la inactividad que se presentó en el análisis indica que las células no desempeñan su actividad contráctil. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Tiempo (s) área 5 área 4 área 3 área 2 área 1 1 2 3 4 5 b) a) 144 6.6.2.2. Comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5%. En la figura 6.46 a) se presentan las áreas de interés que se seleccionaron en el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5 %. En la figura 6.46 b) se presentan registros representativos de la actividad de [Ca2+], obtenidos del cultivo presentado en la figura 6.46 a). Figura 6.46. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 5 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Tiempo (s) área 5 área 4 área 3 área 2 área 1 5 4 3 2 1 a) b) 145 Las áreas de interés 1, 2 y 4, no mostraron actividad en los registros de la actividad de [Ca2+] durante los 160 s, la inactividad nos indica que las células no realizan su función contráctil. El área de interés 3, muestró inactividad en un intervalo de (0 – 70) s, después de los 70 s muestra actividad hasta el término de análisis. El área de interés 5 mostró dos intervalos de inactividad y un intervalo de actividad, el primer intervalo de inactividad se dio en (0 - 40) s, el segundo intervalo de inactividad se dio en (140 – 160) s. La actividad contráctil de la célula se dio en el intervalo de (40 – 140) s. 6.6.2.3. Comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10%. En la figura 6.47 a) se muestran las áreas de interés que se seleccionaron sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10 %, estas áreas de interés se seleccionaron debido a que mostraron un cambio de fluorescencia, que se relaciona con la actividad contráctil de las células de corazón de pollo. En la figura 6.47 b) se presentan registros representativos de la actividad de [Ca2+], obtenidos del cultivo presentado en la figura 6.47 a). 146 Figura 6.47. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabiliazdo con GA /biovidrio al 10 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]. El área 1 presentó un patrón de actividad intermitente, esto es, muestra dos intervalos de actividad y dos intervalos de inactividad. El primer intervalo de actividad se dio en (0 - 40) s y el segundo se dio en el intervalo de (70 - 150) s, el primer intervalo de inactividad se dio (40 – 70) s y el segundo en (150 -160) s. El área 2 mostró un patrón de actividad intermitente, mostró actividad en los intervalos de (0 - 10) s, (20 - 100) s y (120 - 160) s. Los intervalos de inactividad se dieron en (10 – 20) s y (100 – 120) s. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Tiempo (s) área 5 área 4 área 3 área 2 área 1 5 3 4 2 1 a) b) 147 Las áreas 3 y 4 mostraron una actividad mínima en la variación de [Ca2+], lo que indicó que las células no realizan se función contráctil. Por último, el área 5 mostró dos intervalos de actividad, el primero se dio en (20 - 40) s y el segundo intervalo se dio en (130 - 160) s, fuera de estos intervalos el análisis mostró inactividad en la variación de [Ca2+], lo que indica que las células no realizan su función de contracción. 6.6.2.4. Comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15 %. En la figura 6.48 a) se presentan las áreas de interés que se seleccionaron sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15 %. En el área 1 se produce el inicio de la contracción de las células, las áreas 2, 3, 4 y 5 se colocaron de tal mera que, siguieran lo más posible la propagación de la onda. En la figura 6.48 b) se presentan registros representativos de la actividad de Ca2+, obtenidos del cultivo presentado en la figura 6.48 a). El análisis de la actividad de [Ca2+] de las áreas 1, 2, 3, 4 y 5 mostró una actividad homogénea y periódica. Se hace destaca que las células comienzan a formar principalmente capas de células, de esta manera la actividad de las células comienza a mejorar y propagarse a través de una seccióndel andamio, como se muestra en la figura 6.48 b). Por lo anterior, la actividad contráctil mejora en comparación con los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10 %, 5 % y al andamio de PVA estabilizados con GA. 148 Figura 6.48. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 15 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]. 6.6.2.5. Comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 %. En la figura 6.49 a) se presentan las áreas de interés que se seleccionaron sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 %. Las áreas de interés que se seleccionaron sobre el andamio para su análisis se hicieron de tal manera que siguieran la onda de propagación, en este caso la onda se propago diagonalmente. 0 2 4 6 8 10 Tiempo (s) área 5 área 4 área 3 área 2 área 1 5 4 3 2 1 a) b) 149 La figura 6.49 b) muestra los patrones de actividad obtenidos mediante fluorescencia de [Ca2+] para las áreas de interés seleccionadas en la figura 6.49 a), la figura 6.49 c) muestra una amplificación de los patrones de actividad de la figura 6.49 b), esto con el fin de obtener una mejor observación de la lineación o desfase de los picos de actividad. Figura 6.49. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 20 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ, b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+] y c) muestra la alineación o desfase de los máximos de contracción. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Tiempo (s) área 5 área 4 área 3 área 2 área 1 1 5 4 3 2 a) b) c) 150 En el análisis de la actividad de los cardiomiocitos muestra que las áreas seleccionadas tienen una actividad homogénea, sincrónica y periódica, se destaca que no se observa inactividad en ninguna de las áreas seleccionadas, ni en todo el intervalo de tiempo en que se obtuvo el análisis. En la figura 6.49 c) se presenta una amplificación de la actividad de los cardiomiocitos, como se puede observar, los máximos de las gráficas se encuentran desfasados, esto se debe que la contracción de las células no se produce al mismo tiempo. A continuación, se presenta la secuencia de contracción de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre los andamios al 20 % y 25 %, se presentan específicamente estos andamios debido a que muestran una propagación de onda continua. La figura 6.50 muestra la secuencia de contracción revelada por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular en los cardiomiocitos de pollo en el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 20 %. Figura 6.50. Secuencia de contracción revelada por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular en cardiomiocitos de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20%. a) la región iluminada corresponde a la región de alta concentración de [Ca2+] y que está relacionada con la contracción celular de los cardiomiocitos. b) diagramas de la propagación de onda correspondientes a la figura a). b ) Inicio de la propagación a ) 151 6.6.2.6. Comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25 %. En la figura 6.51 a) se presentan las áreas de interés que se seleccionaron sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25 %. Las áreas de interés que se seleccionaron sobre el andamio para su análisis, se hicieron de tal manera que siguieran la propagación de la onda, en el área 1 se seleccionó el inicio de la contracción Figura 6.51. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25%. a) Áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ, b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+] y c) muestra la alineación o desfase de los máximos de contracción. 0 5 10 15 20 25 30 Tiempo (s) área 5 área 4 área 3 área 2 área 1 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Tiempo (s) 5 4 3 2 1 a) b) c) 152 La figura 6.51 b) presentan los patrones de actividad, obtenidos mediante fluorescencia de [Ca2+], para las áreas de interés seleccionadas en la figura 6.51 a), la figura 6.51 c) muestra una amplificación de los patrones de actividad de la figura 6.51 b), esto con el fin de obtener una mejor observación de la lineación o desfase de los picos de actividad. En la figura 6.51 c) se puede observar que los máximos de contracción se encuentran alineados, esto indica que las células analizadas se contraen al mismo tiempo, aunque el inicio y término de la contracción se encuentren distantes. La figura 6.52 muestra la secuencia de contracción revelada por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular en cardiomiocitos de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25%. La secuencia de contracción muestra el inicio de la actividad y su propagación a lo largo de la monocapa de células formada sobre los andamios. Figura 6.52. Secuencia de contracción revelada por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular en cardiomiocitos de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25%. a) la región iluminada corresponde a la región de alta concentración de [Ca2+] y que está relacionada con la contracción celular de los cardiomiocitos. b) diagramas de la propagación de onda correspondientes a la figura a). b ) a ) Inicio de la propagación 153 El análisis de la actividad de los cardiomiocitos mostró que todas las áreas seleccionadas tienen una actividad homogénea, sincrónica y periódica, se destaca que no se observa inactividad en ninguna de las áreas seleccionadas. Se hace notar que no se realizaron las pruebas biológicas para el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 30 %, debido a que los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25 % y al 30 % presentan propiedades térmicas, espectroscópicas y una estructura amorfa semejantes, por lo que se tiene la hipótesis de que el comportamiento contráctil y de actividad de las células será similar al andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25 %. En la tabla 6.16 se presenta un resumen de la actividad de los cardiomiocitos ventriculares de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. 154 Tabla 6.16. Actividad de los cardiomiocitos ventriculares de corazón de pollo sobre el andamio de PVA y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. Nombre del andamio Comportamiento de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio Actividad contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio PVA PVA/biovidrio 5% PVA/biovidrio 10% PVA/biovidrio 15% PVA/biovidrio 20% PVA/biovidrio 25% 155 7. Conclusiones. Se definieron las condiciones para la obtenciónelectrohilados de PVA, contemplando los parámetros de concentración, diferencia de potencial y distancia inyector-colector. Se obtuvo un biovidrio en el sistema ternario de 58%SiO2-33%CaO-9%P2O5 en % mol, a partir de TEOS, TEP y CaCl2∙2H2O. Se obtuvieron una serie de andamios híbridos de PVA/bividrio a diferentes porcentajes de concentración PVA/biocidrio: 95% PVA - 5 % biovidrio, 90 % PVA - 10 % biovidrio, 85 % PVA - 15 % biovidrio, 80 % PVA - 20 % biovidrio, 75 % PVA - 25% biovidrio y 70 % PVA – 30 % biovidrio. Se estabilizó el andamio de PVA y la serie de andamios (O/I) para mejorar su resistencia a la disolución en agua. Se caracterizaron por (SEM), (TEM), (FTIR), (DRX), (DSC) y (TGA) el andamio de PVA y la serie de andamios (O/I) sin estabilizar y estabilizados con GA. Se realizaron cultivos con células ventriculares de corazón de pollo en los andamios híbridos (O/I) estabilizados con GA, esto para analizar la respuesta biológica y la actividad contráctil en función del aumento del porcentaje de biovidrio en los andamios. Se realizó un perfil de actividad en función del tiempo, de las células ventriculares de corazón de pollo en los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio, esto demostró que los andamios son aptos para propiciar que las células presenten actividad homogénea, sincrónica y periódica. Las células en los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio, presentaron dos tipos de comportamiento; a bajas concentraciones de biovidrio las células formaron aglomerados, estos pueden ser utilizados como marcapasos en estudios de actividad de células cardiacas. El otro comportamiento que se observó fue la 156 formación de capas de células altamente conectadas, que presentan una actividad homogénea, sincrónica y periódica, esto se observó en los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 % y 25 %. Los resultados indican que los aumentos del 5 % en los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio modifican los resultados obtenidos en la actividad y distribución de las células en los andamios. 157 8. Recomendaciones. Analizar el comportamiento de los cardiomiocitos en función de otras composiciones de biovidrio. Investigar el efecto en el comportamiento de las células de cardiomiocitos que se puede presentar al utilizar un polímero con propiedades eléctricas. Generar andamios electrohilados cuyas fibras se encuentren alineadas para investigar el efecto que esto generan en el comportamiento de las células ventriculares de corazón de pollo. A pesar de que se obtuvieron buenos resultados en el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de pollo, se recomienda que se pruebe el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 30%, así como concentraciones mayores, esto con el fin de observar el comportamiento de las células. Medir los ángulos de contacto de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio , esto con la finalidad de relacionar la energía superficial de los andamios con el comportamiento de las células. 158 9. Apéndice. Figura A-1. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 5%. Figura A-2. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 10 %. Temperatura (°C) Temperatura (°C) E n d o té rm ic o E n d o té rm ic o F lu jo d e c a lo r (W /g ) F lu jo d e c a lo r (W /g ) 159 Figura A-3. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 15 %. Figura A-4. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 20 %. Temperatura (°C) Temperatura (°C) E n d o té rm ic o E n d o té rm ic o F lu jo d e c a lo r (W /g ) F lu jo d e c a lo r (W /g ) 160 Figura A-5. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 25 %. Figura A-6. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 30 %. Temperatura (°C) Temperatura (°C) E n d o té rm ic o E n d o té rm ic o F lu jo d e c a lo r (W /g ) F lu jo d e c a lo r (W /g ) 161 P e s o ( % ) P e s o ( % ) Figura A-7. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 5 %. Figura A-8. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 10 %. Temperatura (°C) Temperatura (°C) 162 Temperatura (°C) P e s o ( % ) Figura A-9. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 15 %. Figura A-10. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5 %. 33.57 °C Temperatura (°C) E n d o té rm ic o F lu jo d e c a lo r (W /g ) 163 Figura A-11. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10 %. Figura A-12. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15 %. Temperatura (°C) Temperatura (°C) E n d o té rm ic o E n d o té rm ic o F lu jo d e c a lo r (W /g ) F lu jo d e c a lo r (W /g ) 164 Figura A-13. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 %. Figura A-14. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25 %. Temperatura (°C) Temperatura (°C) E n d o té rm ic o E n d o té rm ic o F lu jo d e c a lo r (W /g ) Fl u jo d e c a lo r (W /g ) 165 Figura A-15. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 30 %. Temperatura (°C) E n d o té rm ic o F lu jo d e c a lo r (W /g ) 166 10. Referencias. [1]https://www.gob.mx/profeco/documentos/no-rompas-mas-tu-corazon-salud- cardiovascular?state=published [2] J. Groll, and DW Hutmacher, “How smart do biomaterials need to be? A translational science and clinical point of view,” Adv Drug Deliv Rev., vol. 65, pp. 581–603, 2013. 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