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Matías González

en 9/4/2025

Material

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Curso de Química Biológica
Guía de Trabajos Prácticos

Prof. Titular Dr. Pablo Cetica
Prof. Adjunto Dr. Gabriel Dalvit

2016

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Curso de Química Biológica

Guía de Trabajos Prácticos

Edición 2016

Redacción: Dra. Martha Beconi
Bioq. Norma Beorlegui
Lic. Laura Pintos
Dr. Pablo Cetica

Actualización: Dr. Pablo Cetica
Colaboración del Dr. Gabriel Alvarez, Mg. Silvina Fernández,
Méd. Vet. Noemí Mora y Vet. Eva Romero

Rediseño: Dr. Pablo Cetica
Dr. Gabriel Dalvit

Docentes 2016

Profesores: Titular Dr. Pablo Cetica
Adjunto Dr. Gabriel Dalvit

Jefes de Trabajos Prácticos: Dra. María Verónica Achi
Dr. Gabriel Alvarez
Dra. Elizabeth Breininger
Dra. Mariana Córdoba
Dra. Cynthia Gutnisky
Med. Vet. Noemí Mora
Dr. Pablo Rodríguez
Mg. Mercedes Satorre

Ayudantes de Primera: Mg. Silvina Fernández
Dra. Ana Marquínez
Dr. Sergio Morado
Dra. María Sol Pérez Aguirreburualde
Vet. Eva Romero
Vet. Matías Tellado

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Indice

MATERIAL DE LABORATORIO Y BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
BIOQUIMICO.....................................................................................................................pág. 4
1. Material de laboratorio no volumétrico.
2. Material de laboratorio volumétrico.
3. Bioseguridad en el laboratorio de bioquímica.
PROTEINAS.......................................................................................................................pág. 14
4. Comportamiento de proteínas en solución.
5. Métodos más usados para el fraccionamiento y/o purificación de proteínas.
6. Proteínas plasmáticas.
7. Fotometría.
8. Determinación de proteínas plasmáticas.
9. Trabajo práctico experimental.
10. Fraccionamiento de proteínas plasmáticas: Electroforesis.
11. Trabajo práctico experimental.

BIOENERGETICA...........................................................................................................pág. 46
1. Definición.
2. Principios de la Termodinámica.
3. Energía libre y energía libre estándar.
4. Compuestos de alta energía.
5. Carga energética de la célula.

ENZIMAS...........................................................................................................................pág. 53
1. Aislamiento y purificación de enzimas.
2. Determinación de la actividad de la lipasa pancreática.
3. Trabajo práctico experimental.

FERMENTACION LACTICA.......................................................................................pág. 63
1. Procesos aeróbicos y anaeróbicos.
2. Trabajo práctico experimental.

REGULACION HORMONAL DEL METABOLISMO DE LOS HIDRATOS
DE CARBONO..................................................................................................................pág. 71
1. Mecanismos de regulación de glucosa en sangre.
2. Método de dosaje de glucosa sanguínea.
3. Trabajo práctico experimental.

3
LIPIDOGRAMA................................................................................................................pág. 80
1. Lipoproteínas plasmáticas.
2. Aplicaciones clínicas.
3. Trabajo práctico experimental.

METABOLISMO DE AMINOACIDOS....................................................................pág. 90
1. Enzimas séricas.
2. Transaminasas.
3. Métodos de determinación de actividad de las transaminasas.
4. Interpretaciones clínicas.
5. Trabajo práctico experimental.

CUESTIONARIOS.........................................................................................................pág. 103
a) Material de laboratorio y bioseguridad en el laboratorio bioquímico.
b) Proteínas I.
c) Proteínas II.
d) Bioenergética.
e) Enzimas.
f) Digestión y metabolismo de hidratos de carbono I.
g) Metabolismo de hidratos de carbono II.
h) Metabolismo de hidratos de carbono III.
i) Respiración celular I.
j) Respiración celular II.
k) Aspectos genéticos del metabolismo.
l) Hormonas.
m) Regulación hormonal del metabolismo de los hidratos de carbono.
n) Digestión y metabolismo de lípidos I.
o) Metabolismo de lípidos II.
p) Digestión de proteínas y Metabolismo de aminoácidos.
q) Digestión y metabolismo en poligástricos.
r) Fotosíntesis.

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MATERIAL DE LABORATORIO
Y BIOSEGURIDAD EN EL
LABORATORIO BIOQUIMICO

TEMARIO

1. Material de laboratorio no volumétrico. Material volumétrico sin graduaciones. Material
no volumétrico con graduaciones aproximadas.

2. Material de laboratorio volumétrico. Matraces. Probetas. Pipetas. Buretas.

3. Bioseguridad en el laboratorio bioquímico. Normas básicas de bioseguridad en el
laboratorio de bioquímica. Sustancias químicas peligrosas.

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Para la realización de los Trabajos Prácticos es necesaria la correcta utilización del
material de laboratorio. Uno de los factores que influyen en la aparición de errores en el
laboratorio es la inadecuada utilización del material destinado a la medición de volúmenes,
generando resultados confusos, principalmente al realizar determinaciones que sirvan como base
para la toma de decisiones terapéuticas. El material de laboratorio se puede clasificar en no
volumétrico y volumétrico.

1. MATERIAL DE LABORATORIO NO VOLUMETRICO

1.1. Material no volumétrico sin graduaciones

Corresponde al material que no posee ningún tipo de escala graduada, como el caso de los
tubos de ensayo. Una característica a tener en cuenta es que el diámetro y longitud de los
mismos es variable entre distintos fabricantes, lo que puede generar confusiones al controlar
visualmente el llenado de los mismos. Los tubos de ensayo se colocan en gradillas diseñadas para
ese fin que pueden ser de metal, de plástico o de madera. Las de madera no deben sumergirse
dentro de baños de incubación, ya que el agua puede arruinar la madera.

1.2. Material no volumétrico con graduaciones aproximadas

La graduación que presenta este tipo de material no es exacta. Generalmente se indica,
junto al volumen máximo de graduación, el error aproximado que se puede realizar al medir con
este material, a una temperatura de 20°C.
En el laboratorio, comúnmente se utilizan: vasos de precipitados, balones y
erlenmeyers.
Este material no se usa para la medición de volúmenes exactos. Por ejemplo, al llenar un
vaso de precipitados hasta la línea que indica 100 ml no tenemos exactamente 100 ml, sino que
existen aproximadamente 100ml. Esto significa que, aunque hayamos enrasado perfectamente en
la línea que indica los 100 ml, en realidad puede haber 93, 114 ó 100,4 ml. Esto no se debe a
errores en la manipulación por parte del operador, sino que es una característica del material
utilizado.
Los erlenmeyers se utilizan para preparar soluciones y facilitar la mezcla acelerando el
proceso de disolución. También se usan en las titulaciones para facilitar la agitación.

2. MATERIAL DE LABORATORIO VOLUMETRICO

Corresponde al material específicamente fabricado para la medición de volúmenes. Por
ejemplo: matraces, probetas, pipetas (manuales y automáticas) y buretas.

Cómo realizar la lectura del nivel en el material graduado (Enrase)
En los tubos delgados de vidrio, debido a la tensión superficial de los
fluidos contenidos en ellos, se forma un menisco cóncavo (M en el
gráfico) en la superficie del líquido a medir.
La lectura se debe realizar en la línea de graduación (G en el gráfico)
correspondiente a la parte más baja del menisco.
Para evitar errores en la lectura, el material deberá encontrarse en
posición vertical, y el menisco deberá mantenerse a la altura de los ojos
del operador.

2.1. Matraces

Se trata de material volumétrico con una única medida. Están graduados para medir un
volumen determinado cuando son llenados hasta la línea de graduación correspondiente, por lo
tanto, no se pueden utilizar, para medir volúmenes inferiores o superiores al volumen indicado.
Existen matraces de diversas capacidades, desde 5 hasta 2000 ml (5, 10, 25, 50, 100, 250, 500,1000 y 2000 ml).
Se utilizan principalmente para la preparación de soluciones y reactivos y no para
determinar el volumen desconocido de un líquido.

2.2. Probetas

Son cilindros graduados de boca ancha y permiten la medición de volúmenes de 10 a 2000
ml (10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 ml). Siempre se debe utilizar una probeta con capacidad
superior más cercana al volumen a medir. Por ejemplo: Para medir 45 ml, se deberá utilizar una
probeta de 50ml. Para medir 180 ml, se deberá utilizar una probeta de 250ml.

2.3. Pipetas manuales (De simple y doble aforo)

Las pipetas más comunes pueden ser de: 0,1, 0,2, 1, 2, 5 y 10 ml. Para la correcta
utilización de las pipetas manuales se debe tener en cuenta:

2.3.1. Conocer que pipeta utilizar
Como en el caso de las probetas, siempre debe utilizarse la pipeta de un volumen superior
próximo al volumen a medir. Po ejemplo, para medir 0,7 ml, se deberá utilizar una pipeta de 1
ml. Para medir 2,6 ml, se deberá utilizar una pipeta de 5 ml.

2.3.2. Identificar la pipeta a utilizar

a) Identificar el volumen máximo y la precisión: Todas las pipetas tienen en su extremo
superior la indicación de sus características, por lo tanto se puede observar:
- El volumen máximo que puede ser medido (Por ejemplo, 5 ml)
- El volumen que hay entre dos líneas de graduación (Por ejemplo, la marca "1/100"
indica que cada línea de graduación contiene 1/100 de ml).

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b) Identificar el tipo de pipeta, de simple o de doble aforo: Las pipetas de simple aforo
se cargan hasta un volumen superior a cero, luego se enrasa y se descarga exactamente hasta el
volumen requerido, o completamente si se necesita el volumen total.
Las pipetas de doble aforo tienen la particularidad de tener el área graduada separada del
extremo de la pipeta, lo que implica que el volumen máximo a medir queda incluido entre dos
líneas claramente definidas, que indican el inicio y el final de la escala. Por lo tanto, deberán ser
descargadas hasta la marca inferior y no hasta el final de la pipeta.
Si es necesario hacer la descarga completa de la pipeta, las mediciones realizadas con una
pipeta de doble aforo son más exactas que las realizadas con las de simple aforo (excepto al
medir agua destilada). La razón de esto es que en las pipetas de simple aforo las graduaciones
inferiores corresponden a la sección cónica de la pipeta y el volumen remanente que queda por
capilaridad puede variar de una sustancia a otra.

c) Cargar la pipeta: Para realizar la carga de la pipeta es recomendable el uso de una
propipeta o una pera de goma, ya que el operador se expone menos al riesgo de tragar la sustancia
a pipetear y permite controlar el ascenso de la columna del líquido hasta la graduación deseada.

Manipulación de la pipeta
La pipeta debe ser tomada entre los dedos medio y pulgar,
utilizando al dedo índice como tope en el extremo superior de la
misma.
Esta forma de tomar la pipeta puede ser dificultosa al principio,
pero tiene las siguientes ventajas respecto a tomarla con la mano,
tapando con el pulgar:
- Al tomar la pipeta en la forma correcta, el centro de rotación de
la misma se encuentra en una posición más conveniente, por lo
tanto la manipulación, ya sea para cargarla o descargarla, es mucho
más precisa.
- La movilidad fina en el dedo índice es mejor, permitiendo que la
descarga de la pipeta pueda ocurrir en forma gradual, lo que no
ocurre al ocluirla con el dedo pulgar.

Manipulación de propipetas
Las propipetas de goma se manipulan de la siguiente forma:
- Para expeler el aire presionar la válvula A sobre la parte
superior del bulbo.
- Succionar el líquido hacia arriba presionando la válvula S
ubicada en la parte inferior.
- Para descargar presionar la válvula E que se encuentra al
costado de la válvula S.

Las propipetas de émbolo se manejan con una sola mano. Girando
la rueda dentada hacia arriba o abajo se obtiene un llenado o
vaciado preciso y pulsando la clavija lateral se produce el vaciado
automático.

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d) Descargar la pipeta: Para efectuar la descarga de la pipeta deberá apoyarse el extremo
inferior de la misma a la pared del recipiente en donde se descargue el contenido, liberando
lentamente el dedo índice y permitiendo la descarga del volumen deseado. En el caso de
descargar completamente el contenido de una pipeta de simple aforo, se considera al volumen
remanente en el extremo de la misma, incluido en el volumen medido, por lo tanto este volumen
remanente no debe ser descargado. Esto implica que nunca se debe soplar el contenido remanente
de la pipeta.

2.4. Buretas

Las buretas se utilizan para realizar titulaciones. Constan de un cilindro graduado (con
doble aforo) y un robinete, que permite ocluir el paso del líquido en forma total o parcial. El
robinete deberá ser manipulado con los dedos índice y pulgar de la mano izquierda,
manteniéndose el cuerpo de la bureta en el espacio dejado por estos dedos. Esto permite que
cualquier exceso de fuerza no desplace al robinete de su ubicación, evitando las pérdidas por los
laterales del mismo.
Al realizar una titulación, el punto de interés es el recipiente en donde se está realizando la
misma, deteniéndose el proceso en el momento en el que el indicador utilizado realice el cambio
esperado en su coloración, por lo tanto las buretas permiten independizarse de la lectura del
volumen utilizado, que se realiza después de finalizar la titulación.
Los pasos a seguir para la correcta utilización de las buretas son los siguientes:

2.4.1. Montaje de la bureta en su soporte

Para tal fin deberá armarse el soporte, utilizando una doble nuez que se fija al mismo y
mantiene a la bureta en posición vertical. Para fijar la bureta, deberá ajustarse lentamente la
tuerca mariposa de la doble nuez, hasta que la bureta no tenga más movilidad. El ajuste deberá
ser lo suficientemente firme como para mantener a la bureta en posición vertical, evitando el
exceso de presión, lo que podría provocar la rotura de la bureta. La altura de la doble nuez no
deberá interferir con la lectura de las graduaciones de la bureta.

2.4.2. Cargado de la bureta

a) Llenado: Una vez fijada la bureta con el robinete cerrado, se coloca un embudo en la
parte superior para efectuar la carga, prestando especial cuidado en evitar la formación de
burbujas en el interior de la misma. En este paso, no es necesario el enrase a cero. El aire
contenido en la porción inferior al robinete debe ser desalojado para poder utilizar las buretas con
exactitud. Para esto, se deberá colocar un recipiente debajo de la bureta, y abrir el robinete, hasta
que la burbuja sea desalojada completamente. En caso que la burbuja persista, se puede descargar
completamente la bureta e iniciar nuevamente la carga con el robinete abierto, habiendo colocado
previamente un recipiente debajo de la misma.

b) Enrase: Una vez cumplidos los pasos anteriores, se procederá al llenado final y enrase
de la bureta, manteniendo las mismas precauciones citadas anteriormente.

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c) Descarga de la bureta: La descarga del contenido de la bureta deberá ser realizada en
forma de goteo lento (no abrir el robinete completamente), reduciendo gradualmente el flujo de la
solución a medida que se aproxima el punto de viraje del indicador utilizado. Cuando se logra el
punto final de la titulación se debe cerrar el robinete.

d) Lectura del volumen utilizado: La lectura del volumen utilizado deberá realizarse al
final de la utilización de la bureta, tomando las precauciones descriptas anteriormente para el
enrase y lectura.

e) Recarga: Una vez finalizada la lectura, es recomendable la recarga y el enrase de la
bureta, si es necesario realizar otra titulación.

Limpieza del material de laboratorio
Todo el material utilizado debe ser enjuagado inmediatamente después de su uso, para evitar que se tapen y
eliminar sustancias extrañas que puedan interferiren futuras determinaciones. Como las buretas son utilizadas
para realizar titulaciones con soluciones de ácidos o bases, el secado de dichas soluciones, forma cristales, los
cuales pueden provocar la obstrucción del pico o el bloqueo del robinete, con lo cual quedarían
completamente inutilizadas. Si se trabaja con una pipeta que se utilizó para medir una solución de proteínas
y fue mal lavada, se estará obteniendo e informando un valor de proteínas superior al valor real del paciente.
Al finalizar el trabajo práctico se deberá lavar el material con detergente y abundante agua corriente,
particularmente si se utilizó material biológico con materia grasa como leche o yogur. Para ello se puede
utilizar escobillas, que resultan particularmente útiles para lavar el fondo de tubos de ensayo, probetas y
erlenmeyers. Finalmente deben enjuagarse todos los materiales lavados utilizando preferentemente agua
destilada.
Posteriormente se dejará secar al aire, antes de ser colocado en su lugar correspondiente, si no se dispone de
estufa para secar el material. Queda exceptuado del secado en estufa el material de vidrio volumétrico, ya que
el vidrio puede sufrir modificaciones en su forma por efecto del calor y del enfriamiento, afectando la escala
de graduación.

3. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO BIOQUIMICO

3.1. Normas básicas de bioseguridad en el laboratorio de bioquímica

Las prácticas que se llevan a cabo en el laboratorio presentan riesgos propios de cada
actividad. Las reglas básicas que se detallan a continuación, son un conjunto de normas
destinadas a prevenir accidentes y proteger la salud de alumnos y docentes. El conocimiento de
esta información resulta esencial para evitar o minimizar inconvenientes dentro del laboratorio.

 Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad como matafuegos, salidas de
emergencia, duchas y lavaojos.

 Se debe utilizar la vestimenta apropiada para el trabajo en el laboratorio. El guardapolvo
constituye una barrera de protección, por lo que debe usarse completamente abrochado, sin
arremangar y sin ninguna vestimenta por encima. Las piernas deben estar totalmente cubiertas
y el calzado debe ser cerrado. El cabello largo debe estar siempre recogido.

 Las mesadas de trabajo deben estar siempre despejadas, libres de libros, abrigos, materiales
de estudio y objetos personales como celulares.

 Las manos deben lavarse cuidadosamente luego de manipular cualquier sustancia química o
material biológico y antes de retirarse del laboratorio.

 Se debe dar aviso inmediato al personal docente si detecta fallas en las instalaciones eléctricas
o de gas, así como al detectar materiales de laboratorio rotos o dañados.

 Toda herida o abrasión, por más pequeña que sea, así como el ingerir accidentalmente alguna
sustancia, se deberá informar inmediatamente a los docentes. El laboratorio debe contar con
un botiquín de primeros auxilios correctamente identificado y de fácil acceso.

 Todo residuo que se genere deberá ser depositado en el recipiente destinado para tal fin. Estos
deben estar correctamente rotulados con el tipo de desechos que pueden contener, como
sustancias tóxicas, material biológico, papeles, etc. El material de vidrio roto deberá
envolverse en papel antes de ser depositado en el cesto de basura.

 Utilizar preferentemente dispositivos mecánicos como propipetas o peritas de goma para
pipetear.

 Mantener el orden y la limpieza dentro del ámbito del laboratorio. Las mesadas deberán
quedar perfectamente limpias y libres de cualquier residuo o elemento al finalizar la
actividad.

 No se debe comer, beber o fumar dentro del laboratorio.

 No llevar las manos a la boca u ojos cuando se haya manipulado sustancias químicas y
biológicas.

 No inhalar o probar productos químicos o biológicos.

 Se debe evitar el uso de accesorios, como pulseras, collares, relojes, anillos, etc.

 No retirarse del laboratorio sin haberse quitado el guardapolvo para dirigirse a otras áreas
(comedor, sanitarios, aulas, oficinas) o viajar.

 No se deben bloquear los pasillos y caminos de escape ante una emergencia con bancos,
sillas, mochilas o cualquier elemento que entorpezca la correcta circulación. No se permite
correr dentro del laboratorio, el andar dentro del mismo debe ser cuidadoso para evitar
romper los materiales y causar derrames de sustancias.

 No utilizar equipos sin haber recibido entrenamiento previo o supervisión del personal
docente.

 No se deben guardar alimentos en heladeras o freezers donde se almacenen sustancias
químicas o material biológico.

 No utilizar el contenido de un recipiente que no esté identificado. Todo material a utilizar
debe estar adecuadamente rotulado.

 Está prohibido descartar sustancias tóxicas, inflamables y corrosivas, así como material
biológico, por las piletas.

3.2. Sustancias químicas peligrosas

Las sustancias químicas se clasifican en función de su peligrosidad y se reconocen por un
símbolo específico.

Sustancias y preparados que pueden explotar al acercarles una llama
o por choques o movimientos violentos. Debe evitarse el calor,
fuego, chispas, percusión o fricción.
Mezclas como sodio y agua, hidrógeno y aire (en contacto con una
llama).

Sustancias que por la acción de una fuerte ignición, pueden
arder y continuar quemando. Deben mantenerse lejos de llamas,
chispas y fuentes de calor.
Acetona, alcoholes, benceno, magnesio en polvo, hexano,
fenolftaleína, éter etílico.
Líquidos con puntos de inflamación y ebullición bajos, y gases
que a presión y temperatura ambiente son muy inflamables en el
aire. Deben mantenerse lejos de llamas, chispas y fuentes de
calor.

En contacto con otros productos, especialmente con los
inflamables, reaccionan desprendiendo calor. Pueden provocar
incendios.
Nitrato de amonio, de plomo, de potasio, de aluminio y de cinc,
clorato de sodio y de potasio, ácido perclórico, dicromato de
potasio, ácido nítrico, agua oxigenada.

Por inhalación, ingestión o penetración por la piel pueden producir
envenenamientos graves o incluso la muerte. Benceno, mercurio,
metanol, cianuros, arsénico, dicromato de potasio, tetracloruro de
carbono, óxidos de nitrógeno, halógenos, fenol, sulfato de cromo,
anilinas.
La absorción de estas sustancias en cantidades muy pequeñas puede
tener efectos muy graves para la salud, pudiendo llegar a
consecuencias mortales.

Por inhalación, ingestión o penetración por la piel pueden producir
daños de gravedad limitada.
Ácido bórico, permanganato de potasio, yodo, algunas sales y óxido
de plomo, naftaleno, algunas sales y óxidos de cobre.
Por contacto prolongado con piel y mucosas, pueden originar
inflamaciones.
Hidróxido de amonio, sulfato de sodio, cromato de potasio, gases de
muchos ácidos (clorhídrico, nítrico, sulfúrico, etc.).

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Sustancias y preparados que tienen una acción corrosiva sobre la piel.
Muchos ácidos (nítrico, clorhídrico, sulfúrico, etc.), nitrato de plata,
bases fuertes (hidróxido de sodio, de potasio, amoníaco).

El contacto de esta sustancia con el medioambiente puede causar
daños en el ecosistema.
Benceno, cianuro de potasio, entre otros.

Riesgo de emisión radiactiva.
Ciertos isótopos de algunos elementos (yodo, polonio, etc.).

Riesgo de peligro biológico.
Virus, bacterias, priones, parásitos.

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PROTEINAS

TEMARIO

Estructura y funciones biológicas de las proteínas. Desnaturalización. Propiedades ácido-base
de aminoácidos y proteínas. Significado del punto isoeléctrico y pK. (Estos temas deberán
repasarse del Curso de Química Orgánica de Biomoléculas).

1. Comportamiento de proteínas en solución. pH. Fuerza iónica. Propiedades dieléctricas del
solvente. Temperatura.

2. Métodos másusados para el fraccionamiento y/o purificación de proteínas.
Centrifugación. Cromatografía líquida. Electroforesis. Fraccionamiento Salino. Diálisis.

3. Proteínas plasmáticas. Composición de la sangre. Fracciones proteicas del plasma.

4. Fotometría. Introducción. Teoría de la espectrofotometría. Instrumental: Fotocolorímetro y
Espectrofotómetro. Curva de calibración. Utilización del blanco. Cálculo del factor.

5. Determinación de proteínas plasmáticas. La reacción del Biuret: Fundamento. Otros
métodos para valorar proteínas.

6. Trabajo práctico experimental. Dosaje de proteínas plasmáticas.

7. Fraccionamiento de proteínas plasmáticas: Electroforesis. Introducción. Teoría de la
Electroforesis. Electroendósmosis. Variacione fisiológicas. Aplicaciones clínicas.

8. Trabajo práctico experimental. Proteinograma electroforético.

1. COMPORTAMIENTO DE PROTEINAS EN SOLUCION

La solubilidad de las proteínas depende del pH, de la fuerza iónica de la solución, de las
propiedades dieléctricas del solvente y de la temperatura. Estas variables pueden usarse para
separar mezclas de proteínas.

1.1. pH

Las proteínas muestran un mínimo de solubilidad a un determinado pH, que es específico para
cada una de ellas y se denomina punto isoeléctrico (PI), que se define como el pH en el cual, la
molécula proteica no posee carga eléctrica neta. En estas condiciones no hay repulsión
electrostática entre moléculas vecinas y tienden a agregarse y a precipitar. A mayores o menores
valores de pH, las proteínas tienen carga eléctrica neta del mismo signo, incrementando la capa
de solvatación e impidiendo que se formen agregados insolubles. El PI varía con la composición
iónica del medio. Cuando las proteínas están disueltas en agua pura (deionizada) el PI se conoce
como pH isoiónico. El pH isoeléctrico de una proteína, esta determinado por el número y los pK
de cada grupo R que se ioniza.

1.2. Fuerza iónica

La fuerza iónica de una solución es una medida de su concentración salina y se puede calcular a
través de la siguiente fórmula:   221 ZiCi
, donde Ci es la concentración de cada ión
presente en la solución y Zi es la carga correspondiente a cada uno de estos iones. Las sales
neutras en solución se disocian, formando iones solvatados que modifican la solubilidad de las
proteínas. A baja concentración salina, la solubilidad de la proteína aumenta: "salting in",
debido a que las cargas de las proteínas interaccionan con los iones de las sales, incrementando la
capa de solvatación de las mismas y disminuyendo la interacción proteína-proteína.
Por otra parte, a altas concentraciones de sales neutras, la solubilidad de las proteínas disminuye
("salting out") porque los iones de la sal disuelta atraen el agua de solvatación disponible,
aumentando la interacción entre las moléculas de proteína. Las proteínas precipitadas por
"salting out", retienen su conformación nativa y pueden disolverse nuevamente con el agregado
de solvente sin experimentar desnaturalización.

1.3. Propiedades dieléctricas del solvente

La solubilidad de una proteína a una fuerza iónica y pH determinados, es función de la
constante dieléctrica del medio. A medida que disminuye la constante dieléctrica del solvente
disminuye la solubilidad de las proteínas, porque a menor constante dieléctrica aumenta la fuerza
de atracción entre las cargas opuestas, luego las proteínas tienden a agregarse y precipitar. El
agua tiene la máxima constante dieléctrica, mientras que los solventes orgánicos tienen valores
más bajos de constantes dieléctricas.

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1.4. Temperatura

Dentro de un rango limitado entre 0º y 40ºC, la mayor parte de las proteínas aumenta su
solubilidad al aumentar la temperatura. A temperaturas mayores de 40ºC, aumenta la agitación
térmica y se rompen las uniones que mantenían las estructuras secundaria, terciaria, cuaternaria y
la proteína se desestabiliza y precipita (desnaturalización).

2. METODOS MAS USADOS PARA FRACCIONAMIENTO Y/O
PURIFICACION DE PROTEINAS

En el fraccionamiento y/o purificación de proteínas se utilizan métodos que se describen a
continuación:

2.1. Centrifugación

La fuerza centrífuga permite separar partículas en suspensión que posean diferente masa o
diferente densidad, depositándolas en el fondo del tubo a diferentes velocidades. A menor
velocidad se depositan las partículas más pesadas o de mayor densidad. Los tipos más usados
son:

2.1.1. Centrifugación diferencial (se verá más adelante)

2.1.2. Centrifugación en gradiente de densidad
Se prepara una solución de sacarosa de densidad creciente en un tubo de centrífuga, luego
se deposita la mezcla de proteínas y se centrifuga en posición horizontal a alta velocidad. Se
obtienen así diferentes bandas según su tamaño y densidad.

2.2. Cromatografía líquida

Es otra técnica utilizada comúnmente para separar mezclas de proteínas, que se basa en la
interacción entre las moléculas disueltas y una superficie sólida que se halla contenida en una
columna. Este tipo de cromatografía puede ser:

2.2.1. Cromatografía de exclusión o de filtración por gel
Las proteínas se separan de acuerdo a su tamaño. En este caso la columna contiene polímeros con
poros de diferente tamaño, de acuerdo a las proteínas que se desean separar. La mezcla con las
proteínas disueltas fluye sobre la columna, las moléculas de pequeño tamaño penetran en los
poros del polímero y su movimiento a través de la columna se retarda. En cambio las proteínas
de mayor tamaño no pueden penetrar en los poros del gel y fluyen más rápidamente.

2.2.2. Cromatografía de intercambio iónico
Las proteínas son separadas por diferencia de carga. Grupos funcionales cargados positivamente
(-NH3+) o negativamente (-COO-) se unen covalentemente a un soporte sólido formando un

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intercambiador aniónico o catiónico. Cuando una molécula proteica cargada se hace pasar por un
intercambiador de carga opuesta, ésta es retenida por fuerzas electrostáticas, mientras que las
moléculas neutras o de igual carga, pasan a través de la columna. La unión de la molécula
retenida es reversible y puede ser eluida por el agregado de soluciones de diferentes
concentraciones salinas o por una solución con un gradiente de pH.

2.2.3. Cromatografía de afinidad
Se basa en la afinidad con que una proteína se une específicamente a otra molécula
(ligando). Ej: enzimas unen coenzimas e inhibidores, anticuerpos unen a proteínas antigénicas,
etc. Un ligando está covalentemente unido al soporte y está dentro de una columna
cromatográfica. Cuando se coloca una mezcla de componentes, los compuestos que no tienen
afinidad por el ligando, fluyen a través de la columna, quedando retenida la proteína que tiene
afinidad por dicho ligando. La elución se hace con soluciones que contienen exceso de ligando.

2.3. Electroforesis

Es una técnica para separar proteínas bajo la influencia de un campo eléctrico. La
movilidad de cada uno de las moléculas cargadas en un campo eléctrico depende de su carga y de
su tamaño molecular. Si dos moléculas tienen la misma masa y forma, la que tiene una carga
eléctrica neta mayor, se moverá más rápidamente hacia el electrodo de signo opuesto.
Las más comúnmente usadas son:

2.3.1. Electroforesis en tiras de acetato de celulosa (se utilizará en el trabajo práctico
experimental)

2.3.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-poliacrilamida)
En este caso la mezcla de proteínas es tratada con SDS (dodecil sulfato de sodio) que es
un detergente cargado negativamente, que se une a las proteínas. Colocando la mezcla sobre el
gel de poliacrilamida y aplicando una corriente eléctrica, los complejos SDS-proteínas migran a
través de los poros del gel de poliacrilamida (el tamaño de los poros del gel depende de la técnica
de preparación del mismo). Las proteínas más pequeñas pasan a través de los poros del gel más
fácilmente, recorriendo unamayor distancia, lo contrario ocurre con las proteínas de mayor
tamaño, como consecuencia, las proteínas se separan en bandas de acuerdo a su tamaño. Estas
bandas se visualizan por tratamientos con un colorante. Si L es el largo del gel y d1, d2 y d3 son
las distancias recorridas se pueden calcular los Rf ("Running front": frente de corrida) para cada
una de ellas:
L
dRf 

A partir de los Rf se puede calcular el peso molecular de cada una de las proteínas.

18
2.4. Fraccionamiento salino

Se basa en la separación de una mezcla proteica por el agregado de sales ("salting in" o
"salting out"). La precipitación con sales es un método muy efectivo para la purificación proteica.
El agente precipitante más usado es el sulfato de amonio: (NH4)2SO4. Se usa para la precipitación
y purificación de las distintas enzimas presentes en un tejido determinado, debido a su gran
solubilidad en agua destilada aún a bajas temperaturas, lo que permite usarlo en altas
concentraciones, es además económico y no tiene efectos nocivos sobre las proteínas.

2.5. Diálisis

Permite separar las proteínas, de un soluto de bajo peso molecular, haciendo pasar este
último a través de una membrana semipermeable que retiene a las moléculas proteicas.

3. PROTEINAS PLASMATICAS

3.1. Composición de la sangre

La sangre es un tejido que circula dentro del sistema de los vasos sanguíneos. Está
compuesta por elementos figurados (eritrocitos o glóbulos rojos, leucocitos o glóbulos blancos y
plaquetas) y por el plasma que mantiene a las células en suspensión.
La sangre constituye el vehículo por el cual la mayor parte de los nutrientes son
transportados al hígado y a los órganos en general, y los productos de desecho retornan a los
pulmones y a los riñones, para su excreción. La sangre transporta el oxígeno desde los pulmones
a los tejidos, y el dióxido de carbono, producido durante el metabolismo respiratorio desde las
células hacia los pulmones.
Casi la mitad, aproximadamente, del volumen sanguíneo lo ocupan sus células, que
consisten en su mayor parte en los glóbulos rojos y en una cantidad mucho más pequeña, los
glóbulos blancos y las plaquetas.
Si se saca sangre de una vena y se agrega un anticoagulante apropiado para prevenir su
coagulación, los elementos celulares en suspensión pueden ser separados por centrifugación. El
líquido sobrenadante, normalmente de color ligeramente amarillo, se denomina plasma
sanguíneo.
Si al extraer la sangre se deja que coagule, y se somete luego a centrifugación, se separa
un líquido que se denomina suero sanguíneo.
Así, la diferencia entre plasma y suero sanguíneo es que este último carece de fibrinógeno
(precursor de la fibrina que forma el coágulo).
El plasma contiene aproximadamente un 10% de solutos disueltos, de estos un 2% esta
integrado por nutrientes orgánicos y sustancias de desecho. Un 1% está representado por sales
inorgánicas y aproximadamente el 7% restante, lo constituyen las proteínas plasmáticas.
Los principales iones inorgánicos del plasma sanguíneo son el Na+, Ca++, Mg++, Cl-,
HCO3- y H2PO4-, que desarrollan una importante función en la regulación de la actividad hística.

19
Las proteínas plasmáticas están integradas por una mezcla de diferentes fracciones
proteicas. La concentración total de proteínas plasmáticas en mamíferos varía entre 5,5 y 8,5
g/100ml (ver cuadro pág. 28).

3.2. Fracciones proteicas del plasma

3.2.1. Fibrinógeno
Es el precursor de la fibrina, que participa en la formación del coágulo sanguíneo. Esta
proteína es producida por el hígado y constituye solo el 4 - 6% de las proteínas totales del plasma.
El suero no contiene fibrinógeno puesto que se usa en el mecanismo de coagulación, pero sí
contiene la misma cantidad de albúminas y globulinas que el plasma.

3.2.2. Albúmina
Es la fracción más abundante, aunque las cantidades relativas, varían entre 40-60% de las
proteínas totales, según las distintas especies. La albúmina es sintetizada en el hígado y sus
principales funciones son:
a) El mantenimiento del volumen del plasma, o sea del equilibrio osmótico entre la sangre
circulante y el líquido intersticial.
b) El transporte de sustancias poco solubles en agua (Ej: ácidos grasos libres).

3.2.3. Globulinas
La fracción globulínica de las proteínas plasmáticas es una mezcla muy compleja, que
agrupa las siguientes fracciones principales: 1 y 2 globulinas,  globulinas y  globulinas.
Todas cumplen funciones biológicas muy importantes; por ejemplo:
a) Antitripsina (1 globulina)
b) Ceruloplasmina: (2 globulina), transporta el 90% del cobre presente en el plasma.
c) Transferrina: ( globulina) es una glucoproteína que transporta el Fe+++ desde el intestino a
los lugares del organismo que lo necesiten.
d) Inmunoglobulinas: ( globulina) son sintetizadas en los linfocitos B, secretadas a la
circulación sanguínea y constituyen un mecanismo importante de defensa del organismo.
Las proporciones de las globulinas varían según las especies animales.

Las proteínas plasmáticas se pueden dosar por varios métodos espectrofotométricos.

4. FOTOMETRIA

4.1. Introducción

La luz, energía radiante o radiación electromagnética interactúa con la materia
produciendo una variedad de fenómenos ampliamente conocidos: reflexión, refracción,
absorción, polarización, etc. De todos estos fenómenos, el de absorción de la luz constituye la
base de los métodos de análisis más importantes de la química biológica y otras ciencias.

20
Cuando un haz de luz llega a un medio homogéneo, una parte de la luz incidente se
refleja, otra se absorbe y el resto es transmitida.
Verificándose que: I0=Ia+It+Ir
Donde:Io = intensidad de la luz incidente.
Ia = intensidad de la luz absorbida.
It = intensidad de la luz transmitida.
Ir = intensidad de la luz reflejada.
De la ecuación anterior puede despreciarse la Ir por ser del orden del 4% respecto de la
incidente (cuando se trata de interfase aire-vidrio) quedando:

I0=Ia+It

La fracción de luz transmitida It depende:
a) De la intensidad de la Io.
b) Del espesor (l) del medio atravesado por la luz.
c) De la estructura molecular de la sustancia disuelta en ese medio y también de la estructura del
solvente.
d) De la concentración (c) de dicha sustancia.
e) De la longitud de onda () utilizada en el haz incidente.
f) De la temperatura del sistema.

Los métodos fotométricos se pueden utilizar para:
a) La identificación de una sustancia por medio de su espectro de absorción característico.
b) Hallar la concentración en base a la luz absorbida a una determinada longitud de onda ().
De estas dos posibilidades que brinda la espectrofotometría, estudiaremos aquí la segunda
o sea la medición de la concentración de una sustancia en solución en base a la luz absorbida.

21
4.2. Teoría de la espectrofotometría

4.2.1. Ley de Lambert
En 1760, Lambert investigó la relación existente entre Io e It cuando la luz atravesaba
láminas coloreadas de diferentes espesores, estableciendo que la It decrece exponencialmente al
aumentar el espesor (l) de la lámina, es decir:
l
0 10
 IIt (1)
Siendo  el coeficiente de extinción que es constante y específico de la lámina utilizada.

4.2.2. Ley de Beer
En 1852, Beer estudió la absorción de la luz por medio de soluciones coloreadas variando
la concentración (c) en lugar del espesor, llegando a una expresión matemática similar:
c
t II
 100 (2)
Lo que significa que la It disminuye exponencialmente al aumentar c.
Como las soluciones pueden medirse bajo espesores diferentes se pueden combinar las
dos ecuaciones anteriores (1) y (2) en una que reúne las leyes de Lambert y Beer:
lc
t II
 100 o bien
clt
I
I 10
0

Que al aplicarle logaritmo resulta:
10loglog
0
 cl
I
It 
Multiplicando por (-1) nos conduce al concepto de absorbancia (A) ya que:
cl
I
I
II
t
t  0
0
loglog ó clA  (3)
De la ecuación (3) podemos despejar el coeficiente de extinción molar:
cl
A
 que puede
definirse como la absorbancia de una solución cuando el espesor es igual a 1 cm y la
concentración es 1 M y sus unidades son: 11  Mcm ya que la absorbancia no tiene unidades.
Se llama transmitancia (T) a la relación
0I
IT t o fracción de luz transmitida, y
transmitancia porcentual:

0
100%
I
IT t

De estas definiciones se deduce la relación entre Absorbancia y Transmitancia porcentual:
Como
0
100%
I
IT t

Aplicando logaritmos 0100 IIT t logloglog%log 

22
Multiplicando x (-1) 0100 IIT t logloglog%log 

tI
IT 0log2%log 
AT  2%log

Para T% = 100 100% de luz transmitida
la A = 0
Para T% = 0 0% de luz transmitida
la A  2

4.3. Instrumental: Fotocolorímetro y espectrofotómetro

El fotocolorímetro se esquematiza en la siguiente figura:

Se emplea usualmente luz blanca de tungsteno que es filtrada por láminas coloreadas
(fotométro a filtro). De todo el espectro visible, el filtro deja pasar un cierto ancho de longitudes
de onda ( ) que incidirá en el tubo o cubeta con la solución a medir.
Si en lugar de filtros se utiliza un prisma o una red de difracción (o ambos combinados) se
consiguen medidas más precisas, pudiéndose modificar la longitud de onda del espectro en forma
continua. Con esto se consigue más definición en las lecturas del aparato (espectrofotómetro).
Por otra parte, puede cambiarse la fuente de luz y alcanzarse, usando otras lámparas,
zonas del espectro no visibles, por ej. lámparas de Deuterio para leer en la zona Ultra Violeta
(U.V.). Todos estos métodos permiten dosar sustancias en muy pequeñas cantidades (trazas).
Las lecturas se hacen en un galvanómetro graduado directamente en unidades de
absorbancia, aunque la mayoría de los equipos cuentan con una doble escala paralela de
Absorbancia y Transmitancia porcentual (ver esquema). En el trabajo práctico utilizaremos la
absorbancia que mantiene una relación lineal con la concentración.
Por último puede mencionarse que en equipos más modernos la lectura es digital y poseen
minicomputadoras que permiten obtener directamente la concentración expresada en las unidades
deseadas.
%log2 TA 

4.4. Curva de calibración

Se usa para evaluar la concentración de una sustancia S. De la ecuación lcA  se
infiere que si se grafica la absorbancia de una solución en función de concentraciones variables
de la misma, se obtiene una recta que pasa por el origen y cuya pendiente es l, o sea una curva
de calibración consiste en un gráfico que relaciona absorbancia con concentraciones conocidas de
la sustancia S a dosar.
Para realizar una curva de calibración:
a) Se utiliza como testigo una solución de la sustancia a dosar (S), valorada por otro método.
b) Se toman diferentes alícuotas de la solución testigo, llevándolas en cada caso al mismo
volumen final con agua destilada, luego se agregan el o los reactivos que producen la
reacción de color. Quedan así diferentes concentraciones de la sustancia y a cada una le
corresponderá un valor determinado de absorbancia.
c) Se prepara un blanco en el que intervienen todas las sustancias que participan en la reacción
colorimétrica menos la que se quiere dosar.
d) Se coloca el blanco en la cubeta de un fotocolorímetro o espectofotómetro y se ajusta la
absorbancia a cero.
e) Se lee a continuación las absorbancias de cada una de las distintas concentraciones de la
solución testigo.
f) Los datos obtenidos se consignan en una tabla y luego se realiza un gráfico de absorbancia en
función de la concentración.
Este gráfico puede ser una recta o una curva que en ambos casos pasan por el origen.

En el caso I se observa que la absorbancia es directamente proporcional a la
concentración o sea, se cumple la Ley de Lambert y Beer: A = lc en todo el rango de
concentraciones elegidas en este ejemplo (salvo pequeñas desviaciones experimentales).

24
En el caso II, se produce una desviación para concentraciones mayores de 4 mg/ml. Esto
se debe a alteraciones del  que modifican la pendiente.
Una vez construida la curva de calibración, se procede a hallar la concentración
desconocida de la sustancia (S) contenida en algún material biológico; para ello, a una cantidad
determinada de dicha sustancia se le agrega el o los reactivos de color y se lee la absorbancia
(As).
El valor de la absorbancia (As) se busca sobre el eje de las ordenadas y se halla la
concentración correspondiente.
En el caso II que no cumple con la Ley de Lambert y Beer se deberá hacer una dilución
de la sustancia en estudio para que el valor de la absorbancia esté comprendido en la zona en que
se cumple la ley (menor 4mg/ml).

4.5. Utilización del blanco

Se prepara un blanco con los reactivos (R) sin el agregado de la sustancia a dosar (S). El
blanco puede ser utilizado en dos formas:

1er Método:
a) Se coloca el blanco en la cubeta del aparato y se ajusta la absorbancia a cero.

Ab=0

b) Se prepara un tubo con la sustancia a dosar (S) más los reactivos (R+S). Se coloca en la
cubeta del aparato y se mide su absorbancia As. El valor de la absorbancia leída corresponde
al color desarrollado en la reacción colorimétrica debido a S. A este valor se lo llama
absorbancia corregida (Ac).

2º Método:
a) Se coloca agua destilada en la cubeta del aparato y se ajusta la absorbancia a cero.
b) Luego se mide la absorbancia del blanco de los reactivos y obtenemos Ab.
c) Por último se mide la absorbancia de (R+S) y se obtiene As.

AbAsAc 

Este último método se utiliza cuando el color de los reactivos es casi tan pronunciado
como el de la reacción. Si se ajustara la absorbancia a cero con el 1er método, la lectura de la
absorbancia de la reacción sería muy baja, moviéndose la aguja en una zona de la escala en la
cual el aparato tiene muy poca sensibilidad.

4.6. Cálculo del factor

Cuando se obtiene una recta, como en el caso I, que mantiene la proporcionalidad como
exige la Ley de Lambert y Beer, puede hallarse un factor para calcular la concentración

25
desconocida de una sustancia (S). Trazada la recta que pasa por el origen, si se toman dos
puntos sobre la recta para los cuales se verifica:

11 lcA 
22 clA 

Dividiendo miembro a miembro:
2
1
2
1
c
c
A
A


 y l son constantes porque l no varía por usarse la misma cubeta y  es el coeficiente de
extinción molar para la sustancia en estudio.
Luego: 1
2
2
1 AA
cc 
Donde: f
A
c

2
2
f: es el factor de la reacción en las condiciones utilizadas, con el cual podremos independizarnos
del gráfico. Este factor, que es un dato experimental, no es otra cosa que la inversa de la
pendiente de la recta. Entonces, para cualquier concentración desconocida (cx) se efectúa la
lectura Ax y se emplea la ecuación:
Axfcx 

5. DETERMINACION DE PROTEINAS PLASMATICAS

5.1. La reacción del Biuret: Fundamento

Las sustancias que contienen dos o más uniones peptídicas, forman un complejo
coloreado con sales de cobre en solución alcalina (reactivo del Biuret). La absorbancia de estos
complejos coloreados varía linealmente con la concentración de proteínas (cumple la Ley de
Lambert y Beer), dentro de ciertos límites.
En este trabajo práctico se construirá una curva de calibración usando como solución
testigo: albúmina bovina.

5.2. Otros métodos para valorar proteínas

5.2.1. Método de Lowry
Fundamento: El color obtenido es el resultado de:
a) La formación del complejo entre proteínas y el ion cúprico en medio alcalino (reacción del
Biuret).

26
b) Reducción del reactivo fosfomolíbdico-fosfotúngstico por acción de la tirosina y el triptofano
presentesen las proteínas. Se obtiene así una sensibilidad unas 100 veces mayor que la del
Biuret solamente.

5.2.2. Método de absorción en el ultravioleta
Fundamento: Las proteínas tienen una absorción máxima de la luz ultravioleta a 280 nm,
luego la lectura directa de una solución proteica en la  = 280, es un método rápido y sensible
para calcular la concentración de proteínas.

5.2.3. Método de Bradford
Fundamento: El colorante Coomasie Brillant Blue G250 existe en dos diferentes colores, azul y
rojo, la forma roja se convierte en la azul cuando el colorante se une a proteínas formando un
complejo de color azul. Este ensayo evita la mayor parte de las interferencias de los otros
métodos mencionados y puede ser aplicado a una gran variedad de muestras. Es un método muy
sensible debido al alto coeficiente de extinción del complejo formado. Rango de trabajo: 10 – 100
g. Puede reducirse la escala y llevarla al rango 1 – 10 g.

El aumento de la concentración de las proteínas plasmáticas (hiperproteinemia) o su
disminución (hipoproteinemia) están vinculados con diferentes patologías cuyo diagnóstico, debe
ser completado con el estudio de las diferentes fracciones proteicas mediante un proteinograma.

27
6. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

DOSAJE DE PROTEINAS PLASMATICAS

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DEL BIURET

1. Muestra
Suero sanguíneo de concentración proteica desconocida.

2. Reactivos
a) Solución saturada de hidróxido de sodio
Hidróxido de sodio p.a. 70 g
Agua destilada c.s.p. 100 ml
b) Solución de hidróxido de sodio 10%
Solución saturada 42,8 ml
Agua destilada c.s.p. 300 ml
c) Solución testigo de albúmina bovina 10 mg/ml:
Albúmina bovina 1 g
Cloruro de sodio 0,9% c.s.p. 100 ml
Disolver a temperatura ambiente.
d) Reactivo del Biuret
Sulfato cúprico penta hidratado p.a. 1,6 g
Tartrato de sodio y potasio puro 6,0 g
Solución de hidróxido de sodio 10% 300 ml
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
Disolver el sulfato cúprico y tartrato de sodio y potasio en aproximadamente 300 ml de
agua destilada, agregar 300 ml de solución de hidróxido de sodio 10% dejar enfriar y llevar a
volumen en un matraz aforado de 1 litro.

3. Material de laboratorio (por grupo de alumnos)
13 tubos de ensayo
1 pipeta de 0,1 ml graduada 1/1000
1 pipeta de 0,2 ml graduada 1/1000
1 pipeta de 1 ml graduada 1/100
1 pipeta de 2 ml graduada 1/10
1 pipeta de 5 ml graduada 1/10
1 gradilla para tubos de ensayo

4. Aparatos e instrumentos
Fotocolorímetro o espectrofotómetro

28
5. Técnica

5.1. Curva de calibración

Rotular un tubo de ensayo con la letra B (blanco) y cuatro tubos de ensayo con los
números 1, 2, 3, 4. Agregar los reactivos según se indica en el cuadro.

4 Orden de los tubos
en la gradilla

Sc. Testigo Prot. 10mg/ml

0,2

0,4

0,6

0,8

Agua destilada (ml)

1,8

1,6

1,4

1,2

Reactivo del Biuret

Mezclar y leer a los 20 minutos las absorbancias del contenido de cada uno de los tubos,
usando como blanco el contenido del tubo B, para llevar a 0. Usar filtro 546 nm y anotar los
resultados en este cuadro.

Absorbancia corregida
Cantidad de proteínas en los
testigos (mg) - 2 4 6 8

Reproducir "Absorbancias corregidas" en el cuadro de resultados del informe y con ellos
graficar en papel milimetrado la curva de calibración (Absorbancia corregida en función de mg
de proteína). El gráfico debe dar una recta que pasa por el origen.

5.2. Dosaje de proteínas totales en suero sanguíneo

Rotular dos tubos de ensayo con las letras B (blanco) y M (muestra). Colocar en los tubos
rotulados los reactivos en el orden que indica el siguiente cuadro.

Orden de los tubos en la gradilla

Suero (ml)

0,1

Agua destilada (ml)

1,9

Reactivo del biuret (ml)

Mezclar el contenido de cada tubo y esperar 20 minutos para que se desarrolle color. Leer
las absorbancias a 546 nm usando el contenido del tubo B como blanco. Anotar en este cuadro.

Absorbancia corregida

mg proteínas

Concentración de proteínas en g/100 ml

Buscar e indicar en la curva de calibración los mg de proteínas correspondientes a la
absorbancia de la muestra y anotarlas en la última columna. La última fila (g/100 ml) se calculará
en base a la cantidad de muestra utilizada, 0,1 ml de suero, teniendo en cuenta que se midió
directamente (sin diluir).
Ej.: Una muestra de suero sanguíneo da por el método del Biuret una absorbancia de
0,300. Suponiendo que esta absorbancia corresponda, según la curva de calibración, a 6 mg de
proteínas, calcular la concentración en g/100 ml si se utilizaron para la reacción 0,1 ml de suero.

0,1 ml de suero ––––––––– 6 mg de proteínas
100,0 ml de suero ––––––––– x mg de proteínas x = 6000 mg = 6g

Luego la concentración de proteínas = 6 g/100 ml de suero.
Reproducir las tres últimas filas del cuadro anterior en la hoja del informe y calcular la
concentración de proteínas totales. Este valor depende de la edad, sexo, y de la especie animal.
Su alteración tiene significado clínico en algunas enfermedades. Volcar estos resultados en el
último cuadro del informe.

30
Apellido y nombre:
Comisión:
Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL
DOSAJE DE PROTEINAS PLASMATICAS

1. Objetivo y fundamento

......................................................................................................................................................

2. Resultados

a) Curva de calibración

Tubo

Absorbancia
corregida

mg Proteínas

31
b) Gráfico

c) Dosaje de proteínas totales

Tubo

Absorbancia

mg Proteínas

g de proteínas/100 ml suero

3. Conclusiones

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................32
7. FRACCIONAMIENTO DE PROTEINAS PLASMATICAS: ELECTRO-
FORESIS

Introducción

Se denomina electroforesis al movimiento de partículas cargadas, presentes en una
solución, bajo la influencia de un campo eléctrico. Las partículas cargadas pueden ser enzimas,
ácidos nucleicos, lipoproteínas, glucoproteínas o elementos organizados como virus, bacterias,
espermatozoides.
En la electroforesis sobre soporte, la solución que contiene las sustancias a separar se
coloca (o siembra) sobre un soporte, embebido en un buffer adecuado, cuyos extremos están
sumergidos en sendas cubas cargadas con dicho buffer y conectadas a los electrodos provenientes
de una fuente de poder. Como soportes pueden utilizarse agar, gel de poliacrilamida, papel de
filtro, acetato de celulosa, etc.
En el trabajo práctico se realizará la electroforesis de proteínas plasmáticas en tiras de
acetato de celulosa: Proteinograma. El acetato de celulosa contiene la celulosa con parte o
todos los grupos -OH de las unidades de glucosa reemplazados por acetato. Esto elimina casi
enteramente las propiedades adsorbentes de la celulosa. Es un soporte delgado que presenta las
siguientes ventajas:
a) Mínima adsorción, separación de las fracciones más rápida y eliminación del color de base
más fácilmente.
b) Material homogéneo, microporoso y químicamente puro.
c) Se usa menos material biológico que con el papel.
d) Se puede transparentar para su "scanning", o cortar las bandas y medirlas
fotocolorimétricamente.
Las desventajas serían:
a) Tendencia a secarse durante la corrida por su delgadez.
b) Alta electroendósmosis.
c) Alto costo.
El proteinograma se efectuará con un equipo semejante al de la siguiente figura.

33
Una vez colocado el soporte adecuadamente, se siembra el suero en la zona indicada en la
figura, luego se aplica una corriente eléctrica para lograr la separación de las fracciones proteicas
según la especie, por ejemplo en bovinos las fracciones son albúminas, 1, 2,  y  globulinas.
Luego de efectuada la corrida electroforética, las fracciones proteicas separadas se pondrán de
manifiesto mediante la tinción de las mismas.
El aspecto de la tira coloreada (proteinograma) mostrando las zonas separadas es el
siguiente en una muestra de suero bovino:
Teoría de la electroforesis

En principio, podemos considerar que la velocidad de una partícula cargada es
directamente proporcional al campo eléctrico aplicado y la constante de proporcionalidad es
llamada movilidad m.
mHv  Donde
d
VH 

H = campo eléctrico v = velocidad de migración de la partícula
V = voltaje aplicado d = distancia entre electrodos

A su vez, la movilidad depende de la carga neta de la partícula, su radio, la viscosidad del
medio líquido en que se mueve y de la trama microcapilar del soporte sólido sobre el cual migra
(papel o acetato de celulosa), siendo además inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la
fuerza iónica.
En condiciones de trabajo estándar (cubeta, soporte, soluciones buffers y voltaje
definidos) los factores que hacen que la movilidad (m) de cada una de las fracciones proteicas sea
diferente son principalmente su tamaño y su carga eléctrica neta. La carga eléctrica depende a
su vez del punto isoeléctrico de cada proteína y del pH del buffer elegido.
En general, en la realización del proteinograma se utiliza un buffer de pH alcalino (9,2) al
cual todas las proteínas del suero estarán cargadas negativamente, dependiendo la cantidad de
cargas del número de grupos –COO - , –O - de cada una de las fracciones proteicas. Si una
proteína tiene mayor cantidad de estos grupos, migrará más rápidamente hacia el polo positivo o
ánodo.
De todo lo dicho puede inferirse que las funciones del buffer serán:
a) Mantener el pH constante por encima del PI de las proteínas, para que los grupos –COO - y
–O - estén disociados.

34
b) Transportar la corriente eléctrica.
c) Proveer al medio de la fuerza iónica adecuada para lograr una eficiente movilidad de las
proteínas.

Otros factores que, si bien no influyen en la migración diferencial de las proteínas,
determinan una eficiente corrida electroforética son: intensidad de corriente, temperatura y
evaporación. La intensidad de la corriente eléctrica que depende del voltaje aplicado (V) y de la
resistencia de las tiras (R), genera un calentamiento de las mismas por efecto Joule, efecto que
explica la elevación de la temperatura de cualquier elemento que funcione como resistencia
eléctrica. Al aumentar la temperatura de las tiras, aumenta la evaporación del solvente en el
soporte, lo que se traduce en un aumento de la concentración del buffer. Esto a su vez implica un
aumento de la fuerza iónica 




   2
2
1 zc y por ende una disminución de la movilidad, que es
inversamente proporcional a  , como se dijo anteriormente.
La evaporación del solvente puede disminuirse trabajando con la cuba electroforética
cerrada. Esto producirá condensación del mismo en la cara interna de la tapa de la celda
electroforética. Cuando se trabaja a elevados voltajes es necesario refrigerar por medios
especiales las tiras electroforéticas.
Debido a que los extremos de las tiras están sumergidos en la cuba se generan corrientes
ascendentes de succión por capilaridad. Para que estas corrientes tengan igual velocidad es
importante que el nivel del buffer en los compartimientos electródicos sea el mismo.

(1) Succión por capilaridad. (2) Evaporación. (3) Condensación en la tapa.

Electroendósmosis

En la electroforesis sobre soporte debe tenerse en cuenta el fenómeno de
electroendósmosis. Como la electroforesis se realiza en presencia de un buffer de pH alcalino (en
nuestro caso veronal sódico pH 9,2), los grupos ionizables del soporte estarán cargados
negativamente (-COO- del acetato de celulosa) y se rodean de iones cargados positivamente.

35
Al aplicar la corriente eléctrica las partículas cargadas negativamente no se desplazan por
estar unidas al soporte mientras que las cargadas positivamente se desplazarán hacía el polo
negativo o cátodo. Esta corriente líquida que se desplaza en sentido contrario al de la corriente
eléctrica, se llama corriente electroendosmótica y el fenómeno se llama electroendósmosis.
Dicha corriente puede ser lo suficientemente fuerte como para arrastrar a moléculas neutras o con
pocas cargas negativas (como las  globulinas) en sentido contrario al resto de las proteínas,
como sí hubieran estado cargadas positivamente, sobre todo si la muestra fue sembrada cerca del
centro de la tira donde las corrientes de succión se anulan.
Considerando el conjunto de todas las fuerzas e interacciones que intervienen en una
corrida electroforética, el proceso final se puede resumir esquemáticamente en la siguiente figura.

Zona 1 Zona 2

La dirección de la corriente eléctrica será del polo negativo (-) hacia el polo positivo (+) y
la dirección de la corriente electroendosmótica, opuesta a la dirección de migración de la
corriente eléctrica, será entonces hacia el polo negativo (-). Las corrientes de succión en la zona 1
(según el esquema) es en el mismo sentido que la electroendósmosis y en la zona 2 a favor de la
corriente eléctrica. En la zona central las corrientes líquidas de succión se anulan.
Para que un proteinograma sea óptimo debe ser nítido y contrastado, o sea sus bandas
deben ser paralelas y bien marcadas, con buena resolución entre ellas (espacios blancos bien
definidos entre ellas).
Variaciones fisiológicas

a) En animales, las observaciones realizadas deben compararse con valores tomados como
normales, según la especie, la edad y técnica empleada. Se acepta generalmente que en los
sueros animales se encuentran las mismas fracciones que en el humano, si bien en
proporciones diferentes.
b) Los valores de las proteínas totales son menores durante la vida fetal y hasta 2 ó 3 meses delnacimiento, especialmente en la fracción  globulina, que es la que contiene la mayor parte de
los anticuerpos (los mamíferos los reciben durante la ingesta del calostro).
c) En el hombre y el perro el contenido de albúmina es superior al de globulinas, en cambio en
el caballo, vaca, oveja y cerdo la relación se invierte (ver cociente proteico
Albúmina/Globulinas en el siguiente cuadro).

Valores Normales de Proteínas Séricas en Diferentes Especies

Suero Proteínas Totales g/100ml
Albúminas
g/100ml
Globulinas
g/100ml

C.P.= Alb.
Glob.

Humano 6,0 – 8,0 3,2 - 4,5 2,7 - 3,6 1,0 - 1,8

Canino 5,5 – 7,5 2,6 - 4,0 2,1 - 3,4 1,0 - 1,7

Bovino 6,0 – 8,5 2,7 - 3,9 2,9 - 4,9 0,6 - 1,0

Ovino 6,0 – 8,0 2,7 - 3,7 3,2 - 5,0 0,4 - 0,8

Equino 6,0 – 8,0 2,4 - 3,8 2,5 - 4,6 0,5 - 1,0

Porcino 6,0 – 8,0 2,3 - 4,0 3,9 - 6,0 0,4 - 0,8

Aplicaciones clínicas

El conocimiento de los valores de un proteinograma constituye un valioso elemento de
juicio para elaborar un diagnóstico, pero siempre debe acompañarse de otros análisis y del
examen clínico del animal enfermo. Una disproteinemia puede cursar con normoproteinemia
(valores normales de proteínas totales) ya que es posible que el descenso de una fracción
compense el incremento anormal de otra. Por esto es importante determinar simultáneamente las
proteínas totales, el proteinograma y la relación Albúmina/Globulinas para adquirir una cabal
idea del estado clínico del paciente.

37
Hiperproteinemia

a) Puede ser causada por hemoconcentración debido a una deshidratación que provocará
hiperalbuminemia e hiperglobulinemia, de modo que se mantiene el cociente proteico
albúmina/globulina normal.
b) Problemas infecciosos e inflamatorios aumentan las proteínas plasmáticas totales por
aumento de síntesis de globulinas. El aumento de  globulinas se debe a estados de defensa
contra agentes infecciosos (inmunidad natural o adquirida por vacunación)
Las  y  globulinas aumentan también en procesos inflamatorios agudos y/o crónicos.

Hipoproteinemia
Resulta de una variedad de estados patológicos que se pueden agrupar en:
a) Desórdenes que producen pérdida de proteínas. Ej: Hemorragias, nefropatías, enteropatías.
b) Desórdenes causados por disminución de la síntesis de proteínas. Ejemplo: Insuficiencia
hepática, mala absorción, desnutrición, neoplasia hepática, que cursan con hipoalbuminemia;
o hipoplasia y neoplasia linfoide que presentan hipo  globulinemia.
c) En preñez y lactancia debido a las necesidades proteicas aumentadas. En ovinos la albúmina
disminuye en la primera mitad de la gestación, mientras la globulina disminuye en la etapa
final por lo que el calostro es rico en globulinas.

La electroforesis de proteínas séricas ha sido utilizada en estudios inmunoquímicos de
diversas enfermedades en distintas especies (fiebre aftosa, peste porcina, etc.).
En todo proceso inmunitario se produce un aumento de  globulinas (debido a la
generación de anticuerpos que se hallan presentes en dicha fracción) y muchas veces de las 
globulinas, cuando el organismo atacado se restablece y obtiene una verdadera resistencia a la
infección.

38
Proteinogramas normales y patológicos en distintas especies

39
8. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

PROTEINOGRAMA ELECTROFORETICO

En la práctica se separarán por electroforesis las diferentes fracciones proteicas del suero
usando como soporte una lámina de acetato de celulosa y como buffer veronal sódico (pH 9,2).
Finalizada la separación, la lámina de acetato de celulosa se tiñe con un colorante (Amido
Schwartz) con el fin de que las distintas fracciones puedan observarse y determinarse
cuantitativamente.
Para la determinación cuantitativa se corta la tira ya teñida para separar las distintas
fracciones, luego se sumerge cada una de ellas en solución eluyente y se realizan las lecturas
fotocolorimétricas respectivas.

1. Material biológico
Suero sanguíneo no hemolizado.

2. Reactivos
a) Solución reguladora de pH 9,2
Dietilbarbiturato de sodio (veronal sódico) p.a. 8,24 g
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
b) Solución colorante
Amido Schwartz 10 B p.a. 5 g
Metanol puro 450 ml
Acido acético glacial puro 100 ml
Agua destilada 450 ml
c) Solución eluyente
Acido acético glacial puro 80 ml
Agua destilada 20 ml
d) Solución lavadora
Metanol puro 475 ml
Acido acético glacial puro 50 ml
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
e) Solución para preteñido del suero
Azul de bromofenol puro 0,1 g
Etanol puro (96% V/V) c.s.p. 100 ml
f) Solución para conservar las tiras
Metanol puro 80 ml
Agua destilada 120 ml

3. Material de laboratorio
1 gradilla para tubos de ensayo
6 tubos de ensayo

40
1 varilla de vidrio
1 pipeta graduada de 10 ml (1/10)
1 pipeta capilar o sembrador
1 policubeta o portaobjetos
1 tijera
1 tira de acetato de celulosa

4. Aparatos e instrumentos
Los equipos utilizados para electroforesis están constituidos por una fuente de poder que
suministra la fuerza electromotriz necesaria y una cuba electroforética.
Durante el trabajo práctico experimental se usarán también un transformador de corriente
(220-110 voltios) y un fotocolorímetro.

5. Técnica
Carga de los compartimientos electródicos: Colocar la cantidad apropiada de solución buffer de
pH 9,2 en los compartimientos electródicos, cuidando que el nivel del líquido llegue en ambos
casos hasta la misma altura.
Preparación de las tiras de acetato de celulosa: Sumergir las tiras de acetato de celulosa de 2,5
cm de ancho y 8,5 cm de largo en solución buffer de pH 9,2 durante 10 minutos para que se
impregnen bien con la misma. Retirar las tiras y eliminar el exceso de líquido secándolo con
papel de filtro (*). Inmediatamente, colocarlas sobre el soporte de la cuba electroforética tratando
de que queden bien tensas y que sus extremos se hallen sumergidos en cada uno de los
compartimientos.
Preparación de la muestra: Colocar dos gotas del colorante indicador (azul de bromofenol) en un
portaobjetos o policubetas. Inflamar hasta evaporar el solvente (etanol), dejar enfriar y agregar
dos gotas de suero sobre el residuo sólido del colorante. Mezclar hasta que el conjunto tome color
azul bien homogéneo. Este preteñido servirá como indicador del avance del frente de proteínas (o
sea de la albúmina).
Siembra de la muestra: Cargar el sembrador con la mezcla de suero y colorante. Retirar el exceso
de suero y apoyarlo suavemente del lado no brillante de la tira a 2 cm del compartimiento
catódico.

Esperar 3 minutos para que la muestra sea completamente adsorbida por el soporte y tapar
la cuba.

41
Ajuste de la intensidad de corriente: Conectar la cuba electroforética a la fuente de tensión de
manera que el cátodo se halle del lado que se sembró la muestra. Mediante el control de ajuste de
la corriente, aumentar la diferencia de potencial hasta que el miliamperímetro marque una
intensidad de corriente correspondiente a 1,5 - 2,0 miliamperes por tira. Mantener el sistema en
estas condiciones hasta que la albúmina, que corre coloreada, se desplace de 35 a 45 mm
(aproximadamente 45 minutos).
Coloración de las fracciones proteicas: Una vez finalizada la separación electroforética,
sumergir las tiras en el reactivo colorante de 3 a 5 minutos (no más). Eliminar el exceso de
colorante mediante sucesivos lavados con la solución lavadora hasta que ésta permanezca
incolora (generalmente bastan 3 lavados).

(*) IMPORTANTE: Debe tenerse especial cuidado en evitar que las tiras queden
expuestas al aire sin estar en contacto con el buffer. La deshidratación de las mismas puede
alterar irreversiblemente al acetato de celulosa.

6. Valoración cuantitativa:
La valoración cuantitativa de las fracciones puede realizarse por dos métodos:
densitometría y elución.

6.1. Densitometría (no se hace en este trabajo práctico experimental).El aparato utilizado en este caso es un densitómetro que mide la intensidad del color de
cada zona por transparencia o reflexión.
Primero la tira debe ser sometida a un tratamiento químico que la transparenta sin alterar
la intensidad de la tinción de cada fracción proteica.

Técnica de transparentación: Se sumerge la tira lavada 1º en metanol anhidro durante 1 minuto,
y 2º en una solución formada por: metanol (85 ml), ácido acético (14 ml) y glicerina (1 ml),
durante 2 minutos. Luego se coloca sobre una placa de vidrio y se deja en estufa a 70°C (o bajo
lámpara) durante unos minutos hasta transparencia completa. Se invierte la placa de vidrio sobre
el papel de filtro, se deja enfriar 20 minutos como mínimo y se separa la tira transparentada.

Luego se la coloca en el densitómetro, que esencialmente funciona como un
fotocolorímetro. La tira trasparentada se desplaza (como una diapositiva en un proyector)
perpendicularmente a un haz de luz. A medida que este haz intercepta las franjas coloreadas, las
absorbancias producidas son traducidas al movimiento de una pluma o aguja registradora que
va graficando el densitograma sobre un papel milimetrado que se desplaza sincrónicamente con
la tira electroforética.

La superficie de cada "pico" del densitograma (o forograma) obtenido representa la
cantidad de proteínas en la fracción respectiva.

Dicha superficie puede medirse mediante varios métodos que no se describirán en este
curso.
El porcentaje proteico de cada fracción se calcula mediante simples reglas de tres; por
ejemplo para  globulina:
%100
%
.
. 


totalSup
Sup o bien
ml
TPg
ml
g
totalSup
Sup
100
..
100
.
.




43
En el segundo caso es necesario valorar proteínas totales (g%) por cualquier otro método
(por ejemplo utilizando la reacción del Biuret).
Las ventajas principales del densitograma son que, conociendo bien la forma de la curva
normal, permite visualizar rápidamente alguna posible alteración patológica sin necesidad de
recordar cifras y que pueden informarse o archivarse junto con el proteinograma el cual, estando
transparentado, se conserva indefinidamente.
La desventaja reside en que el densitómetro es costoso, tiene una calibración algo
engorrosa y requiere además proteinogramas muy bien corridos (sin manchas ni franjas curvadas
o deformadas).

6.2. Elución. Es el método que se utilizará en el trabajo práctico experimental.
Para ello rotular seis tubos de ensayo: B, Alb., 1, 2,  y  globulinas, colocar en cada
uno 2 ml de solución eluyente.
Seleccionar la tira de manera que las fracciones queden separadas. Esto se logra cortando
por la parte media de la zona más clara que separa a las fracciones, como se indica en la figura.

Utilizar como blanco una sección de la misma tira de una superficie equivalente a la de
cualquiera de las fracciones y que no contenga colorante. Colocar los recortes así obtenidos en
los tubos de ensayos correspondientes. Dejar en contacto y agitar repetidamente durante el
tiempo necesario para que la tira y el colorante sean disueltos por la solución eluyente.
Realizar la lectura fotocolorimétrica contra un blanco a 620 nm.

7. Cálculos:
Una vez realizadas las lecturas en el fotocolorímetro se tendrán cinco valores de absorbancia:
AAlb, A1, A2, A y A. Sumando todas ellas obtenemos At, que representa la absorbancia total:
  AAAAAA albt 21
Para obtener la concentración relativa de cada una de las fracciones tendrá que tenerse en
cuenta que At representa 100%. Por lo tanto conociendo la absorbancia de cada fracción, por
regla de tres puede realizarse el cálculo. Calcular también la concentración absoluta de las
distintas fracciones teniendo en cuenta que la concentración de proteínas totales representa el
100% y conociendo la concentración relativa de cada fracción por regla de tres puede realizarse
el cálculo. Volcar estos resultados en el cuadro del informe. Luego hallar el cociente proteico
como se indica en el informe.

Apellido y nombre:
Comisión:
Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL
PROTEINOGRAMA ELECTROFORETICO

1. Objetivo y fundamento

......................................................................................................................................................

2. Resultados

Fracción Absorbancia corregida

Concentración relativa
(%)

Concentración
absoluta (g%)

Albúmina

1 globulina

2 globulina

 globulina

 globulina

Globulinas Totales

Proteínas totales

100

En general es muy utilizado el llamado cociente proteico que está dado por la relación
Albúmina/Globulinas:
GlobulinasdeiónConcentrac
AlbúninadeiónConcentracPC
..
.... 

Este cociente tiene importancia diagnóstica en situaciones patológicas.

3. Conclusiones

......................................................................................................................................................

............................................................................................................................................................................................................................................................................................................

46
BIOENERGETICA

TEMARIO

1. Definición.

2. Principios de la Termodinámica. Primer principio de la termodinámica. Segundo principio de
la termodinámica.

3. Variación de energía libre. Sentido de los procesos. Energía libre y energía libre estándar.
Reacciones energéticamente acopladas. Reacciones sucesivas.

4. Compuestos de alta energía.

5. Carga energética de la célula.

47
1. DEFINICION

La bioenergética es el campo de la bioquímica que estudia la transformación y el uso de la
energía en los sistemas biológicos.
El sistema en estudio más el medio ambiente que lo rodea constituyen el universo. Un
sistema termodinámico puede ser una reacción química, una célula o un organismo completo.
Los sistemas pueden ser abiertos, cerrados o aislados, según intercambien materia y/o energía
con su medio ambiente. Los sistemas biológicos se consideran sistemas abiertos, o sea que
pueden intercambiar materia y energía con su medio ambiente.
2. PRINCIPIOS DE LA TERMODINAMICA

2.1. Primer Principio de la Termodinámica

Establece que la energía del universo permanece constante, por lo que la energía total de un
sistema más la de su medio ambiente es constante. Esto implica que la energía no se crea ni se
destruye, sino que se transforma. Es así como las represas hidroeléctricas transforman la energía
cinética del agua en enegía eléctrica y ésta a su vez en energía lumínica en nuestros hogares. Del
mismo modo un animal transforma la energía química de los alimentos en energía mecánica de la
contracción muscular que conlleva a la enegía cinética observada en su desplazamiento.
Es importante destacar que sólo una parte de la energía que se transforma es aprovechada, el
resto se pierde o sea que no puede ser utilizada para realizar trabajo útil. Por ejemplo sólo una parte
de la energía eléctrica es transformada en una lamparita en energía lumínica, el resto se disipa en
forma de calor. Del mismo modo sólo parte de la energía química será aprovechada en la
contacción muscular, el resto genera calor corporal.
También al producirse una reacción química suele haber un flujo de energía (en general
calórica) entre el sistema y el ambiente que debe ser acompañado por un cambio que lo compense
en el contenido energético del sistema o en el trabajo realizado por el sistema sobre dicho ambiente.

2.2. Segundo Principio de la Termodinámica

Establece que la entropía del universo va en aumento, por lo que la entropía del universo se
incrementa en cada proceso. Proporciona un criterio para predecir el sentido de cualquier proceso.
Establece que los procesos físicos y químicos se desarrollan en el sentido en que la entropía del
universo alcanza un máximo; en este punto tiene lugar el equilibrio. Un sistema está en equilibrio
con su medio ambiente cuando la entropía se incrementó a un máximo y no existe energía
disponible para manejar los procesos. Así, la tendencia a incrementar la entropía actúa como una
fuerza que maneja los sistemas hacia el equilibrio con su medio ambiente.
Es interesante destacar que cuando un sistema evoluciona hacia el equilibrio se puede
producir intercambio energético con el medio ambiente y por lo tanto realizar trabajo útil, pero al
llegar al equilibrio ya no. Es por ello que también se define a la entropía como la fracción de la
energía interna total del sistema que no puede ser utilizada para desarrollar trabajo útil. En las

48
reacciones químicas se produce intercambio energético con el medio ambiente mientras la misma
transcurre hacia el equilibrio, pero ya no al alcanzarlo.
3. VARIACION DE LA ENERGIA LIBRE

3.1. Sentido de los procesos

La variación de energía calórica interna total de un sistema o variación de entalpía (H) está
definida como la suma de la fracción de esa energía que puede ser aprovechada para realizar
trabajo útil (variación de energía libre, G) y la fracción que no es capaz de realizar trabajo útil
(variación de entropía, S), siendo T la temperatura absoluta:

H = G + T S

Por lo tanto, la energía libre de Gibbs (G) es una función termodinámica de estado que define la
condición de equilibrio en términos de la entalpía y entropía de un sistema a presión y temperatura
constantes:

G = H - T S

La habilidad de un sistema para realizar trabajo disminuye a medida que se aproxima al
equilibrio, y en el equilibrio no hay energía disponible para realizar trabajo. Si G es negativo el
proceso es espontáneo, si G es positivo el proceso no es espontáneo y si G es cero el sistema
está en equilibrio.
Los sistemas biológicos (por ej. células, organismos) son sistemas abiertos, o sea que
pueden intercambiar materia y energía con su medio ambiente; los cambios de energía y de
entropía serán de importancia para determinar la dirección de los procesos termodinámicamente
favorables. Las células vivas, son sistemas abiertos de evolución irreversible que se encuentran en
un estado estacionario dinámico. Un sistema abierto en el estado estacionario es capaz de realizar
trabajo, porque está alejado de su condición de equilibrio.

3.2. Energía libre y energía libre estándar

La energía libre de Gibbs (G) de una solución de una sustancia A está relacionada a su
energía libre de Gibbs estándar (Gº). La energía libre estándar de una sustancia A se define para
una solución 1 M a una presión de 1 atm, 25ºC (298ºK) y pH 0 en sistemas físico-químicos. En el
caso de los sistemas biológicos el pH es de 7 y la energía libre y la energía estándar se expresan
como G' y Gº', respectivamente:

G'A = G'A + RT ln [A]

Si se considera la reacción:

aA +bB <–––––––––> cC + dD

La variación de energía libre (G') para la reacción es:

G' = (cG'C + dG'D) - (aG'A + bG'B)

Reemplazando la expresión para la energía libre estándar de cada componente de la reacción
anterior, se obtiene:

G' = (cG'C + dG'D - aG'A + bG'B) + RT ln [C]c ·[D]d
[A]a ·[B]b

El término entre paréntesis en la ecuación es la variación de energía libre estándar para la
reacción (G'), mientras que el segundo término dependerá de la relación X en un determinado
momento tal que:
X = [C]c [D]d
[A]a [B]b

De este modo se obtiene la ecuación (1) que determina los posibles valores de G':

G' = G' + RT ln [C]c ·[D]d
[A]a ·[B]b (1)

La variación de energía libre para una reacción química es la fracción de la energía total
del sistema que es capaz de realizar trabajo útil cuando el sistema evoluciona al equilibrio a
presión (1 atm), temperatura (25ºC ó 298ºK) y pH (7) constantes. Debido a que los metabolitos de
una reacción química difícilmente se encuentren en las células en concentraciones estándar, la
variación de la energía libre de una reacción química dependerá de las concentraciones iniciales de
reactivos y productos. De este modo la G' para una reacción puede tomar infinitos valores según
sean las concentraciones de los reactantes y de los productos. El criterio de espontaneidad para una
reacción está determinado por el valor de G', no de Gº'. Si el valor de G' es negativo la
reacción es espontánea, si es positivo es no espontánea y si es cero está en equilibrio.

Por otro lado, en elequilibrio el cambio de energía libre es cero y X es la constante de
equilibrio (Keq) para la reacción. Así a partir de la ecuación (1) obtenemos:

0 = G'+ RT ln {[C]c.[D]d}eq
{[A]a.[B]b} eq

G' = -RT ln Keq (2)

50
La ecuación (2) establece la relación entre la variación de la energía libre estándar y la
constante de equilibrio de una reacción. El valor de G' es único dado que depende de la Keq que
es una constante. Cuando la Keq es > 1 la Gº' es negativa, significa que la reacción es exergónica
y por eso energéticamente favorable. Cuando la Keq es < 1 la Gº' es positiva, la reacción es
endergónica y no es energéticamente favorable.

En las células hay reacciones químicas que son termodinámicamente favorables
(exergónicas) y otras que no lo son (endergónicas). Sin embargo, es necesario que ambos tipos de
reacciones puedan llevarse a cabo en forma espontánea en las mismas. Para ello las células recurren
a dos tipos de estrategias, las reacciones energéticamente acopladas o las reacciones sucesivas.

3.3. Reacciones energéticamente acopladas

En este caso, a una reacción química endergónica se le acopla una reacción química
altamente exergónica que impulsa energéticamente a que la primera se produzca. El caso más
simple de acoplamiento de energía se produce cuando dos reacciones metabólicas comparten un
intermediario común:
Keq1
A + B <–––––––––> C G1' = +10 Kcal/mol
Keq2
C + D <–––––––––> E G2' = -30 Kcal/mol

La constante de equilibrio de la reacción final (Keq3) es igual al producto de las constantes
de equilibrio de las reacciones individuales:

Keq3
A + B + D <–––––––––> E Keq3 = Keq1 . Keq2

El cambio de energía libre estándar total (Gº´3) para una serie de reacciones químicamente
acopladas, es igual a la suma algebraica de la variación de energía libre estándar de las etapas
individuales:

G3'= G1' + G2' = [+10 + (-30)] Kcal/mol = -20 Kcal/mol

Si la reacción para la producción de C es endergónica (G1 > 0) y el equilibrio se desplaza
hacia la izquierda, la reacción neta puede todavía ser exergónica, resultando en la formación neta
de E. Esto ocurre si el cambio de energía libre estándar para la formación de E es lo
suficientemente exergónico como para sobrepasar el cambio de energía libre estándar para la
producción de C. Las dos reacciones están energéticamente acopladas y la segunda reacción provee
la fuerza termodinámica necesaria para impulsar la primera reacción.
El flujo de energía en el metabolismo celular se produce mediante reacciones
energéticamente acopladas en las cuales participa como intermediario el ATP. La mayoría de las
reacciones energéticamente acopladas en las que participa el ATP involucran la transferencia del

51
grupo fosfato a partir del ATP a otras sustancias, o a partir de un metabolito rico en energía al ADP
formando ATP.
Así, la hidrólisis del fosfoenolpiruvato (PEP) que es altamente exergónica (G -14,8
Kcal/mol) es capaz de sintetizar ATP (proceso endergónico, G 7,3 Kcal/mol) en un proceso
termodinámicamente favorecido:

(1) Hidrólisis de
fosfoenolpiruvato (PEP) PEP + H2O –––––––> piruvato + Pi G10' = -14,8 Kcal/mol

(2) Fosforilación de ADP ADP + Pi –––––––––> ATP + H2O G20' = +7,3 Kcal/mol
______________________ ____________________________ _________________

(1) + (2): Fosforilación PEP + ADP –––––––––> piruvato + ATP GT0'= -7,5 Kcal/mol
acoplada de ADP por PEP

Del mismo modo, la hidrólisis del ATP (proceso exergónico, G -7,3 Kcal/mol) puede
ceder energía para el proceso endergónico de fosforilación de la glucosa (G 3,3 Kcal/mol):

(1) Hidrólisis de ATP ATP + H2O –––––––––> ADP + Pi G10' = -7,3 Kcal/mol

(2) Fosforilación de la glucosa G + Pi –––––––––> G 6-P + H2O G20' = +3,3 Kcal/mol
__________________________ __________________________ _________________

(1) + (2): Fosforilación acoplada ATP + G –––––––––> ADP + G 6-P GT0' = - 4,0 Kcal/mol
de glucosa por ATP

Esto explica el comportamiento del ATP como un agente de transferencia de fosfato
versátil a través de reacciones energéticamente acopladas.

3.4. Reacciones sucesivas

En otros casos, las células modifican las concentraciones de los reactantes y de los
productos haciendo que las reacciones endergónicas puedan realizarse igual en forma espontánea.
Si los productos están en baja concentración por estar siendo continuamente utilizados en
reacciones posteriores, el valor de G' puede ser negativo al transformarse el segundo término de la
ecuación (1) en un mayor valor absoluto y negativo tal que supere el valor positivo de G':

G' = G' + RT ln [C]c ·[D]d
[A]a ·[B]b (1)

En este caso, la concentración de los productos C y/o D baja al ser utilizados como
reactantes de una reacción sucesiva que los consuma. Este concepto es importante porque las
reacciones que no son termodinámicamente favorables basadas en su G (endergónicas) pueden
transformarse en espontáneas modificando las concentraciones de los reactantes y de los productos.

52
4. COMPUESTOS DE ALTA ENERGIA

Los compuestos de alta energía son sustancias que poseen altos valores de energía libre
estándar de hidrólisis (G > -5,0 Kcal/mol) y que por lo tanto son aptas para ser utilizados por las
células como dadores de energía para reacciones energéticamente acopladas, transporte activo a
través de membranas, procesos de contracción celular, etc. Existen principalmente dos tipos de
compuestos de alta energía, los compuestos con grupo fosfato y los tioésteres.
Entre los compuestos con grupo fosfato podemos nombrar al fosfoenolpiruvato (G -14,8
Kcal/mol), 1,3-bisfofoglicerato (G -11,8 Kcal/mol), fosfocreatina (G -10,3 Kcal/mol), ATP
(G -7,3 Kcal/mol), entre otros. El ATP es un compuesto relativamente inestable (carga -4) cuya
hidrólisis es termodinámicamente favorable al rendir como producto dos compuestas más estables,
el ADP (carga -3) y fosfato (estabilizado por resonancia).
Entre los tioésteres se encuentran el SuccinilCoA (G -10,2 Kcal/mol) y el AcetilCoA
(G -7,5 Kcal/mol). La hidrólisis del AcetilCoA es termodinámicamente favorable al producir
Acetato, compuesto que se estabiliza por resonancia.
5. CARGA ENERGETICA DE LA CELULA

La capacidad de una célula para llevar a cabo reacciones conducidas por el ATP depende de
las concentraciones relativas de ATP y de sus productos de hidrólisis. La suma de la concentración
de ATP y de sus productos de hidrólisis en las células se mantiene constante. Esto es lo que se
conoce como el sistema adenilato:

ATP + ADP + AMP = constante

Esta expresión significa que una forma química se transforma en otra según el nivel de
energía presente en la célula.
Debido a que la hidrólisis de ADP es también una reacción de alta energía (G -7,3
Kcal/mol), la cual puede ser usada en algunos procesos, el estado energético de la célula puede ser
mejor descripto por la relación llamada carga energética:

carga energética = [ATP] + 1/2 [ADP]
[ATP]+[ADP]+[AMP]

En el numerador están las concentraciones de las formas que pueden actuar como fuente
de energía libre, mientras que el denominador incluyetanto el ATP como todos sus productos de
degradación. El valor de la carga energética oscila entre 0 (todo está presente como AMP) y 1
(todo estaría presente como ATP). La mayoría de las células normales funcionan con valores de
carga energética de alrededor de 0,9.
Una forma práctica para expresar la carga energética de una célula es la relación
[ATP]/[ADP], así valores elevados significan que la célula posee alta carga energética y valores
bajos significa que tiene baja carga energética.

53
ENZIMAS

TEMARIO

Enzimas como catalizadores biológicos. Clasificación. Especificidad. Sitio activo.
Complejo E-S. Cinética enzimática: Ecuación de Michaelis-Menten. Estado estacionario.
Significado de las constantes KM y Vmáx. Representación gráfica de dobles recíprocas.
Inhibidores reversibles: competitivos y no competitivos. Enzimas reguladoras: alostéricas y por
modificación covalente.
Estos conceptos deben ser conocidos por el alumno para poder comprender los siguientes
temas.

1. Aislamiento y purificación de enzimas. Medida de la velocidad. Medida de la actividad
enzimática. Aspectos técnicos del trabajo con enzimas. Extracción y purificación de enzimas.
Grado de pureza y rendimiento.

2. Determinación de la actividad de la lipasa pancreática. Introducción. Medición de la
actividad de la lipasa pancreática por aparición del producto: Fundamento.

3. Trabajo práctico experimental. Determinación de la actividad de la lipasa pancreática.

54
1. AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE ENZIMAS

La propiedad característica de las enzimas es su capacidad de catalizar ciertas reacciones
químicas bien definidas. La presencia de una enzima se detecta, en general, por la reacción que
cataliza y la cantidad de la misma se estima a partir de la velocidad de reacción.

1.1 . Medida de la velocidad

Es el paso esencial en la técnica de estudio de una enzima. La velocidad de una reacción
enzimática se determina midiendo el aumento de producto formado o la desaparición de sustrato
en función del tiempo.
S + Enz –––––––––> P + Enz S = sustrato
P = producto

Se observa que la velocidad disminuye con el tiempo. Las causas de este fenómeno
pueden ser varias:
a) El producto puede ser un inhibidor de la reacción.
b) Al aumentar [P] aumenta la velocidad de la reacción opuesta.
c) Al disminuir [S] decrece el grado de saturación de la enzima.
d) Desnaturalización de la enzima.
Uno o varios de estos factores pueden interactuar simultáneamente; para independizarse
de estos problemas entonces se recurre a la medición de la velocidad inicial. Sólo al comienzo de
la reacción, cuando los factores mencionados no han tenido tiempo de actuar, las condiciones se
conocen con precisión. Al trabajar con velocidades iniciales sólo una pequeña fracción del
sustrato se ha transformado en producto, si la [P] es pequeña la reacción opuesta es prácticamente
nula y tampoco puede actuar como inhibidor. La velocidad inicial se determina trazando la
tangente al tiempo cero (t).

55
Los métodos usados para realizar las curvas de producto formado en función del tiempo
son de dos tipos:

a) En un caso se toman alícuotas de la mezcla de reacción a distintos tiempos y se determina la
formación de producto o desaparición de sustrato.

b) En casos en que la reacción se pueda llevar a cabo en la cubeta del espectrofotómetro, por
ejemplo:
LDH
Lactato + NAD+ –––––––––> Piruvato + NADH + H+

Se mide la aparición de NADH en base a su absorción a 346 nm, sin necesidad de tomar
alícuotas y la curva de producto formado en función del tiempo aparece directamente en la
pantalla del aparato.

1.2 . Medida de la actividad enzimática

Se define la unidad enzimática como la "cantidad de enzima que cataliza la
transformación de un mol de sustrato por minuto". Otra posibilidad es definirla en relación con
el método utilizado para su valoración.
La actividad específica (AE) es una medida de la pureza de la preparación enzimática y se
expresa como UE/mg de proteína. Durante el proceso de purificación de enzimas tanto las
unidades enzimáticas (UE) como la actividad específica (AE) de la preparación sufren
variaciones.

1.3. Aspectos técnicos para el trabajo con enzimas

El éxito en el trabajo con enzimas depende del cuidado con que se eviten las condiciones
en las cuales son inestables. Estas condiciones varían con cada enzima, pero en general deben
evitarse las altas temperaturas y la acidez o alcalinidad extremas. Durante el aislamiento y
purificación se debe trabajar a 0°C (para que la enzima no pierda actividad) y evitar pH
superiores a 9 o inferiores a 5. Los solventes orgánicos inactivan muchas enzimas a temperatura
ambiente, de modo que los fraccionamientos con los mismos deben efectuarse a baja temperatura.
Por último las purificaciones deben llevarse a cabo sin pérdida de tiempo y en caso necesario los
extractos se deben guardar en congelador, siempre y cuando la enzima esté disuelta en un medio
adecuado para ello.
Para determinar la actividad enzimática se deben tener en cuenta las siguientes
precauciones:
a) La reacción que cataliza la enzima debe realizarse a la temperatura óptima para la misma.
b) Elegir un buffer adecuado para mantener estable el pH óptimo de la enzima.
c) Evitar la contaminación con detergentes u otras sustancias contaminantes.

56
1.4. Extracción y purificación de enzimas

El paso común para iniciar la extracción de una enzima, es la obtención de un
homogenato. La preparación de un homogenato de tejidos implica la destrucción o disgregación
mecánica de las células y por lo tanto, de la membrana celular, con lo cual se liberan las enzimas
que pasan a solución. Algunos de los métodos utilizados son:
a) Homogeneización mecánica: Puede utilizar un homogeneizador de vidrio, con pistón de
vidrio o teflón, un mortero, licuadora o aparatos similares. A veces se hace con la ayuda de
abrasivos tales como alúmina, bolitas de vidrio, etc.
b) Homogeneización sónica: La radiación sónica se utiliza en general para las bacterias y
levaduras (debido a la mayor resistencia que presentan sus membranas).
c) Desintegración térmica: El congelamiento y descongelamiento repetido permite la
desintegración de la membrana celular. Por congelamiento se forman cristales de hielo
destruyendo la estructura intracelular. Al descongelarse, las células son destruidas
osmóticamente debido a la presencia del agua, liberándose su contenido.
d) Desintegración química: Actúan agentes químicos destruyendo la pared celular. Los más
utilizados son el butanol, éter de petróleo, e isopentano.
Muchas veces, una vez obtenido el homogenato, es conveniente hacer una filtración a
través de gasa o lana de vidrio para separar tejidos conjuntivos y restos celulares. La suspensión
total obtenida por estos métodos es lo que se denomina homogenato o extracto crudo.

A partir del homogenato se puede detectar la actividad enzimática por la reacción que
cataliza la enzima en estudio, pero en general se procede a realizar el aislamiento de la enzima,
utilizando en primer lugar la centrifugación diferencial. En la centrifugación diferencial las
partículas que difieren en densidad y tamaño sedimentan a distintas velocidades por aplicación de
una fuerza centrífuga. Un esquema tipo es el siguiente.

57
Dada la naturaleza proteica de las enzimas, los métodos de purificación utilizados son
los mismos que para proteínas.

1.5. Grado de pureza y rendimiento

Durante la purificación de una enzima, en cada fracción obtenida luego de los distintos
pasos del proceso de purificación empleado, se determinarán las UE y proteínas totales. Con
estos datos se obtiene la AE = UE/mg proteínas que nos permite conocer si hubo purificación,
ya que a mayor AE tendremos menor cantidad de proteínas extrañas.

1.5.1. Grado de pureza
Ala AE obtenida para el homogenato se le asigna el grado de pureza 1, conociendo la AE
de cada fracción, podemos calcular el grado de pureza de cada una de ellas, a mayor AE, mayor
purificación.

1.5.2. Rendimiento
Si al homogenato se le asigna el 100% de enzima presente, se puede calcular el
rendimiento de cada fracción en base a las UE calculadas para cada una de ellas.

El siguiente cuadro, sirve como ejemplo de una buena purificación acompañada de un
buen rendimiento.

FRACCIÓN UE PROT. TOT. (mg)
AE
(UE/mg)
REND.
(%) PURIFICACION
Homogenato crudo de hígado 100.000 10.000 10 100 1
Sobrenadante 100.000 g. 98.000 8.000 12,2 98 1,22
Precipitación con solución saturada
(NH4)2SO4; 20-35% de saturación
90.000 1.500 60 90 6
Precipitación con solución saturada
(NH4)2SO4; 40-50% de saturación
60.000 250 240 60 24
Resina de intercambio DEAE*:
50-100 58.000 29 2.000 58 200

* DEAE: dietil amino etilcelulosa (resina de intercambio aniónico)

58
2. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA LIPASA
PANCREATICA

2.1. Introducción

Los animales superiores degradan los triacilglicéridos ingeridos mediante la acción de
enzimas hidrolíticas (lipasas) del jugo pancreático, en el intestino delgado. Para que la lipasa
pancreática actúe, es necesario que los triacilglicéridos estén solubilizados en el jugo intestinal.
En el organismo esto tiene lugar por la acción detergente de las sales biliares. La lipasa
pancreática cataliza la reacción:

La hidrólisis completa de los triacilglicéridos produce glicerol y ácidos grasos. Sin
embargo se demostró que la lipasa pancreática es específica para la hidrólisis de las uniones ester
primarias y de hidrolizar la unión ester en la posición 2 del triacilglicérido lo haría en forma muy
lenta. Por lo dicho, debido a la dificultad de la hidrólisis de la unión ester secundaria en el
triacilglicérido, resulta que los 2-monoacilglicéridos constituyen los principales productos finales
de la digestión de las grasas.

2.2 . Medición de la actividad de la lipasa pancreática por aparición del
producto: Fundamento

Para estudiar la actividad de la lipasa pancreática es necesario disponer del sustrato
adecuado: triacilglicéridos. Una fuente de triacilglicéridos de fácil acceso es la leche que posee
un 3% de sustancias grasas. Los triacilglicéridos presentes en la leche se hidrolizan en presencia
de la lipasa pancreática liberando ácidos grasos, por lo tanto se medirá la actividad de la enzima
por titulación de dichos ácidos grasos liberados (aparición de producto) con una base de
concentración conocida.

Lipasa
pancreática

59
3. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA LIPASA PANCREATICA

1. Material biológico
Leche entera

2. Reactivos
a) Solución de rojo fenol (fenol sulfonftaleína)
(Vira del amarillo al rojo a pH 7,2)
Rojo fenol 0,1 g
Solución de NaOH 0,01 N 28,2 ml (0,04 g NaOH en 100ml de solución)
Agua destilada c.s.p. 250 ml
b) Extracto pancreático
c) Solución de NaOH 0,005 N
NaOH 0,2 g
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
d) Leche a pH 8,0
A 500 ml de leche entera se le agregan 50 gotas de solución de rojo fenol y tantos ml de
solución de NaOH 1 N como para obtener un color ligeramente rosado. Se prepararán 20 ml para
cada grupo de alumnos.

3. Material de laboratorio
1 tubo de ensayo
1 tapón para tubo de ensayo
1 pipeta de 0,2 ml
1 pipeta de 1 ml
1 pipeta de 5 ml
1 pipeta de 10 ml
1 bureta de 25 ml
1 vaso de precipitación de 50 ml
3 Erlenmeyers de 50 ml
1 embudo de plástico

4. Aparatos e instrumentos
Baño termostático a 37°C

5. Técnica

Colocar en 1 tubo de ensayo los reactivos que figuran en el siguiente cuadro.

Extracto pancreático en solución (ml)

0,2

Agua destilada (ml)

0,8

Leche con rojo fenol pH 8,0 (ml)

Tapar el tubo de ensayo y mezclar suavemente por inversión. Incubar a 37°C en un baño
termostático durante 30 minutos. Entre tanto preparar la bureta para titular los ácidos grasos
liberados, agregando NaOH 0,005 N mediante un embudo de plástico y enrasar a cero.
Colocar en el vaso de precipitación 3 ml de leche con rojo fenol (pH 8,0) y el volumen de
agua destilada necesario para usar como referencia de color rosado en la titulación.
A los 30 minutos tomar 3 ml del contenido del tubo de ensayo, colocarlos en un
erlenmeyer de 50 ml y titularlo con la solución de NaOH contenida en la bureta, agregando gota a
gota hasta obtener el color rosado de referencia.
Antes de realizar la titulación de los 30 minutos verificar que el color rosado inicial de
la leche a pH 8,0 haya virado al amarillo por la acción de los ácidos grasos liberados por la
lipasa; en caso contrario no se realizará la titulación y se dejará mayor tiempo de incubación
(observar a los 5 minutos y anotar el tiempo).
Repetir las titulaciones sacando muestras de 3 ml de leche a los 60 y 90 minutos de
incubación.
A partir de los volúmenes gastados de la solución de NaOH 0,005 N para titular cada una
de las muestras (30, 60 y 90 minutos), calcular el número de miliequivalentes de ácidos grasos
presentes en 3 ml de muestra y anotar los datos en la tabla correspondiente al informe del trabajo
práctico experimental.

4. Cálculo de la titulación

La titulación ácido base se fundamenta en que en el punto de equivalencia:

número de equivalentes de ácido = número de equivalentes de base

Siendo el número de equivalentes = Volumen x Normalidad (V x N). En este caso los
ácidos que se titulan son los ácidos grasos liberados a partir de los triacilglicéridos de la leche por
acción de la lipasa pancreática y la base utilizada es una solución 0,005 N de NaOH (0,005
mEq/ml).
número de equivalentes de ácido = V de base x N de base

Si el volumen de base gastado se mide en ml y la normalidad se expresa mEq/ml, la
cantidad de ácido graso titulada se expresará en mEq.
Construir en papel milimetrado un gráfico de miliequivalentes de ácido en función del
tiempo en minutos. Trazar la tangente al origen para determinar la velocidad inicial (Vo)
expresada en UE. Calcular la AE del extracto pancreático (dato: concentración proteica del
extracto pancreático en mg/ml).

61
Apellido y nombre:
Comisión:
Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA LIPASA
PANCREATICA

1. Objetivo y fundamento

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................2. Resultados

Volumen de NaOH (ml)
0,005N
mEq de ácido liberado Tiempo en minutos

62
Realizar un gráfico en papel milimetrado

Calcular Vo en UE : UE
mEq
utos
 
min

Calcular AE: AE
UE
mg prot
 
. .

FERMENTACION LACTICA

TEMARIO

Entrada de glucosa a la célula. Glucosa metabolizable. Glucolisis. Objetivo de la
glucolisis. Enzimas reguladoras. Balance energético. Condiciones energéticas para el
funcionamiento de la vía. Estos conceptos deben ser conocidos por el alumno para poder
comprender los siguientes temas.

1. Procesos aeróbicos y anaeróbicos. Introducción. Fermentación láctica. Acción de las
enzimas de los microorganismos del yogur sobre la lactosa de la leche. Titulación del ácido
láctico producido. Cálculo de la acidez. Inhibición enzimática de la glucolisis.

2. Trabajo práctico experimental. Fermentación láctica.

64
1. PROCESOS AEROBICOS Y ANAEROBICOS

1.1. Introducción

Comenzaremos a estudiar la generación de energía metabólica con el estudio de la
glucolisis, que es una vía universal en los sistemas biológicos. La glucolisis está constituida por
una secuencia de reacciones que convierten la glucosa en piruvato con producción de ATP.
Bajo condiciones aeróbicas, el piruvato entra en la mitocondria donde es completamente oxidado
a CO2 y H2O. Si en cambio la cantidad de oxígeno es insuficiente (anaerobiosis) como en el caso
de una contracción muscular intensa, el piruvato se convierte en lactato en el citosol. En
algunos microorganismos anaeróbicos como las levaduras, el piruvato es transformado en etanol.
La formación de etanol y de lactato a partir de la glucosa son ejemplos de procesos
fermentativos.

CO2 + H2O (aerobiosis)
glucolisis 
Glucosa - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -> Piruvato

Lactato (anaerobiosis)

Existen además otros tipos de fermentaciones que se estudiarán en el metabolismo
ruminal, como por ejemplo la fermentación acética, propiónica, butírica, etc.
El objetivo de la formación de lactato a partir de piruvato es reoxidar la coenzima
NADH (factor limitante del sistema). El estudio de la vía demostró que en ella participan dos
tipos de compuestos: algunos de 6 átomos de carbono y otros de 3 átomos de carbono. Los
primeros derivan de la glucosa o fructosa y los últimos del gliceraldehído, de la dihidroxiacetona
fosfato, del glicerato y del piruvato. Todos los intermediarios entre la glucosa y el piruvato están
fosforilados y los grupos fosfato están unidos a los -OH de las hexosas o triosas formando ésteres
fosfóricos o anhídridos.

1.2. Fermentación láctica

En este trabajo práctico experimental se evaluará la fermentación láctica.
Para estudiar dicho proceso se hacen actuar los microorganismos del yogur (Lactobacillus
bulgaricus y Streptococcus thermofilus) sobre los azúcares de la leche, principalmente la lactosa.
El ácido láctico producido, se valorará por titulación con una base de concentración conocida.

65
1.3. Desdoblamiento de la lactosa de la leche por las enzimas de los microorganismos del
yogur

1.4. Producción de ácido láctico

Se prepara una mezcla leche – yogur y se la fracciona en tres partes.
Una de ellas se coloca a 0°C para evitar la acción enzimática y servirá como blanco de acidez
(B), debido a que la leche tiene un pH menor a 7.0 por la presencia de pequeñas cantidades de
sustancias de carácter ácido y al CO2 disuelto; además el yogur agregado aumenta la acidez
natural de la leche. A otra fracción de la mezcla se le agrega un inhibidor de la glucolisis:
muestra + inhibidor (M+I) y junto con la tercera fracción sin agregados: muestra (M), se
incuban a 45°C, que es la temperatura óptima para la actividad de los microorganismos del yogur.

1.5. Titulación de acidez y cálculo del ácido láctico producido

La titulación ácido-base se fundamenta en que en el punto de equivalencia se cumple que:

número de equivalentes de ácido = número de equivalentes de base

Siendo el número de equivalentes = Volumen x Normalidad

Vácido . Nácido = Vbase . Nbase (1)

En este caso el ácido es el ácido láctico producido durante la fermentación y la base es
una solución de hidróxido de sodio (0,6 N ) con la que se realiza la titulación por lo tanto:

número de equivalentes de ácido láctico = VNaoH . NNaoH (2)

Para calcular el número de equivalentes de ácido láctico producidos durante la
fermentación, deben descontarse los equivalentes de ácido propios de la leche y del yogur
agregado, para lo cual, al volumen de solución de NaOH gastados en titular el ácido láctico de la
muestra (Vmuestra), es necesario restar el volumen de solución de NaOH gastados en titular el
blanco: (Vblanco). Remplazando en (2) VNaoH por (Vmuestra - Vblanco) resulta que:

número de equivalentes de ácido láctico = (Vmuestra - Vblanco) . NNaoH (3)

Las unidades a utilizar son:
a) Si se expresan las normalidades en Equivalente/litro y los volúmenes en litros, el resultado
quedará expresado en Eq de ácido láctico.
b) Si se expresan las normalidades en mEq/ml y los volúmenes en ml, el resultado quedará
expresado en mEq de ácido láctico.

1.6. Inhibición enzimática de la glucolisis

En el trabajo práctico se estudiará la inhibición producida por la yodoacetamida
(ICH2-CONH2) sobre la enzima gliceraldehído-3-P deshidrogenasa, la que cataliza la siguiente
reacción:

Gliceraldehído-3-P + Pi + NAD+ <–––––––> 1,3-bifosfoglicerato + NADH + H+

La inhibición irreversible es debida a la combinación del inhibidor con los grupos -SH
esenciales de la enzima, según la siguiente reacción.

E-SH + ICH2-CONH2 ––––––––––––––––––> ES-CH2-CONH2 + IH
  
enzima inhibidor complejo inactivo
activa yodoacetamida

67
2. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

FERMENTACION LACTICA

1. Muestra
Leche
Yogur

2. Reactivos
a) Solución de hidróxido de sodio 0,6 N
Hidróxido de sodio p.a. 24 g
Agua destilada c.s.p. 1000 ml
b) Solución de fenolftaleína 0,1%
Fenolftaleína pura 0,1 g
Etanol 96% c.s.p. 100 ml
c) Solución 0,1 M de yodoacetamida
Yodoacetamida p.a. 1,85 g
Agua destilada c.s.p. 100 ml

3. Material de laboratorio
1 vaso de precipitación de 500 ml
1 probeta graduada de 100 ml
1 varilla de vidrio
1 pipeta de 1 ml graduada 1/10
3 Erlenmeyers de 125 ml con tapón de corcho o goma
3 Erlenmeyers de 250 ml
1 bureta de 25 ml graduada 1/10
1 vaso de precipitación de 50 ml
1 embudo plástico

4. Aparatos e instrumentos
Baño termostático a 45°C

5. Técnica

Rotular 3 Erlenmeyers de 125 ml con las letras B (blanco), M (muestra) y M+I (muestra +
inhibidor).
En un vaso de precipitación de 500 ml colocar 420 ml de leche y 30 ml de yogur (medidos
con probeta). Mezclar muy bien con la varilla de vidrio. Colocar la mezcla obtenida en los
Erlenmeyers B y M de tal manera que al ser tapados no quede aire dentro de ellos (anaerobiosis).
Introducir rápidamente el Erlenmeyer B en un baño de agua con hielo o en el congelador de la
heladera y anotar la hora.
El Erlenmeyer M se deja por el momento a temperatura ambiente. Al resto de la leche y
yogur que quedó en el vaso, agregarle 0,7 ml de solución 0,1 M de yodoacetamida y mezclar muy

68
bien con la varilla de vidrio. Llenar con esta mezcla el Erlenmeyer M+I y taparlo en forma
similar a los anteriores (anaerobiosis). Dejar los Erlenmeyers M y M+I durante 10 minutos a
temperatura ambiente (preincubación) y luego introducirlos en el baño termostático a 45°C.
Incubar durante 90 minutos.
Al cumplirse los 90 minutos de colocar el Erlenmeyer B en el congelador de la heladera oen el baño de hielo, sacarlo para titular. Para ello medir 100 ml de su contenido con probeta y
pasarlos a un Erlenmeyer de 250 ml. Agregarle 5 gotas de solución de fenolftaleína 0,1% y titular
con solución de hidróxido de sodio 0,6 N hasta color rosado persistente de la fenolftaleína.
Anotar el volumen gastado (en ml) en el cuadro de resultados (Vblanco).
Al cumplirse los 90 minutos de incubación a 45°C de los Erlenmeyer M y M+I, retirarlos
del baño termostático y colocarlos en un baño de agua con hielo (con ésto se consigue detener la
acción enzimática). Una vez fríos, titular en forma semejante a la que se usó para el Erlenmeyer
B. Anotar los volúmenes de solución de hidróxido de sodio (expresados en ml) gastados en cada
una de las titulaciones en el cuadro de resultados en las columnas VM y VM+I.

6. Cálculo

Efectuar las diferencias VM - Vblanco y VM+I - Vblanco, y anotarlas igualmente en las
columnas correspondientes del cuadro. Con ellas calcular mediante la fórmula (3) los
miliequivalentes de ácido láctico producidos en los Erlenmeyers M y M+I. Con estos datos
calcular el porcentaje de inhibición.

mEq de ácido láctico producidos en M ––––––––– 100% de actividad
mEq de ácido láctico producidos en M+I ––––––––– x% de actividad

100% de actividad - x% de actividad = % de inhibición

69
Apellido y nombre:
Comisión:
Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL
FERMENTACION LACTICA

1. Objetivo y fundamento

....................................................................................................................................................

2. Resultados

V (M)
(ml)
V (M+I)
(ml)
V (Blanco)
(ml)
V (M) –
V (Blanco)
(ml)
V (M+I) –
V (Blanco)
(ml)
mEq ác.
(M)
100 ml.
mEq ác.
(M+I)
100 ml
%
Inhibición

70
4. Conclusiones

....................................................................................................................................................

71
REGULACION HORMONAL DEL
METABOLISMO DE LOS HIDRATOS
DE CARBONO

TEMARIO

1. Mecanismos de regulación de glucosa en sangre. Glucosa sanguínea. Vías de entrada y
utilización de glucosa. Mecanismos de regulación hormonal.

2. Método de dosaje de glucosa sanguínea. Método enzimático colorimétrico: Fundamento.

3. Trabajo práctico experimental. Determinación de glucosa en sangre.

72
1. MECANISMOS DE REGULACION DE GLUCOSA EN SANGRE

1.1. Glucosa sanguínea

La glucemia es la concentración de glucosa libre total en sangre. Es una constante del
medio interno fundamental para el suministro energético a los diferentes tejidos, esencialmente
para el sistema nervioso central y los eritrocitos. En los mamíferos domésticos, la glucemia oscila
entre 70 y 110 mg/100 ml en monogástricos y entre 40 y 70 mg/100 ml en poligástricos. En estos
últimos los hidratos de carbono de la dieta fermentan a nivel ruminal por acción de
microorganismos, obteniéndose ácidos grasos volátiles que se absorben a través de la pared del
rumen, por lo tanto la concentración de glucosa en el contenido intestinal es muy baja (10% de la
ingerida). La glucemia en los rumiantes se mantiene en los valores mencionados por la constante
gluconeogénesis hepática que se produce principalmente a partir del ácido graso volátil
propiónico. En poligástricos el ácido graso volátil acetato es utilizado como la principal fuente de
energía de los tejidos (excepto por el sistema nervioso central, los eritrocitos y el hígado).
La homeostasis es la conservación de la composición del medio interno, fundamental para
la salud. Cuando la concentración de alguno de los constituyentes del medio interno varía, el
organismo pone en marcha mecanismos de regulación. El mantenimiento de los niveles de
glucosa en sangre es fundamental para lograr una adecuada distribución en los diferentes tejidos
y principalmente para el sistema nervioso central, debido a que la glucosa es prácticamente el
único compuesto que atraviesa la barrera hematoencefálica en un nivel suficiente para sostener la
función celular normal. Los valores de glucosa sanguínea se mantienen dentro de ciertos límites
por medio de mecanismos regulatorios del organismo.

1.2. Vías de entrada y de utilización de glucosa

1.3. Mecanismos de regulación hormonal

Entre todos los mecanismos de regulación del organismo, el que mantiene los niveles
estables de glucemia es uno de los más finamente regulados. Cualquier variación de este valor,
aún con modificaciones fisiológicas, no críticas, desencadena la activación de mecanismos
reguladores a fin de restablecer los niveles normales de glucemia. En esta función intervienen el

73
hígado, los tejidos extrahepáticos y varias hormonas (sistemashipo e hiperglucemiante). El
hígado es el órgano glucostático por excelencia que regula la concentración de glucosa en sangre.
El sistema hiperglucemiante actúa cuando desciende la concentración de glucosa en
sangre y su función es elevar la glucemia; está constituido por el glucagón, los glucocorticoides
y la adrenalina. El sistema hipoglucemiante actúa cuando aumenta la concentración de glucosa
sanguínea; está constituido por la insulina que cumple la función de disminuir el nivel de glucosa
sanguínea. El balance entre estos dos sistemas antagónicos contribuye a la homeostasis de la
glucosa en sangre.

1.3.1. Sistema Hiperglucemiante

a) Glucagón: Es secretado por las células  de los islotes de Langerhans pancreáticos y
actúa en situaciones fisiológicas respondiendo a una disminución leve de glucemia o una
hipoglucemia no crítica. Tiene receptores en la membrana de células de hígado y tejido adiposo.
Produce la activación de la cascada fosforilante con aumento de la [AMPC] y por ende de la
actividad de la proteinquinasa A (PKA).

En tejido hepático:

 Activa la glucogenolisis porque la PKA actúa sobre:
PKA
Fosforilasa b quinasa ——> Fosforilasa b quinasa-P

Fosforilasa b ——> Fosforilasa a-P

Glucógeno (n) + Pi ——> Glucógeno (n-1) + Glucosa 1-P

 Inhibe la glucogenogénesis porque la PKA actúa sobre:
PKA
Glucógeno Sintasa ——> Glucógeno Sintasa-P

 Estimula la gluconeogénesis por fosforilación de la enzima bifuncional hepática que adquiere
actividad de fructosa 2,6-bisfosfatasa, disminuyendo la concentración de la F 2,6-bisP.

 Inhibe la glucólisis por disminuir los niveles hepáticos de F 2,6-bisP por el mecanismo antes
mencionado.

En tejido adiposo:

 Activa la lipólisis porque la PKA actúa sobre:
PKA
Lipasa ——> Lipasa-P
MAG Lipasa
TAG ——> 2 AG + MAG ——> AG + Glicerol

Como consecuencia de la activación de la glucogenolisis y de la lipólisis, se producen
compuestos (Glucosa 1-P y Glicerol) que son incorporados a la gluconeogénesis hepática.

b) Glucocorticoides: La acción de los glucocorticoides es más lenta porque actúan a nivel
del genoma sobre el mecanismo de síntesis de proteínas. Son hormonas secretadas por la corteza
adrenal en situaciones de ayuno prolongado. El principal glucocorticoide es el cortisol. Hay
receptores para los glucocorticoides en el citosol y/o núcleo de células de tejido muscular,
hepático, adiposo, etc.
En tejido adiposo estimula la lipólisis (por activar la síntesis de la lipasa).
En tejido muscular estimula la síntesis de proteasas.
Por estimulación de estas vías se activa la gluconeogénesis hepática.
En tejido hepático induce la síntesis de enzimas claves de la gluconeogénesis e induce la
síntesis de transaminasas.

c) Adrenalina: Es una hormona secretada por la médula adrenal en situaciones de stress
y/o hipoglucemia crítica. Hay receptores en la membrana de células del tejido hepático,
muscular, adiposo, etc. En estos tejidos activa la cascada fosforilante y en consecuencia las
siguientes vías: glucogenolisis, lipólisis y gluconeogénesis hepática en forma similar al glucagón.

En tejido muscular se activa la glucogenolisis, seguida de glucólisis.

1.3.2. Sistema hipoglucemiante

La insulina es secretada por las células  de los islotes de Langerhans pancreáticos. Su
receptor se encuentra ubicado en la membrana celular de la mayoría de los tejidos y sus acciones
son:

 Estimular la captación de glucosa en los tejidos muscular y adiposo debido a que provoca el
reclutamiento de los transportadores GLUT-4 desde el citosol hacia la membrana celular.
 Estimular la glucólisis hepática por desfosforilación de la enzima bifuncional que adquiere
actividad de fosfofructoquinasa 2, aumentando la concentración de F 2,6-bisP.
 Inhibir la gluconeogénesis hepática por aumentar los niveles de F 2,6-bisP por el mecanismo
antes mencionado.
 Estimular la glucogenogénesis e inhibir la glucogenolisis por activación de la fosfodiesterasa
(que transforma AMPC ——> 5’-AMP) y de las proteína fosfatasa 1 (PP1).
 Estimular la vía de las pentosas fosfato por aumentar la concentración de NADP por activación
de la síntesis de ácidos grasos.
 Estimular, por mecanismo más lento a nivel nuclear, la síntesis de enzimas clave de la
glucólisis, la glucoquinasa hepática, las deshidrogenasas de la vía de las pentosas fosfato,
enzimas lipogénicas (acetilCoA carboxilasa y aciltransferasas) y de proteínas en general.

75
2. METODO DE DOSAJE DE GLUCOSA SANGUINEA

Método enzimático colorimétrico: Fundamento.

La glucosa es oxidada enzimáticamente por la glucosa oxidasa (GOD) a ácido glucónico y
agua oxigenada. El agua oxigenada en presencia de peroxidasa (POD), produce la copulación
oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF) dando lugar a la formación de un cromógeno
rojo-cereza con un máximo de absorción a 505 nm.

GOD
Glucosa + O2 + H2O ——————> Acido Glucónico + H2O2
POD
2 H2O2 + 4-AF + Fenol ——————> 4-(p-Benzoquinona-monoimino) fenazona + 4 H2O

Cromógeno rojo-cereza

76
3. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE

1. Material biológico
La determinación debe efectuarse en suero o plasma. Los eritrocitos y leucocitos son
responsables de la destrucción enzimática de la glucosa sanguínea. La pérdida de glucosa causada
por la glucólisis de los elementos figurados de la sangre tiene lugar rápidamente,
aproximadamente un 10% por hora a temperatura ambiente y más rápida si existe contaminación
por microorganismos. Por lo tanto, la sangre debe centrifugarse dentro de las 2 horas de la
extracción hasta obtener un sobrenadante límpido, libre de elementos figurados y transferirlo a
otro tubo.
Cuando no es posible hacer esto dentro del tiempo aconsejado debe agregarse un inhibidor
de la glucólisis, por ejemplo fluoruro de sodio (NaF) 5-10 mg/ml. Los preparados comerciales
suelen combinar NaF (2,5 mg/ml) con EDTA (1 mg/ml). El EDTA actúa como anticoagulante.

No se observaron interferencias por los siguientes compuestos:

Bilirrubina hasta 200 mg/l
Acido Ascórbico hasta 75 mg/l
Acido Úrico hasta 200 mg/l
Hemólisis ligera

2. Reactivos
a) Testigo
Solución de glucosa 1 g/l (listo para usar).
b) GOD/POD
Solución de glucosa oxidasa 1.000 U/ml y peroxidasa 120 U/ml (homogeneizar por
inversión antes de usar).
c) Reactivo 4-AF
Solución 4-aminofenazona 25 mmol/l en buffer Tris 0,92 mol/l (listo para usar)
d) Reactivo fenol
Solución de fenol 55 mmol/l (listo para usar).
e) Reactivo de trabajo
Se prepara de acuerdo al número de muestras que se van a valorar. Colocar los reactivos
en las siguientes proporciones:
Agua destilada 500 ml
Reactivo 4-aminofenazona 50 ml
Reactivo fenol 50 ml
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
Agregar 3 ml de la solución GOD/POD previamente homogeneizada, mezclar por
inversión sin agitar, rotular y anotar la fecha.
Duración de los reactivos a, b, c y d: Son estables en refrigerador de 2 a 10°C hasta la
fecha indicada en la caja. No mantener a temperaturas elevadas por lapsos prolongados.

77
Reactivo de trabajo: Es estable por 2 meses a partir de su preparación; debe ser guardado
en frascos color caramelo a una temperatura de 2 a 10°C. Este reactivo puede desarrollar un
ligero color rosado que no afecta su funcionamiento, siempre que se procese un blanco con cada
serie de determinaciones y un testigo periódicamente. Desechar cuando las lecturas de las
absorbancias del blanco sean superiores a 0,160 o las del testigo sean anormalmente bajas.

3. Material de laboratorio4 tubos de ensayo
1 frasco de color caramelo de 1 litro
3 pipetas de 0,1 ml.
1 pipeta de 2 ml.

4. Aparatos e instrumentos
Baño termostático a 37° C
Fotocolorímetro o espectofotómetro
Reloj o timer

5. Técnica (para suero o plasma)
En 4 tubos de ensayo marcados B (blanco), T (testigo), MI (muestra I) y MII (muestra II)
colocar:

Tubos

M I

M II

Sc. Testigo

20 l

Suero 1 (M I)

20 l

Suero 11 (M II)

20 l

Reactivo de trabajo

2 ml

Mezclar e incubar 10 minutos en baño de agua a 37° C. Luego leer en el espectofotómetro
a 505 nm o fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm) llevando el aparato a 0 (cero) con el
blanco. El color de la reacción final es estable durante una hora por lo que la lectura puede ser
hecha dentro de ese lapso.

6. Cálculos
A partir de la Absorbancia y la concentración del testigo (T) calcular el factor (f).

Concentración T
f = ———————
Absorbancia T

78
Para calcular la concentración de glucosa de cada una de las muestras, multiplicar las
absorbancias de MI y MII por el factor calculado. Concentración del testigo de glucosa = 1g/l
(100 mg/100 ml).

7. Limitaciones del procedimiento
- Contaminaciones: Los reductores disminuyen la respuesta de color y los oxidantes
colorean el reactivo aumentando los blancos. Dichos agentes se pueden encontrar en el agua
destilada empleada para preparar el reactivo de trabajo, por lo que conviene controlar la calidad
de la misma o en su defecto usar RECONSTITUYENTE AA DE WIENER.
- Los detergentes, metales pesados y cianuros son inhibidores enzimáticos.

79
Apellido y nombre:
Comisión:
Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL
DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE

1. Objetivo y fundamento

......................................................................................................................................................

2. Resultados

TESTIGO

MUESTRA I

MUESTRA II

ABSORBANCIA

CONCENTRACION

3. Conclusiones

......................................................................................................................................................

80
LIPIDOGRAMA

TEMARIO

1. Lipoproteínas plasmáticas. Introducción. Fracciones lipoproteicas del plasma.

2. Aplicaciones clínicas. Humanos. Felinos. Caninos.

3. Trabajo práctico experimental. Desarrollo de un lipidograma electroforético.

81
1. LIPOPROTEINAS PLASMATICAS

1.1. Introducción

Los componentes lipídicos que se encuentran en mayor concentración en plasma humano
y de animales superiores son el colesterol, ésteres de colesterol, fosfolípidos y triacilglicéridos.
Estos lípidos son insolubles en soluciones acuosas y deben circular en sangre unidos a moléculas
proteicas (apoproteínas).
Las lipoproteinas resultantes son clasificadas en cuatro grupos que reciben una doble
designación según su densidad (cuando se las separa por ultracentrifugación) o según su
movilidad (cuando se las fracciona por electroforesis).

1.2. Fracciones lipoproteicas del plasma

1.2.1. Quilomicrones (Q)
Son sintetizados en la mucosa intestinal a partir de los lípidos contenidos en los alimentos
(previa degradación y absorción) y llegan al torrente circulatorio a través de la linfa. Constituyen
en realidad el medio de transporte de los triacilglicéridos de la dieta, que son elementos
energéticos de más fácil utilización. Abundan en el período postprandial y son degradados por el
llamado (hasta hace poco) factor clarificante del plasma, que es en realidad una enzima, la
lipoproteinlipasa, presente en membrana plasmática de las células endoteliales de distintos
tejidos, especialmente adiposo. Por acción de esta enzima se liberan ácidos grasos libres y
glicerol de los trigliacilcéridos presentes en los quilomicrones.
El aspecto opalescente (lechoso) del suero extraído después de una ingesta rica en grasas
es debido a los quilomicrones presentes en la sangre. La permanencia de los mismos después de
12 hs de ayuno debe considerarse patológica.

1.2.2. Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) o pre lipoproteínas
Son sintetizadas en el hígado y transportan triacilglicéridos de origen endógeno hacía el
tejido adiposo principalmente. También como los quilomicrones, son degradadas por la
lipoproteinlipasa que hidroliza la mayor parte de los triacilglicéridos, dejando un remanente
lipídico (de densidad algo mayor) rico en colesterol llamado LDL.
Las pre lipoproteínas pueden, en ciertos sueros normales o patológicos, desdoblarse en
dos fracciones.

1.2.3. Lipoproteínas de baja densidad (LDL) o  lipoproteínas
Resultan de la degradación de las VLDL y su función es transportar colesterol a los
tejidos periféricos y regular la síntesis "de novo" del colesterol.

1.2.4. Lipoproteínas de alta densidad (HDL) o  lipoproteínas
Son sintetizadas por el hígado e intestino y catabolizadas por el hígado, siendo ricas en
fosfolípidos y colesterol al que transportan desde los tejidos periféricos al hígado donde se

82
degradan. Tienen por consiguiente, un rol importante en la prevención de la ateroesclerosis ya
que no depositan colesterol en las paredes vasculares.
Pueden distinguirse tres subfracciones principales: HDL1, HDL2 y HDL3, que difieren en
densidad, tamaño y composición química.
2. APLICACIONES CLINICAS

Si se desea efectuar un estudio completo de las lipoproteínas plasmáticas de un paciente,
lo cual es aconsejable toda vez que se pretenda diagnosticar la naturaleza de una dislipemia,
además de un lipidograma deben realizarse valoraciones de ácidos grasos libres o no
esterificados, triacilglicéridos, colesterol total, colesterol esterificado, colesterol unido a HDL y a
LDL y fosfolípidos por métodos independientes.

2.1. Humanos

En el plasma humano normal las HDL presentan dos subfracciones, la HDL2 y la HDL3.
La HDL3 es la más abundante y migra en la banda . Las HDL2 están cargadas más
negativamente y por lo tanto migran más velozmente en la banda denominada pre lipoproteína
(a veces se las llama lipo-albúminas por tener una movilidad semejante a esta fracción proteica).
Si bien estas subfracciones se han caracterizado perfectamente al separarlas por
ultracentrifugación, la electroforesis se ha constituido en el método de elección en la
investigación clínica por su simplicidad, menor costo, rapidez, eficiencia y mínimo requerimiento
demuestra.
En la Tabla I se esquematizan para plasma humano un proteinograma y un lipidograma,
sus densitogramas (diagramados superpuestos para una mejor comparación), las denominaciones
de cada fracción por densidad y movilidad electroforética (en acetato de celulosa), su
composición lipídica y concentración absoluta y relativa, destacándose el tipo de lípido
predominante transportado por cada una de ellas. Los valores presentados en la tabla difieren
según los autores, las metodologías y el núcleo poblacional estudiado.
Las dislipemias humanas, especialmente las hiperlipemias (mucho más frecuentes), han
sido profundamente estudiadas, existiendo la conocida clasificación de Fredrickson que las
agrupa en cinco tipos según las distintas fracciones lipoproteicas alteradas, aspecto del suero
(límpido, cremoso, lactescente) y los diferentes niveles de triacilglicéridos y colesterol.
Las enfermedades cerebro-vasculares y accidentes cardíacos por formación de ateromas
(depósitos de colesterol en arterias y arteriolas) no tienen en animales la misma incidencia que en
la especie humana que está sometida a factores de riesgo ampliamente comprobados, muchos de
los cuales no existen en aquellos. Estos factores son la hipertensión, la hipercolesterolemia
causadas fundamentalmente por la dieta, el hábito de fumar, el stress (tensión psíquica), la vida
sedentaria, la obesidad, la edad avanzada y la diabetes mellitus.

Designación por
electroforesis

pre lipop.  lipop.

pre
lipop.

 lipoproteína

Quilomicrón

Designación por
ultracentrifugacion

HDL2 HDL3
<- - - - HDL - - - ->

VLDL

LDL

Densidad (g/l)

1,063 - 1,125 -
1,125 1,210

0,95 –
1,006

1,006 – 1,063

< 0,95

Concentración en mg%

180 - 410

20-300

160 - 560
No debe
haber

% relativo

4 – 13 10 - 26

0 -18

55 - 75

Triacilglicéridos %

Fosfolípidos %

Colesterol total %

Proteinas %

Lípido predominante
Fosfolipidos y
colesterol
TAG
endóg

Colesterol

TAG
exógeno
Lípidos totales = 450 – 900 mg%

84
El dosaje de HDL-colesterol (colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad) ha
adquirido importancia en humanos por ser un índice de protección frente a los riesgos
mencionados. Esto se debe a que dicho tipo de colesterol es movilizado por las HDL desde los
tejidos hacia el hígado como se mencionó anteriormente, evitando su depósito en paredes
vasculares; un nivel normal o elevado de HDL-colesterol ( colesterol) impide, por consiguiente,
la formación de ateromas. Aunque existen varios métodos de determinación de HDL-colesterol,
la electroforesis en gel de agarosa es uno de los más usados ya que pueden separarse las
fracciones lipoproteicas habituales, la banda en posición  que contiene las HDL se corta y se
extrae su colesterol el que se cuantifica por un método colorimétrico específico ().
En animales, la mayor parte de las hiperlipemias clínicas conocidas son secundarias a
hipotiroidismo, diabetes mellitus, hiperadrenocorticismo (colesterol y triacilglicéridos
aumentados) o pancreatitis aguda (triacilglicéridos y  lipoproteínas aumentados), síndromes
nefróticos, cirrosis o intoxicación hepática. Las hiperlipemias primarias, poco comunes, pero
importantes en felinos y caninos fueron identificadas muy recientemente.

2.2. Felinos

El gato presenta cuatro clases de lipoproteínas: Quilomicrones, VLDL, LDL y HDL. En
los animales normales la HDL es la principal lipoproteína y la fracción más importante en cuanto
al transporte del colesterol.
La HDL felina está constituida por dos subfracciones (HDL2 y HDL3) que migran juntas
en la banda 1.
Si se detecta un plasma hiperlipémico se deben considerar las siguientes alternativas:
a) Que la muestra no fue obtenida en ayunas.
b) Lipemia secundaria a un desorden metabólico subyacente: Hiperlipemia medicamentosa,
diabetes mellitus, hipotiroidismo y síndrome nefrótico.
c) Alteración primaria del metabolismo lipídico.
d) Hiperquilomicronemia hereditaria, debida a la baja actividad de lipoproteinlipasa plasmática.
En los felinos no se determinó la base metabólica de esta afección.

2.3. Caninos

En el suero de perros sanos fueron identificadas las siguientes fracciones lipoproteicas:
Quilomicrones, VLDL, LDL, HDL1, HDL2 y HDL3. La LDL migra en la banda electroforética 
y a diferencia del humano la LDL canina actúa en el transporte de triacilglicéridos (30%) y
colesterol (20%).
La lipoproteína más abundante en caninos es la HDL2, de migración electroforética 1 a
causa de su elevada concentración de apoproteína A (42%). La HDL2 casi no contiene
triacilglicéridos, tiene un 20% de colesterol y transporta la mayor parte del mismo en el animal
sano. La HDL3 está presente en muy baja proporción y migra en la banda 1 junto a la HDL2.
La HDL1 es de mayor tamaño y de menor densidad, generándose principalmente por
enriquecimiento en colesterol. En la electroforesis migra en la banda 2

85
En la Tabla II se muestra la composición y características de las lipoproteínas caninas:
Clase de
lipoproteína
TAG
%
Colesterol
%
Fosfolípidos
%
Proteinas
%
Diámetro
nm
Apoprot.
principal
Movilidad
electroforética
 ultracentr.
(g/l)
Quilomicrón 80 – 95 2 - 7 3 - 6 1 - 2 80 - 200 A, B, C Origen -
VLDL 59 15 16 10 26 - 90 B, C, E pre  1,008
LDL 30 22 24 23 20 B  1,006-1,087
HDL1 2 35 40 22 10 -35 A 2 1,025-1,100
HDL2 y HDL3 1 20 36 42 5,5 -8,5 A 1 1,070-1,210

Algunas de las enfermedades que sufren los caninos y en las cuales se observa
hiperlipemia son: Diabetes mellitus, pancreatitis aguda, hipotiroidismo, hiperglucocorticoidismo,
enfermedad hepática colestática, hiperlipemia idiopática.
En la Tabla III se muestra la proporción de cada fracción lipoproteica presente en el
plasma, separadas por electroforesis en gel de agarosa.
Si se compara la Tabla III correspondiente a suero canino con la Tabla I correspondiente
a suero humano se destacan las siguientes características:
a) En sueros humano y canino no se observan quilomicrones debido al ayuno (se recomienda un
ayuno no menor a 12 hs) que precedió a las pruebas.
b) En suero canino como en humano los lípidos predominantes de las HDL son los fosfolípidos
y el colesterol. Pero en suero canino las  lipoproteínas (HDL2 y HDL3) constituyen la
fracción más abundante (94%).
c) En humanos las  lipoproteínas (LDL) son las que se encuentran en mayor concentración
relativa (55 a 75%) y transportan especialmente colesterol mientras que la misma fracción en
suero canino es más rica en triglicéridos y fosfolípidos que en colesterol.

Tabla III. Composición lipoproteica relativa del plasma en perros.

Clase de lipoproteína

HDL1

HDL2 y HDL3

VLDL

LDL

Quilomicrón

Concentración en mg%

645

% relativo

3,2

94,2

1,5

1,2

Triacilglicéridos %

2,2

0,4

68,8

36,4

Fosfolípidos %

31,0

31,9

12,3

21,4

Colesterol total %

41,2

21,2

6,4

20,8

Colesterol esterificado %

30,7

18,2

2,8

12,6

Colesterol libre %

10,5

3,0

3,6

8,2

Proteínas %

23,6

46,7

12,4

20,7

Lípido predominante
Fosfolípidos
y colesterol
Fosfolípidos y
colesterol

TAG endógeno
TAG endógeno y
fosfolípidos

-
Lípidos totales = 685 mg%

() Nota: Es importante remarcar que el colesterol plasmático se halla libre o esterificado (en el
OH del C3) con ácidos grasos. Ambos pueden ser a su vez transportados por las HDL o LDL. El
colesterol total (libre + esterificado) puede dosarse colorimétricamente porla reacción de
Lieberman-Buchard, Wang-Chen u otras. El colesterol esterificado puede determinarse por
reacciones específicas y el colesterol libre se calcula por diferencia.

87
3. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

DESARROLLO DE UN LIPIDOGRAMA ELECTROFORETICO

El desarrollo de un lipidograma es esencialmente semejante al de un proteinograma. Las
diferentes lipoproteínas se separan en gel de agarosa, obteniéndose fracciones coincidentes con la
ultracentrifugación, considerado el método patrón.

1. Material biológico
Suero o plasma sanguíneo no hemolizado. Si la determinación se efectúa utilizando
plasma, se agrega a la sangre una solución de EDTA al 5% en proporción de 0,1 ml para cada 1
ml de sangre. La muestra debe conservarse a 4°C.

2. Reactivos
a) Solución reguladora de pH 8,6
Buffer veronal-veronal sódico 0,05 M pH 8,6;  = 0,05. Disolver 10,3 g de veronal sódico
y 1,34 g de veronal en 700 ml de agua destilada, calentar si es necesario; completar a 1.000 ml
con agua destilada. Conservar a 4°C.
b) Solución de agarosa 0,6%
Disolver 0,6 g de agarosa en 100 ml de buffer, calentando hasta disolución total o hasta
comienzo de ebullición. Fraccionar en tubos y guardar a 4°C. La solución solidificada dura
aproximadamente 20 días.
c) Solución fijadora
Etanol : Metanol : Isopropanol : Agua, según la siguiente proporción: 45:1:1:20
respectivamente. Duración 30 días.
d) Solución colorante
Disolver 0,4 g de Sudan-Black, 4 g de acetato de Zn y 120 ml de etanol en 80 ml de agua
destilada. Dejar reposar y filtrar antes de usar. Duración aproximada 20 días.
e) Solución para preteñido del suero
Disolver 0,1 g de azul de bromofenol puro en etanol puro (96% V/V) c.s.p. 100 ml.

3. Material de laboratorio
1 pipeta de 2ml
1 vaso de precipitación de 100 ml
1 tela metálica
1 trípode
1 mechero
1 imán
1 pipeta de 0,1 ml
portaobjetos de 7 x 2,6 cm perfectamente desengrasado
agujas de 0,9 mm de diámetro y 18 mm de longitud
papel de filtro

4. Aparatos e instrumentos
Ver proteinograma

5. Técnica
Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado con alcohol, derramar con una pipeta 1,8 ml
de solución de agarosa, calentada a baño maría. Inmediatamente, colocar a 2 cm del borde un
trozo de aguja, cuidando de hacerlo antes de que solidifique el gel. Esperar 10 minutos y retirar la
aguja con un imán. En la canaleta así formada en la agarosa, sembrar alrededor de 10 l de suero
con una micropipeta. Una de las muestras debe ser teñida con azul de bromofenol.
Colocar los portaobjetos en la cuba de electroforesis y poner en contacto con el buffer por
medio de puentes hechos con papel de filtro. Aplicar el amperaje adecuado (de 3 a 5
mA/portaobjetos). La electroforesis se detiene cuando la banda azul de bromofenol se ha
desplazado 4 cm.
Sumergir los portaobjetos en la solución fijadora durante por lo menos 2 horas. Retirarlos,
cubrirlos con papel de filtro mojado con agua y colocarlos en la estufa a 70°C media hora.
Luego sumergirlos en colorante 2 horas, lavarlos con agua destilada y dejarlos secar al
aire.
Se procede así a realizar la evaluación semicuantitativa del lipidograma comparándolo
con otros lipidogramas normales y patológicos.

89
Apellido y nombre:
Comisión:
Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL
LIPIDOGRAMA ELECTROFORETICO

1. Objetivo y fundamento

......................................................................................................................................................

2. Resultados

Realizar el esquema correspondiente al lipidograma obtenido y al normal correspondiente
a la especie en estudio.

3. Conclusiones

......................................................................................................................................................

90
METABOLISMO DE AMINOACIDOS

TEMARIO

1. Enzimas séricas.

2. Transaminasas. Métodos de determinación de la actividad de las transaminasas.

3. Métodos de determinación de actividad de las transaminasas.

4. Interpretaciones clínicas.

5. Trabajo práctico experimental. Determinación de la actividad de la GPT.

1. ENZIMAS SERICAS

Las enzimas presentes en el suero provienen de los tejidos y de los elementos figurados de
la sangre. En circunstancias normales la actividad de las enzimas en plasma se mantiene
constante dentro de ciertos límites, pero en procesos patológicos se altera el equilibrio normal
durante un período de tiempo variable en que las concentraciones o actividades enzimáticas
séricas aumentan como consecuencia de las alteraciones producidas en el tejido lesionado.
Las enzimas dentro de la célula pueden tener distinta localización, algunas son citosólicas
o mitocondriales exclusivamente (enzimas uniloculares), otras en cambio pueden encontrarse
simultáneamente en citosol y mitocondrias (enzimas biloculares).
Los procesos de necrosis o destrucción tisular de los distintos órganos van acompañados
de la liberación de las enzimas propias de ese órgano, las que pasan a la circulación aumentando
su nivel sérico en forma proporcional al porcentaje de membrana celular afectada. En los daños
celulares mínimos pasan a la sangre las enzimas citosólicas (ubicadas cerca de la membrana
plasmática) y en los daños más intensos lo hacen las enzimas localizadas en mitocondrias y hasta
las nucleares.
La determinación de la actividad enzimática sérica como ayuda para el diagnóstico clínico
puede ser útil en distintos sentidos:
a) Indicaciones sobre existencia de enfermedad.
b) Signos para un diagnóstico diferencial, al considerar la especificidad de órgano que poseen la
mayoría de las enzimas.
c) Estimación de la gravedad de la lesión celular.
d) Seguimiento del curso de la lesión.
Las enzimas que abandonan la célula pasan a sangre donde no existen los cofactores
naturalmente presentes en el interior de las mismas. Por consiguiente, las enzimas del suero son
funcionalmente poco activas, en parte por carencia de cofactores y en parte por ausencia de
sustratos.
La mayoría de las enzimas son degradadas después de su liberación a partir de un órgano
lesionado o después de su inyección en cuestión de horas o unos pocos días como máximo. En

92
particular las transaminasas desaparecen en dos o tres días, su vida media tiene una duración
breve, especialmente si se compara con las de las proteínas plasmáticas.
La implicancia práctica de estas diferencias en la vida media es que los cambios de la
actividad enzimática en suero reflejan una respuesta sumamente rápida a alteraciones de la
función celular, que se puede apreciar a las pocas horas de producirse la alteración. Por el
contrario, las variacionesde las distintas fracciones de las proteínas séricas que suelen ser lentas,
son más indicativas de alteraciones de tipo crónico.

2. TRANSAMINASAS

Las transaminasas (aminotransferasas) son enzimas que catalizan en forma reversible la
transferencia del grupo amino desde un -aminoácido al átomo de carbono de uno de los tres -
cetoácidos siguientes: piruvato, -cetoglutarato y oxalacetato, de acuerdo a la siguiente reacción
general.

Las transaminasas se encuentran en plantas, bacterias y tejidos animales y participan en
algunas de las etapas del catabolismo de casi todos los aminoácidos. La función de las reacciones
de transaminación es reunir los grupos -NH2 de casi todos los aminoácidos, en forma de un solo
aminoácido, usualmente el ácido glutámico o glutamato. Aunque se han encontrado varias
transaminasas, el dosaje de dos de ellas reviste importancia clínica, que son la transaminasa
glutámico pirúvica (GPT) (alanina aminotransferasa –ALT-) y la transaminasa glutámico
oxalacética (GOT) (aspartato aminotransferasa –AST-), que catalizan las siguientes
reacciones reversibles:

GPT
Alanina + -Cetoglutarato <–––––––––> Piruvato + Glutamato (1)

GOT
Aspartato + -Cetoglutarato <–––––––––> Oxalacetato + Glutamato (2)

Ambas enzimas son citosólicas y la GOT es también mitocondrial. La GPT se encuentra
en alta proporción en el tejido hepático, mientras que la GOT se encuentra además en músculo
cardíaco en grandes cantidades. Así, un aumento de ambas transaminasas en el suero, es
indicativo de trastorno hepático y un aumento de la GOT con poco o nada de incremento de GPT
es indicativo de un problema cardíaco.
El dosaje de ambas enzimas se puede utilizar para evaluar el grado de necrosis hepática
siempre que se conozca el estado de integridad de los demás tejidos.

93
La actividad de una enzima se puede medir determinando la velocidad de desaparición del
sustrato o la velocidad de formación del producto.

3. METODOS DE DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE LAS
TRANSAMINASAS

3.1. Método espectrofotométrico de Karmen

Karmen, en 1955, desarrolla un procedimiento para medir la actividad de enzimas
transaminasas en suero. Este método se basa en la determinación espectrofotométrica de la
desaparición del NADH que absorbe a 340 nm según dos reacciones sucesivas:

GPT
Alanina + -Cetoglutarato –––––––––> Piruvato + Glutamato
LDH
Piruvato + NADH + H+ –––––––––> Lactato + NAD+

Para la determinación se requiere un espectrofotómetro U.V., provisto con cubeta
termostatizada para asegurar la temperatura constante durante la reacción y un extracto purificado
de lactato deshidrogenasa (LDH) que se agrega en cantidad suficiente como para asegurar que
todo el piruvato originado por la actividad de la GPT sea reducido a lactato.
El decaimiento de la absorbancia debida a la desaparición del NADH se registra durante
unos cinco minutos (método cinético). Como todo el piruvato presente reacciona con el NADH
para formar lactato en forma proporcional, la reacción catalizada por la GPT no ocurre en
sentido opuesto.
Karmen define UE como la cantidad de enzima transaminasa capaz de producir un
descenso de 0,001 de absorbancia/minuto en las condiciones del método (UK).
Si bien este procedimiento es el método de referencia para la determinación de la
actividad de transaminasas, su uso en el laboratorio clínico se encuentra limitado debido a que
requiere el uso de un espectrofotómetro U.V. y extractos enzimáticos purificados.
En este trabajo práctico se medirá la actividad enzimática de la GPT en suero por el
método de Reitman y Frankel el cual determina la formación de uno de los productos, el piruvato.

3.2. Método colorimétrico de Reitman y Frankel

En 1957 Reitman y Frankel (R y F) desarrollaron un método para medir la actividad de la
GPT y GOT. La metodología de determinación de GPT en suero es el siguiente:
Se incuba el suero con los sustratos (alanina y -cetoglutarato, Reacción 1) durante media
hora a 37°C. Luego se agrega 2,4-DNFH (2,4-dinitrofenilhidracina), que con el piruvato formado
durante la transaminación forma una hidrazona que es un compuesto coloreado en medio alcalino
(castaño) que absorbe la luz a 505 nm (Reacción 2).

Reacción 1

Además la 2,4-DNFH desnaturaliza a la enzima GPT deteniendo la reacción de
transaminación. Finalmente el medio se alcaliniza para estabilizar el producto y su color.
La absorbancia debida a la hidrazona formada es proporcional al piruvato presente, el cual
depende de la actividad de GPT durante la incubación del suero con los sustratos, pero esta
dependencia no es lineal. Debido a que en el método de R y F la reacción de transaminación se
realiza en un tubo de ensayo, el producto formado (piruvato) se acumula y desplaza la reacción
en sentido opuesto; por lo tanto, la cantidad de piruvato formado no es la máxima posible para la
cantidad de enzima presente, vale decir, no es directamente proporcional a la actividad de
transaminasa presente. Por ese motivo R y F comparan su método de ensayo con el de Karmen y
establecen una correspondencia entre los valores de absorbancia medidos por su método y la
actividad de transaminasas obtenida por el método de Karmen.

Reacción 2

95
Elaborando la siguiente tabla:

Piruvato (g)

UK de GPT

8,7
17,4
26,1
34,8
43,5

37
77
116
163
234

Para una mayor comprensión de esta técnica, ejemplificamos un posible resultado
experimental de la realización de una curva de calibración y de trabajo, y dosaje de GPT en una
muestra de suero.

Nº
Tubo

Sc. Testigo piruvato

g piruvato

UK/ml

Dato experimental
Abs. corregida

Blanco
1
2
3
4

0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25

-
8,7
17,4
26,1
34,8
43,5

-
37
77
116
163
234

-
0,080
0,160
0,240
0,320
0,400

0,1 ml suero

Incógnita

0,072

Las curvas de calibración y trabajo resultantes de estos datos son las que muestran las
siguientes figuras.

96
Comentarios
a) En realidad graficar la "curva de calibración" no tiene ninguna utilidad práctica; su único
objeto es mostrar el cumplimiento de la Ley de Lambert y Beer para la reacción colorimétrica
de formación de hidrazona. En los Kits comerciales para la determinación de GPT y GOT
solamente se recomienda graficar la "curva de trabajo" a la que llaman curva de calibración.
b) Como la 2,4-DNFH reacciona con ceto-compuestos, podría pensarse que el -cetoglutarato
también forma hidrazona con este reactivo interfiriendo en el dosaje deseado. Si bien esto es
cierto, ocurre que las hidrazonas del -cetoglutarato, oxalacetato y piruvato absorben a
distintas longitudes de onda, por lo tanto, midiendo a 505 nm la lectura se hace específica
para la hidrazona del piruvato.
c) Actualmente se expresan los resultados en mUI/ml, de manera que en los Kits comerciales
proporcionan una tabla de equivalencias entre UK y mUI/ml.

Conversión de unidades: mUI/ml = UK/ml x 0,482
UK/ml = mUI/ml x 2,07
d) Valores normales de GPT y GOT para algunas especies animales:

Especie Actividad de GPT (mUI/ml) Actividad de GOT (mUI/ml)

Canino y felino < 25 < 30
Equino sin valor diagnóstico 100 - 250
Hombre < 18 < 18

4. INTERPRETACIONES CLINICAS

La GPT es una enzima específica del hígado, ya que las altas actividades sólo se pueden
detectar allí; esto es válido para perro, gato y primates.
En equinos y bovinos con hepatosis y hepatitis se produce escasa variación de la
actividad.
Se han observado elevaciones significativas de la actividad de la GPT en el suero de
perros con las siguientes afecciones: Hepatitis infecciosa, neoplasia hepática, degeneración grasa
del hígado, envenenamiento con arsénico o tetracloruro de carbono. Para los casos de necrosiso
fibrosis hepática en perros se recomienda la determinación de la actividad de la GPT,
conjuntamente con otras pruebas de funcionamiento hepático.

97
5. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA GPT

1. Material biológico
Suero sanguíneo. El suero no debe presentar hemólisis porque los glóbulos rojos tienen un
alto contenido de la transaminasa y se cometería un error por exceso.

2. Reactivos
a) Sustrato de la GPT
Solución 0,2 M de L-alanina y 2 mM de -cetoglutarato en buffer fosfato 0,1 M pH 7,4
(Na2HPO4 = 1,779 g + KH2PO4 = 1,360g + H2O c.s.p. 100 ml)
b) Solución 2,4-DNFH
Solución 1mM de 2,4-dinitrofenilhidrazina en HCI 1 mM. Guardar en heladera al abrigo
de la luz.
c) Solución 0,4 M NaOH
NaOH 16 g
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
d) Solución testigo
Solución de piruvato de sodio 2 mM

3. Material de laboratorio
8 tubos de ensayo
3 pipetas de 1ml graduadas 1/10
1 pipeta de 2 ml graduada 1/10
1 pipeta de 5 ml
1 pipeta de 0,2 ml

4. Aparatos e Instrumentos
Baño termostático a 37°C
Fotocolorímetro o espectrofotómetro

5. Técnica

a) Realización de las curvas de calibración y de trabajo

Rotular 6 tubos de ensayo y colocarlos ordenados en una gradilla.

Unidades Enzimáticas
Tubo Sc. Test. Agua dest.
Sc. 2,4-
DNFH
Sc.
NaOH Abs.
Abs.
correg. mUI/ml UK/ml

0,60 0,5 5

0,05

0,55 0,5 5

0,10

0,50 0,5 5

0,15

0,45 0,5 5

116

0,20

0,40 0,5 5

163

0,25

0,35 0,5 5

113

234

Colocar los reactivos de las dos primeras columnas, mezclar por agitación y agregar a
cada tubo 0,5 ml de la solución de 2,4-DNFH guardando un intervalo de 1/2 minuto entre uno y
otro. Mezclar por agitación e incubar durante 10 minutos a 37°C (contados desde el agregado de
la solución de 2,4-DNFH al primer tubo).
Retirar del baño a 37ºC y agregar 5 ml de la solución de NaOH a cada tubo manteniendo
el intervalo de 1/2 minuto entre ellos.
Mezclar cada tubo por inversión, esperar 10 minutos y leer las absorbancias en
fotocolorímetro con filtro verde (500-550 nm) o en espectrofotómetro a 505 nm llevando a 0 de
absorbancia con agua destilada.
El color es estable durante 30 minutos.
Consignar los datos obtenidos en el cuadro del informe.

b) Determinación de la actividad de la GPT en suero sanguíneo

Rotular dos tubos de ensayo con las letras B (blanco) y M (muestra). Colocar los reactivos
procediendo según la siguiente tabla.

99
B M
Sustratos (ALA + -CG) 0,5 ml 0,5 ml
Colocar en el baño termostático a 37ºC durante 2 ó 3 minutos
Suero -- 0,1 ml
Agua destilada 0,1 ml --
Mezclar por agitación suave e incubar a 37ºC durante 30 minutos
Reactivo 2,4-DNFH 0,5 ml 0,5 ml
Mezclar y dejar 10 minutos a 37ºC
NaOH 0,4 M 5 ml 5 ml

Mezclar por inversión y leer después de dos minutos en el fotocolorímetro a 505 nm,
llevando el aparato a 0 de Absorbancia con agua destilada. El color es estable durante 30
minutos.
El tubo blanco (B) contiene todos los reactivos excepto la enzima activa, de modo que no
habrá reacción y la coloración que presenta este tubo se debe únicamente al color propio de los
reactivos agregados.
En el tubo muestra (M) se produce la reacción enzimática y la intensidad de color
desarrollada se deberá a la actividad de la enzima presente en el suero y a la coloración de los
reactivos, de modo que una vez leídos los dos tubos M y B tendremos dos lecturas de
Absorbancias donde:
Abs muestra - Abs blanco = Abs corregida

En el caso de trabajar con suero hiperlipémico o ictérico se modifica la técnica de la
siguiente manera: En lugar de agregar agua destilada en el tubo B, se agrega 0,1 ml de suero
después de agregado el reactivo 2,4-DNFH. Esto se realiza con el objeto de igualar en el blanco y
en la muestra la absorbancia debida a este tipo de suero, que de no restarse con el blanco se
atribuirá erróneamente a la actividad de la GPT.

100
Apellido y nombre:
Comisión:
Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA GPT

1. Objetivo y fundamento

.....................................................................................................................................................

2. Resultados

a) Realización de las curvas de calibración y de trabajo

Unidades Enzimáticas Tubo Sc. testigo Absorbancia Absorbancia corregida
mUI/ml

UK/ml

0,05

0,10

0,15

116

0,20

163

0,25

113

234

101
b) Gráficos: Representar gráficamente absorbancia corregida en función de ml de solución testigo
(curva de calibración) y en función de mUI/ml o UK/ml (curva de trabajo).

102

c) Determinación de la actividad de la GPT en suero sanguíneo

Absorbancia de la muestra =
Absorbancia del blanco =
Absorbancia corregida =

Unidades enzimáticas presentes en el suero sanguíneo:

mUI/ml =
UK/ml =

Conversión de unidades:

mUI/ml = UK/ml x 0,482
UK/ml = mUI/ml x 2,07

3. Conclusiones

.....................................................................................................................................................

103
CUESTIONARIO

MATERIAL DE LABORATORIO Y
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO BIOQUIMICO

1)¿Qué ventajas obtendría al utilizar una pipeta de doble aforo respecto a una de simple aforo?

2) ¿Qué tipo de error cometería al vaciar completamente una pipeta de doble aforo? ¿El error
sería por exceso o por defecto? Justifique.

3) ¿Por qué es mejor utilizar una bureta que una pipeta para realizar una titulación?

4) Al llenar cuatro tubos de ensayo con el mismo volumen de una solución, se observa que la
altura de la misma en los distintos tubos es diferente. ¿A qué se puede deber esto?

5) Para medir 45 ml de una solución se comparan las siguientes alternativas:
a) Utilizar una probeta de 25 ml, cargarla completamente, volverla a utilizar cargando 20 ml
b) Utilizar una probeta de 50 ml
c) Utilizar una probeta de 250 ml
¿Cuál sería la alternativa más válida? Describa qué ocurriría en los otros casos.

6) Para medir 0,53 ml de una solución de fluoruro de sodio tiene dos pipetas, con las siguientes
inscripciones:
a) 1 ml 1/10
b) 1 ml 1/100
¿Cuál utilizaría? Justifique.

7) ¿Qué posibles accidentes pueden ocurrir durante el trabajo dentro del laboratorio?

8) ¿Qué ventaja tiene el uso de las propipetas?

9) ¿Con qué elementos de seguridad considera que un laboratorio debe contar para brindar
seguridad a sus operadores?

10) ¿Qué importancia tiene conocer la potencial peligrosidad de las sustancias químicas?

104
CUESTIONARIO

PROTEINAS I

1. ¿Qué representa el coeficiente de extinción molar en la ley de Lambert-Beer y en qué
unidades se mide?

2. ¿Cuál es la posible causa de la desviación de la ley de Lambert-Beer?

3. ¿De qué depende la constancia del factor f?

4. ¿En qué se fundamenta la reacción del Biuret?

5. Indique a que % de transmitancia corresponde un 0 de Absorbancia. ¿Qué significado físico
tiene?

6. Determinar los puntos isoeléctricos de los siguientes aminoácidos a 25ºC. Los valores de pKa
vienen referidos a esa temperatura.

a) Fenil alanina: pK1: 1,83 pK2: 9,13
b) Tirosina: pK1: 2,20 pK2: 9,11 pK3: 10,07 (-OH)
c) Glutámico: pK1: 2,19 pK2: 4,25 pK3: 9,67 (-NH3+)

7. Calcular la fuerza iónica que corresponde a las siguientes soluciones.

a) (NH4)2SO4 0,2 M
b) NaCl 0,2 M
c) NaCl 0,1 M

8. ¿En qué dirección migrarán en un campo eléctrico la cisteinil glicina a los valores de pH de:
1,5; 4,0; 7,0 y 13,0? Cisteinil glicina: pK1: 2,34; pK2: 8,18 (-SH); pK3: 10,28

9. Para la determinación cuantitativa de proteínas por el método del Biuret se tienen los datos
del siguiente cuadro.

105

Tubo

Solución testigo (ml)

H2O dest. (ml)

mg Prot.

Absorbancia

Abs. corregida

2,0

0,020

0,2

1,8

0,105

0,4

1,6

0,215

0,6

1,4

0,325

0,8

1,2

0,425

Teniendo en cuenta que se trabajó con una solución testigo de concentración = 10 mg/ml.
a) Completar el cuadro.
b) Construir el gráfico correspondiente a absorbancia vs. mg de proteínas.
c) Para 2 muestras cuyas absorbancias corregidas son 0,35 y 0,65 respectivamente,
determinar los g% de proteínas para los 2 casos teniendo en cuenta que se partió de 0,1 ml
de suero y que se llevó al mismo volumen final en cada caso.

10. Para determinar la concentración de proteínas en g% de una muestra de suero se obtuvieron
los siguientes datos.
Absorbancia corregida mg.Prot.

Muestra 0,35
Testigo 0,23 4

Calcule la concentración de proteínas (g%) teniendo en cuenta que se cumple la ley de
Lambert-Beer y se utilizaron 0,1 ml de suero y que procedió de igual forma con la muestra
y el testigo.

106
CUESTIONARIO

PROTEINAS II

1. Mencione dos métodos de fraccionamiento de proteínas y explique brevemente en que
consisten.

2. Cuál es el método más adecuado para separar:
a) Proteínas de distinto peso molecular.
b) Proteínas de distinta carga eléctrica.
c) Proteínas de iones.
d) Anticuerpos.

3. ¿Qué tipos de compuestos pueden separarse con la electroforesis?

4. Mencione los factores de que depende la movilidad de una partícula en un campo eléctrico.
Al trabajar en condiciones estandarizadas se eliminan algunos factores. ¿Cuáles son los
factores que permanecen y son responsables de la migración diferencial de las proteínas?

5. Explique la relación existente entre el buffer elegido y la electroforesis. ¿Cuáles son las
funciones del buffer?

6. La intensidad de corriente y la temperatura, si bien no afectan a la migración diferencial,
influyen en los resultados de una corrida. Explique como y por qué.

7. ¿Cuáles son las ventajas de trabajar con la cuba tapada?

8. Electroendósmosis: explique cómo y porqué se produce.

9. Esquematice las diferentes fuerzas que intervienen en la corrida electroforética y explique el
origen de cada una de ellas.

10. ¿Qué fracciones proteicas espera encontrar en la corrida electroforética de una muestra de
suero bovino? Grafique y especifique el sentido de la migración.

11. ¿Cómo realiza el blanco en el trabajo práctico de electroforesis?

107
12. Sabiendo que la concentración de proteínas totales es de 7,1 g% y su absorbancia corregida es
0,85; calcular las concentraciones relativas y absolutas en g% de las albúminas y globulinas

FRACCIÓN ABS. CORREGIDA FRACCIÓN ABS. CORREGIDA
Albúminas 0,30 Beta globulinas 0,18
Alfa-1 globulinas 0,05 Gama globulinas 0,28
Alfa-2 globulinas 0,04 Proteínas totales 0,85

13. Calcular el cociente proteico de la muestra. ¿Cómo se vería modificado este valor en un
animal con desnutrición, hemorragia severa o infección aguda?

108
CUESTIONARIO

BIOENERGETICA

1. Cuando se incuba una solución de glucosa 1-P con cantidades catalíticas de fosfoglucomutasa,
la glucosa-1-P se transforma en glucosa 6-P hasta alcanzar el equilibrio según la siguiente
reacción:
PGM
Glucosa 1-P <–––––––––> Glucosa 6-P

En el equilibrio: [Glucosa 1-P] = 4,5 10-3 M y [Glucosa 6-P] = 9,6 10-2 M.

Calcule la Keq y G' de esa reacción a 25C y pH 7,0. Dato: R = 2 cal/Kmol.

2. Las concentraciones celulares de sustratos y productos que intervienen en la fosforilación de la
fructosa-6-fosfato catalizada por la enzima fosfofructoquinasa 1 en tejido cardíaco son las
siguientes:
Metabolito Concentración (M)
Fructosa 6-fosfato 0,087 . 10-3
Fructosa 1,6-bisfosfato 0,022 . 10-3
ATP 11,52 . 10-3
ADP 1,320 . 10-3
PFK
(F-6-P + ATP –––––––––> F 1,6-bisP + ADP)

Datos: G'= -3,4 Kcal/ mol, 25ºC y R = 2 cal/Kmol.

a) Calcular la constante de equilibrio de la reacción.
b) Para las condiciones del problema, indicar en qué sentido se produce la reacción.

3. La glucosa 1-P se convierte en fructosa 6-P en dos reacciones consecutivas.

Glucosa 1-P <–––––––––> Glucosa 6-P G1'= -1,0 Kcal/mol.
Glucosa 6-P <–––––––––> Fructosa 6-P G2'= 0,4 Kcal/mol.

a) Determinar el valor de G' para la reacción global.
b) Indicar si la reacción global es exergónica o endergónica. Justifique.
c) Calcular la Keq de la reacción global.

4. Para la reacción: Fructosa 6-P <–––––––––> Glucosa 6-P

Si la Keq = 19,7 a 25C, pH 7,0 y R = 2 cal/Kmol.

109
a) Calcule G'
b) Calcule G´ para [F 6-P] = 1,5 . 10-3 M y [G 6-P] = 0,5 . 10-3 M
c) ¿Por qué son diferentes G´ y G'?

5. Calcular la variación de la energía libre (G´) (pH 7,0 y 25C) para la hidrólisis del ATP a
ADP y Pi, suponiendo que el ATP y el ADP están presentes en concentraciones
equimoleculares y que la concentración de [Pi] es: a) 0,01 . 10-3 M; b) 0,1 . 10-3 M; c) 1 . 10-3
M. Dato: G'= -7,3 kcal/mol.

6. Cuál debe ser la concentración mínima de malato que debe hallarse presente para conseguir que
la reacción de la fumarasa (malato <–––––––––> fumarato+ H2O) transcurra hacia la
derecha a 25C y pH 7,0 si el fumarato está presente en una concentración 1. 10-3 mM. Datos:
G' 0 y R = 2 cal/Kmol.

7. Dada la reacción: ATP + H2O –––––––––> ADP + Pi G'= -7,3 Kcal/mol

a) Calcular la variación de energía libre de la reacción, sabiendo que las concentraciones
son: [ADP] = [Pi] = 0,02 M y [ATP] = 0,015 M a 25C y pH 7,0.
b) Indicar si la reacción es exergónica.
c) Indicar si la reacción es espontánea en las condiciones del problema.

110
CUESTIONARIO

ENZIMAS

1. Una enzima que cataliza la reacción S –––––––––> P se ensayó con distintas concentraciones
de sustrato, obteniéndose las siguientes velocidades iniciales:

Velocidad inicial (moles/min) Concentración de sustrato (M)

0,150 0,20
0,200 0,40
0,275 0,85
0,315 1,25
0,340 1,70
0,350 2,00
0,360 4,00

a) Represente gráficamente en papel milimetrado la velocidad inicial en función de la
concentración de sustrato.
b) Halle gráficamente Vmáx y KM.
c) Represente gráficamente 1/Vo en función de 1/[S] (dobles recíprocas) y a partir del gráfico y
calcule nuevamente Vmáx y KM.

2. Dado los siguientes datos: [S] = 0,22 mM, Vo = 0,171 mmoles/min, Vmáx = 0,640
mmoles/min. Calcule el KM de la enzima mediante la ecuación de Michaelis-Menten.

3. Se han hecho investigaciones del efecto de pH sobre el valor de KM de la enzima 6-
fosfogluconato deshidrogenasa de hígado de rata. Empleando diferentes soluciones
reguladoras se trabajó a pH 7,6 y a pH 9,0. Para cada uno de los pH mencionados, se midió
la actividad de la enzima, siguiendo la velocidad de reducción del NADP+ a 340 nm y se
obtuvieron los siguientes resultados:
Enzima
6-P-Gluconato + NADP+ –––––––––> Ribulosa 5-P + NADPH + H+

111

Velocidad inicial

(moles/hora) [S] (mM)

pH 7,6

pH 9,0

0,18
0,30
0,54
1,60
4,0
5,0

0,050
0,063
0,084
0,114
0,116
0,116

0,034
0,047
0,075
0,128
0,167
0,168

Determine gráficamente a que valor de pH la enzima tiene su máxima afinidad por el
sustrato.

4. Explique el comportamiento de las enzimas reguladoras:
a) Alostéricas.
b) Por modificación covalente.

5. a) ¿En los gráficos 1 y 2 cuáles son las variables que corresponden a los ejes de coordenadas?
¿Qué información obtiene de ellos?

112
b) ¿En el gráfico 3 qué curva corresponde a un modulador positivo y cuál a uno negativo,
sabiendo que se trata de una enzima alostérica?

6. ¿Cuál de los efectos cinéticos tiene un inhibidor enzimático competitivo puro?
a) Aumenta KM sin afectar Vmáx
b) Disminuye KM sin afectar Vmáx
c) Aumenta Vmáx sin afectar KM
d) Disminuye Vmáx sin afectar KM
e) Disminuyen ambos

7. El salicilato inhibe la acción catalítica de la glutamato deshidrogenasa. Determine por análisis
gráfico si la inhibición es competitiva o no competitiva.

Velocidad inicial (mmoles/minuto)
[S] (mM)

Sin inhibidor

Con inhibidor

15
20
30
40
80
100

0,20
0,21
0,28
0,33
0,37
0,40

0,081
0,097
0,120
0,130
0,160
0,185

113
8. En una reacción enzimática la velocidad de reacción varía al agregar un inhibidor de acuerdo
a los siguientes datos:

Velocidad inicial (mmoles/minuto)
[S] (mM)

Sin inhibidor

Con inhibidor

1
2
3
4
5
10

17,8
25,4
38,4
45,4
50,0
62,5

3,3
6,3
9,0
11,8
14,5
24,4

Determine gráficamente si se trata de un inhibidor competitivo o no competitivo (utilice
gráfico de dobles recíprocas).

9. Para aislar y purificar una enzima citoplasmática, una vez obtenido el homogenato, se
sometió a éste a centrifugación a 100.000 g durante 60 minutos. El sobrenadante (Fracción A)
fue precipitado al 40% de (NH4)2SO4, obteniéndose de esta forma la Fracción B que contiene
la enzima. En las tres fracciones, es decir, homogenato, Fracción A y Fracción B se
determinaron las unidades enzimáticas (UE) y las proteínas totales, obteniéndose los
siguientes resultados.

Fracción Enzimática

Prot. (mg)

Rend.

Pureza

Homogenato

127.400

9.800

Fracción A

112.500

7.500

Fracción B

81.250

3.250

a) ¿Logró purificar la enzima?
b) ¿Qué rendimiento obtuvo?

10. Se desea purificar una enzima contenida en un homogenato que tiene 150.000 UE/ml. Si se
pretende que el rendimiento del proceso no sea menor de 60%, indique hasta que número de
UE/ml puede descender la concentración de enzima durante la purificación.

114
11. En un proceso de purificación enzimática, se obtuvieron los siguientes resultados.

Fracc. Enz.

Prot. (mg)

Rendimiento

Pureza

Homogenato

100.000

Fracción A

90.000

1.500

Fracción B

2000

a) Complete el cuadro.
b) Indique si hubo purificación. Justifique su respuesta.

12. Una preparación enzimática que contiene 1,5 10-2 g de proteína produce 0,016 moles de
producto en 4 minutos. Calcule las unidades enzimáticas y la actividad específica.

115
CUESTIONARIO

DIGESTION Y METABOLISMO
DE HIDRATOS DE CARBONO I

1. ¿Por qué es necesario digerir los principios nutritivos principales (hidratos de carbono, lípidos
y proteínas) antes de que puedan ser utilizados por los tejidos?

2. Explique la diferencia que hay entre procesos digestivos y metabólicos. Ejemplifique.

3. Mencione las enzimas digestivas de los hidratos de carbono.

4. Describa los diferentes mecanismos de transporte de la glucosa a la célula en los distintos
tejidos.

5. Indique qué tipo de vía metabólica es la glucolisis y en qué tejidos se produce.
Explique la importancia funcional de la vía en músculo esquelético, tejido adiposo y
eritrocitos.

6. ¿Cuáles son las semejanzas y diferencias entre las enzimas glucoquinasa y hexoquinasa?

7. ¿Cuáles son las etapas de la glucolisis?

8. ¿Cuáles son las reacciones claves de la glucólisis?. Mencione las enzimas reguladoras, tipo de
regulación de cada una y sus efectores alostéricos positivos y negativos.

9. ¿Qué función cumple la Fosfofructoquinasa 2?

10. ¿Por qué el NAD es el factor limitante de la vía glucolítica?

11. Escriba con fórmulas la reacción de oxidación fosforilante que ocurre en glucolisis. Explique
la importancia de la relación NAD+/NADH+H+.

12. Establezca si hay pérdida o ganancia de ATP cuando se pasa de F 6-P > PEP.
Justifique su respuesta escribiendo las reacciones en las que se intercambian moléculas de alta
energía.

13. Explique el significado de “fosforilación a nivel del sustrato”, su importancia e indique en
qué reacciones de la glucólisis se lleva a cabo este proceso.

fosfofructoquinasa 1
14. Dada la reacción Fructosa 6-P + ATP > Fructosa 1,6-bis P + ADP.

116
Explique cómo y por qué en esta reacción el ATP puede actuar como sustrato y como efector
negativo.

15. ¿Qué destinos posibles tiene el piruvato formado en la glucólisis? ¿Cuál es el balance
energético de la vía?

16. ¿Qué importancia metabólica tiene la fermentación láctica? Escriba la reacción que permite
reoxidar la coenzima en estas condiciones.

117
CUESTIONARIO

METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO II

1. ¿Cuál es el objetivo de la gluconeogénesis?

2. ¿Qué condiciones metabólicas son necesarias para que ocurra el proceso de gluconeogénesis
y en qué tejidos ocurre?

3. Mencione precursores de esta vía de síntesis, indique su procedencia y a que nivel de la vía
gluconeogénica ingresan.

4. ¿De qué forma afecta al músculo la acumulación de lactato y cuál es el proceso que permite
su eliminación y reutilización por el hígado?

5. Escriba las reacciones que permiten a la célula sintetizar PEP a partir de piruvato. ¿Cuál es la
ubicación celular de las enzimas y qué cofactores intervienen?6. ¿Cuáles son las enzimas claves de la vía? Indique su regulación y efectores alostéricos
positivos y negativos en los casos que corresponda.

7. Explique la regulación de la actividad de la Enzima Bifuncional (Fosfofructoquinasa 2 para
glucólisis y Fructosa 2,6-bisfosfatasa para gluconeogénesis) y el rol de la Fructosa 2,6-
bisfosfato como nexo regulador de ambas vías.

8. ¿Cuántas moléculas de ATP se requieren para la síntesis de un residuo de D-glucosa a partir
de piruvato? ¿En qué reacciones se utilizan?

9. ¿Cuál es el objetivo funcional de la vía de las pentosas fosfato, ya que en ella no se produce
ni se gasta ATP? Mencione las 3 fases de la vía.

10. ¿En qué tejidos está activa la vía? Mencione la localización celular de las enzimas.

11. Mencione cómo se regulan las deshidrogenasas de la 1ra. fase de la vía.

12. El músculo no posee gran actividad de las deshidrogenasas, sin embargo necesita sintetizar
pentosas para obtener nucleótidos y ácidos nucleicos. ¿Cómo logra ese objetivo?

118
CUESTIONARIO

METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO III

1. a) Escriba las ecuaciones correspondientes a la entrada de fructosa a la vía glucolítica en el
hígado.
b) ¿Qué otra vía alternativa existe en espermatozoides?

2. a) ¿Qué es un nucleótido azúcar?
b) Escriba la ecuación fundamental de los nucleótido azúcares.

3. a) Describa el metabolismo de la galactosa.
b) ¿Qué es la galactosemia?

4. ¿Cuál es el polisacárido de reserva en los vegetales? Describa su estructura química ¿Cuál es
el polisacárido de reserva en los animales? Describa su estructura química.

5. a) Describa el proceso de glucogenolisis, enzimas involucradas, localización celular y tejidos
en que se produce la vía.
b) ¿Cuál es la enzima regulable y cuáles son los productos obtenidos?
c) ¿Cuál es el beneficio, desde el punto de vista energético, de la fosforólisis en la
degradación de glucógeno?

6. ¿Cuál es la importancia funcional del glucógeno en el hígado y en el músculo? Indique el
destino de sus productos finales respectivamente.

7. Indique las diferencias entre la fosforilasa hepática y la isoenzima que se encuentra en
músculo.

8. Esquematice sin fórmulas las reacciones necesarias para incorporar un residuo de D-glucosa
al glucógeno, indicando las enzimas correspondientes y su localización celular.

9. a) ¿Cuál es la enzima reguladora de la glucogenogénesis y qué características tiene dicha
enzima respecto de su actividad catalítica?
Describa su mecanismo de regulación en hígado y en músculo.

10. ¿Cuál es el balance energético de la incorporación de una molécula de glucosa al glucógeno?

11. Escriba las ecuaciones correspondientes a la formación de glucógeno a partir de galactosa.

12. En los sujetos galactosémicos, falta la enzima galactosa 1-P uridíntransferasa. El metabolismo
de galactosa está bloqueado y su ingestión produce trastornos graves. Si se elimina la
galactosa de la dieta y se la reemplaza por glucosa, estos sujetos se normalizan e inclusive

119
sintetizan galactolípidos. ¿Por qué caminos se puede sintetizar la galactosa necesaria, ya que
el precursor de los galactolípidos es UDP-galactosa? Detalle las reacciones involucradas.

13. Escriba la ecuación de síntesis de lactosa en glándula mamaria.

14. Describa la situación metabólica que se produce en el músculo, para un equino entrenado:
a) Durante una carrera corta.
b) En la fase de recuperación.

120
CUESTIONARIO

RESPIRACION CELULAR I

1. Escriba la reacción de descarboxilación oxidativa del piruvato, indicando su ubicación
celular, composición del complejo de la Piruvato Deshidrogenasa, su regulación e
importancia de la irreversibilidad de la reacción.

2. Explique por qué el Ciclo de Krebs es considerado como una vía anfibólica.

3. a) ¿Cuáles son las enzimas reguladoras del ciclo de Krebs?
b) Mencione sus efectores y destaque la enzima reguladora principal de dicha vía
.
4. Si el Ciclo de Krebs se haya frenado por una alta concentración de ATP, mencione los
metabolitos del mismo que pueden utilizarse para vías de síntesis e indique qué productos se
obtienen de cada uno de ellos.

5. ¿Cuántas moléculas de ATP se obtienen cuando cada uno de los sustratos enumerados se
oxida hasta CO2 + H2O?
a) PEP
b) Piruvato
c) Glucosa
Se suponen activas las mitocondrias. Justificar cada respuesta con las ecuaciones
correspondientes.

6. A un homogenato de hígado de mamífero se lo somete a una centrifugación diferencial a
100.000g y se obtiene una fracción particulada (f.p.) y un sobrenadante (s). Se coloca cada
fracción en tubos rotulados f.p., s , f.p.+ s.

TUBO NO

10
Fracción
Incubada f.p. f.p. s s f.p.+ s f.p.+ s f.p. f.p. s s
Sustrato
Utilizado gluc. gluc gluc gluc gluc gluc piruv. piruv. piruv. piruv.
Condiciones
de incubación aerob. anaerob aerob anaerob aerob. anaerob aerob. anaerob aerob. anaerob
Rendimiento
en ATP

Complete el cuadro indicando el número de moles de ATP formados en cada caso. Justifique

121
7. ¿Qué son las reacciones anapleróticas? Escriba la principal reacción anaplerótica del ciclo de
Krebs.

8. ¿Por qué mecanismos se reoxida el NADH+H+ citosólico producido en glucolisis en
presencia de oxígeno?

122
CUESTIONARIO

RESPIRACION CELULAR II

1. El ciclo de Krebs no utiliza O2 pero depende de él. Explique por qué es necesario el O2 para
el funcionamiento del ciclo.

2. Mediante una tabla consigne el estado de óxido-reducción de los transportadores de la cadena
respiratoria mitocondrial:
a) En presencia de CO o CN-
b) En presencia de antimicina.
c) En presencia de barbitúricos.

3. ¿Cuál es el único citocromo capaz de reaccionar directamente con el oxígeno? Justifique.

4. ¿Qué tipo de inhibidor debe agregarse a una suspensión de mitocondrias para que éstas
puedan:
a) Consumir O2 pero no sintetizar ATP.
b) No consumir O2 ni sintetizar ATP.
c) Disminuir el consumo de O2 y no sintetizar ATP.
Justifique cada respuesta.

5. Defina control respiratorio y explique su importancia en el funcionamiento de la cadena
respiratoria mitocondrial.

6. Esquematice los gráficos de consumo de O2 (especifique que parámetro se representa en cada
eje) considerando los siguientes casos:

CASO I:
Hasta 2 minutos estado de reposo (estado 4)
A los 2 minutos agregado de ADP
A los 3 minutos agregado de dinitrofenol
A los 4 mintuos agregado de antimicina

CASO II:
Hasta 2 minutos estado de reposo (estado 4)
A los 2 minutos agregado de ADP
A los 3 minutos agregado de oligomicina
A los 4 mintuos agregado de ADP
A los 5 minutos agregado de dinitrofenol
7. Compare desde el punto bioquímico el ejercicio anaeróbico y aeróbico.

121
CUESTIONARIO

ASPECTOS GENETICOS DEL METABOLISMO

1. Escriba la reacción catalizada por la fosforribosilpirofosfato sintetasa, enzima involucrada en
la síntesis de nucleótidos. ¿De que vía metabólica proviene el sustrato de la reacción?

2. ¿En qué fase del ciclo celular se produce la replicación del ADN?

3. Mencione las enzimas que participan en el proceso de replicación del ADN en procariotes e
indique su función.

4. Indique las diferencias que existen en la replicación del ADN en células de eucariotes
respecto de las células de procariotes.

5. Indique las 4 etapas del proceso de transcripción en procariotes y enzimas que intervienen en
el mismo. ¿Qué diferencias existen con las células de eucariotes?

6. Explique por qué el ARNm inmaduro en células de eucariotes no puede ser utilizado para
sintetizar proteínas.

7. ¿Cuál es la estructura del ARNt y qué funciones cumplen las diferentes zonas que conforman
la molécula?

8. ¿Qué son los ribosomas y cuál es su composición química?

9. Indique las 5 etapas del proceso de biosíntesis de proteínas en procariotes. ¿Qué diferenciasexisten con las células de eucariotes?

10. Escriba la ecuación de activación de un aminoácido para la formación del aminoacil-ARNt.

11. a) ¿Cómo es leída la información del ARNm para la síntesis de proteínas?
b) Explique si existe superposición de bases en la lectura.

12. Se hizo una experiencia in vitro para sintetizar una determinada proteína utilizando los
siguientes componentes: ARNt de levadura, ribosomas de reticulocitos de conejo y ARNm de
hepatocitos de tiburón. ¿A qué especie pertenece la proteína sintetizada? Justifique.

13. ¿Qué significa que el código genético sea universal?

14. ¿Qué son las modificaciones postraduccionales y qué función tienen?

122
15. El agregado de un compuesto a un cultivo de bacterias produce la síntesis de dos nuevas
proteínas. Explique el mecanismo de regulación génica que permite este proceso.

16. Explique el mecanismo de regulación de la expresión génica en eucariotes a nivel de los sitios
promotores, potenciadores y silenciadores.

17. ¿Cuáles son los productos finales de la degradación de los ácidos nucleicos? Mencione las
diferencias entre especies.

123
CUESTIONARIO

HORMONAS

1. a) ¿Qué es una hormona?
b) ¿Cómo se clasifican según su estructura química?

2. Explique la formación del complejo Hormona-Receptor y su cinética.

3. ¿Cuáles son los sistemas de secreción hormonal?

4. ¿Qué función cumple?
a) El hipotálamo
b) La adenohipófisis
c) La neurohipófisis

5. Explique la relación que existe entre el mecanismo de acción de una hormona y la velocidad
de su respuesta en la célula.

6. Explique detalladamente los mecanismos de acción para las hormonas que tengan receptor en
la membrana celular, según estén asociados a Proteína Gs, Proteína Gi, Proteína Gq.

7. En el mecanismo de amplificación en cascada producido por activación hormonal asociado a
Proteína Gs indique:
a) ¿Cuál es el significado de acción amplificada?
b) ¿A qué se llama mensajero intracelular y por qué?
c) A partir de la activación inespecífica de una proteinquinasa, explique cuál es el proceso
químico que implica modificación covalente y activación o inhibición de diferentes
enzimas.

8. Explique el mecanismo de acción para el caso de una hormona que tenga su receptor en
citoplasma. De Ejemplos.

9. Explique el mecanismo de acción para el caso de una hormona que tenga su receptor en
núcleo. De Ejemplos.

10. Describa la estructura química, ubicación celular y tisular del receptor de insulina. Explique
su mecanismo de activación.

11. Explique los diferentes mecanismos de acción de la insulina.

124
CUESTIONARIO

REGULACION HORMONAL DEL METABOLISMO
DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

1. Defina glucemia y su importancia como constante del medio interno.

2. Establezca las diferencias entre mamíferos monogástricos y poligástricos en cuanto al nivel
de la glucemia.

3. Indique:
a) Las vías que aportan glucosa a la sangre.
b) Las vías que disminuyen la concentración de glucosa en sangre.

4. a) ¿Cuál es el sistema hormonal hipoglucemiante?
b) ¿Cuál es el sistema hormonal hiperglucemiante?

5. a) ¿Cuál es el par fisiológico hormonal que regula la glucemia?
b) ¿Cuál es el sistema hormonal que actúa en hipoglucemia crítica?

6. a) ¿Cuál es la enzima de la gluconeogénesis directamente involucrada en la salida de glucosa
a la sangre?
b) ¿En qué tejido/s aparece actividad de gluconeogénesis?

7. Describa:
a) Las acciones del glucagón y la adrenalina sobre el metabolismo de hidratos de carbono a
nivel hepático. Explique el mecanismo de acción.
b) Las acciones de la adrenalina sobre el metabolismo de hidratos de carbono a nivel muscular.
Explique el mecanismo de acción.

8. a) Mencione las acciones de la insulina sobre el metabolismo de hidratos de carbono
(explicando los mecanismos de acción).
b) Mencione las acciones de la insulina a nivel del tejido adiposo.
c) Integre las diferentes acciones y justifique el resultado final de disminución de la glucemia.

9. Explique los efectos que ejercen los glucocorticoides a nivel hepático y extrahepático.

10. ¿Por qué se habla de acción lenta o de refuerzo en el caso de los glucocorticoides?

125
CUESTIONARIO

DIGESTION Y METABOLISMO DE LIPIDOS I

1. Explique cómo y en qué parte del aparato digestivo se produce la digestión de los lípidos
de la dieta.

2. De los componentes que contiene la dieta, ¿por qué los lípidos son los únicos que no
pasan a la circulación porta-hepática?

3. La Acil-CoA sintetasa cataliza una reacción reversible:
Ácido graso + ATP + CoA ↔ Acil-CoA + AMP + PPi
¿De qué modo puede favorecerse la formación de Acil- CoA?

4. Explique cómo ingresan los ácidos grasos a la mitocondria.

5. Explique el mecanismo por el cual se reoxidan las coenzimas que se reducen en la -
oxidación.

6. Calcular el número de enlaces de alta energía que se forman en la degradación del
palmitato (ácido graso saturado de 16 átomos de carbono) hasta:
a) AcetilCoA
b) CO2 y H2O

7. ¿Cómo se halla regulada la -oxidación de ácidos grasos?

8. Explique los pasos metabólicos por los cuales la célula logra obtener Acetil-CoA en el
citosol para la síntesis de novo de ácidos grasos.

9. a) ¿Cuál es la enzima reguladora de la síntesis de ácidos grasos?
b) Escriba la reacción que cataliza y mencione su tipo de regulación.

10. ¿Cuál es la función de la descarboxilación en la síntesis de ácidos grasos?

11. La biosíntesis de ácido palmitoleico (ácido graso insaturado de 16 átomos de carbono con
una doble ligadura entre C9 y C10) utiliza como precursor al ácido palmítico (ácido graso
saturado de 16 átomos de carbono). ¿Puede realizarse esta síntesis en condiciones
anaeróbicas estrictas? Justifique.

12. a) ¿Cómo sintetiza el tejido adiposo los lípidos de depósito?
b) ¿De dónde proviene el glicerol activado?

126
13. ¿Cuántos fosfatos de alta energía se necesitarán para la síntesis de un triacilglicérido en
tejido hepático partiendo de glicerol y ácidos grasos libres?

14. Comparar los siguientes aspectos entre la -oxidación y la síntesis de los ácidos grasos:
a) Lugar de la célula donde ocurren los procesos.
b) Transportador de los acilos.
c) Reductores y oxidantes.

15. Respecto a la biosíntesis de colesterol indique la ubicación celular de la vía, la enzima
reguladora y el tipo de regulación.

127
CUESTIONARIO

METABOLISMO DE LIPIDOS II

1. Respecto a las lipoproteínas plasmáticas mencione:
a) Tipos de lipoproteínas.
b) Origen.
c) Lípido predominante.
d) Función.

2. Indique las funciones de las siguientes apo-proteínas y a qué lipoproteínas pertenecen:
a) Apo C-II
b) Apo A-I
c) Apo B-100
d) Apo E

3. Mencione cuáles son las principales diferencias entre los mamíferos HDL y los LDL.

4. ¿Qué otro tipo de lípido puede hallarse en sangre? ¿Cómo se transportan?

5. Respecto a la LIPOLISIS mencione:
a) Situaciones nutricionales en que está activa
b) Efectos del par fisiológico insulina-glucagón sobre la misma.

6. Respecto a la LIPOGENESIS mencione:
a) Situaciones nutricionales en que está activa.
b) Efectos del par fisiológico insulina-glucagón sobre la misma.

7. Mencione cuáles son los efectos de la adrenalina sobre el metabolismo de los lípidos,
indicando las enzimas involucradas.

8. Mencione cuáles son los efectos de los glucocorticoides sobre el metabolismo de los
lípidos, indicando las enzimas involucradas.

9. Respecto a los cuerpos cetónicos indique:
a) Situación metabólica en que se favorece su síntesis y tejidos donde sucede.
b) Secuencia de reacciones de degradación de los mismos y tejidos que la realizan.
c) Por qué el exceso de acetilos provenientes de la -oxidación de ácidos grasos no puede
acumularse en forma de Acetil-CoA.

10. Explique las relaciones metabólicas existentes entre la disminución de la glucemia y la
lipólisis en monogástricos.128
11. Explique las relaciones metabólicas existentes entre el aumento de la glucemia y la
lipogénesis en animales monogástricos.

129
CUESTIONARIO

DIGESTION DE PROTEINAS Y
METABOLISMO DE AMINOACIDOS

1. Describa la digestión de proteínas en el estómago de un animal monogástrico. Explique las
funciones del HCl y las enzimas proteolíticas.

2. Clasifique las enzimas gástricas, pancreáticas e intestinales según el sitio de acción sobre los
diferentes sustratos e indique si son específicas para algún tipo de aminoácido.

3. Describa el mecanismo de absorción de los aminoácidos a nivel intestinal.

4. Se observó que suministrando glucosa marcada con C14 en posición 6 a un animal
monogástrico, aparecía alanina marcada con C14 en posición 3. Escriba las secuencias
metabólicas que expliquen esta incorporación.

5. Escriba la reacción más importante de desaminación oxidativa e indique compartimento
celular y tejidos donde se realiza. Explique su regulación en el sentido anabólico y catabólico.

6. Cite la secuencia de reacciones a través de las cuales se cataboliza la alanina hasta urea y CO2
+ H2O. ¿Qué camino alternativo puede ser propuesto para el caso en que el aminoácido sea
aspartato?

7. Cite la secuencia metabólica que explica el carácter glucogénico de la glutamina.

8. ¿Cuáles son los principales aminoácidos encargados de transportar el grupo amino en sangre?
Indique tejidos de origen y destino final.

9. ¿En que se basa la diferencia entre aminoácidos glucogénicos, cetogénicos y mixtos? De
ejemplos.

10. ¿Cuáles son los aminoácidos esenciales? ¿Por qué se los denomina de esa forma?

11. Mencione 3 aminoácidos glucogénicos e indique de qué producto metabólico son precursores,
en qué reacción se encuentran dichos productos y su vía metabólica.

130
CUESTIONARIO

DIGESTION Y METABOLISMO EN POLIGASTRICOS

1. Caracterice a los microorganismos ruminales.

2. Describa las características del medio ambiente ruminal, indicando el pH, potencial de óxido-
reducción y temperatura.

3. Explique la regulación del pH ruminal. Mencione cada uno de los factores que influyen en
dicha regulación.

4. Mencione y caracterice a los hidratos de carbono, proteínas y lípidos presentes en la
alimentación habitual de los rumiantes.

5. Explique cómo se degradan los polisacáridos por acción de los microorganismos del rumen

6. Mencione los productos finales de la degradación de los hidratos de carbono ingeridos e
indique a qué nivel se absorben.

7. Explique el mecanismo de reoxidación de las coenzimas en las fermentaciones acética,
propiónica y butírica.

8. a) ¿Por qué la fermentación acética no se considera una verdadera fermentación?
b) ¿A qué proceso debe necesariamente acoplarse?
c) ¿Quiénes lo realizan?

9. Mencione los distintos tipos de lípidos que integran la dieta del rumiante y explique su
degradación en el rumen.
a) ¿Qué transformaciones sufren los ácidos grasos provenientes de la dieta?
b) ¿Qué características tienen los ácidos grasos sintetizados por los microorganismos?
c) ¿A qué nivel se absorben los distintos ácidos grasos de alto peso molecular?
d) ¿Qué características tienen los ácidos grasos de la grasa de depósito de los poligástricos a
diferencia de los monogástricos?

10. a) ¿De qué manera son degradadas las proteínas de origen vegetal por acción de las enzimas
de los microorganismos?
b) ¿Cómo se sintetizan las proteínas de los microorganismos y qué características tienen?

11. Describa el ciclo rumino-hepato-salival. Mencione las ventajas para el animal rumiante y para
los microorganismos ruminales.

131
12. Compare el metabolismo intermedio en lo referente a síntesis de triacilglicéridos entre
monogástricos y poligástricos.

13. ¿De qué manera son utilizados cada uno de los ácidos grasos volátiles por el animal
rumiante?: a) Cuando éste necesita energía. b) Cuando éste no necesita energía.

14. ¿De qué depende que el acetato de origen ruminal derive a la producción de grasa corporal o
de leche?

15. ¿Por qué el valor de la glucemia en los rumiantes es aproximadamente la mitad comparada
con los monogástricos?

16. ¿Por qué la gluconeogénesis es fundamental en rumiantes? ¿Cuáles son sus precursores?

17. ¿Cómo es normalmente el valor de la cetonemia de los poligástricos comparados con el de los
monogástricos? ¿A qué se debe esta diferencia?

132
CUESTIONARIO

FOTOSINTESIS

1. Explique que función tiene la fotosíntesis en plantas superiores. Escriba la ecuación general y
explique la función de cada uno de los reactantes.

2. a) ¿Cuáles son los principales pigmentos fotosintéticos? ¿Qué función cumplen los mismos?
b) ¿Cómo es captada la energía luminosa y cómo es transmitida por los pigmentos
mencionados?

3. a) ¿Qué son los fotosistemas I y II?
b) Establezca las diferencias existentes entre el sistema pigmentario P700 y P680.

4. a) Describa el flujo electrónico no cíclico de la etapa fotodependiente o lumínica. ¿Qué
productos se obtienen?
b) De acuerdo con el potencial de reducción que tiene el P700 (+0.43v), ¿por qué puede ceder
el electrón a un aceptor que tiene un potencial negativo (-0.55v)?

5. a) Describa el flujo electrónico cíclico de la etapa fotodependiente o lumínica.
b) ¿Qué productos se obtienen en la misma?

6. ¿En qué lugar del cloroplasto y en qué condiciones se produce el proceso de
fotofosforilación?

7. Explique cómo se produce la energía para la síntesis de ATP (Teoría de Mitchell).

8. a) ¿Qué es la etapa fotoindependiente u oscura de la fotosíntesis?
b) ¿Cuál es el primer producto de fijación de CO2 en plantas de C3?
c) ¿Cuál es la enzima reguladora principal del ciclo de Calvin-Benson y cómo se regula?

9. a) ¿Cuál es el primer producto de fijación del CO2 en plantas de C4?
b) ¿Qué enzima interviene?
c) Explique diferencias con la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa.

10. ¿Qué es la fotorespiración? ¿En qué tipo de plantas superiores se produce?

11. ¿Cuáles son las hexosas sintetizadas a partir del gliceraldehido 3-P, producto del ciclo de
Calvin-Benson? ¿Cuáles son los principales disacáridos y polisacáridos producidos en las
hojas a partir de dichas hexosas y la función de cada uno de ellos en el vegetal?

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