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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE MEDICINA BIOMEDICINA ESTUDIO ETNOBOTÁNICO, FARMACOLÓGICO Y FITOQUÍMICO DE LA ACTIVIDAD COMO ANSIOLÍTICO-SEDANTE DE Tagetes erecta L. Y Tagetes lucida Cav. TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTORA EN CIENCIAS PRESENTA: PÉREZ ORTEGA GIMENA TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. MARÍA EVA GONZÁLEZ-TRUJANO FACULTAD DE MEDICINA, UNAM COMITÉ TUTOR: DRA. HEIKE DORA MARIE VIBRANS LINDEMANN COLEGIO DE POSTGRADUADOS, CAMPUS MONTECILLO DR. RICARDO REYES CHILPA INSTITUTO DE QUÍMICA, UNAM MÉXICO, CD. MX., AGOSTO, 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE MEDICINA BIOMEDICINA ESTUDIO ETNOBOTÁNICO, FARMACOLÓGICO Y FITOQUÍMICO DE LA ACTIVIDAD COMO ANSIOLÍTICO-SEDANTE DE Tagetes erecta L. Y Tagetes lucida Cav. TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: DOCTORA EN CIENCIAS PRESENTA: PÉREZ ORTEGA GIMENA TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. MARÍA EVA GONZÁLEZ-TRUJANO FACULTAD DE MEDICINA, UNAM COMITÉ TUTOR: DRA. HEIKE DORA MARIE VIBRANS LINDEMANN COLEGIO DE POSTGRADUADOS, CAMPUS MONTECILLO DR. RICARDO REYES CHILPA INSTITUTO DE QUÍMICA, UNAM MÉXICO, CD. MX., AGOSTO, 2016 UNAM POSGRJ?Q ¡ Ciencias Biológicas Dr. Isidro Ávila Martínez Director General de Administración Escolar, UNAM Presente COORDINACIÓN Me permito informar a usted que el Subcomité de Biología Experimental y Biomedicina del Posgrado en Ciencias Biológicas, en su sesión ordinaria del día 14 de marzo de 2016, aprobó el jurado para la presentación del examen para obtener el grado de DOCTORA EN CIENCIAS de la alumna PÉREZ ORTEGA GIMENA con número de cuenta 95288291 con la tesis titulada "ESTUDIO ETNOBOTÁNICO. FARMACOLÓGICO y FITOQuíMICO DE LA ACTIVIDAD COMO ANSIOLíTICO-SEDANTE DE Tagetes erecta L. Y Tagetes lucida Cav ... . realizada bajo la dirección de la DRA. MARíA EVA GONZÁLEZ TRUJANO: Pres idente: Vocal: Secretario: Suplenle: Suplente: DR. ROBERT ARTHUR BYE BOETTLER DR. MANUEL JIMÉNEZ ESTRADA DR. RICARDO REYES CHILPA DR. JORGE ARTU RO ARGUETA VILLAMAR ORA. HEIKE DORA MARIE VIBRANS LlNOEMANN Sin otro particular. me es grato enviarle un cordial saludo. ATENTAMENTE " POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU" Cd. Universitaria, Cd. Mx .. a 02 de junio de 2016 /I-~Go~- DRA. MARíA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA COORDINADORA DEL PROGRAMA COORDINACiÓN Unidad de Posgrado ' Coordinación del Posgrado en Ciencias Biológicas Edificio D, ler. Piso, Circuito de Posgrados Cd. Universitaria Delegación Coyoacán C .P. 04510 México, D.E Tel. 5623 7002 http://pcbio1.posgrado.unam.mx AGRADECIMIENTOS Al Posgrado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de México. Por la enseñanza académica y los diversos apoyos económicos brindados para la asistencia a congresos, además de la impresión de esta tesis. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca No. 332465 recibida. A la tutora principal de este estudio, la Dra. María Eva González Trujano. Al comité tutor la Dra. Heike Dora Marie Vibrans Lindemann y el Dr. Ricardo Reyes Chilpa. Como en todo trabajo de investigación, al hacer éste se requirió del conocimiento y apoyo de muchas personas. Agradezco a: Los todos compañeros y maestros del laboratorio de Neurofarmacología de Productos Naturales. En especial a la Dra. Guadalupe Esther Ángeles López y al QFB Omar Guadarrama Enríquez. Además por la fotografía número 25. Los sinodales el Dr. Robert Arthur Bye Boettler, Dr. Manuel Jiménez Estrada, Dr. Ricardo Reyes Chilpa, Dr. Jorge Arturo Argueta Villamar y la Dra. Heike Dora Marie Vibrans Lindemann por las observaciones, correcciones y sugerencias a este escrito. Los curanderos del Estado de Morelos: Aurelio Ramírez Cázarez, Sofía Díaz Hernández, María de la Paz Puebla Alvear, Norma Garduño Salazar, Gerardo Gómez Mureddu, Raúl Ramírez Guerrero, Roberto Gómez Casiano, Teresa Contreras, Cristina Vargas y Aurelio Ramírez in memoriam. Los comerciantes de plantas medicinales del Estado de Morelos: Amada Ortíz, Gabriela Trovamala, Ligia Camacho, Florida Camaño Villegas, Gabriela Castellanos Padilla, Alejandrino Mendoza, Cony Mercado, Raymundo Vázquez, Adelina Fernández, Víctor Hugo Sánchez Ramírez, Max Rodríguez, Nancy Domínguez, Gelacio, Felipe Morales, Sonia López, Fernando Morales, Honorio Méndez, Yolanda Martínez, Claudia Castro, Juana Pérez, Eusebia Díaz, Nelly Pérez, Rosa Ángela La Fragua, Mayra Flores, Nohemí García, Lilia Prado y Víctor Palacio. A los comerciantes anónimos. La M. en C. Abigail Aguilar Contreras del Herbario del IMSS por la determinación de los ejemplares botánicos y su guía continua en el conocimiento de los saberes de las plantas medicinales. También al Dr. Manuel Jiménez Estrada y al QFB Rafael Álvarez Chimal de la UNAM por el apoyo otorgado durante la estancia en el Instituto de Química. Al Dr. Samuel Enoch Estrada Soto de la UAEM por la contribución de la elucidación de la escoparona. A la Dra. Eva Aguirre y la Dra. Ana Laura Martínez por su ayuda en la parte experimental de este estudio. A la Dra. Martha García Ramírez y el Dr. Eliezer Chuc Meza de la Escuela de Nacional de Ciencias Biológicas del IPN por la enseñanza de diversos modelos conductuales con ratas. Al Dr. Mark Olson del Instituto de Biología de la UNAM y al taller “Academic Writing” del Posgrado en Ciencias Biológicas de la UNAM, por la guía en la escritura de artículos. Al biólogo, enfermero y acompañante Julio Erick Hernández Rivera por asistirme en todo este camino. Al diseñador Othoniel Pérez Ortega por las ilustraciones de las especies botánicas aquí estudiadas, figuras 11 y 15. Al área de ilustración biomédica del Instituto Nacional de Psiquiatría “Ramón de la Fuente Muñíz” por las figuras 1, 2, 3, 7, 10, 14 y 18. A la Red Temática Sobre el Patrimonio Biocultural del CONACYT por los diversos apoyos otorgados. A los animales, a los sujetos experimentales. A los curanderos de plantas medicinales con los que conversé en Morelos. Gracias por honrar la vida. Con amor al núcleo integrado por Erick, Leticia-Cesáreo, Otho e Isabel-Iñigo-Lucas. También a Irene. ¡Muchas gracias! ÍNDICE página ABREVIATURAS i ÍNDICE DE FIGURAS vi ÍNDICE DE TABLAS x RESUMEN 1 ABSTRACT 4 1. INTRODUCCIÒN 6 2. MARCO TEÓRICO 10 2.1 SISTEMA NERVIOSO CENTRAL 10 2.1.1 Las neuronas10 2.1.2 Los neurotransmisores 12 2.1.2.1 Ácido gamma amino butírico (GABA) 14 2.1.2.2 Serotonina 14 2.2 ANSIEDAD 15 2.2.1 Epidemiología de la ansiedad en el mundo y en México 15 2.2.2 Definición y características de la ansiedad 17 2.2.3 Trastornos de la ansiedad 19 2.2.4 Enfermedades de filiación cultural asociados a la ansiedad 22 2.2.5 “Los nervios” y el ”susto“ 23 2.2.6 Terapéutica de la ansiedad 25 2.2.7 Mecanismos de acción de fármacos ansiolíticos 28 2.2.8 Terapias alternas o tradicionales de la ansiedad 29 2.3 ETNOBOTÁNICA 29 2.3.1 Conocimiento tradicional 31 2.3.2 Medicina tradicional mexicana 33 2.3.3 La herbolaria en el Estado de Morelos 36 2.3.4 Plantas mexicanas utilizadas para el tratamiento de la ansiedad 39 2.3.5 Género Tagetes 45 2.3.6 Tagetes erecta L. 46 2.3.7 Tagetes lucida Cav. 58 2.4 INVESTIGACIÓN FARMACOLÓGICA PARA LA BÚSQUEDA DE NUEVOS FÁRMACOS 68 2.4.1 Modelos de animales en el estudio de la ansiedad 71 2.5 FITOQUÍMICA 73 2.5.1 Investigación fitoquímica 73 2.5.2 Metabolitos secundarios con actividad de tipo ansiolítico-sedante 74 2.5.3 Cumarinas 75 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 76 4. HIPÓTESIS 77 5. OBJETIVOS 78 5.1 Objetivo general 78 5.2 Objetivos particulares 78 6. MATERIALES Y MÉTODOS 79 6.1 ESTUDIO ETNOBOTÁNICO 80 6.1.1 Especies del Estado de Morelos empleadas para “los nervios” 80 6.1.2 Entrevistas 82 6.2 ESTUDIO FARMACOLÓGICO 88 6.2.1 Reactivos y fármacos 89 6.2.2 Animales 89 6.2.3 Material vegetal 90 6.2.4 Preparación de los extractos 90 6.2.5 Determinación de la toxicidad (DL50) 91 6.2.6 Pruebas experimentales de ansiedad y sedación 91 6.2.6.1 Modelo de campo abierto 92 6.2.6.2 Modelo de tablero con orificios 93 6.2.6.3 Modelo de exploración en cilindro 93 6.2.6.4 Modelo de cruz elevada 94 6.2.6.5 Evaluación de la interacción farmacológica 95 6.2.7 Búsqueda de mecanismos de acción 95 6.2.8 Análisis estadístico 95 6.3 ANÁLISIS FITOQUÍMICO 96 6.3.1 Cromatografía de capa fina 96 6.3.2 Resonancia Magnética Nuclear. 1H-RMN, 13C-RMN 96 6.3.3 Espectrometría de Masas 97 6.3.4 Cromatografía líquida de alta eficacia 97 7. RESULTADOS 98 7.1 ESTUDIO ETNOBOTÁNICO 98 7.1.1 Reportes de usos de Tagetes erecta 100 7.1.2 Reportes de usos de Tagetes lucida 103 7.2 ESTUDIO FARMACOLÓGICO 105 7.2.1 Rendimiento de los extractos 105 7.2.2 Determinación de la toxicidad 106 7.2.3 Evaluación del efecto tipo ansiolítico-sedante de Tagetes erecta 107 7.2.4 Evaluación del efecto tipo ansiolítico-sedante de Tagetes lucida 111 7.2.5 Evaluación del efecto tipo ansiolítico-sedante de los fármacos individuales 116 7.2.6 Mecanismos de acción de Tagetes erecta y Tagetes lucida 125 7.3 ESTUDIO FITOQUÍMICO 127 7.3.1 Cromatografía de capa fina 127 7.3.2 Resonancia Magnética Nuclear. 1H-RMN, 13C-RMN y espectrometría de masas 129 7.3.3 Identificación de las cumarinas y perfil cromatográfico en UPLC 134 8. DISCUSIÓN 146 9. CONCLUSIONES 152 10. PERSPECTIVAS 153 11. LITERATURA CITADA 154 ANEXO A. Artículo de requisito ANEXO B. Artículo de divulgación ANEXO C. Asistencia a congresos y ponencias i ABREVIATURAS 5-HT 5-hidroxitriptamina. Receptor de serotonina 5-HT 1A 5-hidroxitriptamina y subtipo 1A 5-HT 1B 5-hidroxitriptamina subtipo 1B 5-HT 1D 5-hidroxitriptamina subtipo 1D 5-HT 2A 5-hidroxitriptamina subtipo 2A 5-HT 3 5-hidroxitriptamina subtipo 3 5-HT 4-7 5-hidroxitriptamina subtipo 4-7 ANADEVA Análisis de varianza AcOEt Acetato de etilo acetil CoA Acetil coenzima A α2 Receptor adrenérgico alfa 2 BDZ Benzodiacepinas β1 Receptor adrenérgico beta 1 β2 Receptor adrenérgico beta 2 cAMP Monofosfato de adenosina cíclico CIE-10 Clasificación Internacional de Enfermedades 10a edición Cl- Ión cloro cm Centímetro co Colénquima ii CO2 Dióxido de carbono COFEPRIS Comisión Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios 13C-RMN Resonancia Magnética Nuclear de Carbono13 d Doblete D1 Receptor de dopamina 1 D2 Receptor de dopamina 2 DAG Diacilglicerol DART Análisis directo en tiempo real (por sus siglas en inglés Direct Analysis in Real Time) DL50 Dosis letal 50 DMSO Dimetilsulfóxido DSM-4 Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales 4a edición (por sus siglas en inglés Diagnostical and Statical Manual of Mental Disorders, 4th edition) DSM-5 Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales 5a edición (por sus siglas en inglés Diagnostical and Statical Manual of Mental Disorders, 5th edition) DZP Diazepam E Células epiteliales secretoras EMEA Agencia europea de medicamentos (por sus siglas en inglés European Medicines Agency) Esc Esclerénquima EtOH Etanólico f2 Floema secundario iii FDA Administración de fármacos y alimentos (por sus siglas en inglés Food and Drug Administration) g Gramo GABA Ácido gamma-aminobutírico GABAA Ácido gamma-aminobutírico subtipo A GABAB Ácido gamma-aminobutírico subtipo B GABAc Ácido gamma-aminobutírico subtipo C H2O Agua h Hora Hex Hexánico HPLC Cromatografía liíquida de alta resolución (por sus siglas en inglés High Purity Liquid Cromathography) 1H-RMN Resonancia Magnética Nuclear de Hidrógeno 1 IE Impacto Electrónico IMSSM Herbario Medicinal del Instituto Médico del Seguro Social INALI Instituto Nacional de Lenguas Indígenas INEGI Instituto Nacional de Estadística y Geografía IND Investigación de un nuevo fármaco (por sus siglas en inglés Investigational New Drug) IP3 Inositol 1,4,5-trifosfato i.p. Intraperitoneal K+ Ión potasio iv kg Kilogramo l Lumen L Litro LSD Dietilamida de ácido lisérgico M1 Receptor de muscarina 1 M2 Receptor de muscarina 2 Me Mesófilo Me Médula Mg Miligramo min Minutos mL Mililitro μL Microlitros mm Milímetros mn Moneda nacional m/z Relación masa/carga NDA Aplicación de nuevo fármaco (por sus siglas en inglés New Drug Application) nm Nanómetros OCDE Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (por sus siglas en inglés Organization for Economic Co-operation and Development) OMS Organización Mundial de la Salud v Pa Parénquima p.i. Vía intraperitoneal PBS Pentobarbital sódico s Singulete S Revestimento celular SNC Sistema Nervioso Central SSI Solución salina isotónica SW Cepa de ratón Swiss Webster UPLC Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (por sus siglas en inglés Ultra High Performance Liquid Cromatography) UV Ultra Violeta WAY100635 Sales de maleato. Antagonista altamente selectivo para el receptor 5-HT1A x2 Xilema secundario vi ÍNDICE DE FIGURAS página Figura 1. El encéfalo 10 Figura 2. La estructura de las neuronas 11 Figura 3. Estructura de GABAA 14Figura 4. Diagrama de la neurotransmisión de la serotonina 15 Figura 5. Sistema médico tradicional mesoamericano 34 Figura 6. Treinta y tres municipios del Estado de Morelos 37 Figura 7. Ubicación del Estado de Morelos 38 Figura 8. Copaliyacxiuhtontli 47 Figura 9. Cempoalxóchitl (Hernández, 1959) 47 Figura 10. Distribución de Tagetes erecta 48 Figura 11. Ilustración de Tagetes erecta 50 Figura 12. Anatomía de Tagetes erecta 51 Figura 13. Quauhyyauhtli 59 Figura 14. Distribución de Tagetes lucida 60 Figura 15. Ilustración de Tagetes lucida 61 Figura 16. Anatomía de Tagetes lucida 64 Figura 17. Las cuatro fases secuenciales en los estudios clínicos de nuevos fármacos 71 Figura 18. Metabolismo primario y secundario 73 Figura 19. Diseño experimental del estudio 79 vii Figura 20. A) T. erecta (cempasúchil) y B) T. lucida (pericón) de Amatlán de Quetzalcóatl, Morelos 80 Figura 21. Imágenes de algunos médicos tradicionales en el Estado de Morelos 86 Figura 22. Imágenes de algunos comerciantes en el Estado de Morelos 88 Figura 23. Actividad ambulatoria 92 Figura 24. Exploración en tablero con orificios 93 Figura 25. Cilindro 94 Figura 26. Exploración en el modelo de cruz elevada 94 Figura 27. Imágenes de algunos usos del cempasúchil en el Estado de Morelos 101 Figura 28. Usos del cempasúchil comentados por los curanderos 101 Figura 29. Usos del cempasúchil por comerciantes de plantas medicinales 102 Figura 30. Imágenes de algunos usos del pericón en el Estado de Morelos 103 Figura 31. Usos del pericón comentados por los médicos tradicionales 104 Figura 32. Usos del pericón comentados por comerciantes de plantas medicinales 105 Figura 33. Efecto tipo ansiolítico-sedante de Tagetes erecta 108 Figura 34. Interacción farmacológica de Tagetes erecta con PBS 110 Figura 35. Efecto tipo ansiolítico-sedante de Tagetes lucida 112 Figura 36. Interacción farmacológica de Tagetes lucida con PBS 114 viii Figura 37. Efecto tipo ansiolítico-sedante de algunos flavonoides 116 Figura 38. Interacción farmacológica con PBS de algunos flavonoides 118 Figura 39. Efecto tipo ansiolítico-sedante de algunas cumarinas 120 Figura 40. Interacción farmacológica con PBS de algunas cumarinas 121 Figura 41. Efecto tipo ansiolítico-sedante del β–sitosterol 123 Figura 42. Interacción farmacológica con PBS del β–sitosterol 125 Figura 43. Búsqueda del mecanismo de acción de Tagetes erecta, en el modelo de campo abierto 126 Figura 44. Búsqueda del mecanismo de acción de Tagetes lucida, en el modelo de campo abierto 126 Figura 45. Cromatografía de capa fina de Tagetes erecta y Tagetes lucida 127 Figura 46. Espectro del hidrógeno de la dimetilfraxetina (6, 7, 8- trimetoxicumarina). 130 Figura 47. Espectro del carbono de la dimetilfraxetina (6, 7, 8- trimetoxicumarina). 131 Figura 48. Espectro de masas de dimetilfraxetina (6, 7, 8- trimetoxicumarina). 132 Figura 49. Espectro del hidrógeno de la escoparona (6, 7- dimetoxicumarina). 135 Figura 50. Espectro del carbono de la escoparona (6, 7- dimetoxicumarina). 136 Figura 51. Espectro de masas de la escoparona (6, 7- dimetoxicumarina). 137 ix Figura 52. UPLC de extractos de T. lucida A) Extracto acuoso; B) Extracto etanólico; C) Mezcla de cumarinas; D) 6, 7-dimetocumarina (dimetilfraxetina); E) 6, 7, 8 trimetoxicumarina (escoparona). Longitud de onda 347 nm. 144 Figura 53. UPLC de Tagetes erecta. A) Extracto acuoso. B) Extracto etanólico. Longitud de onda 347 nm. 145 x ÍNDICE DE TABLAS página Tabla 1. Neurotransmisores, agonistas, antagonistas y mecanismos 13 Tabla 2. Prevalencia de los trastornos de ansiedad durante la vida de los sujetos en la Ciudad de México 16 Tabla 3. Razones de la morbilidad específica de uno y otro género 16 Tabla 4. Diferencias entre ansiedad normal y patológica 18 Tabla 5. Síntomas de la ansiedad 18 Tabla 6. Clasificación de los trastornos de ansiedad según los CIE-10 19 Tabla 7. Prevalencia en México del uso de servicios alternos para tratar trastornos mentales. Diferencia entre sexos 23 Tabla 8. Usos clínicos de los sedantes hipnóticos 26 Tabla 9. Características farmacocinéticas de las benzodiacepinas en el ser humano 26 Tabla 10. Investigaciones interdisciplinarias de plantas medicinales 30 Tabla 11. Características del sistema de la medicina tradicional mexicana o del sistema médico tradicional mesoamericano 33 Tabla 12. Ejemplos de estudios farmacológicos hechos a plantas medicinales empleadas para tratar afecciones del SNC 42 Tabla 13. Ejemplos de algunos aceites de T. erecta 55 Tabla 14. Ejemplos de metabolitos secundarios de T. erecta 57 Tabla 15. Algunas cumarinas presentes en T. lucida 66 Tabla 16. Especies utilizadas en el Estado de Morelos para tranquilizar “los nervios” 81 xi Tabla 17. Preguntas hechas a comerciantes y curanderos 83 Tabla 18. Médicos tradicionales o curanderos entrevistados en el Estado de Morelos 87 Tabla 19. Rendimiento de los extractos, fracciones y mezcla de compuestos de T. erecta y T. lucida 106 Tabla 20. Dosis letal de los extractos orgánicos y acuosos de T. erecta y T. lucida 107 Tabla 21. Datos de los espectros de RMN 1H y 13C para la 6, 7, 8- trimetoxicumarina (dimetilfraxetina) 133 Tabla 22. Datos de los espectros de RMN 1H y 13C para la 6, 7- dimetoxicumarina (escoparona) 134 1 RESUMEN La ansiedad es considerada a nivel mundial como uno de los desórdenes mentales que más afectan a la población, a tal padecimiento se le asocia con enfermedades de filiación cultural conocidas popularmente como “los nervios”. A este respecto, se sabe que la medicina tradicional mexicana emplea las plantas como recurso para contrarrestar diversos padecimientos que incluyen afecciones del sistema nervioso central como la ansiedad o “los nervios”, sin embargo no todas las especies están documentadas con información científica que fundamente sus propiedades medicinales. Las especies Tagetes erecta L. (cempasúchil) y Tagetes lucida Cav. (pericón) son plantas nativas de México que se usan ampliamente en la medicina tradicional mexicana para tratar diversas enfermedades; sin embargo, este conocimiento no está del todo argumentado. En este proyecto se puntualiza que de acuerdo con entrevistas hechas a curanderos y a comerciantes del Estado de Morelos, las plantas medicinales como T. erecta y T. lucida son utilizadas para el tratamiento de “los nervios” lo que sugiere su potencial como ansiolíticas, cuya forma de consumo fue referida principalmente como tintura (20 gotas del extracto hidroalcohólico ingeridas cada cuatro horas) y en infusión (una taza por la mañana y otra por la noche en un periodo de siete días). Las entrevistas antes mencionadas señalaron que T. lucida es además una de las especies más citadas para contrarrestar “los nervios” en dicho estado, mientras que T. erecta se emplea primordialmente para tratar afecciones del aparato digestivo o en combinación con otras especies como tranquilizante. Dentro del contexto socio-cultural es de considerarse que en su mayoría las personas entrevistadas (curanderos y comerciantes) pertenecían al género femenino en edad adulta. Donde los comerciantes mencionan mayor número de usos para dichas especies en comparación con los curanderos. En el caso de los curanderos,especializados en la terapia de “los nervios”, refieren que el tratamiento incluye además del consumo de plantas medicinales, cambios en la alimentación, hábitos de vida, y según sea el caso, un ritual como la limpia con huevo o plantas, ofrendas y el uso de la temazcalli. 2 Para dar evidencia científica y corroborar el efecto de tipo ansiolítico- sedante descrito para estas especies, en este proyecto se hicieron pruebas en los modelos experimentales tales como: campo abierto, tablero con orificios, cruz elevada e interacción farmacológica con la evaluación de la potenciación de la hipnosis inducida con pentobarbital sódico (PBS). Las dosis (3-300 mg/kg, según el caso) fueron administradas a ratones de la cepa SW agrupados en al menos una n de seis. Para T. erecta se evaluó el extracto acuoso, el etanólico, su fracción de acetato de etilo y etanólica. Para T. lucida se evaluó el extracto acuoso, el etanólico, la fracción de acetato de etilo y una mezcla de compuestos de tipo cumarínico con identificación de la 6, 7, 8-trimetoxicumarina y la 6, 7- dimetoxicumarina. Una vez que se determinó el efecto ansiolítico-sedante de ambas especies se exploró el posible mecanismo de acción utilizando el extracto acuoso completo en presencia de los antagonistas flumazenil (10 mg/kg) y WAY100635 (0.32 mg/kg), donde el fármaco de referencia como ansiolítico fue el diazepam (1 mg/kg). Adicionalmente se evaluaron estándares de referencia de compuestos puros reportados en la literatura para estas especies tales como el β-sitosterol, la naringenina, el canferol, la canferitrina, la quercetina, la rutina, la esculetina y la escopoletina, constituyentes de naturaleza flavonoide, cumarínica y/o esterol. Los resultados demuestran que el extracto acuoso, etanólico y las fracciones de T. erecta producen efectos significativos de tipo ansiolítico y sedante sin potenciar la actividad hipnótica del PBS. En el caso de T. lucida, la especie mostró actividad significativa de tipo ansiolítico-sedante, en los extractos polares, la fracción, la mezcla de cumarinas y los compuestos aislados así como en la potenciación de la hipnosis donde demostró un efecto depresor sinérgico con PBS. Las pruebas farmacológicas con los compuestos señalaron que existe un efecto significativo de tipo ansiolítico-sedante en el caso del β-sitosterol, los flavonoides y las cumarinas evaluadas. Respecto a los mecanismos de acción, los resultados refieren que en el efecto de tipo ansiolítico de T. erecta está involucrado el sistema serotoninérgico mediado por el receptor 5HT1A. Mientras que para T. lucida se incluye un mecanismo de acción gabaérgico mediado por el 3 sitio a benzodiacepinas y serotoninérgico por el receptor 5-HT1A. En relación a la identificación de algún metabolito responsable de la actividad ansiolítica sedante de T. lucida, se identificaron dos cumarinas: la 6, 7, 8-trimetoxicumarina y la 6, 7- dimetoxicumarina mediante 1H-RMN, 13C-RMN y gases masas. 4 ABSTRACT Anxiety disorder is considered one of the most prevalent mental affection worldwide, such condition is associated with diseases of cultural affiliation popularly known as “nerves”. It is known that Mexican traditional medicine uses plants as a resource to decrease different sickness including of the central nervous system (CNS) such anxiety or nerves. However not all species are documented with scientific information supporting their medicinal properties. Tagetes erecta L. (marigold) and Tagetes lucida Cav. (pericón) species are plants native to Mexico that are widely used in Mexican traditional medicine to treat some illness related to CNS, but this knowledge is not entirely clear. This project specifies that according to interviews with healers and merchants of Morelos State, T. erecta and T. lucida are used to treat nerves suggesting its potential as an anxiolytic. People ingest them usually as a tincture (20 drops of alcoholic extract, taken every four hours) an infusion (one cup in the morning and one at night, over a period of seven days). Interviews indicated that T. lucida is also one of the most cited species used to attend “nerves” in the state, while T. erecta is primarily used to treat digestive disorders or in combination with other species as a tranquilizer. In socio-cultural context, most of the people interviewed (healers and merchants) were adult females. Merchants mentioned greater number of uses for these species compared with healers. In the case of healers, specialized in therapy of “nerves”, they recommended medicinal plants, changes in diet, and lifestyle, as well a ritual “cleansing”, offerings and use of temazcalli (a sweat lodge). To give scientific evidence and to corroborate anxiolytic-sedative like effect described for these species, tests were performed on experimental models. Such open field, hole-board, elevated plus maze, and drug interaction with induced hypnosis strengthening with sodium pentobarbital (SP). Doses (3-300 mg/kg) were administered to mice strain SW grouped into at least six animals. Aqueous, ethanol extracts, and its fractions of T. erecta were evaluated. For T. lucida aqueous and ethanol extracts, fraction of ethyl acetate and a mixture of coumarins identificated as 6, 7, 8–trimethoxycoumarin and 6, 7-dimethoxycoumarin were evaluated. 5 Once the anxiolytic-sedative like effect was determined, the mechanism of action was explored using the aqueous extracts in presence of flumazenil antagonists (10 mg/kg) and WAY100635 (0.32 mg/kg). The reference drug was diazepam (1 mg/kg). Additionally pure compounds and reference standards reported in literature for these species such as β-sitosterol, naringenin, kaempferol, kampferitrin, quercetin, rutin, aesculetin, and scopoletin, constituents of flavonoid, sterol, and coumarin nature were evaluated. Results showed that T. erecta aqueous extract and fractions of ethanolic extract produced significant anxiolytic-like effects without sedative hypnotic synergism with SP. For T. lucida, species showed significant anxiolytic-sedative like effect in polar extracts, fraction, mixture of coumarins, and isolated compounds. Also it shows a potentiation of hypnosis with synergistic effect of SP depressor. Pharmacological compounds tests indicated a significant anxiolytic- sedative like effect for β-sitosterol, flavonoids and coumarins evaluated. The mechanisms of action for T. erecta results involved 5HT1A receptor. While T. lucida includes GABAergic mechanism mediated by benzodiazepine site and the serotonergic 5-HT1A receptor. The main effective substances appears to be 6, 7, 8– trimethoxycoumarin and 6, 7-dimethoxycoumarin identificated by 1H, 13C NMR, and mass gases with anxiolytic-sedative like effect activity for T. lucida. 6 1. INTRODUCCIÓN Los trastornos mentales son un problema grave de salud pública (Bersh, 1997). Es un grupo de enfermedades que afecta al ser humano en cualquier etapa de su vida. Una enfermedad importante en este grupo es, la ansiedad. En el caso específico de México, en 1996, la prevalencia de los trastornos psiquiátricos para la población se estimó en 16.7%, con mayor incidencia en el género femenino (Caraveo-Anduaga et al., 1996). El término ansiedad se define como una emoción universal que normalmente experimentamos cuando enfrentamos peligros externos o conflictos internos. Es de valor adaptativo y nos obliga a actuar según nuestro instinto de autoconservación. Para considerarse ansiedad patológica la duración de tal sensación debe ser de más de seis meses y generar síntomas como la aprensión, tensión, dificultad para respirar y concentrarse. Además se observa sudoración y presenta molestia abdominal, entre otros síntomas (Baldwin et al., 2008). En algunoscasos tal padecimiento se trata con médicos alópatas, como el psicólogo o el psiquiatra. Éste último receta ansiolíticos, por ejemplo, las benzodiacepinas o los inhibidores selectivos de la recaptura de serotonina. A pesar de que son fármacos ampliamente empleados producen diversos efectos colaterales, tales como sedación, relajación muscular, la disminución de la coordinación motora de movimientos finos e incluso generan tolerancia y dependencia (Dell´Osso y Lader, 2013). Existen alterativas a la terapia farmacológica como hacer actividad física (correr o yoga), acudir con un quiropráctico o emplear la herbolaria (Da Silva et al., 2009; Sarris et al., 2011). La medicina tradicional mexicana utiliza un 3.3% aproximado de plantas para tratar padecimientos del sistema nervioso central (SNC) (Lozoya, 1990; Tortoriello y Romero, 1992). A las plantas con efectos sobre el SNC se les describen popularmente como para curar “los nervios”, el “susto” o el “espanto”. A pesar de que las especies vegetales son ampliamente utilizadas y de fácil acceso a la población hay estudios preclínicos escasos y aún menos investigación clínica. 7 Tagetes erecta L. (cempasúchil) y Tagetes lucida Cav. (pericón) son plantas aromáticas nativas de México y de gran valor cultural no sólo por su uso en rituales, como alimenticias u ornamentales sino también como medicinales. Ambas especies se consumen de forma oral en infusiones y en tinturas hidroalcóholicas en diferentes regiones de México para el tratamiento de “los nervios”, pero sus efectos ya sea como ansiolíticos o sedantes no se habían evaluado. El presente proyecto aborda la investigación etnobotánica, farmacológica y fitoquímica del cempasúchil y pericón, las cuales son utilizadas en el Estado de Morelos, México, como ansiolíticos y/o sedantes. Este texto se encuentra organizado con un marco teórico en el que se incluye la descripción breve de algunos componentes y estructuras anatómicas del SNC, como las neuronas, los receptores y los agonistas involucrados en los procesos propios de comunicación del SNC, en específico conceptos relacionados con la ansiedad patológica. Se define el término y características de la ansiedad, sus síntomas, los estudios epidemiológicos más actuales, las distintas clasificaciones de su diagnóstico, y las diversas terapias: la psicológica, la psiquiátrica y las medicinas alternas o tradicionales. Se hace mención de los principales fármacos empleados, sus mecanismos de acción y efectos adversos; así mismo, se indica la asociación del término ansiedad con lo que popularmente se conoce como “los nervios”. El marco teórico contiene también la descripción breve de la importancia de la etnobotánica, farmacología y fitoquímica de estas especies. Se incluyen los conceptos de herbolaria, conocimientos tradicionales, medicina tradicional mexicana, así como un listado de las plantas más utilizadas para el tratamiento de la ansiedad. A partir del listado se describe el género Tagetes como de importancia por poseer especies útiles como ansiolíticas y/o sedantes. A T. erecta y T. lucida se les describe por separado y se señala para cada una sus datos históricos, botánicos, ecológicos, anatómicos, farmacológicos, de toxicidad, fitoquímicos, de distribución de la especie, los usos que se les da, incluyendo los medicinales y las partes empleadas. 8 Posterior a la descripción de las especies se inserta el apartado de farmacología, en que se explica la búsqueda de nuevos fármacos, los estudios preclínicos utilizados para conocer si una especie es ansiolítica o sedante mediante el empleo de modelos conductuales tales como de campo abierto, exploración de orificios, cilindro y cruz elevada. También se describen los métodos que usan para conocer la posible interacción farmacológica fármaco-planta, utilizando el ya validado modelo de inducción de sedación e hipnosis con pentobarbital sódico. Como último apartado del marco teórico se explica el estudio fitoquímico de las plantas, algunas bases para entender el metabolismo primario y secundario, así como los metabolitos secundarios implicados en la actividad de tipo ansiolítico- sedante. En específico destacan las cumarinas, un grupo no muy reportado con respecto al uso medicinal, a la actividad sobre el SNC y por ser el grupo del metabolito bioactivo identificado en Tagetes lucida. En el desarrollo del escrito y propiamente lo que corresponde a la ejecución del proyecto, se menciona el planteamiento del problema abordado en cuatro hipótesis y el objetivo general dividido en seis específicos. El diseño experimental constó del: a) estudio etnobotánico que incluyo cómo se hizo la selección de las especies, las preguntas elegidas en entrevistas dirigidas y abiertas hechas a los curanderos y comerciantes del Estado de Morelos; b) estudio farmacológico que desglosa las estrategias experimentales en que se utiliza el reactivo biológico, los extractos, las fracciones, los compuestos puros y los fármacos de referencia. En este apartado se especifican las cantidades empleadas y condiciones puntuales. Se describe la recolecta de ejemplares botánicos y la obtención del número de referencia del herbario donde están depositados, así como la preparación de los extractos acuoso y orgánico, las fracciones y compuestos derivados de estos. Se indican las pruebas de toxicidad aguda y los modelos experimentales para determinar parámetros como eficacia, potencia e índice terapéutico, interacción farmacológica y de búsqueda de mecanismos de acción (gabaérgico o serotoninérgico) utilizando la validación de los datos mediante análisis estadístico. Y como último apartado del diseño experimental, se refiere el estudio fitoquímico 9 en que se describen las pruebas de cromatografía en capa fina y líquida de alta resolución, y las técnicas de resonancia magnética nuclear, el impacto electrónico y la espectrometría de masas para la identificación de metabolitos bioactivos. El lector podrá encontrar la descripción de los resultados en tablas y figuras, así como dibujos o diagramas, los cuales son discutidos con citas actuales. No solo se contestan las hipótesis planteadas, sino además se dejan algunas perspectivas para el futuro a partir de este proyecto. Al final del escrito se incorporan las publicaciones derivadas de este estudio y una lista de trabajos presentados en congresos y ponencias (Anexo A, B y C). En resumen, este proyecto contribuye al estudio sistemático e integral de la medicina tradicional mexicana, mediante 1) la participación de conocimientos transmitidos por curanderos y comerciantes de plantas medicinales, 2) las evidencias científicas de la evaluación preclínica de ambas especies vegetales y 3) los datos fitoquímicos que refuerzan la existencia del contenido de sustancias activas de diferente naturaleza en ambas especies, cuya actividad ansiolítica y/o sedante involucra sistemas de neurotransmisión reconocidos en la terapéutica de la ansiedad. Contribuye a reforzar el conocimiento de éstos y aporta blancos de acción de terapias alternativas. 10 2. MARCO TEÓRICO 2.1 SISTEMA NERVIOSO CENTRAL El Sistema Nervioso Central (SNC) es uno de los sistemas más complejos del cuerpo y se encarga del control de diversas funciones corporales. Consta de encéfalo y médula espinal (Figura 1). El encéfalo incluye distintas partes del cerebro (hemisferios cerebrales y diencéfalo), tronco encefálico (mensencéfalo, puente y bulbo raquídeo) y cerebelo (Guyton y Hall, 2001; Fox, 2011). A este sistema se le puede dividir en dos: sistema nervioso autónomo y sistema nervioso somático. El sistema nervioso autónomo, como su nombre lo dice controla las funciones involuntarias, regula funciones como la digestión, la circulación, la respiración, los metabolismos y la excreción(Fox, 2011). A su vez este sistema se subdivide en simpático, parasimpático e intestinal. El sistema nervioso somático regula funciones voluntarias como el movimiento y la postura (Astiril, 2010). Figura 1. El encéfalo. 2.1.1 Las neuronas La unidad funcional más pequeña del SNC es la neurona (Figura 2); se trata de una célula que consta de un cuerpo neuronal o soma y sus prolongaciones. El soma, depende del lugar donde se encuentre, puede ser poligonal, multipolar, 11 redondo o unipolar. El núcleo es ovoideo o esférico con escasa heterocromatina. Respecto a las prolongaciones de las neuronas, están las dendritas y los axones. Las dendritas son las encargadas de la recepción de señales mientras que los axones conducen los estímulos a otras neuronas o células (Society for Neuroscience, 2015). Figura 2. La estructura de las neuronas. Las neuronas están rodeadas por muchas otras células con funciones de soporte. Los sistemas procesadores del sistema nervioso se crean mediante la comunicación entre neuronas. Tal comunicación es posible debido a que las neuronas son células excitables con capacidad para transmitir señales electroquímicas e influir en la actividad de otras neuronas a través de las sinapsis (Lasserson et al., 1998). Las sinapsis son los lugares especializados donde se conectan dos neuronas. Las neuronas envían impulsos eléctricos por medio de los axones, éstas se comunican cuando una neurona envía un mensajero químico, o neurotransmisor a otra neurona. Tal acción se efectúa desde un axón presináptico o terminal nerviosa presináptica a cualquiera de los sitios de la otra neurona llamada postsináptica o terminal nerviosa presináptica (Stahl, 2002). 12 Las neuronas se clasifican en tres tipos (Cingolani y Houssay, 2000): a) Neuronas sensoriales, que transmiten la información obtenida en estímulos externos como el sonido, la luz, las señales químicas y responde a estímulos internos del cuerpo como la posición de alguna extremidad. b) Neuronas motoras, que transmiten señales a los órganos efectores causando contracción de los músculos o secreción de las células glandulares. c) Interneuronas, que conectan otras neuronas con el SNC (aproximadamente el 90% son de este tipo). 2.1.2 Los neurotransmisores Los neurotrasmisores son mediadores químicos que ejercen efectos de duración breve o prolongada, actúan de forma difusa y a distancias considerables del lugar donde se liberaron y son capaces de originar diversos efectos sobre la síntesis de un transmisor y sobre la expresión de los receptores del neurotrasmisor, además actúan sobre la conductancia iónica de las células postsinápticas. Los neuromoduladores son los que regulan la respuesta neuronal postsináptica o presináptica, modificando la respuesta de las neuronas (Rang et al., 2008). La secuencia en la neurotransmisión es de importancia porque los agentes con actividad farmacológica modulan los pasos individuales (Westfall y Westfall, 2011). La combinación de distintas técnicas como de genética molecular, la unión de radioligandos, el “patch-clamp”, el uso creciente de fármacos agonistas y antagonistas cada vez más selectivos ha permitido el conocimiento de los neurotransmisores y sus receptores (Aldea et al., 2002). Los neurotrasmisores más comunes son la noradrenalina, la acetilcolina, la dopamina, el glutamato, los purigénicos o la serotonina y el ácido gamma amino butírico o GABA (Tabla 1). 13 Tabla 1. Neurotransmisores, agonistas, antagonistas y mecanismos Tomado de Nicoll, 2013. El estudio de la ansiedad se ha focalizado en el conocimiento de diversos mecanismos de acción como el gabaérgico (GABAA) y serotoninérgico (receptor 5- HT1A). Neurotransmisor Anatomía Subtipos de receptores Antagonistas del Mecanismos y agonistas preferidos Receptor Acetilcolina Cuerpos celulares en todos los niveles; conexiones largas y cortas Muscarínicos (M1): muscarina Pirenzepina, atropina Excitadores: ↓conductancia de K+;↑IP3, DAG Muscarínicos (M2): muscarina, Atropina, metoctramina Inhibidores: ↑ conductancia de K+; ↓ cAMP Betanecol Sinapsis celular de neuronas motoras de Renshaw Nicotínicos: nicotina Dihidro-β-eritroidina, Excitadores: ↑ conductancia de cationes bungarotoxina α Dopamina Cuerpos celulares en todos los niveles; conexiones cortas, intermedias y largas D1 Fenotiacinas Inhibidores (¿?): ↑ cAMP D2; bromocriptina Fenotiacinas, butirofenonas Inhibidores (presinápticos): ↓ Ca 2+; ↓ cAMP GABA Interneuronas raquídeas y suprarraquídeas involucradas en la inhibición presináptica y postsináptica GABAA: muscimol Bicuculina, picrotoxina Inhibidores: ↑ conductancia de Cl- GABAB: baclofeno 2-OH saclofeno 5-hidroxitriptamina Cuerpos celulares en el mesencéfalo y la protuberancia anular se proyectan a todos los niveles Inhibidores: ↑ conductancia de K+↓ cAMP 5-HT2A: LSD Ketanserina Excitadores: ↓conductancia de K+;↑IP3, DAG Neurotransmisor Anatomía Subtipos de receptores Antagonistas del Mecanismos α2: clonidina Yohimbina Inhibidores (presinápticos): ↓ conductancia de Ca 2+; inhibidores: ↑ conductancia de K+,+↓ cAMP β1:isoproterenol, dobutamina Atenolol, practolol Excitadores: ↓conductancia de K+, ↑cAMP y agonistas preferidos Butoxamina Inhibidores pueden involucrar en la bomba electrogénica de sodio; ↑cAMP 14 2.1.2.1 Ácido gamma amino butírico (GABA) Los receptores de GABA se dividen en tres tipos principales GABAA, GABAB y GABAc. Los potenciales inhibidores postsinápticos en muchas zonas del cerebro tienen un componente rápido y uno lento. El rápido es mediado por receptores de GABAA y el lento por los receptores GABAB. Los receptores de GABAA (Figura 3) son ionotrópicos, con estructuras pentaméricas y permeabilidad selectiva a Cl-. Son receptores que se inhiben en forma selectiva a picrotoxina y la bicuculina¸ los cuales interactúan alostéricamente unos con otros (Olsen et al., 2004). Los receptores para GABAB se localizan en la región perisináptica y por tanto, necesitan la liberación de GABAB desde la hendidura sináptica. También se pueden localizar en las terminales axónicas de muchas sinapsis excitadoras e inhibidoras (Nicoll, 2013). Y GABAC (o GABAA-rho) se localiza en el cristalino de los ojos (Johnson, 1996). Las funciones de GABA dependerán de las áreas dónde se encuentren en el cerebro, actúan como inhibidores del SNC, en la reducción de la excitabilidad de las neuronas o en la regulación del tono muscular (Watanabe et al., 2002). Figura 3. Estructura de GABAA. 2.1.2.2 Serotonina Casi todas las vías de la 5-hidroxotriptamina o serotonina (5-HT) se originan desde las neuronas en el rafé o las regiones de la línea media de la protuberancia anular o 15 y la porción superior del tallo cerebral (Figura 4). Los receptores 5HT están acoplados a la proteína G, salvo 5HT3, que es un canal catiónico controlado por un ligando. Las funciones de las vías de 5-HT son las de presentar diversas respuestas conductuales (como alucinatoria); la conducta alimentaria; el control de estado de ánimo y las emociones; el control del sueño/vigilia; el control de las vías sensitivas; y en la nocicepción y la emesis. Los principales subtipos de receptores en el SNC son 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT2 y 5-HT3. Las asociaciones entre las funciones fisiológicas y de la conducta con estos receptores se conocen parcialmente, incluso existen otros tipos de receptores (5-HT4-7) de función menos conocida (Rang et al., 2008).Figura 4. Diagrama de la neurotransmisión de la serotonina. 2.2 ANSIEDAD 2.2.1 Epidemiología de la ansiedad en México En México existen algunos estudios epidemiológicos relativos a los trastornos mentales entre los que destacan los trastornos de la ansiedad. La mayor incidencia se encontró en el género femenino (casi al doble que el género masculino). Para 1999, la población adulta de la Ciudad de México de entre 18 a 65 años de edad refirió en un 28% presentar a lo largo de su vida un trastorno mental, mientras que el 9.5% manifestó dos o más trastornos. En la prevalencia de los diferentes trastornos de ansiedad durante la vida de los sujetos, el diagnóstico 16 más frecuente es la ansiedad generalizada (Caraveo-Anduaga et al., 1999) (Tabla 2). Tabla 2. Prevalencia de los trastornos de ansiedad durante la vida de los sujetos en la Ciudad de México Modificado de Caraveo- Anduaga et al., 1999. Es así que la ansiedad patológica es uno de los desórdenes psiquiátricos más prevalentes dentro de la población en general y el número de casos se ha incrementado en años recientes (Díaz-Saez et al., 2014). Las mujeres tienen mayor incidencia, 1.9 mujeres por cada hombre (Caraveo-Anduaga et al., 1999) (Tabla 3). Tabla 3. Razones de la morbilidad específica de uno y otro género Diagnósticos CIE★-10 % en la vida Agorafobia 4.9* Agorafobia simple 2.4* Fobia específica 2.2* Fobia social 2.4* Ansiedad generalizada 1.9* Pánico 2.8* Trastorno obsesivo-compulsivo 2.7* *Mujeres por cada hombre Modificado de Caraveo-Anduaga et al., 1999. ★Otros diagnósticos de trastornos mentales catalogados según la CIE 10 de la OMS (1993) son: episodios depresivos, distimia, manía, hipomanía, dependencia del alcohol, dependencia de otras sustancias, abuso de alcohol y abuso de otras sustancias. Diagnósticos (Clasificación Internacional de Enfermedades) CIE-10 % en la vida Agorafobia 2.5 Agorafobia simple 2.1 Fobia específica 2.8 Fobia social 2.6 Ansiedad generalizada 3.4 Pánico 1.9 Trastorno obsesivo-compulsivo 1.4 17 En un análisis de la Encuesta Nacional de Epidemiología Psiquiátrica, Medina-Mora et al. (2003) mencionan para México que los trastornos de ansiedad en la vida adulta son los más prevalentes y crónicos entre las enfermedades mentales. Éstos se inician en edades tempranas, seguidos en orden de frecuencia por los trastornos afectivos (manías, episodios depresivos, hipomanía, distimia con jerarquía o cualquier trastorno afectivo) y por el uso de sustancias. En dicha encuesta encontraron diferencias entre las distintas regiones geográficas del país. La zona centro-oeste tenía una mayor incidencia de prevalencia. Tres áreas metropolitanas mostraron la tendencia más elevada a trastornos de ansiedad con un 3.4% (Medina-Mora et al., 2003). La encuesta hecha en el 2009 a 361 personas del Distrito Federal señala que es consistente la prevalencia de esta enfermedad para el género femenino de 16.3% en comparación con el 9% para el género masculino (Berenzon et al., 2009). 2.2.2 Definición y características de la ansiedad Como ya se mencionó la ansiedad se refiere a una emoción universal que normalmente experimentamos cuando enfrentamos peligros externos y/o conflictos internos. Este tipo de ansiedad se denomina umbral emocional, se considera normal y útil, ya que permite mejorar el rendimiento y la actividad de las personas (Dickey, 2000). De acuerdo con su intensidad, duración y el grado de alteración del comportamiento y funcionamiento de la persona se suele dividir en normal o patológica (Rodríguez-Landa y Contreras, 1998; Dickey, 2000). La ansiedad patológica se caracteriza por un sentimiento subjetivo de tensión e intranquilidad con características de terror intenso y presentimientos derivados de una amenaza externa imaginaria que puede ocasionar impulsos o conflictos desagradables. La ansiedad puede estar representada por fobias, obsesiones y compulsiones o puede estar somatizada por otro tipo de enfermedades (Rickels y Rynn, 2001) (Tabla 4). 18 Tabla 4. Diferencias entre ansiedad normal y patológica Ansiedad normal Ansiedad Patológica Características generales Episodios poco frecuentes Episodios repetidos Intensidad leve o media Intensidad alta Duración limitada Duración prolongada Situación o estímulo estresante Reacción esperable y poco común Reacción desproporcionada Grado de sufrimiento Limitado y transitorio Alto y duradero Grado de interferencia en la vida cotidiana Ausente o ligero Profundo Tomado de Guía de Práctica Clínica Diagnóstico y Tratamiento de los Trastornos de Ansiedad en el Adulto. Secretaría de Salud, 2010. En el diagnóstico clínico de la ansiedad, esta sensación de preocupación excesiva se debe presentar durante más de seis meses y no se restringe a circunstancias particulares. Además incluye síntomas como aprensión, tensión, dificultad para concentrarse e hiperventilación, entre otras (Baldwin et al., 2008) (Tabla 5). Tabla 5. Síntomas de la ansiedad Sistema del cuerpo Síntomas Psicológico Miedo anticipado Inquietud Irritabilidad Poca concentración Pensamientos de preocupación Gastrointestinal Dificultad para tragar Malestar epigástrico Respiratorio Dificultad para inhalar Hiperventilación 19 Sistema del cuerpo Síntomas Cardiovascular Molestia en el pecho Palpitaciones Neuromuscular Tremores Mareos Tensión o dolor muscular Genitourinario Micción frecuente o urgente Pérdida de erección Molestias en la menstruación Amenorrea Molestias del sueño Insomnio Otros Miedo nocturno Despersonalización Obsesiones Modificado de Walker y Shepherd, 2001. 2.2.3 Trastornos de la ansiedad Para el diagnóstico de las enfermedades mentales como la ansiedad, se utilizan categorizaciones que permiten determinar el tipo de trastorno que presentan los pacientes. Los documentos usados son el Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales o DSM elaborado por la Asociación de Psiquiatras Americanos y los Criterios Diagnósticos de Investigación o CIE de la OMS. Los CIE-10 agrupan los trastornos neuróticos (ansiedad) con el estrés y los trastornos somatomorfos (Tabla 6). Tabla 6. Clasificación de los trastornos de ansiedad según los CIE-10 CIE-10 a) Trastorno de ansiedad fóbica Fobias sociales Fobias específicas b) Otros trastornos de ansiedad 20 CIE-10 Trastorno de ansiedad generalizada Trastorno mixto ansioso-depresivo Otro trastorno mixto de ansiedad Otros trastornos de ansiedad c) Trastorno obsesivo-compulsivo d) Reacciones de estrés y trastornos de adaptación Trastorno por estrés postraumático Reacción de estrés agudo Trastorno de adaptación Trastornos disociativos Trastornos somatomorfos e) Otros trastornos neuróticos Modificado de Guía de Práctica Clínica para el Manejo de Pacientes con Trastornos de Ansiedad en Atención Primaria, 2008. La última versión del DSM-5 se publicó en el 2013. Ésta se basa en la aparición del trastorno en el ciclo vital del individuo. Se consideran primero los trastornos del desarrollo (síntomas somáticos) y después los neurocognitivos; es decir, para conocer a que le tienen o tuvieron miedo las personas en la niñez, que situaciones evaden y cómo la ansiedad responde a un factor estresante. De esta forma determinan los diferentes tipos de ansiedad y demás enfermedades mentales (Silove y Ress, 2014). Algunos de los criterios diagnósticos para el trastorno de ansiedad de la DSM-5 son los siguientes (Tortella-Feliu, 2014): a. Trastorno de ansiedad por separación. Es relativo a separarsede una persona con un vínculo estrecho y que se manifiesta en mínimo tres acciones centradas en preocupación, malestar psicológico subjetivo, rechazo a quedarse solo en casa, desplazarse a otros lugares o tener pesadillas o síntomas físicos ante la separación de las personas con las que se tiene un vínculo. b. Mutismo selectivo. Se refiere a la incapacidad persistente de hablar o responder a otros en situaciones sociales específicas en que se espera debe hacerlo. La 21 persona puede hacerlo en otras situaciones (prototípicamente delante de familiares inmediatos). c. Fobia específica. Se trata de la aparición de miedo o ansiedad intensa y persistente, prácticamente inmediata e invariable respecto a un objeto o situación específica, que se evita o soporta a costa de intenso miedo-ansiedad. d. Trastorno de ansiedad social. Es el miedo o ansiedad intensos que aparecen prácticamente en relación a una o más situaciones sociales en que la persona se expone al posible escrutinio por parte de otros. La persona teme actuar de una determinada manera o mostrar síntomas de ansiedad que puedan ser valorados negativamente por los observadores. e. Trastorno de angustia. Se manifiesta en la presencia de distintas crisis de angustias inesperadas y recurrentes. Al menos una de las crisis va seguida durante mínimo de un mes de inquietud o preocupación persistente, por la aparición de nuevas crisis o sus consecuencias o por un cambio significativo y no adaptativo en el comportamiento que se relacione con la crisis de angustia. f. Agorafobia. Es causada por el miedo o ansiedad que aparecen respecto a dos o más situaciones prototípicamente agorafóbicas (transportes públicos, lugares abiertos, estar en medio de una multitud y/o estar solo fuera de casa, etcétera). Además se evitan estas situaciones activamente, solicitan la presencia de un acompañante o se toleran a pesar de un miedo intenso o ansiedad. g. Trastorno de ansiedad generalizada. Ansiedad o preocupaciones excesivas, persistentes y que las personas tienen dificultades para controlar, sobre diversos acontecimientos o actividades que se asocian a tres o más síntomas de sobre- activación fisiológica, tales como: sudoración, palpitaciones, etcétera. h. Trastorno de ansiedad inducido por sustancias/medicación. El cuadro clínico se caracteriza fundamentalmente por la presencia de crisis de angustia o ansiedad y 22 en el que haya evidencias de que dichos síntomas se desarrollan durante o poco después de la intoxicación o abstinencia a una sustancia o por la toma de medicación. i. Trastorno de ansiedad debido a otra enfermedad médica. El cuadro se caracteriza por crisis de angustia o ansiedad con evidencias de que ello es consecuencia fisiopatología directa de otra condición médica. j. Otros trastornos de ansiedad especificados. Se refiere a la presencia de síntomas clínicamente significativos característicos de algún trastorno de ansiedad que no cumplen con todos los criterios diagnósticos de ninguno de los trastornos; un ejemplo es la crisis de angustia limitada. 2.2.4 Enfermedades de filiación cultural asociados a la ansiedad En México distintas encuestas como la del Estudio Nacional (Medina-Mora et al., 1992), informan que las personas con trastornos emocionales piden primero ayuda en un 54% a conocidos cercanos, 10% a sacerdotes y ministros, 15% se automedican y solo de forma secundaria acuden a la medicina general y a los servicios especializados. Datos que refuerzan esta situación son los provenientes de la Encuesta Nacional de Epidemiología Psiquiátrica publicada por Medina-Mora et al. (2003). En tal encuesta se señala que una de cada cinco personas con algún trastorno afectivo usaron servicios médicos y sólo una de cada 10 personas con algún trastorno de ansiedad tuvieron atención médica. Para la Ciudad de México se hizo una encuesta en seis colonias (Berenzon et al., 2009). Tal estudio señala que aproximadamente un 5% de la población con padecimientos emocionales acude a servicios médicos especializados. Respecto a las medicinas tradicionales para tratar la ansiedad se emplea a nivel mundial principalmente la herbolaria (Kourosh et al., 2014; Sarris et al., 2011). Además se incluyen técnicas de relajación, sanación espiritual, las terapias físicas, la quiropraxis (Druss y Rosenheck, 2000; Berenzon et al., 2009), el ejercicio o la yoga (Da Silva et al., 2009) (Tabla 7). 23 Tabla 7. Prevalencia en México del uso de servicios alternos para tratar trastornos mentales. Diferencia entre sexos Modificado de Berenzon et al., 2009. 2.2.5 “Los nervios” y el “susto” Los trastornos de ansiedad están influenciados por factores éticos, raciales y culturales (Hofmann y Hinton, 2014). Dependen de la conceptualización que tienen las culturas de la fisiología de los síntomas de ansiedad, de los denominados síndromes dependientes de la cultura (Campos-Navarro, 2004) y del contexto social y normas a los cuales las personas están expuestas (Hofmann et al., 2011; Hinton 2012). El DSM-4, en la Guía para la formulación cultural y glosario de síndromes dependientes de la cultura, Apéndice J incluye diversos síndromes latinoamericanos de trastornos mentales como: “los nervios”, “ataques de nervios”, “susto”, espasmo, “muina” (bilis y cólera), locura y “mal de ojo”. “Los nervios” son descritos de la siguiente manera: “Término que refleja malestar entre los grupos latinos de Estados Unidos y Latinoamérica. Otros grupos étnicos poseen términos similares que reflejan la idea de «nervios» (como nevra entre los griegos de Norteamérica). Los nervios se refieren tanto a un estado de vulnerabilidad frente a experiencias de estrés cotidiano como a un síndrome producido por circunstancias difíciles en la vida. El término nervios incluye una amplia variedad de Cualquier trastorno mental Hombres Mujeres Total (n=21) (n=49) (n=70) Remedios caseros 0 34.7 24.3 Automedicación 9.1 10.2 9.9 Actividades físicas 66.7 42.9 50 Redes informales de apoyo 52.4 53.1 52.9 Grupos de autoayuda 33.3 22.4 25.7 Medicina tradicional mexicana 19 8.2 11.4 Acupunturista, homeópata o quiropráctico 0 6 4.2 Prácticas curativas adaptadas de otras cultura 14.3 16.3 15.7 Consejero espiritual 23.8 28.6 27.1 Prácticas adivinatorias 0 16.3 11.4 Uso de medicinas alternativas 47.6 55.1 52.9 24 síntomas de malestar emocional, alteración somática e incapacidad para la actividad. Los síntomas más frecuentes son cefaleas y «dolor cerebral», irritabilidad, alteraciones gástricas, trastornos del sueño, nerviosismo, llanto fácil, dificultad para concentrarse, temblor, sensación de escalofríos y prurito, y mareos (inestabilidad con exacerbaciones ocasionales similares al vértigo). Los nervios tienden a ser un problema continuo, aunque variable en el grado de incapacidad que provoca. Los nervios es un síndrome muy amplio, que va desde casos sin trastorno mental hasta cuadros que se parecen a los trastornos adaptativos, de ansiedad, depresivos, disociativos, somatomorfos o psicóticos. El diagnóstico diferencial dependerá de la constelación de síntomas, del tipo de acontecimientos”. El susto lo describe de la siguiente manera: “Susto («miedo súbito» o «pérdida del alma»). Enfermedad popular prevalente entre algunos latinos de Estados Unidos y entre la población mexicana, de América Central y Sudamérica. El susto se conoce también como espanto, pasmo, tripa ida, pérdida del alma o chibib. El susto es una enfermedad atribuida a un acontecimiento que provoca miedo súbito y causa la salida del alma, dando lugar a sufrimiento y enfermedad. Los individuos que sufren sustos experimentan también dificultades significativas en el contexto social. Los síntomas pueden aparecer tras semanas o años de experimentarel miedo súbito. Se cree que, en casos extremos, el susto puede provocar la muerte. Los síntomas típicos incluyen trastornos del apetito, sueño inadecuado o excesivo, sueño intranquilo o pesadillas, disforia, falta de motivación para cualquier actividad, y baja autoestima o valoración negativa. Los síntomas somáticos que acompañan el susto incluyen mialgias, cefaleas, gastralgias y diarrea. Los rituales de salud se orientan en el sentido de recuperar el alma para que vuelva al cuerpo y limpiar a la persona para que restaure el equilibrio corporal y espiritual. Las diferentes experiencias de susto pueden estar relacionadas con un trastorno depresivo mayor, trastorno por estrés postraumático y trastorno somatomorfo. Creencias etiológicas y configuraciones de síntomas similares pueden encontrarse en diversas partes del mundo”. El término “los nervios” para la medcina tradicional mexicana se refiere a un estado de intranquilidad en el que se presenta insomnio, pérdida de apetito, pulso acelerado, desesperación, entre otros. Generalmente se manifiesta cuando las personas tienen conflictos sociales, dificultades familiares, económicas, laborales, impresiones fuertes o un “susto” (Mata, 1994). El “susto” es un término también conocido como espanto o pasmo (pérdida del alma o espíritu), debido a una impresión súbita o amenazante (Collado, 1988). También es originado por el encuentro con objetos inanimados, entidades sobrenaturales, animales peligrosos o por haber tenido una caída en tierra o agua y en general cualquier episodio traumático (Mata, 1994). Se piensa que los niños son especialmente propensos a un “susto”, y es una de las principales enfermedades a las cuales se enfrentan (Kearney, 1969; Mendoza, 2011). 25 Nuevamente algunos de los síntomas que incluyen esta enfermedad son: insomnio, depresión, languidez, debilidad, pérdida de apetito, pérdida de interés en la apariencia personal, inquietud durante el sueño, fiebre, etcétera (Mysyk, 1998). De esta manera, la enfermedad de “los nervios”, el “susto” y “ataque de nervios” se asocian con los síntomas de ansiedad (Alcántara et al., 2011). Las afecciones como “los nervios” o el “susto” y la traducción a nuestros conceptos, requieren de investigación clínica, que aún no se ha hecho con el debido rigor. No solo la gente de los pueblos presenta esas enfermedades y síntomas relativos a síndromes de filiación cultural, la cuestión es que nuestros padecimientos son diagnosticados bajo otras categorías nosológicas y curados en función de ellas (Fagetti, 2005). Por lo tanto, el estudio interdisciplinario sobre salud mental se hace necesario. Esto permitirá la comparación entre géneros y clases sociales donde se concibe la enfermedad de “los nervios” (Baer et al., 2003). 2.2.6 Terapéutica de la ansiedad La gente que presenta ansiedad patológica recurre a diversos especialistas de la salud como el psiquiatra, el psicólogo, el psicoterapeuta, el enfermero, el trabajador social especializado en la salud mental, el médico general o familiar y/o el terapeuta ocupacional (Medina-Mora et al., 2003). En el sistema de salud hegemónico se mencionan oficialmente dos tipos de terapias, la psicológica o farmacológica. En algunos casos se emplean ambas. El tratamiento psicológico es un proceso de comunicación interpersonal que tiene como objeto producir cambios para mejorar la salud mental del paciente. Maneja terapias cognitivo-conductuales o psicodinámicas. En la terapia farmacológica de la ansiedad se prescriben medicamentos tranquilizantes (sedantes-hipnóticos) (Tabla 8). 26 Tabla 8. Usos clínicos de los sedantes hipnóticos Usos Para el alivio de ansiedad Contra el insomnio Para la sedación y amnesia, antes y durante procedimientos médicos quirúrgicos Para el tratamiento de la epilepsia y los estados convulsivos Como componente de la anestesia balanceada (de administración intravenosa) Para el control de estados de abstinencia del etanol y otros sedantes hipnóticos Para la relajación muscular en trastornos neuromusculares específicos Como ayuda diagnóstica o tratamiento en psiquiatría En esta terapia los fármacos eficaces para la ansiedad se pueden clasificar en tres grupos: 1) antidepresivos con acciones ansiolíticas (antidepresivos tricíclicos, inhibidores de la recaptura de serotonina, inhibidores de la monoamino- oxidasa); 2) bloqueadores beta-adrenérgicos (hormonas esteroidales) y 3) las benzodiacepinas (BDZ) (Rodríguez-Landa y Contreras, 1998). Éstas últimas son el grupo más importante de fármacos utilizados como ansiolíticos e hipnóticos (Tabla 9). Tabla 9. Características farmacocinéticas de las benzodiacepinas en el ser humano Fármaco Semivida del fármaco original (horas) Metabolito activo Semivida del metabolito (horas) Duración global de la acción Aplicaciones más importantes Triazolam1 2-4 Derivado 2 Ultracorta (<6 h) Hipnótico Midazolam hidrolizado El midazolam se emplea como anestésico Zolpidem 2 2 No Ultracorta (-4 h) Hipnótico Loracepam, 8-12 No Corta (12-18 h) Ansiolítico, hipnótico Oxacepam, Tomado de Trevor y Way, 2013. 27 Fármaco Semivida del fármaco original (horas) Metabolito activo Semivida del metabolito (horas) Duración global de la acción Aplicaciones más importantes Temacepam, Ormetacepam 8-12 No Corta (12-18 h) Ansiolítico, hipnótico Alprazolam 6-12 Derivado 6 Media (24 h) Ansiolítico, antidepresivo hidrolizado Nitracepam 16-40 No Media Hipnótico, ansiolítico Diazepam, 20-40 Nordacepam 60 Larga (24-48 h) Ansiolítico, relajante muscular Clordiacepóxido Diacepam es usado como anticonvulsionante Fluceracepam 1 Desmetil- 60 Larga Ansiolítico Fluracepam Clonacepam 50 No Larga Anticonvulsivante, ansiolítico (sobre todo en la manía) 1 de uso controlado en México 2 no es benzodiacepina, pero actúa ahí. De las BDZ, el diazepam es de los más usados. El tratamiento en humanos inicia con una dosis pequeña de 2 mg tres veces al día o 5 mg dos veces al día, llegando a usarse hasta 40 mg por día (Argyropoulos et al., 2000). Los ansiolíticos producen diversos efectos adversos, como disminución de la agudeza mental y de las habilidades motoras, fotosensibilidad, despertar prematuro con insomnio de rebote, amnesia anterógrada, deterioro de las habilidades psicomotoras, teratogénesis, así como tolerancia y dependencia (Uzun et al., 2010). En general se recomienda su utilización a corto plazo, es decir, no más allá de cuatro semanas, y cuando sea importante el control rápido de los síntomas o mientras se espera la respuesta del tratamiento con antidepresivos (Guía de Práctica Clínica para el Manejo de Pacientes con Trastornos de Ansiedad en Atención Primaria, 2008). Tomado de Rang et al., 2008. 28 2.2.7 Mecanismos de acción de fármacos ansiolíticos Las BDZ son moduladores alostéricos de GABA que pueden generar varios efectos terapéuticos y también adversos, lo cual estará en función de la dosis (Dell´Osso y Lader, 2013). Las BDZ potencian la respuesta al GABA aumentando la conductancia del ión cloro, la consecuencia de tal conductancia es la hiperpolarización de las células. Las BDZ ejercen por lo tanto una acción inhibidora en diversas regiones del SNC, como la corteza cerebral, el hipocampo o la médula espinal aumentando la frecuencia de apertura de los canales de cloro en presencia de GABA, así como el tiempo de apertura de los mismos. Debido a ello es que se van a producir efectos de tipo depresor del SNC, entre ellos los de tipo ansiolítico, sedante, de relajación muscular, amnesia anterógrada y acción anticonvulsiva (Rioja, 2004). El efecto inverso tienen los antagonistaspues disminuyen la conductancia del cloro, antagonizando las respuestas derivadas de la unión del GABA a su receptor. Los antagonistas no tienen efecto sobre el flujo del cloro, pero bloquean las acciones de los agonistas (Tanelian et al., 1993), un ejemplo es el del antagonista del sitio de BDZ con el flumazenil (Robin y Trieger, 2002) o el Ro- 151788, el cual fue el primer antagonista benzodiazepínico introducido en el arsenal terapéutico. Su principal utilidad radica en la práctica anestésica, para revertir la sedación causada por las BDZ (Hurlé, 1992). Entre los fármacos utilizados en el tratamiento de la ansiedad, también están los antagonistas para receptores a serotonina como la buspirona, la ipsapirona y la gespirona (Argyropoulos et al., 2000). Tal acción es mediada por los receptores 5-HT1A, localizados en los sitios pre y postsinápticos, y está relacionada con la hiperpolarización de la membrana en las neuronas del hipocampo, la cual es causada por un incremento en la conductancia del potasio. Para generar el caso contrario de la hiperpolarización, uno de los antagonistas selectivos de los receptores 5-HT1A que está ampliamente caracterizado en modelos in vivo e in vitro es el WAY 1006355 (Martel et al., 2007; Yu et al., 2007). 29 2.2.8 Terapias alternas o tradicionales de la ansiedad Históricamente la medicina tradicional mexicana ha ofrecido a la población una gran gama de recursos para la prevención y atención de enfermedades o malestares. Constituye un amplio acervo de recursos medicinales que atiende diversos casos mórbidos. Los encargados de la transmisión de la medicina tradicional y el uso de los recursos naturales son los curanderos indígenas, que con sus distintas especialidades se encargan de la salud de sus comunidades (Pérez-Ramírez, 2013). La causa de que exista una gran diversidad de conocimientos tradicionales medicinales y de recursos naturales que se emplean, en especial de las plantas, se debe, entre otros factores a que en México existe un traslape geográfico entre la riqueza biológica, la variedad lingüística y territorios indígenas (Toledo, 1991). Distintos reportes y listados florísticos, los cuales registran el empleo de las especies vegetales en diferentes comunidades de México, ejemplifican tal diversidad. En esos listados y clasificaciones de usos de las plantas se encuentran las medicinales, y a su vez al conjunto de plantas utilizadas para tratar padecimientos del SNC con un porcentaje aproximado del 3.3%, antecedidas por las plantas utilizadas para el sistema digestivo, respiratorio, traumatismo o piel (Lozoya, 1990). Las especies vegetales se clasifican de acuerdo con su acción en el sistema nervioso central como: psicoanalépticas (estimulantes), psicodislépticas (alucinógenas) y psicolépticas (depresoras). Las especies con efecto de tipo ansiolítico-sedante entran en la última categoría y popularmente se dice que tratan “los nervios”, el susto, el espanto, el insomnio, el nerviosismo, la excitación nerviosa y son para tranquilizar (Guzmán et al., 2014 y Pérez-Ortega y González- Trujano, 2015). 2.3 ETNOBOTÁNICA La etnobotánica se ha definido como “el campo de la ciencia que estudia las interrelaciones que se establecen entre el hombre y las plantas, a través del tiempo y en diferentes ambientes” (Hernández-Xolocotzi, 1983). En la 30 etnobotánica se tienen listados de nombres científicos y comunes de plantas en los que se señala el uso de las especies, partes de las plantas utilizadas, formas de consumo y su empleo, posteriormente se ha involucrado la información etnográfica de las poblaciones que le adjudicaban tal o cual función. La labor actual de la etnobotánica es comprender: a) Los fenómenos que estudia desde una perspectiva interdisciplinar, conjuntando métodos de ciencias como la antropología, la etnografía, la botánica, la farmacología, la fitoquímica y la toxicología, entre otras (Pardo de Satayana y Gómez, 2003) y b) las relaciones ecológicas, evolutivas y simbólicas (Molina-Mendoza et al., 2012). La etnobotánica se integra como parte de las disciplinas de la etnobiología, junto con la etnozoología, la etnoedafología, la etnomicología y la etnoecología como ciencias que incluyen conocimientos tradicionales asociados a la riqueza cultural y biológica (Lagos-Witte et al., 2001). Generalmente las investigaciones etnobotánicas se hacen de acuerdo a la disciplina en que los investigadores incursionan. El trabajo interdisciplinario desde contextos culturales concretos es requerido pues permite, además de conocer sus características fitoquímicas y farmacológicas de las especies, el diseñar estrategias de conservación in situ y ex situ (Ladio, 2006), el manejo sostenible de determinados ecosistemas y de impacto ecológico, incluso interesarse en la propiedad intelectual del conocimiento tradicional de las poblaciones originarias y de retribución a las comunidades (Bermúdez et al., 2005) (Tabla 10). Tabla 10. Investigaciones interdisciplinarias con plantas medicinales Tipo de investigación Aspectos principales • Etnobotánico • Botánica, fitogeografía, ecología vegetal, aprovechamiento y conservación de los recursos naturales • Etnomédico • Medicina popular o tradicional de la región Cosmovisión Enfermedades y tratamientos • Fitoquímico • Aislamiento, separación, identificación y determinación de metabolitos secundarios 31 Tipo de investigación Aspectos principales • Farmacológico y/o • Ensayo y valoración de la actividad biológica de los compuestos obtenidos o de la planta medicinal Toxicológico • Agronómico • Domesticación y cultivo, factibilidad de propagación, inventario y protección de los recursos silvestres y de la agricultura tradicional Modificado de Waizel, 2006. De acuerdo con los objetivos del estudio etnobotánico (Waizel, 2006) se propone considerar los aspectos sociales y biológicos a partir de seguir los siguientes pasos: a. Definición del tipo de estudio. b. Recopilación bibliográfica: Información ecológica, socio-médica, diagnóstico de salud comunitaria. c. Elaboración de cuestionarios. d. Trabajo de campo: Recorrido por la zona de estudio, recolecta de ejemplares para depositar en herbarios (secado y prensado) y determinación taxonómica de ejemplar. Hacer las entrevistas. e. Pruebas fitoquímicas. f. Análisis farmacológico y toxicológico. g. Retroalimentación a la comunidad. Entrega de materiales elaborados. 2.3.1 Conocimiento tradicional El conocimiento tradicional se refiere al entendimiento, las innovaciones y prácticas que las comunidades indígenas y locales tienen en relación con sus recursos naturales. Tales conocimientos, transmitidos de generación en generación, los han desarrollado con base a las experiencias de las comunidades a través de los siglos, adaptándose a sus necesidades, culturas y ambientes locales (Convenio sobre la Diversidad Biológica, 2011). Los conocimientos tradicionales han sido sistematizados por las comunidades principalmente por su lenguaje, cognición humana, historia, creencias, religión y redes sociales; además dependen del acceso a la información con la que cuenten las comunidades 32 (Menendez-Baceta, 2015). Es así que el conocimiento tradicional involucra una racionalidad cultural y operaciones complejas que lo alejan de la casualidad y permiten articular en un solo proceso de transformación elementos de diferente índole (Díaz et al., 2011) tales como los saberes agrícolas o medicinales (Organización Mundial de la Propiedad Intelectual, 2015). Los actores, formadores e innovadores del conocimiento tradicional a partir de su kosmos (sistema de creencias o cosmovisiones), tienen un corpus (repertorio completo de conocimientos o sistemas cognitivos) para tener una praxis (conjunto de prácticas productivasque incluyen diferentes usos y manejos de los recursos naturales), es decir, a toda praxis corresponde siempre un corpus de conocimiento. Tal repertorio de conocimientos es la síntesis de tres vertientes: a) la experiencia acumulada y transmitida de generación en generación; b) la experiencia socializada por los miembros de una misma generación y c) la experiencia personal aprendida durante la repetición del ciclo productivo (Toledo, 1991). A los saberes se le denomina saberes colectivos, cuando son conocidos por todos los miembros del pueblo o comunidad; y saberes individuales, que solo los poseen personas especializadas, por ejemplo, los curanderos, sobadores, hueseros, rezadores o “graniceros” (Comisión Nacional para el Desarrollo de los Pueblos Indígenas, 2011). Actualmente este conocimiento es valioso para quienes de él dependen en sus vidas diarias pero también para la industria y la agricultura moderna. Incluso muchos productos como los medicamentos y cosméticos a base de vegetales se derivan las formas de uso o los compuestos del conocimiento tradicional (Bode, 2008). Las comunidades indígenas u originarias se consideran a sí mismas como custodios y protectores de tal conocimiento así como de la diversidad biológica. De esta manera, las prácticas tradicionales, como las medicinales les han ayudado a preservar, mantener e incluso incrementar la diversidad biológica a través de los siglos (Convenio sobre la Diversidad Biológica, 2011). En relación a los saberes tradicionales, para la OMS la medicina tradicional “es el conjunto de conocimientos, aptitudes y prácticas basados en teorías, 33 creencias y experiencias indígenas de las diferentes culturas, sean o no explicables, usados para el mantenimiento de salud, así como para la prevención, el diagnóstico, la mejora o el tratamiento de enfermedades físicas o mentales” (OMS, 2015). Tal medicina incluye distintas terapias y prácticas que varían entre los países y regiones. Tiene la característica que es milenaria y que sus practicantes han contribuido a la salud humana, particularmente en las comunidades (OMS, 2015). 2.3.2 Medicina tradicional mexicana En México, la Secretaría de Salud describe a la medicina tradicional como “la concreción de un cúmulo de saberes en torno a la salud y enfermedad que los pueblos indígenas de nuestro país han acopiado y organizado a lo largo de milenios”. Estos conocimientos han sido ordenados por los pueblos originarios en una visión del mundo que ponen énfasis en la totalidad de las cosas, en relación de las personas y los seres vivos con la naturaleza, las divinidades, el cosmos, y en el equilibrio entre elementos y conceptos, que se manifiestan físicamente en el organismo y/o partes de él con procesos de “frío o calor “(Almaguer et al., 2014). Esto se refleja en la diversidad de sistemas de atención a la salud que tienen las diferentes etnias y pueblos indígenas, que en el caso de Mesoamérica, tienen muchas semejanzas, por tanto la Secretaría de Salud incluye a la medicina tradicional mexicana en el sistema médico tradicional mesoamericano (Tabla 11 y Figura 5). Tabla 11. Características del sistema de la medicina tradicional mexicana o del sistema médico tradicional mesoamericano Características del sistema de la medicina tradicional mexicana 1. Cosmovisión que entiende al universo interconectado (cuerpo, mente y espíritu). 2. Salud y enfermedad como estados de equilibrio y desequilibrio principalmente entre elementos fríos y calientes, derivados del comportamiento individual, las relaciones sociales, los factores ambientales y espirituales. 3. Nosología de las patologías, dependientes de la cosmovisión. 34 Características del sistema de la medicina tradicional mexicana 4. La causalidad de los desequilibrios, por ejemplo entre el frío/calor del cuerpo (y de las emociones), desórdenes alimenticios, movimientos bruscos y las alteraciones de la fuerza vital. 5. Procedimientos preventivos, enfocados a controlar o evitar los factores desequilibrantes (frío/calor) 6. Estrategias para el diagnóstico de las enfermedades o desequilibrios. 7. Emplea elementos terapéuticos como: La herbolaria, el uso de productos animales y minerales La aplicación de masajes, fricciones, succiones, acomodamientos, etcétera Punciones con diferentes recursos naturales (espinas, huesos) El empleo de frío, calor, humedad como el uso de agua, la temazcalli y brazas de carbón. Ritos, ensalmos o limpias. Modificado de Almaguer et al., 2014. Figura 5. Sistema médico tradicional mesoamericano. Los actores o ejecutores de la medicina tradicional mexicana son los médicos tradicionales, o los autodenominados curanderos. Los médicos tradicionales son miembros de los pueblos y comunidades indígenas que de generación en generación desde la época prehispánica y hasta la fecha producen e innovan los conocimientos y las prácticas de tal medicina. Respecto a la especialidad de los curanderos, ésta es intrínseca a la manera en que se manifiesta su capacidad potencial de ayudar a las demás personas en cuanto a la A partir de una cosmovisión o “el costumbre” 35 salud; es decir, se está ya predispuesto desde el nacimiento, se les manifiesta en sueños, se les presentan enfermedades o les acontecen determinadas experiencias extraordinarias, como la caída de un rayo, como es el caso de los “graniceros” (Lorente, 2009). En algunos otros casos esta preparación es por la familia y en otros por voluntad propia. El proceso de curación en la práctica médica tradicional incluye el uso sistematizado de diversos recursos y espacios naturales, como los volcanes, lagos o determinados lugares considerados como entes, así mismo el agua, la tierra, los minerales, los animales, los hongos o las plantas, las cuales con el recurso más empleado (Argueta et al., 2012). Las formas en que emplean unos y otros elementos de la naturaleza dependen de su raíz cultural y de las condiciones del medio ambiente en el que viven. Aparte de ello, existen otras relaciones que influyen en su bienestar, como las asociadas con las divinidades y los seres que habitan en el mundo de la naturaleza (Fagetti, 2005). Es así, como los elementos sociales de creencias, la fe, formas de concebir la salud, la enfermedad y los recursos que emplean, particularmente como en el caso de los animales y plantas (con sus componentes bioactivos) son los que generan respuestas efectivas a problemáticas de salud en las distintas comunidades. Es decir, además del componente bioactivo, está el “principio cultural activo”, el cual se construye, y su efectividad depende del contexto cultural donde se desarrolle (Menendez-Baceta, 2015). En la historia del ser humano los recursos naturales más socorridos son los provenientes del reino vegetal. Desde los primeros homínidos se utilizaron las plantas para aliviar sus problemas de salud y con el tiempo el uso de estos elementos terapéuticos se fueron arraigando cada vez más en las costumbres (Sanfilipo, 1993). El interés actual en su estudio es que el conocimiento de nuestros antepasados era racional, y sirve de antecedente para el conocimiento científico de las mismas plantas medicinales (Viesca, 1993). 36 2.3.3 La herbolaria en el Estado de Morelos México es el quinto país con mayor riqueza vegetal, tiene alrededor de 22,351 especies de plantas vasculares. Además destaca por su alto grado de endemismo. Según Villaseñor y Magaña (2007), se han registrado 219 géneros endémicos de plantas vasculares. En el caso de las angiospermas con usos medicinales, se ha reportado que alrededor de 4,000 especies (cerca del 15% de la flora total) tienen atributos medicinales, es decir aproximadamente una de cada siete especies se le atribuye una propiedad curativa (Ocegueda et al.,2005). La diversidad de usos se debe, entre otros factores a que México es pluricultural. Según el Instituto Nacional de Lenguas Indígenas (INALI, 2015) el país cuenta con 68 agrupaciones lingüísticas. Esa situación aunada a los distintos ecosistemas que existen en el país permite notar la estrecha relación entre la población indígena, las especies vegetales y el uso y conocimiento que se tiene de las plantas, como es en el caso de la flora medicinal del Estado de Morelos. Morelos limita al norte con el Estado de México y la Ciudad de México, al este y sureste con Puebla, al sur y suroeste con Guerrero y al oeste con el Estado de México (Aguilar, 1990). Políticamente está dividido en 33 municipios (Figura 6) que abarcan una superficie total de 4 980 km2, es decir el 0.25% de la superficie del territorio nacional (Espejo et al., 2002). Morelos presenta una gran diversidad ecológica por su situación geográfica. Hacia la parte alta norte tiene atributos del Eje Volcánico Transversal y de la Cuenca del Balsas. Cuenta con un gradiente altitudinal marcado en dirección norte sur, lo que propicia una amplia riqueza de especies reunidas en diversos tipos de vegetación como bosque de Abies, bosque mesófilo de montaña, bosque de Pinus, bosque de Pinus hartwegii, bosque de Juniperus, bosque de Pinus- Quercus, bosque de Quercus, bosque tropical caducifolio, matorral subtropical, matorral xerófilo, pastizal alpino, vegetación acuática y bosque de galería (Rendón y Fernández, 2007). 37 Figura 6. Treinta y tres municipios del Estado de Morelos. Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI), 2010. De acuerdo a Monroy et al. (1992), como consecuencia de la geografía del Estado, se puede regionalizar en tres zonas principales: 1) Zona Norte, donde se encuentra el área de Protección de Flora y Fauna silvestre o el “Corredor Biológico Ajusco-Chichinautzin”; 2) Zona Central, formada por los Valles de Cuernavaca y Cuautla. Valles que están separados por la Reserva Estatal “Sierra de Montenegro” y 3) Zona Sur, donde se creó la Reserva de la Biósfera “Sierra de Huautla” (Figura 7). Según los datos de Bonilla-Barbosa y Villaseñor (2003), en Morelos están presentes el 70.5% de las familias de plantas vasculares de México, el 36.4% de los géneros y el 14.2% de las especies. En un estudio publicado por Monroy-Ortiz y Castillo-España (2007), se señala como flora medicinal del Estado de Morelos a 133 familias botánicas, 465 géneros y 818 especies. La gran variedad de uso de las especies vegetales se explica por la convergencia de factores ambientales y sociales. 38 Figura 7. Ubicación del Estado de Morelos. Se muestran las ciudades de Cuernavaca y Cuautla, así como sus áreas naturales protegidas. Morelos ha sido un territorio de paso y establecimiento de migrantes a lo largo de su historia. En su territorio habitaron la cultura olmeca, la tlahuica y la xochimilca (Smith, 2010). Posteriormente, el movimiento de habitantes se ve incrementado por el establecimiento de la industria azucarera, luego el surgimiento del zapatismo durante la Revolución Mexicana. Para 1968 las áreas rurales del Estado de Morelos fueron proveedoras de la Ciudad Industrial del Valle de Cuernavaca o Civac (Monroy y Ayala, 2003). Desde los años ochenta hasta la fecha, Morelos se convierte en un lugar de descanso por la cercanía con la Ciudad de México. Entonces, considerando que Morelos desde todos los tiempos es un Estado que comunica el sur con el centro y la capital del país, el fluir y devenir de personas y culturas han influido en el uso de los recursos naturales (Monroy-Ortiz y Monroy, 2004). Los principales estudios etnobotánicos antiguos que abordan el conocimiento y uso de la flora medicinal del Estado de Morelos son referidos por Baytelman a mediados de los años setenta. A partir del 2004 hasta la fecha se publicaron diversidad de tesis de licenciatura y maestría, folletos y artículos del 39 uso de la flora medicinal en el Estado. Un estudio representativo es el de Monroy- Ortiz y Monroy (2004), quienes hicieron un análisis preliminar de la dominancia cultural de las plantas útiles para el Estado de Morelos. En el 2006 los mismos autores divulgan un libro con el listado de especies y sus respectivas monografías con algún uso. Gómez-Mureddu (2006) realizó un estudio de plantas medicinales utilizadas en Anenecuilco; Rendón y Fernández (2007) publicaron un libro de las plantas con potencial uso ornamental del Estado de Morelos, en el que se incluyen las medicinales. En ese mismo año Monroy-Ortíz y Castillo-España hicieron una revisión bibliográfica de lo descrito de 1979 a 1999, libro en el que se estima el número de especies vegetales con uso medicinal y se describen las especies utilizadas. De los trabajos recientes está el de Beltrán-Rodríguez et al. (2014) quienes trabajaron en una comunidad mestiza de la Reserva de la Sierra de Huautla e hicieron una estimación del valor de uso que le dan a las especies vegetales para el manejo del bosque. 2.3.4 Plantas mexicanas utilizadas para el tratamiento de la ansiedad El conocimiento tradicional se renueva permanentemente, por el enorme conjunto de saberes y de sabedores médicos que investigan las posibilidades de nuevas especies; por las numerosas investigaciones en regiones del país en que se hacen nuevos catálogos y, finalmente por la introducción de otras especies a México que son o pueden ser medicinales (Zolla, 2012; Argueta y Pérez-Ortega, 2015). Además de esas posibilidades de crecimiento de los registros, se debe de enfatizar la presencia y persistencia de algunas plantas medicinales a lo largo de los siglos, cuyas propiedades ya eran utilizadas para atender padecimientos hace cientos de años como “los nervios” y que los métodos tecnológicos actuales han permitido corroborar su muy atinada utilización. Aquí caben algunas plantas que, a pesar de las prohibiciones coloniales, decimonónicas y de los siglos XX y XXI, siguen en las preferencias de los mexicanos para emplearlas como ansiolíticas, por ejemplo la magnolia (Magnolia grandiflora), o la flor de manita (Chiranthodendron pentadactylon), especies de importancia estética, biológica e 40 histórica, registradas desde el siglo XVI como medicinales para padecimientos relacionados con el corazón y el SNC como para calmar “los nervios” (Zolla et al., 2009; Argueta y Pérez-Ortega, 2015). En cuanto a las plantas manejadas para tratar padecimientos del SNC Guzmán-Gutiérrez et al. (2014) reportaron una revisión en la que incluyen 92 plantas para el tratamiento de “los nervios” y consideran que representa entre el 2.74 y 2.96% de un total de 3,103 a 3,352 especies mexicanas medicinales. La mayoría de las especies usadas en tales tratamientos pertenecen a las familias: Asteraceae, Rutaceae, Lamiaceae, Passifloraceae, Valerianaceae, Rosaceae, Theaceae y Verbenaceae. En las distintas revisiones de las plantas empleadas para tratar afecciones del SNC (Tortoriello y Romero, 1992; Guzmán-Gutiérrez et al., 2009; Guzmán- Gutiérrez et al., 2014; López-Rubalvaba y Estrada-Camarena, 2016), relacionadas con la ansiedad, ha surgido también la observación de corroborar y señalar los estudios de los efectos que se les atribuyen a las especies vegetales. Al respecto Viesca (1993) menciona que al hacer un estudio de la herbolaria prehispánica, resta por comprobar si los efectos esperados por los usuarios originales son los mismos o semejantes a los que se esperaría encontrar en los estudios farmacológicos, sin dejar de lado que se requiere estudiar los conceptos indígenas de enfermedad para conocer cuál era el sentido de su empleo. Por lo tanto, se hace necesario abordarlo desde distintas disciplinas y saberes, donde se analicen los sistemasconceptuales y simbólicos, así como el estudio de sus principios activos y eficacia (Faguetti, 2011), para dar paso a la evaluación clínica de la misma (Meckes, 1993) considerando el contexto social y político en que se desarrolla (Hersch, 2011). La mayoría de los artículos sobre estudios de plantas medicinales utilizadas en México para el SNC se han abordado de forma separada, ya sea desde la perspectiva etnobotánica, farmacológica, química o histórica (Pérez-Ortega y González-Trujano, 2015). Incluso, a pesar de la existencia de la gran diversidad biológica y saberes tradicionales de las diversas culturas ocurre que las especies medicinales han sido poco evaluadas (Gurib-Fakim, 2006). La investigación de la 41 herbolaria en psicofarmacología es todavía más limitada, no obstante se observa un incremento en las evidencias científicas de las últimas décadas. Algunos de los estudios experimentales preclínicos efectuados a especies propiamente mexicanas o introducidas, pero que habitan o se usan en México por sus propiedades ansiolítico-sedantes son: Annona cherimolia, Citrus sinensis, Dracocephalum moldavica, Galphimia glauca, Heteropterys brachiata, Ipomoea tyrianthina, Litsea glaucescens, Loeselia mexicana, Magnolia dealbata, Magnolia grandiflora, Montanoa frutescens, Salvia elegans, Ternstroemia pringlei, Ternstroemia sylvatica, Tilia americana var. mexicana y Valeriana edulis ssp. procera. Las evidencias de su potencial para la terapéutica se han publicado en revistas como el Journal of Ethnopharmacology, Planta Medica, Phytomedicine, Journal of Natural Products, Food Chemistry y Phytotherapy Research. Los escritos reportan datos farmacológicos de las pruebas con los extractos crudos, en general polares, así como de sus fracciones y compuestos puros aislados por estrategias como el fraccionamiento biodirigido o de manera directa sobre los extractos acuosos u orgánicos polares. Los extractos son obtenidos de las raíces, los tallos, las flores, las hojas o toda la parte aérea. El reactivo biológico empleado en los estudios son primordialmente roedores, como ratones o ratas de diferentes cepas, los cuales son introducidos en distintos modelos experimentales como de campo abierto, rotarod, tablero con orificios y cruz elevada, entre otros. Se evalúan los efectos en diferentes vías de administración entre las que predominan la intraperitoneal (i.p.) y la esofágica (p.o.). El interés de la investigación se centra además en conocer los posibles mecanismos de acción y los metabolitos secundarios responsables de la actividad ansiolítico-sedante. En la mayoría de los casos se determinan los parámetros de dosis efectiva y/o letal (Pérez-Ortega y González-Trujano, 2015) (Tabla 12). 42 Especie Nombre común Parte Usos Extracto Modelos ansiolítico sedantes Mecanismo de acción Organismo evaluado Compuesto Toxicidad, citotoxicidad o dosis efectiva Referencia Agastache mexicana (Kunth) Lint et Epling subsp. mexicana Bye, Linares et Ramamoorthy y xolocoltziana Bye, Linares y Ramamoorthy Toronjil morado y toronjil blanco Aérea Ayuda a dormir, contra el “susto”, “espanto” y “los nervios” Acuosos Campo abierto Tablero con orificios (activa)a GABAAb Ratonesa,b DE: 0.1δ, 1.0 mg/kga Estrada- Reyes et al., 2014. González- Trujano et al., 2015. Annona cherimolia Mill. Chirimoya Hojas Tranquilizar, sedar Hexano Actividad ambulatoria (activo) Pentobarbital sódico (activo) GABA (hexano) Ratones Palmitona, β-sitosterol López- Rubalcava et al., 2006. Citrus sinensis (L.) Osbeck Naranja Flores Insomnio Metanol, diclorometano Cilindro Receptores de adenosina Ratones Hesperidina DE50: 47.04 ±12.03 mg/kg, metanol DE50: 11.34 ±2.48 mg/kg, hesperidina Guzmán- Gutiérrez y Navarrete, 2009. Dracocephalum moldavica L. Cabeza de dragón Moldávica Aérea Tranquilizante, para “los nervios” Acuoso Tablero con orificios (inactiva) Actividad ambulatoria (activa) Coordinación motora (activa) Pentobarbital sódico (activa) Ratones Acacetina, apigenina, luteolina DL50=470 mg/kg Martínez- Vázquez et al., 2012. Galphimia glauca Cav. Árnica rojaa; árnica rojab Aéreaa Excitación nerviosaa; tranquilizar el SNCb; ansiolítico y sedantec Metanola Cruz elevada(activa)a, b ,c Pentobarbital sódico (activa)b, c Ratonesa, b, c Galphiminaa aHerrera- Ruiz et al., 2006. bSharma et al., 2012. cCardoso- Taketa et al., 2008. Tabla 12. Ejemplos de estudios fitofarmacológicos hechos a plantas medicinales empleadas para tratar afecciones del SNC 43 Especie Nombre común Parte Usos Extracto Modelos ansiolítico sedantes Mecanismo de acción Organismo evaluado Compuesto Toxicidad, citotoxicidad o dosis efectiva Referencia Heteropterys brachiata (L.) DC. Bejuco de margarita Aérea Padecimientos de “los nervios” como ansiolítico, anticonvulsivo, antidepresivo y sedante Metanol Cruz elevada (activo) Pentobarbital sódico (inactivo) Actividad ambulatoria (activo) GABA Ratones Ácido clorogénico, metil éster 2000 mg/kg Huerta- Reyes et al., 2013. Ipomoea tyrianthina Lindley Escamonea Raíz Desórdenes nerviosos, purgante , contra tumores Metanol (resina) Pentobarbital sódico (activa) GABA Ratones Convolvulina DE50 2.3 µg/ml, líneas celulares activas contra KB León- Rivera et al., 2011. Litsea glaucescens Kunth Laurel Hoja Epilepsia, angustia, tristeza Aceite esencial Cruz elevada (activa) Actividad ambulatoria (activa) GABA Ratones β-pineno, linalol Guzmán- Gutiérrez et al., 2012. Loeselia mexicana (Lam.) Brandegee Espinosilla Aérea “Espanto”, “susto” (miedo) Metanol Cruz elevada (activa) Actividad ambulatoria (activa) GABA Ratones Dafnoretina Herrera- Ruiz et al., 2011. Magnolia dealbata Zucc. Magnolia Hojas Tranquilizante, antiepiléptico Etanol Tablero con orificios (activa) Actividad ambulatoria (activa) Pentobarbital sódico (activa) Cruz elevada Cilindro Ratones Honokiol, Magnolol DL50=770 mg/kg etanol, (vía intraperitoneal) DL50=2150 mg/kg Etanol, (vía oral) Martínez AL et al., 2006. Magnolia grandiflora L. Magnolia Semillas Antiespasmódi -ca, músculo relajante, antiepiléptica Éter etílico, hidroalcohol Pentobarbital sódico (activa) Ratas 250 mg/kg (éter etílico), 200 mg7kg (hidroalcohólico) Bastidas BE et al., 1998. Tabla 12. Ejemplos de estudios fitofarmacológicos hechos a plantas medicinales empleadas para tratar afecciones del SNC Tabla 12. Ejemplos de estudios fitofarmacológicos hechos a plantas medicinales empleadas para tratar afecciones del SNC 44 DE50: Dosis efectiva cincuenta y DL50: Dosis letal cincuenta Especie Nombre común Parte Usos Extracto Modelos ansiolítico sedantes Mecanismo de acción Organismo evaluado Compuesto Toxicidad, citotoxicidad o dosis efectiva Referencia Montanoa frutescens Cerv. Cihuapatli Hojas Desórdenes de “los nervios” y de humor Acuoso Actividad ambulatoria (activa) Cruz elevada (activa) GABA Ratas Ácidos kaurénicos Carro- Juárez et al., 2012 Salvia elegans Vahl. Mirto Hojas y flores Ansiedad Hidroalcohol Cruz elevada (activa) Actividad ambulatoria Ratones Apigenina, Linalol Herrera- Ruiz et al., 2006. Ternstroemia pringlei (Rose) Standl. Flores de tila Flores (cáliz y frutos) Tranquilizar, insomnioa, anticonvulsivob Metanol, acuoso Cruz elevada (inactiva) Pentobarbital sódico (activa) GABA Ratones Jacaranona C9H1004 DL50= 150-200 mg/kg aLozada- Lechuga et al., 2010. bTortoriello, Santamaría, 1996. Ternstroemia sylvatica Cham. & Schldl. Tila Flores Ansiedad, insomnio Acuoso Actividad ambulatoria (activo) Cruz elevada (activo) Ratas Molina etal., 1999. Tilia americana var. mexicana (Schldtl) Hardin Tilia, tilia de bolita Brácteas a,d, floresa, b, c, d, e Insomnio, contra dolor de cabeza, tensión nerviosaa; ansiolítico, sedanteb; ansiolíticoc; tranquilizanted Hexanoa,b,c acetato de etiloa, acuosoa,e Metanola,b, fracciones del extracto metanólico a Cruz elevada (no activa) Cruz elevada (activa)a, b, d, e Cilindro (activa)b Tablero con orificios (activa)b, c, d, e Actividad ambulatoria (activa) b, c, d, e Pentobarbital sódico (activa)b, d, e GABA Ratonesa, b ,c, d, e Tilirósido, quercetinaa, b, d, e, quercitrina, canferolb, d , e, glicósidosa; β-sitosterolc DL50>2900mg/kg (hexano), DL50>375mg/kgb (metanol) DL50= 5000 mg/kge aHerrera- Ruiz et al., 2008; bAguirrre- Hernández et al., 2007a. cAguirrre- Hernández et al., 2007b. dAguirrre- Hernández et al., 2010. ePérez- Ortega et al., 2008 Valeriana edulis spp. procera Meyer Valeriana Raíces Inducción del sueño, tranquilizante, sedante Hidroalcoho l Coordinación motora(activa) Pentobartital sódico (activa) GABA Ratones Valepotriatos Oliva et al., 2004. Ugalde et al., 2005. Tabla 12. Ejemplos de estudios fitofarmacológicos hechos a plantas medicinales empleadas para tratar afecciones del SNC 45 2.3.5 Género Tagetes La familia de las Asteraceae recibe su nombre en 1822 por Berchtold y J. C. Presl. Es un grupo heterogéneo respecto a la morfología de las raíces, los tallos, las hojas y homogéneo en las características de las inflorescencias. Tal familia es de los grupos de plantas vasculares más grande que hay junto con las Fabaceae, Gramíneas, Orchidaceae y Euphorbiaceae. A nivel mundial cuenta con alrededor de 1,535 géneros y de 23,000 a 32,000 especies (Tapia, 2010; Katinas et al., 2007). En el caso de México hay 361 géneros y 3,012 especies (Villaseñor, 2003; Villaseñor et al., 2007), la concentración más numerosa de este grupo de plantas de todos los países del mundo (Ortiz et al., 1998; García-Sánchez et al., 2014). Los principales ambientes ocupados por las Asteraceae son las sabanas, los pastizales, los márgenes de los ríos, así como lugares perturbados como claros de la selva, ambientes antropogénicos y donde hubo desmonte e incendios (Freire et al., 2006). La familia incluye entre otros géneros al Tagetes. El género Tagetes pertenece a la tribu Tageteae, a la cual se le han referido 56 especies distribuidas en América del Norte, Sur y Sudamérica. Aproximadamente de 24 a 30 especies de ellas están en México, país considerado centro de diversidad (Serrato, 2004a; Barajas-Pérez et al., 2011). Rzedowski (2001) describe al género de la siguiente manera: Tagetes L. Plantas anuales o perennes, aromáticas al estrujarse; hojas todas opuestas, o bien las superiores alternas, por lo común profundamente pinnadas, algunas veces simples con numerosas glándulas oleíferas translúcidas; cabezuelas solitarias o más o menos cimoso- corimbosas, involucro cilíndrico, fusiforme o angostamente campanulado, sus brácteas de tamaño subigual, unidas entre sí cerca del ápice y provistas de dos hileras de glándulas oleíferas translúcidas; receptáculo plano o convexo, desnudo; flores liguladas generalmente presentes, fértiles, sus corolas amarillas, anaranjadas, rojizas o blancas; flores del disco hermafroditas, sus corolas amarillas o anaranjadas, con la garganta infundibuliforme, anteras con las bases obtusas, ramas del estilo de las flores hermafroditas truncadas y peniciladas en el ápice, o bien, con apéndices cónicos cortos; aquenios lineares o claviformes, vilano de tres a 10 escamas desiguales, a veces más o menos unidas entre sí, 1 o 2 (veces más) de ellas lineares, mucho más largas que las demás. Varias de sus especies se emplean como ceremoniales, de ornato, en la producción de aceites esenciales (García-Sanchez et al., 2012), como pesticidas, 46 insecticidas (Vasudevan et al., 1997) y como terapéutico herbolario. Entre las especies que incluye el género están T. lunuata, T. filifolia, T. micrantha, T. coronopifolia, T. foetidissima, T. triradiata, T. erecta y T. lucida. Los metabolitos secundarios que poseen tales plantas son terpenoides, esteroides, flavonoides, alcaloides, poliacetilenos, derivados del tiofeno, carotenoides y ácidos grasos (Vasudevan et al., 1997; Xu et al., 2012). Hay diversas especies de Tagetes que cuentan con registros de uso para el tratamiento de “los nervios”, el “susto” o “espanto”, la T. erecta, T. lucida, T. lunuata y T. micrantha (Argáez, 1989, Aguilar et al., 1996, Monroy-Ortiz y Castillo-España, 2007). Las primeras dos especies fueron seleccionadas en este proyecto para evaluar su actividad como ansiolítico-sedantes. 2.3.6 Tagetes erecta L. Nombres comunes Se encontraron los siguientes nombres comunes en la literatura: flor de muerto (Osuna et al., 2005), cempoal (en Zacatecas), cempoalxochitl, (náhuatl), chant (tepehua, Puebla), kyalhpuxan (totonaca, Puebla), tateni (otomí, Puebla), nichim anima, potzemnichim, tusus (tzeltal, Chiapas), (Aguilar et al., 1996), guiamén benaguti (zapoteco) (Vázquez, 2005), sampual (zoque) (González et al., 2013) rosa o flor de muerto (Argáez, 1989), cempaxochitl, cempoaxuchil o cempasúchil (Nava y Rendón, 2008), African marigold (Ogunwande y Olawore, 2006). Datos históricos En el códice de la Cruz-Badiano, de mediados del siglo XVI, se describen sus usos contra la inflamación del estómago y en lavados intestinales. La referencia con el cempasúchil se hizo por la similitud de la imagen a la morfología de la especie, sus usos y el nombre común actual como flor de muerto. Sin embargo podría no tratarse de la especie (Figura 8). La traducción de la glosa en latín del Códice señala (Bye y Linares, 2013): “Para la inflamación del vientre o estómago bueno es preparar: hojas de xiuhtontli y tlatlancuaye, raíz de copaliyac xiuhtontli, molidas con alectoria y dadas en el mejor pulque. Por la parte posterior se ha de poner una 47 lavativa, confeccionada de raíz cococ xihuitl, chile, sal, salitre y la alectoria. Todo en agua para lavar el intestino… Contra el dolor de vientre, muélase en agua la alectoria con raíz de la hierba ohuaxocoyolin. Hecha una poción, aplíquese al vientre por la parte posterior. Bébase también la raíz molida de la hierba huihuitzmallotic.” Figura 8. Copaliyacxiuhtontli. Hernández (1959) en el capítulo CLXXIX describe al cempasúchil de la siguiente manera: “Encontré siete principales variedades de la planta que da la flor llamada por los mexicanos CEMPOALXÓCHITL a causa de la gran multitud de sus hojas, que los españoles llaman clavel de Indias…Tiene virtud resolutiva y aperitiva; el jugo de las hojas tomado o a las mismas hojas machacadas y tomadas con agua o con vino atemperan el estómago frío, provocan las reglas, a orina, el sudor, alejan los fríos intermitentes untadas un poco antes del acceso, quitan la flatulencia, excitan el apetito venéreo, curan la debilidad que proviene de destemplaza fría del hígado, abren las vías obstruidas, aflojan los miembros contraídos, alivian la hidropesía, provocan vómito tomadas con agua tibia, y curan los fríos de las fiebres y aun las fiebres mismas evacuando la causa por la orina y el sudor. La flor de la primera especie es amarilla y supera a las de los demás géneros en el número y amplitud de sus hojas, siendo propiamente llamada cempoalxóchitl por la numerosa y admirable agrupación de las mismas, en cuya forma y disposición se parece hasta cierto punto a nuestra rosa blanca; la planta es mayor que todas las otras y con hojas más grandes…” (Figura 9). Figura 9. Cempoalxóchitl (Hernández, 1959). 48 Las descripciones de uso del cempasúchil contra padecimientos estomacales continuaron. Martínez (1969) lo refirió contra los cólicos, cuandoéstos estaban acompañados de meterorismo, así como antihelmíntico y estimulante. La compilación de Díaz (1977), como parte de los trabajos hechos por el Instituto Mexicano para el Estudio de Plantas Medicinales, revisó el uso de las plantas medicinales de México y mencionó para esta especie reportes de uso como antipalúdico, aperitivo y resolutivo. Distribución El cempasúchil se distribuye ampliamente a lo largo del país, según la investigación hecha en ejemplares de herbario (Linares et al., 1988) (Figura 10). En un registro más actualizado (Villaseñor y Espinosa, 1998) se reporta en Aguascalientes, Campeche, Chiapas, Coahuila, Colima, Distrito Federal, Durango, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Estado de México, Michoacán, Morelos, Nayarit, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, San Luis Potosí, Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz, Yucatán y Zacatecas. Figura 10. Distribución de Tagetes erecta. 49 Datos botánicos y ecológicos basados en Rzedowski (2001) “Planta anual, erecta, hasta de 1.8 m de alto, muy aromática al estrujarse; tallos estriados, glabros o pubescentes; hojas hasta de 20 cm de largo, pinnadas, foliolos 11 a 17, lanceolados a linear-lanceolados, hasta de 5 cm de largo y hasta 1.5 cm de ancho, agudos a acuminados, aserrados a subenteros; cabezuelas solitarias o agrupadas por varias, sobre pedúnculos hasta de 15 cm de largo; provistos de brácteas pinnadas con segmentos cerdiformes en el ápice; involucro campanulado, de 13 a 20 mm de alto, de 9 a 25 mm de ancho, sus brácteas 5 a 11, glabras, sus ápices triangulares; flores liguladas 5 a 8, o más frecuentemente numerosas, amarillas a sencillas, pero en las “dobles” mostrando diferente grado de transformación en lígulas, sus corolas amarillas a anaranjadas, de 8 a 10 mm de largo; aquenios lineares, de 7 a 10 mm de largo, glabros o hispídulos en los ángulos , vilano, de 1 ó 2 escamas acuminadas de 6 a 12 mm de largo y 2 ó 3 escamas romas de 3 a 6 mm de largo, más o menos unidas entre sí (Rzedowski, 2001) (Figura 11)”. Las formas asilvestradas de las especies domesticadas se encuentran a nivel mundial en los trópicos (Vibrans, 2015). Anatomía En las Asteraceae la formación de canales secretores de origen esquizógeno es común, carácter que se presenta en el tallo y en las hojas de varias de sus especies (García-Sánchez et al., 2012). En estos canales también es característica la presencia de compuestos con apariencia aceitosa (Ogunwande y Olawore, 2006). Las cavidades secretoras de las hojas de la T. erecta son mayormente esféricas y frecuentemente traslúcidas y menos clorofílicas que los tejidos circundantes del mesofilo. La sección transversal a través de la lámina muestra que las cavidades se desplazan del mesofilo, en su vecindad, éstos se pueden ampliar de la epidermis superior a la inferior. Las cavidades están separadas del mesofilo por una capa, las células del parénquima tienen menos cloroplastos que las células de alrededor del mesofilo. 50 Figura 11. Ilustración de Tagetes erecta. A) Rama florida, B) Flor ligulada y C) Flores tubulares bisexuales y aquenio. Dentro de esta capa hay dos o tres capas de revestimiento celular, dentro de este revestimiento celular están las células secretoras epiteliales, las cuales delinean el lumen de la cavidad. Este es el lumen que contiene la masa de los productos de secreción (Figura 12). A C B 51 Figura 12. Anatomía de Tagetes erecta. Vista trasversal (1) y paradermal (2) de la hoja de T. erecta. pa: parénquima, l: lumen, e: células epiteliales secretoras, Me: mesófilo, s: revestimiento celular, ↑: células epidérmicas. Tomado de Russin et al., 1992. Usos medicinales La T. erecta se prescribe actualmente para atender principalmente padecimientos digestivos y respiratorios, así como enfermedades de filiación cultural, en que se involucran síntomas relacionados con la ansiedad o “los nervios”. En el caso de los padecimientos gastrointestinales se recomienda contra la diarrea de la siguiente manera: se emplea junto con ramas de manzanilla (Matricaria recutita), las hojas de hierbabuena (Mentha piperita) y albahacar (Ocimum basilicum), o bien se combina y se le añade una raja de canela (Cinnamomum zeyeylanicum) junto con el pedazo de hueso de aguacate tostado (Persea americana). Al hacer la infusión se le agrega una pizca de ceniza, una vez que hirvió se puede tomar como agua de tiempo hasta que se quita el malestar (Osuna et al., 2005). Otra combinación para el tratamiento de la diarrea es hacer una infusión de la mezcla de flor de cempasúchil con la flor de pericón (Tagetes lucida) o con la semilla de cilantro (Coriandrum sativum), ésta se toma una taza tres veces al día durante tres días o más si se considera necesario (Osuna et al., 2005). En el tratamiento de diferentes disenterías (denominadas como roja, blanca y la que presenta moco) se utiliza el cempasúchil, e incluso se puede utilizar en el 52 enfriamiento del estómago. Para ello se hace una mezcla con el bulbo de la cebolla rebanado (Allium cepa) y la flor de cempasúchil, manteca de cerdo y un huevo, se revuelve todo en un comal o sartén y se fríe dándole forma de tortilla o torta, ésta se pone caliente en el estómago del niño o del adulto para aliviar el malestar. Además, se debe de tomar junto con un té hecho de hojas de orégano (Lippia graveolens) y de albahacar (Ocimum basilicum) durante tres veces al día o más tiempo, si se requiere (Ruiz, 1989; Osuna et al., 2005). Para desparasitar se usan las flores en infusión y se toma una taza por siete días en ayunas (Osuna et al., 2005). Si se tiene dolor de estómago, se recomienda hervir de tres a cuatro flores en un litro de agua, al cual se le agrega una “bracita” de carbón ya apagada y se toma como agua de uso (Gómez- Mureddu, 2006). En el caso de que niños o adultos presenten deposiciones o evacuaciones de color blanco se hace un cocimiento con dos “cabezas” de cempasúchil en un cuarto de agua, y se le da a beber una taza diaria hasta que sea necesario (Ruiz, 1989). Si se presenta dolor de estómago y vómito se hierven tres “hojitas” de flor de muerto, tres “ramitas” de pericón (Tagetes lucida) en un litro de agua y se toma como agua de tiempo (Vázquez, 2005). En caso del “empacho” y cólicos se utilizan las flores y las hojas en cocimiento (Argáez, 1989). En el tratamiento de enfermedades respiratorias se utiliza de la siguiente manera: para combatir la “frialdad del pulmón” se colocan los pétalos fritos en aceite de almendra sobre la parte afectada cubriendo con un lienzo durante todo el día, las aplicaciones se hacen hasta notar mejoría (Argáez, 1989). En caso de bronquitis, se mezclan los pétalos de una flor con cebo, esto se unta en la espalda después de haberla “picado” con una escobilla con el propósito de que penetre más rápidamente el cebo medicinal (Castillo, 1991). Contra la tos se hierven dos o tres flores en un vaso de agua y se toma una o dos veces. También se usan los cogollos (González et al., 2013). Si se presenta fiebre, se colocan las ramas en alcohol y posteriormente se frota el cuerpo (Monrroy-Ortíz y Castillo-España, 2007). 53 Contra las hemorroidesse emplean las hojas hervidas y se pone lavativa. En el caso de existir dolor de muelas, se hierve una “ramita” y se hacen gárgaras (Vázquez, 2005). En el tratamiento del “susto” o “espanto”, se prepara un cocimiento de las ramas en un litro de agua y se toma tres veces al día. Con el mismo propósito, se hierve en agua las hojas de esta planta, junto con epazote, chilocuaco y zacatlaxal, el líquido resultante se aplica en baños. También se usa la planta restregada en agua suficiente para bañar a los asustados. La curación se complementa mediante la ingestión de dos tazas diarias de un té preparado con una flor de cempasúchil en medio litro de agua (Aguilar et al., 1996). Las flores de esta planta también son empleadas externamente para contrarrestar el “aire”, y las flores fritas se untan en los brazos de los niños que se orinan en la cama (Gómez- Mureddu, 2006). Las flores y las hojas en cocimiento son útiles para curar las hidropesías y relajar “los nervios” (Argáez, 1989). Es una planta considerada por los curanderos como de calidad caliente (Ruiz, 1989). Otros usos La T. erecta en México es cultivada con fines comerciales. El 2 de noviembre se emplea como ornamental para la celebración del Día de Muertos; asimismo se comercializa como colorante natural de textiles y para el control de plagas (Pupo, 2007). La especie se emplea como alimento de aves de corral para dar el color amarillo a la yema del huevo y a la carne de las aves, por la gran cantidad de carotenos que contiene (Aguilar et al., 1996; Serrato, 2004b). Además se usa como insecticida en lociones de esta planta junto con otras como el clavo (Syzygium aromaticum) o para quitar los piojos, pues es un buen repelente (Ref. Cultivando el Saber de la Medicina Tradicional de los Pueblos Indígenas, sin año). En un estudio etnobotánico hecho en la India, entre las especies que más emplea la población de Uttar Pradesh con fines veterinarios es la T. erecta, para contrarrestar la otitis (Khumar y Bharati, 2013). 54 Partes de la planta empleada La parte aérea (la flor, los tallos y las hojas). Farmacología Las investigaciones preclínicas corroboran la actividad como antioxidante de T. erecta debido a la presencia de luteína, para ello se empleó células de ovario de hamsters (Wang et al., 2006). Se considera que las especies que contienen luteína pueden presentar propiedades anticancerígenas, en específico contra el cáncer de colón (Slaterry et al., 2000). Del extracto etanólico se demostró su acción larvicida contra Culex quinquefasciatus (Nikkon et al., 2011), así como del extracto metanólico con efecto contra las larvas de la especie C. quinquefasciatus, Aedes aegypti (mosquitos portadores del dengue, la chikunguña y la fiebre de Zika) y Anopheles stephensi (Jayaraman et al., 2015). La actividad antibacterial se corroboró de un aceite esencial (Garg y Dengre et al., 1986), como la actividad de los extractos (éter de petróleo, cloroformo, acetato de etilo, metanol y acuoso) y del bitienil (2-hidroximetil-non-3 inoico ácido 2-[2, 2´]-bitiofenil-5 etil ester) de las raíces de la planta, éste último dio resultado contra la cepa de Plasmodium falciparum, mientras que todos los extractos tuvieron actividad contra tres bacterias Gram-positivas, dos Gram-negativa y dos cepas de hongos (Gupta y Vasudeva, 2010) La actividad analgésica del extracto de la flor fue evaluada in vivo induciendo los estiramientos abdominales con ácido acético. Mostró una curva de dosis dependiente en dosis de 100-300 mg/kg (Bashir y Giliani, 2008). En cuanto a pruebas para evaluar actividad en el SNC, se corroboró el efecto antidepresivo del extracto hidrometanólico de la flor con la prueba de nado forzado, además el mecanismo de acción con el empleo de Imipramina. Los posibles mecanismos de acción implicados son el serotoninérgico, la vía nitrérgica y los receptores sigma (Khulbe et al., 2013). 55 La propiedad como antioxidante y citotóxica se probó contra líneas celulares HeLa del tienil derivado de la T. erecta evidenciando su efecto a más bajas concentraciones que el extracto (Gupta et al., 2012). Toxicidad El extracto etanólico-acuoso de la planta administrado por vía intraperitoneal en ratón presentó una dosis letal media (LD50) de 0.1 g/kg (Zolla et al., 2009). El ácido hidrociánico que contiene se considera tóxico (Osuna et al., 2005). Fitoquímica Para las hojas del cempasúchil se reportó que contienen aceite esencial, característico de su olor. Se han identificado monoterpenos como geraniol, linalol y su acetato, así como mentol, β-felandreno, dipenteno, α- y β-pineno y tagetona (Zolla et al., 2009). Se han encontrado también aceites como piperitona (50.7%), piperitenona (13.2%), (E)-β-ocimeno (6.7%), alcanfor (4.8%) y limoneno (4.1%). En las flores hay 1-8-cineol (23.1%), α-pineno (11.7%), α-terpineol (10.7%) y piperitona (8.0%) con considerable presencia de sabineno (5.6%), piperitona (4.0%) y α- terpinenilacetato (3.5%). La contribución del hidrocarburo del sesquiterpeno es significante (11.4%) y es representado por β-cariofileno (3.3%), alo-aromadendreno (2.3%) y α– longipineno (2.0%) (Ogunwande y Olawore, 2006) (Tabla 13). Tabla 13. Ejemplos de algunos aceites de Tagetes erecta Nombre Estructura química Alcanfor 56 Las flores y los pétalos, que le dan el color característico, son ricos en carotenoides, éstos varían en concentración dependiendo de la variabilidad morfológica de las especies (Serrato et al., 2008). Los carotenoides que se han identificado son luteína, xantofila y cinco ésteres de ambos componentes con ácidos grasos de 10, 16 y 18 carbonos; los monoterpenos dipenteno y mentol, así como piretrinas. En las flores y en las raíces se han detectado componentes azufrados de bitienilo y tertienilo (Zolla et al., 2009), además de compuestos de tipo terpenoide como: β-sitosterol y lupeol (Xu et al., 2012); hay presencia de flavonoides tales como: luteolina, patuletina, quercetina y canferol (Gong et al., Nombre Estructura química Limoneno Linalol Sabineno 57 2012) (Tabla 14), así como taninos 3,4-di-O-[siringato]-α-D-glucopiranosa y 3,4-di- O-[siringato]-β-D-glucopiranosa (Zhou et al., 2012). Tabla 14. Ejemplos de metabolitos secundarios de Tagetes erecta Nombre Estructura química β-sitosterol Lupeol Canferol 58 2.3.7 Tagetes lucida Cav. Nombres comunes Los siguientes nombres comunes se encontraron en la literatura: flor de pericón, pericón (Osuna et al., 2005), hierba anís (Durango, Tamaulipas, Zacatecas), ichka (Chiapas), jericón (Oaxaca), pericón vomol (Chiapas), Santa María (Michoacán) (Aguilar et al., 1996), guishra guili (zapoteco) (Vázquez, 2005) o yerbanís (Linares et al., 1990). Datos históricos En el códice De la Cruz-Badiano se hace referencia del empleo de la T. lucida para el tratamiento de las personas a las que les ha caído un rayo, mencionándola con el nombre de Quauhyyauhtli (Figura 13). La traducción de la glosa en latín (Bye y Linares, 2013) es la siguiente: “El tocado por el cielo o fulminado, beba esta poción, bien preparada con las ramas de estos árboles: ayauhquahuitl, tepapaquilti cuahuitl, ciprés muy verde, ramas de iztauhyatl, Nombre Estructura química Luteolina Quercetina 59 hierba cuauhyyauhtli y teamoxtli. Siempre que se haya de dar esta poción, caliéntese al fuego. El cuerpo únjase con una cataplasma de papaloquilitl, tlalehecapahtli, cuauhyyauhtli, tlatlancuaye, huizitzilxochitl, iztac ocoxochitl, y en suma todas las hierbas sobre las cuales cayó el rayo. Pasadosunos días, beba agua que haya tenido un poco de incienso blanco. Ahora bien, esta agua con incienso blanco e incienso blancuzco ha de cocerse y se le agregará un hueso de zorruela hecho cenizas. También se le agregará un poquito de pulque. Además hay que destilarle en la nariz una medicina compuesta de perla blanca , raíz de tlatlacotic y toda clase de hierbecillas que nazcan en algún jardín que alguna vez se haya quemado. También se le darán sahumerios con el buen olor de incienso blanco, una pasta que se llama xochiocozotl, y la hierba cuauhiyauhtli, muy olorosa todo echado en el fuego”. Figura 13. Quauhyyauhtli. Hernández (1943) menciona que sirve para curar el frío y alejar las calenturas, se emplea además para quitar las nubes de los ojos, estimular reglas, quitar la tos, la flatulencia, el mal aliento, el dolor de cabeza, alivia a los dementes y espantados por el rayo, estriñe el vientre cuando está demasiado suelto y sana el salpullido cuando se consume por la mañana. Martínez (1969) la reporta para el tratamiento de los dolores del vientre, cólicos y meteorismo, así como para aromatizar el agua en que se baña a los niños. La señala además con usos alimenticios y aromáticos por su olor y sabor similar al anís (Linares et al, 1990). Distribución La T. lucida se encuentra en gran parte del territorio de México (Figura 14). En Morelos se localiza en Tepalcingo, Cuernavaca, Tepoztlán, Cuautla y Atlatlahuacan (Nava y Rendón, 2008). 60 Figura 14. Distribución de Tagetes lucida. Datos botánicos y ecológicos basados en Rzedowski (2001) “Planta herbácea perenne, erecta, hasta de 80 cm de alto, con olor a anís al estrujarse; tallos generalmente varios o muchos partiendo de la base, más o menos ramificados, glabros; hojas indivisas, sésiles, lineares a oblongas, elípticas u oblanceoladas, de 2 a 10 cm de largo, de 0.5 a 2 cm de ancho, agudas a redondeadas en el ápice, márgenes aserrados; cabezuelas dispuestas en corimbos, sobre pedúnculos bracteados hasta de de 1 cm de largo; involucro cilíndrico, de 4 a 12 mm de alto, sus brácteas 5 a 7, con los ápices subulados; flores liguladas 3 ó 4 amarillas, sus láminas flabeladas o suborbiculares, de 3 a 6 mm de largo; flores del disco 5 a 8, sus corolas amarillas, de 4 a 6 mm de largo; aquenios linear-claviformes, de 5 a 8 mm de largo, negruzcos, glabros o algo hispídulos, vilano de 2 escamas aristiformes, de 3 a 5 mm de largo y 4 ó 5 escamas romas de 1 a 2 mm de largo. Habita pastizales y bosques de Quercus y de coníferas, preferentemente en condiciones de disturbio” (Rzedowski, 2001) (Figura 15). 61 Figura 15. Ilustración de Tagetes lucida. A) Rama con cabezuelas, B) Cabezuela, C) Flor del disco. Usos medicinales La T. lucida es empleada principalmente para afecciones del aparato digestivo. Contra el dolor de estómago y vómito se hierven dos “ramitas” en un litro de agua 4 cm A B C 62 y se toma como agua de tiempo (Vázquez, 2005). Si se presenta con diarrea y vómito se ponen a cocer en un litro de agua ocho ramitas hasta que hierva el agua, en seguida se bebe calentito, poco a poco (González et al., 2015). Otra forma de tratar la diarrea es empleando las hojas de hierbabuena (Mentha piperita), la flor de cempasúchil (Tagetes erecta) y las ramas de té negro (Bidens aurea) en infusión, se toma tres veces al día antes de cada alimento. A esa mezcla se le pueden agregar otras plantas como las flores o ramas de T. lucida y las cortezas de diferentes árboles como granada (Punica granatum), guamuchil (Pithecellobium dulce), guaje (Leucaena esculenta) y guayaba (Psidium guajava), se consume en infusión como agua de tiempo por varios días (Osuna et al., 2005). En el caso de la disentería con moco se puede tomar la infusión con las flor de pericón o también mezclada “para potenciar su acción” junto con hojas de lantel o llantén (Plantago major), se le puede añadir las hojas de golondrina (Boerhavia sp.) y se consume tres veces al día. O las ramas de cilantro (Coriandrum sativum) y la raíz de manrrubio (Marrubium vulgare), se bebe de la misma manera. Ambas combinaciones se utilizan también para tratar diarreas. En Amatlán de Quetzalcóatl emplean la planta para problemas ginecológicos en baños de asiento, cuando hay infecciones vaginales (información obtenida en entrevistas). En Pantepec, Veracruz se usa para el dolor de cerebro; se prepara una tisana con las ramas y se toma como agua de tiempo. Para el espanto se ponen una ramitas en un tarro de alcohol o refino con toronjil, cáscara de limón y canela, se deja reposar durante un día y se toma en ayunas una cucharadita, solo o en cocimiento de naranja cucha. Contra el “susto”, también en Veracruz, se mezcla con otras plantas, entre éstas yoloxochitl (Talauma mexicana), todo se pone en aguardiente y se le unta al enfermo en todo el cuerpo, se le abriga y pone una cinta en la cabeza (Martínez et al., 2001). Otro de los usos para tratar el sistema nervioso central, para calmar “los nervios” es consumiendo una infusión preparada con una “ramita” de pericón por taza (Monroy-Ortiz y Castillo-España, 2007). La planta recién cortada es empleada en limpias, baños de temazcal. La especie se considera de naturaleza caliente y se mezcla con otras plantas más 63 templadas o frías para contrarrestar su naturaleza, dependiendo del tratamiento para el cual se use (Linares et al., 1990). Recomendación: Es importante no administrarse por más de tres días, ya que es abortiva (Monroy-Ortíz y Monroy, 2007). Otros usos Como condimento, insecticida y ceremonial. Partes de la planta empleada Aérea. Anatomía “Respecto a la lámina foliar, en su vista superficial, las células epidérmicas tienen paredes anticlinales sinuosas y gruesas, con estomas anomocíticos en la superficie abaxial. En la sección transversal de ambas superficies, la cutícula es lisa con 2-10 μm de espesor, tiene la epidermis simple con células epidérmicas de 5-64 μm x 14-64 μm y un mesófilo bifacial. El cual tiene un parénquima en empalizada formado por una capa de células de 32-76 μm x 8-6 μm, ocupando el 24-30% del mesofilo. El parénquima esponjoso es de 4 a 5 capas, ocupando el 70- 76% del mesofilo. El mesofilo equibilateral está formado por una capa de células en cada una de las superficies de la hoja, de 42-74 μm x 2-17 μm. Las cavidades secretoras son de origen esquizógeno y presenta numerosos cordones vasculares de tipo colateral con una vaina de células parenquimatosas” (García-Sánchez et al., 2012). “En cuanto a la vena media es de cutícula con 4-13 μm de espesor, los tricomas son uniseriados de paredes gruesas con una célula apical aguda, más abundantes en la superficie abaxial. En la sección transversal la epidermis es simple con células de 15-35 μm x 12-41 μm. Por debajo de la epidermis de ambas superficies de 1 a 4 capas de parénquima con diferentes grados de engrosamiento, desarrollando colénquima o células esclerosadas. Presenta dos cordones vasculares, uno más desarrrollado que el otro, el mayor con más de 20 64 vasos xilemáticos organizados radialmente, cada uno con fibras extendiéndose a manera de arco en ambos polos, rodeados por una vaina de esclereidas. El tallo en su sección transversal es de forma circular sinuosa en la base y en las partes más jóvenes del eje de forma cuadrandular. La cutícula tiene un grosor de 4-9 μm con tricomas simples y escasos, uniseriados de 4 a 6 células de paredes gruesas. La epidermis es simple, con células de 7-24 μm x 20-53 μm. El córtex está formado por colénquima, parénquima, esclerénquima y algunos canales secretores de origen esquizógeno. El colénquima es angular de 4-5 capas, mejor desarrolladoen los ángulos del tallo, mientras que el parénquima tiene grandes espacios intercelulares formando un aerénquima. Sin embargo, en la parte media y superior del eje escaos o ausentes. Los paquetes de esclerénquima en T. lucida se encuentran separados por células esclerosadas. El xilema secundario tiene un espesor de 449-785 μm. El xilema es primario en las zonas más jóvenes del eje en haces vasculares de tipo colateral. La médula es parenquimatosa con forma de estrella, de diámetro promedio de 1.72 mm” (García-Sánchez et al., 2012) (Figura 16). Figura 16. Anatomía de Tagetes lucida. Vistas trasversales de tallo basal y medio de T. lucida. co: colénquima, esc: esclerénquima, f2: floema secundario, pa: parénquima, me: médula, x2: xilema secundario.Tomado de García-Sánchez et al., 2012. Farmacología La actividad antifúngica y antibacterial se evaluó con diferentes cumarinas aisladas de T. lucida así como flavonoides. Se comprobó su actividad de las 65 cumarinas: 7, 8-dihidroxi-6-metoxicumarina, 7-8-dihidroxicumarina contra las bacterias Gram positiva y negativa. Adicionalmente se corroboró su actividad contra cepas micóticas de Trichophyton mentagrophytes y Rhizoctonia solani debido a la presencia de esculetina y 6, 7-dimetoxi-4-metilcumarina (Céspedes et al., 2006). El extracto acuoso se probó contra las células HeLa (que causan cáncer cérvico uterino), los resultados fueron positivos (Vega-Ávila et al., 2009). La actividad antidepresiva del extracto acuoso evaluada en el modelo de nado forzado en ratas demostró la participación del sistema serotoninérgico (Guadarrama-Cruz et al., 2012; Bonilla-Jaime et al., 2015). Otra de sus propiedades farmacológicas es de acción estrogénica, de actividad depresora del SNC, con potente actividad antiinflamatoria y anestésica (Romero et al., 2007). Fitoquímica La planta contiene el aceite esencial estragol (Zolla et al., 2009). Del aceite esencial se han aislado los monoterpenos: β-ocimeno; sesquiterpeno: limoneno, β- cariofileno (Osuna et al., 2005). Además se conocen de flavonoides, particularmente glicósidos de quercetina, quercetagritín, tagetona, tagetina, canferol y quercetagenina 3,4´-dimetileter 7-O-β-D-glucopiranósido, taninos, pectina y gomas. En la raíz se ha detectado un compuesto sulfurado, el bitienil-2- 2'-5- (but-3-en-l-inil) y en la semilla se indica la presencia de un alcaloide no identificado (Zolla et al., 2009; Lara et al., 1999; Abdala, 1999; Aquino et al., 2002; Xu et al., 2012). A partir de la hidrodestilación de la parte aérea (flores, hojas y tallos) se identificó su mayor componente, el metil chavicol, empleando los índices de retención obtenidos, su contenido es de un 95-97% (Cicció, 2004). En la flor se encontraron los siguientes compuestos químicos: alcaloides cuaternarios; saponinas; taninos; leucoantocianinas; ácido gálico; glicósidos cianogénicos; poliacetileno: (5-(3-buten-1-inil)-2,2´-bitienol); cumarinas: dimetilalileter de 7-hidroxicumarina, 7-metoxicumarina; 6, 7, 8-trime-toxicumarina, 66 herniarina; derivados del tiofeno; gomas; grasas; resinas acídicas; sales minerales y otro compuesto: dextrina (Osuna et al., 2005). En el aceite esencial de la flor hay: monoterpenos: β-ocimeno, mirceno, alilanisol, anetol, éter metílico de eugenol; sesquiterpenos: β-cariofileno, limoneno, linalol (Osuna et al., 2005). En las hojas se detectaron alcaloides cuaternarios; saponinas; taninos; leucoantocianinas; ácido gálico; glicósidos cianogénicos; poliacetileno: (5-(3-buten-1-inil)-2,2´-bitienol); cumarinas: dimetilalileter de 7- hidroxicumarina, 7-metoxicumarina; 6, 7, 8-trimetoxicumarina, herniarina; derivados del tiofeno; gomas; grasas; resinas acídicas; sales minerales; carbohidrato: pectina y otros compuestos: dextrina, α-tertienilo (Osuna et al., 2005; Céspedes et al., 2006) (Tabla 15). En la raíz se reportó el compuesto sulfurado bitienilo-2-2´-5-(-but-3-en-1- inil). Este es el órgano que contiene la mayor cantidad y diversidad de tiofenos (del 64 al 100% de la cantidad de tiofenos totales presentes en la especie), con (5-(3- buten-1-inil)-2,2´-bitienil como el componente mayor, seguido de 5-(4-acetoxi-1- butinil)-2,2´-bitienil, 2,2´:5´,2”-tertienilo (α-T) y 5-(4-hidroxi-1-butinil)-2,2´-bitienil (Marotti et al., 2010). Tabla 15. Algunas cumarinas presentes en T. lucida Nombre Estructura química Umbeliferona Esculetina 67 Comentarios Esta especie es de las que por estudios fitoquímicos presenta el mayor potencial de uso como biocida y pesticida para los cultivos y contra los insectos (Villavicencio-Nieto et al., 2010; Marrotti et al., 2010). En las excavaciones del Templo Mayor de Tenochtitlán se encontraron diversos sahumadores en que había semillas de pericón, por lo que infieren los antropólogos que las flores de esta planta se habían atado al extremo de tal pieza. Dentro de la cultura indígena, la planta se considera de naturaleza caliente, se le asocia al fuego, al rayo fertilizador, la diosa del maíz y a los dioses del pulque y la lluvia (Argüelles, 2012). En la ofrenda 102 del Templo Mayor de Tenochtitlán, destapada en el año 2000, según Montúfar (2013), rescataron 111 elementos de oblación en 15 niveles de deposición. Al lado de un figura antropomorfa y de una máscara Tláloc, se halló una vara (con forma de bastón de mando) adornada con tres conos de papel amate que en su interior tenían restos de flores de pericón. Se corroboró que dicha especie se trata de T. lucida, plantas que son idénticas a las muestras contemporáneas. Tal descubrimiento demuestra que la ceremonia de ofrenda fue de agosto a octubre, por la floración anual de la especie. El uso de la planta significa además, que es una planta muy apreciada por sus propiedades terapéuticas y rituales. Menciona Montúfar (2013), que tal vez es porque “recuerda Nombre Estructura química Herniarina Escopoletina 68 al sol” (de color amarillo muy brillante y además, aromática) y se le confiere una connotación simbólica asociada al agua. Actualmente en el Estado de Morelos el 28 de septiembre, continúa la tradición de La Enflorada o Periconeada, como lo narró Sierra (2007). Consiste en colocar cruces de pericón equidistantes en las cuatro esquinas o rumbos de la milpa. Además se colocan en las puertas de las casas, locales comerciales, los atrios de las iglesias y lo vehículos para que el 29 de septiembre que Dios envía a San Miguel proteja de todo lo maligno y bendiga la primer cosecha. Las especies T. erecta y T. lucida tienen reportes de su uso medicinal desde 1552. De ambas plantas hay estudios taxonómicos, anatómicos, químicos, antropológicos y farmacológicos, en que se exploraron distintas actividades o efectos, incluso los relativos al SNC, para el tratamiento de la depresión. Pero no se habían explorado sus usos tradicionales en la farmacología, como ansiolíticos- sedantes. 2.4 INVESTIGACIÓN FARMACOLÓGICA PARA LA BÚSQUEDA DE NUEVOS FÁRMACOS La farmacología es el estudio de los efectos de las sustancias químicas sobre las funciones de los organismos vivos (Rang et al., 2008). Incluye a la farmacognosia, que explora la naturaleza de los medicamentos y sus componentes; también la farmacocinética, que estudia la acción de los medicamentos en el organismo que incluyen la absorción, la distribución, la localización en tejidos, la biotransformación y la excreción. Además abarca a la farmacodinamia, que estudia los efectos bioquímicos y fisiológicos de los medicamentos y del mecanismo de sus acciones, e incluye la correlación de efecto-acción de los medicamentos con su estructura química (Dychter, 2006). En sus inicios, la farmacología se dedicaba únicamente al estudio de los efectos de las sustancias naturales, como losextractos de plantas y de los fármacos obtenidos de éstas, por ejemplo se estudió la quinina, la digital, la atropina, la efedrina, y la estricnina, entre otros. Actualmente el estudio de la farmacología se ha extendido a áreas como la genómica, genética, biotecnología, 69 epidemiología o economía. Sin embargo, el estudio de las especies vegetales empleadas con fines medicinales se sigue haciendo, debido a que son conocimientos de interés para las ciencias médicas, químicas, sociales y de la industria farmacéutica (Rang et al., 2008). La medicina actual emplea principalmente fármacos como herramienta terapéutica. Los fármacos antes de que puedan ser comercializados son evaluados para comprobar su seguridad y eficacia. Para ello se hacen estudios in vitro e in vivo (Katzung, 2000) con animales, bacterias u hongos y se hacen pruebas de toxicidad aguda y bioquímicas. A esta investigación se le nombra preclínica y es la parte hecha en este estudio. Si se decide continuar con la evaluación del fármaco e incluso comercializarlo, el interesado debe presentar ante las agencias regulatorias tales como la Secretaría de Salud, a través de COFEPRIS (Comisión Federal para la Protección Contra Riesgos Sanitarios) en el caso de México, la FDA (Administración de fármacos y alimentos, por sus siglas en inglés Food and Drug Administration) para Estados Unidos o la EMEA (Agencia europea de medicamentos por sus siglas en inglés European Medicines Agency) para Europa, un expediente con los resultados obtenidos y el interés por continuar con el estudio clínico. Una vez aprobado por la agencia regulatoria correspondiente le asignan al fármaco el carácter de estar bajo investigación el nombre de “nuevo fármaco” o IND (Investigación de un nuevo fármaco por sus siglas en inglés Investigational New Drug) (Magos y Lorenzana-Jiménez, 2009). Después de tener resultados de seguridad y autorización gubernamental se comienza la fase clínica del ensayo farmacéutico, la cual involucra seres humanos. La etapa uno o la Fase 1 se hace en general con personas del género masculino, esta fase es fundamental para determinar la actividad farmacocinética (Dychter, 2006). En esta fase se revisa la seguridad al valorar los efectos dañinos y la tolerabilidad de establecer los límites probables de valores de dosis clínicas seguras. En la Fase I las pruebas no son ciegas, tanto los sujetos como los investigadores conocen el medicamento que se está administrando. Posteriormente, si las pruebas han sido positivas, el ensayo pasa a la Fase II. En 70 su mayoría se hacen estudios experimentales aleatorizados y tienen el propósito de valorar la eficacia del fármaco nuevo para la enfermedad a la que se ha diseñado. En esta fase, el clínico necesita estar familiarizado con la patología que se está tratando, y diseña con frecuencia un estudio ciego en donde los pacientes desconocen el tratamiento. Además del grupo que recibe el fármaco nuevo, hay otro grupo que recibe el fármaco de referencia y son el control positivo (Magos y Lorenzana-Jiménez, 2009). Antes de que un medicamento sea sometido a exámenes para su aprobación por las instituciones regulatorias se hace otra prueba dentro de la población a la cual se dirigirá el medicamento. La Fase III se puede bifurcar en dos o puede conducir a nuevas pruebas suplementarias, o puede dirigirse a un nuevo ensayo como viabilidad de mercado o a la evaluación de la siguiente fase (Dychter, 2006). En la Fase III los ensayos clínicos controlados son conducidos por investigadores calificados que controlan una gran población de pacientes. Más de 150 clínicos pueden participar y supervisarán de 1000 a 3000 pacientes (Magos y Lorenzana-Jiménez, 2009). Una vez que el fármaco fue aprobado como eficaz y seguro la FDA le da el término de NDA (Aplicación de nuevo fármaco por sus siglas en inglés New Drug Application), la investigación entra a la Fase IV tiene la finalidad de obtener detalles adicionales acerca de los perfiles de eficacia y seguridad, y pueden ser evaluadas diferentes formulaciones, dosis y duración de los tratamientos, así como nuevos grupos de la misma edad de los pacientes, o reacciones adversas inadecuadamente cuantificadas y factores de riesgo relacionados (Dychter, 2006; FDA, 2015). El tiempo que transcurre entre una solicitud de patente y la aprobación para la venta de un nuevo medicamente es de 12 años y el costo asciende de 500 a 1000 millones de dólares. La autorización de comercialización de tal patente desde la Fase III tendrá una vigencia de 20 años, la cual al finalizar este periodo, otras compañías podrán manufacturarlo y venderlo como medicamento genérico (Dychter, 2006) (Figura 17). 71 Figura 17. Las cuatro fases secuenciales ren los estudios clínicos de nuevos fármacos. 2.4.1 Modelos de animales en el estudio de la ansiedad Los modelos experimentales son parte medular en los estudios preclínicos que se hacen principalmente en roedores, donde el término “modelo” usualmente refiere una construcción teórica en la cual una hipótesis específica puede ser deducida o probada experimentalmente. Los protocolos desarrollados en organismos que no son humanos se efectúan con la finalidad de replicar características patológicas, fisiológicas o de comportamiento de pacientes con distintos padecimientos (Steimer, 2011; Bourin et al., 2007). En estos se miden respuestas conductuales a situaciones de conflicto o de novedad. Las pruebas para detectar actividad de los compuestos que tienen propiedades ansiolíticas potenciales se pueden clasificar en pruebas de conflicto, neofobia, miedo condicionado, ansiedad social y pánico (Andrews et al., 2014). Los roedores y el humano son especies que comparten más del 90% de los genes, debido a ello, los modelos experimentales para evaluar la ansiedad en animales resultan herramientas de utilidad para la terapéutica en humanos (Mervis et al., 2012). Sin embargo, la selección del modelo adecuado al explorar una alternativa de tratamiento médico no es fácil ya que implica conocer: a) las diferencias entre los sistemas nerviosos de ambas especies; b) la dificultad en encontrar conductas análogas entre las especies; y c) la semejanza de que los Fase I Sanos Fármaco con aplicación IND voluntarios NDA eficaz y seguro Farmacovigilancia población Fase IV Fase II Enfermos Fase III Enfermos 72 datos puedan ser extrapolados al humano (Kumar et al., 2013). Es así que varios modelos experimentales en animales se han desarrollo e investigado basados en la reactividad emocional de los roedores, entre ellos su sensibilidad al estrés. Dentro de los modelos más empleados se encuentran: el campo abierto para valorar la actividad ambulatoria, el rota-rod para analizar la coordinación motora; el tablero con orificios; la exploración en cilindro y la cruz elevada para evaluar los efectos de tipo ansiolítico. También se emplea la potenciación de la hipnosis inducida con un sedante-hipnótico como el pentobarbital sódico (PBS), utilizado para indicar el sinergismo entre los agentes depresores del SNC y los efectos sedantes de nuevos compuestos. Dichos modelos se han validado utilizando fármacos empleados en la clínica (Martínez et al., 2006; Sarker et al., 2007; Aguirre et al., 2007a). Más de 30 modelos experimentales preclínicos son utilizados para la investigación de fármacos con acción sobre el SNC, entre ellos se incluyen aquellos que evalúan la ansiedad. Tales modelos se basan en respuestas incondicionadas, es decir las que no requieren de entrenamiento previo, y las condicionadas, en este caso los roedores deben de tener un entrenamiento antes de hacer el experimento y su comportamiento demuestra interferencia con los procesos motivacionales o nemotécnicos (Steimer, 2011). Losmodelos que no requieren entrenamiento son los que evalúan la actuación en la transición de la luz y oscuridad, la conducta social de defensa, la supresión de la ingesta inducida por novedad y de comportamiento exploratorio, como la evaluación de la actividad ambulatoria, la exploración en el tablero con orificios, en cilindro y cruz elevada (Polanco et al., 2011). Independientemente del empleo de uno u otro modelo y de lo que se pretende evaluar es necesario considerar diversas variables asociadas con la especie del animal, la raza, la edad y el género, así como las variables de procedimiento, las condiciones del bioterio, el nivel de iluminación, el tiempo de la prueba y duración de la misma, las manipulaciones previas del animal, la presencia del experimentador, el tamaño y material del que fue construido el 73 instrumento, las mediciones técnicas y si se trata de aparatos automatizados u observadores entrenados (Rodgers et al., 1997). 2.5 FITOQUÍMICA 2.5.1 Investigación fitoquímica La fitoquímica es el estudio de los productos químicos naturales. El comienzo de esta ciencia se considera que fue cuando se aisló en 1769 ácido tartárico de las uvas, por el químico sueco Carl Wilhelm Scheele. Actualmente es una de las disciplinas que se han desarrollado en los últimos 200 años logrando avances impresionantes. Por ejemplo podemos conocer sobre un gran número de compuestos que se encuentran en un organismo en un momento dado al nivel de proteína, el ácido desoxirribonucleico o los metabolitos primarios y secundarios (Figura 18) (Heinrich, 2005), es decir desde la estructura química molecular de los compuestos, sus componentes químicos hasta sus propiedades biológicas. Se estima que alrededor del 25% de las medicinas actuales provienen de derivados de las plantas, como en el caso de los medicamentos antitumorales o antimicrobianos (Calixto, 2000). Figura 18. Metabolismo primario y secundario. Metabolismo primario 74 Los organismos requieren transformar diversos compuestos para poder sobrevivir. A estas transformaciones cuidadosamente reguladas por reacciones químicas se le llama metabolismo intermediario y a las rutas involucradas se les llama rutas metabólicas (Dewick, 2002). El metabolismo primario son los distintos procesos por los cuales las plantas sintetizan, degradan sustancias orgánicas y generan productos que les son indispensables en el crecimiento, para el almacenamiento y la reproducción (Schwachtje y Baldwin, 2008), por ejemplo los aminoácidos, carbohidratos, proteínas, etcétera. A esos productos se les denominan metabolitos primarios (Mata y Rivero, 2000). En contraste, los metabolitos secundarios son los productos que las plantas elaboran en respuesta al ambiente, los patógenos y como señales para la comunicación con simbiontes (Davies y Schwinn, 2003). Los metabolitos secundarios se encuentran en organismos específicos y son la expresión individual de las especies. No necesariamente se producen bajo las mismas condiciones. Además, en la mayoría de los casos las funciones y sus beneficios aún no se conocen (Dewick, 2000). Entre los metabolitos secundarios se encuentran los alcaloides, saponinas, glicósidos, esteroides, taninos, terpenoides, lignanos, flavonoides y las cumarinas, entre otros (Dorcas, 2012). 2.5.2 Metabolitos secundarios con actividad de tipo ansiolítico-sedante Algunos de los metabolitos secundarios con propiedades ansiolíticas que se han reportado en la literatura son: a) flavonoides como la quercetina, el canferol, la canferitrina, la apigenina, la rutina, la naringenina (Vissiennon et al., 2012; Cassani et al., 2014; Zhang y Zhang, 2010; Kumar y Bhat, 2014; Noguerón-Merino et al., 2015); b) terpenos como limoneno (Lima et al., 2013); c) Esteroles como el β– sitosterol (Aguirre et al., 2007b); c) alcaloides como sanjoinina (Han et al., 2009); d) Lignanos como honokiol (Kuribara et al., 2000) y e) cumarinas (Musa et al., 2008; Medeiros-Neves et al., 2015). 75 2.5.3 Cumarinas Las cumarinas pertenecen a la familia de las benzopironas, provienen de la ruta del ácido shikímico. El nombre lo reciben de la palabra francesa coumarou, el nombre común del haba tonka (Dipteryx odorata Willd) (Musa et al., 2008; Shen et al., 2010). Existen cuatro subtipos de cumarinas, las cumarinas simples, las furanocumarinas, piranocumarinas y las pirona cumarinas sustituídas. Están presentes principalmente en las familias de las Apiaceae, Rutaceae y Asteraceae (Jain y Himanshu, 2012). Las cumarinas se usan como colorantes e insecticidas. En la medicina son empleadas para la fotoquimioterapia, como antifúngicos y antibacteriales, en el tratamiento de la diabetes, el síndrome de inmonodeficiencia adquirida, contra el cáncer de seno, pulmones y próstata, así como antibacterial, antiinflamatoria, anticoagulante y en el tratamiento del SNC (Céspedes et al., 2006; Musa et al., 2008; Shen et al., 2010; Medeiros-Neves et al., 2015). Estudios que refieren un efecto de tipo ansiolítico de las cumarinas son para la danforetina, cumarina presente en el extracto etanólico crudo de Loeselia mexicana (Navarro-García et al., 2007); a compuestos derivados de la escopoletina y la umbeliferona de las raíces de Biebersteinia multifida (Monsef-Esfahani et al., 2013); y a una mezcla de cumarinas aisladas de Angelica archangelica (Kumar et al., 2013). 76 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La ansiedad patológica es una afección del SNC de alta incidencia que se asocia con enfermedades de filiación cultural como “los nervios”. En este proyecto se estudiaron dos especies mexicanas de alto valor cultural y amplio uso para tratar la ansiedad o “los nervios” de las cuales no se tienen antecedentes de estudios farmacológicos: Tagetes erecta L. (cempasúchil) y Tagetes lucida Cav. (pericón). Con base a las experiencias, técnicas y conocimientos de los médicos tradicionales y comerciantes de las especies de T. erecta y T lucida se espera corroborar sus propiedades y uso potencial como tranquilizante. También se pretende conocer si estas especies medicinales son fuente de origen de principios activos mediante técnicas fitoquímicas y de diseño experimental farmacológico, con la finalidad de promover la eficacia del tratamiento con un mínimo de efectos adversos. 77 4. HIPÓTESIS En el Estado de Morelos las especies T. erecta y T. lucida son reconocidas tanto por los médicos tradicionales y los comerciantes por sus propiedades tranquilizantes. Entonces: - Las especies de T. erecta y T. lucida producirán respuestas de tipo ansiolítico y/o sedante en modelos experimentales. - Tanto T. erecta como T. lucida son especies que producen su actividad depresora involucrando a los sistemas inhibidores GABAérgico y/o serotoninérgico. - Los componentes de naturaleza flavonoide y terpenoide están involucrados en el efecto de tipo ansiolítico-sedante de las especies de T. erecta y T. lucida. 78 5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo general - Estudiar la etnobotánica, farmacología y fitoquímica de la actividad como ansiolítico-sedante de Tagetes erecta L. y Tagetes lucida Cav. 5.2 Objetivos particulares a) Hacer entrevistas a médicos tradicionales, comerciantes y usuarios del Estado de Morelos sobre el uso de T. lucida y T. erecta para tratar “los nervios”. b) Analizar cualitativamente las entrevistas para corroborar el uso de estas especies en el tratamiento de “los nervios”. c) Evaluar la actividad ansiolítico-sedante de extractos acuosos y etanólicos, fracciones y/o compuestos activos de T. erecta y T. lucida mediante modelos experimentales en ratones. d) Establecerla toxicidad aguda mediante el cálculo de la dosis letal media (DL50) de los extractos de T. erecta y T. lucida y determinar el índice terapéutico. e) Analizar la participación de los receptores GABA/BDZ y/o 5HT1A como posible mecanismo de acción en la actividad ansiolítico-sedante de los extractos de ambas especies. f) Fraccionar los extractos activos crudos para aislar al menos un metabolito activo. g) Determinar la actividad ansiolítico-sedante del metabolito activo elucidado. 79 6. MATERIALES Y MÉTODOS En la Figura 19 se resume el diseño experimental y la preparación de las muestras vegetales para el análisis fitoquímico y analítico. Listado de especies empleadas en Morelos para tratar “los nervios” (revisión bibliográfica) Recolección e identificación de ejemplares botánicos: T. erecta (IMSSM No. 15987) y T. lucida (IMSSM No. 15878) Entrevistas abiertas y dirigidas a: Curanderos y comerciantes Análisis cualitativo de entrevistas Preparación de los extractos Liofilización, maceración y fraccionamiento por percolación Toxicidad aguda (Lorke 1983, modificado) DL 50 Modelos conductuales de ansiedad y sedación Dosis 3-1000 (mg/kg i.p.) Fármaco de referencia (DZP 1 mg/kg) Pentobarbital sódico (PBS) Dosis 3-1000 (mg/kg, i.p.) Mecanismos de acción Flumazenil (10 mg/kg) y WAY100635 (0.32 mg/kg) Cromatografía de capa fina de los extractos y fracciones de T. erecta y T. lucida Análisis estadístico ANADEVA seguido de la prueba de Dunnett o T-student *P<0.05, # P<0.05. Evaluación de compuestos: flavonoides, cumarinas y esterol, en modelos conductuales de ansiedad y sedación Análisis de los cromatogramas por UPLC Extractos acuosos, etanólicos y la mezcla de compuestos Para T. lucida elucidación de cumarina de la mezcla de compuestos por 1 H-RMN, 13 C-RMN, gases masas Figura 19. Diseño experimental del estudio. 80 6.1 ESTUDIO ETNOBOTÁNICO El estudio etnobotánico consistió en hacer la revisión bibliográfica de las especies utilizadas en el Estado de Morelos para el tratamiento de “los nervios”. A partir de ahí se eligieron la Tagetes erecta y la T. lucida por ser plantas ampliamente utilizadas, de fácil acceso de recolecta y adquisición para as personas y que no contaban con estudios con actividad ansiolítico-sedante. Para conocer el uso actual de ambas especies se hicieron entrevistas estructuradas y semiestructuradas a curanderos y comerciantes del Estado de Morelos (Figura 20). Figura 20. A) Tagetes erecta (cempasúchil) y B) Tagetes lucida (pericón) de Amatlán de Quetzalcóatl, Morelos. 6.1.1 Especies del Estado de Morelos empleadas para “los nervios” La lista de plantas del Estado de Morelos que se ocupan como tranquilizantes se obtuvo mediante una revisión bibliográfica. Se basa en los estudios de Carlini et al. (1986), Tortoriello y Romero (1992), Monroy-Ortiz y Monroy (2004), Monroy-Ortiz y Monroy (2006), Gómez-Mureddu (2006), Monroy-Ortiz y Castillo-España (2007). La búsqueda de especies incluyó las que mencionan usos para “los nervios”, susto, espanto, tranquilizar, nerviosismo e insomnio. Además se anexaron las plantas indicadas por los médicos tradicionales y comerciantes de Morelos (Tabla 16). El nombre común se iba cotejando con la especie, a partir de ver las plantas secas o frescas. A) B) 81 Tabla 16. Especies utilizadas en el Estado de Morelos para tranquilizar “los nervios” Familia Nombre científico Nombre común Acanthaceae Justicia spicigera Schltdl. Muicle Amaranthaceae Iresine calea Standley Atlancuayo Apiaceae Petroselinum crispum (Miller) Mansf. Perejil Asteraceae Artemisia absinthium L. Ajenjo Asteraceae Lactuca sativa L. Lechuga Asteraceae Tagetes erecta L. Cempasúchil Asteraceae Tagetes lucida Cav. Flor de pericón Boraginaceae Borago officinalis L. Borraja Cactaceae Stenocereus stellatus (Pfeiffer) Riccob. Flor de pitaya Caricaceae Carica papaya L. Papaya Ebenaceae Diospyros digyna Jacq. Cáscara de zapote prieto Equisetum Equisetum hyemale L. var. affine (Engelm.) A.A. Eaton Carricillo Erythroxylaceae Erythroxylum havanense Jacq. Palo chino Euphorbiaceae Cnidoscolus chayamansa McVaugh Chaya Fabaceae Erythrina americana Miller. Cáscara de chompatle Fabaceae Haematoxylum brasiletto Karsten Brasil Fabaceae Mimosa albida Humb. & Bonpl. Ex Willd. Dormilona Fabaceae Hippocratea excelsa Kunth Cancerina Lamiaceae Agastache mexicana (Kunth) Lint & Epling Toronjil Lamiaceae Salvia microphylla Kunth Mirto Loranthaceae Phoradendron velutinum (DC.) Nutt. Injerto de cazahuate Magnoliaceae Illicium verum Hook.f. Anís de estrella Magnoliaceae Talauma mexicana (DC.) G. Don Flor del corazón Malphigiaceae Heteropterys beecheyana Adr. Juss. Bejuco de margarita Oleaceae Jasminum officinale L. Estrellita 82 Familia Nombre científico Nombre común Passifloraceae Passiflora edulis Sims Flor de la pasión Passifloraceae Passiflora subpeltata Ortega Itamo real Piperaceae Piper auritum Kunth Acuyo Poaceae Cymbopogon citratus (DC.) Stapf Zacate limón Rubiaceae Exostema caribaeum (Jacq.) Roemer & Schultes Cáscara sagrada roja Rutaceae Casimiroa edulis Llave & Lex. Hoja de zapote blanco Rutaceae Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle Limón Rutaceae Citrus sinensis (L.) Osbeck Azahar de naranjo Saxifragaceae Heuchera mexicana Schaffner Salve real redonda Saxifragaceae Philadelphus mexicanus Schldl. Flor de jazmín Solanaceae Brugmansia arborea Lagerh. Floripondio Sterculiaceae Chiranthodendron pentadactylon Larreát Flor de manita Theaceae Ternstroemia lineata DC. subsp. lineata Flor de tila Valerianaceae Valeriana ceratophylla Kunth Valeriana Valerianaceae Valeriana urticaefolia Kunth Valeriana Verbenaceae Vitex mollis Kunth Aceitunillo Vitaceae Cissus sicyoides L. Abrojo rojo Revisión bibliográfica y datos de entrevistas hechas en el 2011 para la elaboración del protocolo de este estudio 6.1.2 Entrevistas Las conversaciones con los comerciantes (ocho) y los curanderos (veinticinco) se hicieron en mercados y casas de los curanderos en los municipios de Alpuyeca, Amatlán de Quetzalcóatl, Cuernavaca, Cuautla, Temixco, Tepoztlán, Tetela del Volcán, Tlayapacan, Yautepec y Yecapixtla. La elección de los lugares se hizo considerando localidades urbanas y rurales del estado para contar con diversos testimonios de personas que habitan en distintos tipos de ecosistemas. Son regiones con bosques de pino, encino, bosque de galerías y selva baja caducifolia. 83 Además se investigó en zonas con diferente estatus económico y con diferente población, como Cuernavaca y Cuautla, lugares productores de las especies de interés como Yecaplixtla, también donde se encuentran las Sierras del estado como Tepoztlán o Amatlán de Quetzalcóatl, o donde están las corrientes de agua superficial más importantes como Yautepec (Rendón y Fernández, 2007). Para conocer el uso actual de T. erecta y T. lucida se elaboraron cuestionarios de tipo abierto para curanderos y dirigidos para los comerciantes. En estos se les preguntó edad, de dónde eran originarios, ocupación, las formas de preparación (infusiones o tinturas), la dosis recomendada para adultos y niños, dónde consiguen el material vegetal. En el caso de los comerciantes adicionalmente se indagó sobre el costo a la venta y si ésta ha aumentado o disminuido, además se les preguntó sobre las personas que los visitan, por ejemplo: el género (masculino o femenino) y sus edades. Para entender y delimitar el padecimiento de “los nervios” y cómo este término está relacionado con la ansiedad, se preguntó qué es tal padecimiento y sus causas, así como las demás especies que se emplean o ritualesque hacen en el tratamiento de “los nervios” (Tabla 17). Cabe señalar que en este caso no se llevaron muestras de referencia debido a que son especies ampliamente conocidas en Morelos. Además las entrevistas se hicieron en la temporada de floración de ambas especies y se obtuvieron muestras o se mostraron las plantas por parte de las personas entrevistadas. Tabla 17. Preguntas hechas a comerciantes y curanderos Preguntas a comerciantes 1. ¿Cuál es su nombre y edad? 2. ¿Qué son los nervios? 3. ¿Qué plantas vende para los nervios? 4. ¿Qué nos causa tener los nervios? 5. ¿Qué partes de la planta vende? 6. ¿Quiénes pueden tomarla? 84 Preguntas a comerciantes 7. ¿Cómo recomienda utilizarlas? 8. ¿Cuál es la planta que vende más? 9. ¿De dónde viene la planta que vende, dónde la compra? 10. ¿Mezcla las plantas que vende? ¿Vende preparados para los nervios? ¿Qué plantas incluye? 11. ¿La planta debe cubrir determinadas características para su venta? 12. ¿Las plantas se pueden confundir unas con otras? 13. ¿Qué tan frecuente es la visita del paciente? 14. ¿Qué tan recurrente se enferman de los nervios? 15. ¿Cómo reconoce al pericón, al cempasúchil? ¿Para qué los usa? 16. ¿Las usa para los nervios? 17. ¿Cuándo y por qué es mejor usar una u otra o mezcladas? 18. ¿Cuál es la frecuencia mayor de uso por las mujeres u hombres? 19. ¿Cómo adquiere las plantas medicinales? 20. ¿A quién le vende? 21. ¿Cómo conserva las plantas medicinales? 22. ¿Cuál es el procedimiento de secado de las plantas? 23. ¿Usted usa las plantas para consumo personal? Preguntas a curanderos 1. ¿Cuál es su nombre y edad? 2. ¿Qué son los nervios? 3. ¿Por qué las personas se enferman de los nervios? 4. ¿Cómo cura a una persona de los nervios? 5. ¿Qué tan frecuente se enferman de los nervios? 6. ¿De qué edades son los que más acuden a visitarlo por este padecimiento? 7. ¿Está relacionado con el susto? 8. ¿Qué tratamiento les recomienda? 85 Preguntas a curanderos 9. ¿Por cuánto tiempo? 10. ¿Quiénes pueden tomarla? 11. ¿Cómo aprendió o supo para qué usar las plantas medicinales? 12. ¿Se ha incrementado o disminuido esta enfermedad? 13. ¿Cómo adquiere sus plantas medicinales? 14. ¿Cómo conserva las plantas medicinales? 15. ¿Es diferente el uso de las plantas que se usan para tratar los nervios en Morelos que en otro estado? 16. ¿Las plantas se pueden confundir unas con otras? 17. ¿Qué tan frecuente es la visita del paciente? 18. ¿Cómo reconoce al pericón y al cempasúchil? 19. ¿Para qué enfermedades usa el pericón y el cempasúchil? 20. ¿Cómo recomienda usar el pericón y el cempasúchil? 21. ¿Usted usa el pericón y el cempasúchil para el tratamiento de los nervios? 22. ¿Hay diferencia entre el uso de una planta u otra? 23. ¿Cuándo y por qué es mejor usar una o varias plantas medicinales mezcladas? 24. ¿Cuál es la frecuencia mayor de uso por las mujeres u hombres? Las entrevistas se hicieron a los curanderos y comerciantes en los mercados con el consentimiento de los mismos y respetando sus actividades, tiempo, la cultura local y la autonomía de las comunidades. Antes de iniciar las entrevistas se les informó en forma clara y concisa del objetivo del proyecto que se deseaba realizar. En los casos en que se permitió la entrevista, se les reconoció su participación; en algunos casos se mantiene la confidencialidad y se publicó sólo la información autorizada. En el escrito de esta tesis se utilizaron únicamente los datos referentes a los usos de las plantas medicinales aquí evaluadas. 86 Los comerciantes de plantas medicinales, por lo general fueron empleados capacitados para la venta de las especies vegetales y de los demás productos que venden como velas, amuletos e incienso. Nueve fueron hombres y diesciseis mujeres. La edad de los comerciantes iba de los 36 hasta los 66 años. Los registros de las respuestas se tienen por escrito y audiograbadas, según lo permitieron. Se cuenta con el consentimiento de las personas entrevistadas de utilizar el material generado. Con los comerciantes, la aproximación fue al momento de hacer la entrevista, se visitaron los mercados Adolfo López Mateos (Cuernavaca), Hermenegildo Galeana (Cuautla), los mercados municipales de Temixco, de Tepoztlán, Tlayacapan (frente a la iglesia), Tetela del Vocán, Yecapixtla, Yautepec (Centenario) y a fuera del mercado de Alpuyeca. En algunos casos el mercado era establecido y en otros casos el mercado itinerante (tianguis). Los testimonios de los comerciantes solo se documentaron por escrito. No hubo consentimiento de grabación (Figura 21). Figura 21. Imágenes de algunos comerciantes en el Estado de Morelos. En el caso de los curanderos las entrevistas fueron abiertas, pues se trataba de especialistas en el manejo de la medicina tradicional que permitieron el acercamiento. Se facilitó debido a que se conocían de encuentros previos sobre la medicina tradicional efectuados en Morelos. La relación se fue fortaleciendo con 87 ellos debido a que se hicieron diversas visitas y se establecieron vínculos de confianza. La edad de los curanderos fue de los 36 hasta los 75 años, de los cuales cinco fueron mujeres y tres hombres. Las entrevistas se hicieron en Cuernavaca, debido a que es la capital del Estado de Morelos dónde se concentra la mayor actividad económica y número de habitantes (20.5% de población total de la entidad (INEGI, 2011) y por consecuencia de curanderos). Y la otra localidad dónde se conversó fue en Amatlán de Quetzalcóatl, municipio de Tepoztlán, lugar conocido por la existencia de curanderos. Los curanderos entrevistados que viven en Cuernavaca en general eran originarios de diversas partes del país, como de la Ciudad de México, de Aguascalientes, Michoacán y Chiapas. Las personas originarias de Morelos eran de Santa María Ahuacatitlán (perteneciente al municipio de Cuernavaca) y de Amatlán de Quetzalcóatl (municipio de Tepoztlán) (Tabla 18). Tabla 18. Médicos tradicionales o curanderos entrevistados en el Estado de Morelos Los curanderos son especialistas en el manejo de las especies vegetales asociados a las distintas actividades que desarrollan. Como se señaló anteriormente la herbolaria es el recurso más empleado dentro de la medicina tradicional mexicana, por lo que se entrevistaron a temazcaleros, a un granicero, Curandero Género Edad (años) Ocupación Originarios 1 Masculino 75 Curandero, campesino, "granicero" (maneja el clima) Amatlán de Quetzalcóatl, Morelos 2 Femenino 49 Curandera, promotora de salud Solusuchiapa, Chiapas 3 Femenino 58 Curandera, partera Santa María, Cuernavaca, Morelos 4 Femenino 37 Curandera, temazcalera Aguascalientes, Aguascalientes 5 Masculino 36 Curandero, masajista Amatlán de Quetzalcóatl, Morelos 6 Masculino 55 Curandero, temazcalero Ciudad de México 7 Femenino 54 Curandero, temazcalera, masajista Michoacán 8 Femenino 42 Curandera, masajista Cuernavaca, Morelos 88 sobadores y una partera con conocimientos de herbolaria. Los tratamientos de las enfermedades aunque sean de distintas especialidades, generalmente incluyen plantas medicinales (Figura 22). Figura 22. Imágenes de algunos médicos tradicionales en el Estado de Morelos. 6.2 ESTUDIO FARMACOLÓGICO El estudio farmacológico consistió en hacer pruebas de toxicidad aguda, la evaluación de la actividad como ansiolítico-sedante de los extractos y de las fracciones derivadas de las flores de T. erecta y la parte aérea de T. lucida en modelos conductuales con roedores. Además se evaluó la interacción farmacológica del PBS con los extractos y sus fracciones, se probaron algunos fármacos individuales en los modelos conductuales y se determinó el posible mecanismo de acción serotonérgico o gabaérgicode los extractos acuosos. 89 6.2.1 Reactivos y fármacos Se emplearon el tween 80, el dimetilsulfóxido (DMSO), los estándares: naringenina, canferol, canferitrina, quercetina, rutina, escopoletina, esculetina y beta sitosterol, así como los antagonistas WAY 100635 y el flumazenil; todos se adquirieron de la compañía Sigma-Aldrich Co. El diazepam (DZP) y el PBS se compraron de Psicofarma S.A. de C.V. y PiSA Farmacéutica, respectivamente. Los estándares y los extractos se suspendieron en Tween 80 al 0.5% o DMSO con solución salina isotónica (SSI) al 0.9% o agua destilada, dependiendo de su solubilidad. El DZP se suspendió en una solución de 0.5% de tween 80 y agua destilada, mientras que el PBS en s.s. al 0.9%. Todos los fármacos, los extractos, fracciones y la mezcla o compuestos se utilizaron de recién elaboración y se administraron vía intraperitoneal (i.p.) en un volumen de 10 mg/kg del peso del ratón. 6.2.2 Animales En las pruebas se emplearon ratones machos de la cepa Taconic (SW) con un peso de 25-30 g. Las hembras de la misma cepa y peso se utilizaron para las pruebas de toxicidad aguda y cálculo del parámetro dosis letal media (DL50). Los roedores fueron proporcionados por el bioterio del Instituto Nacional de Psiquiatría “Ramón de la Fuente Muñiz”. Los animales se colocaron en cajas de acrílico en grupos de al menos seis a una temperatura controlada de (22°± 1°C) con ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los ratones se alimentaron ad libitum. Las pruebas de toxicidad aguda, efecto ansiolítico y sedante se hicieron siguiendo las especificaciones emitidas por el Comité de Ética y de Investigación de dicha institución con la aprobación del número de proyecto NC123280. Además se trabajó de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana para el cuidado y manejo animal (NOM-062-ZOO-1999), y las reglas internacionales de cuidado y uso para animales de laboratorio. 90 6.2.3 Material vegetal Las plantas con flor de T. erecta (1.5 Kg) se recolectaron en Huertas de San Pedro, en el municipio de Huitzilac, Morelos, cerca de un bosque de encino a 19°00´N y 99°15´O, a una altitud de 2250 msnm. Se recolectó el 03 de noviembre del 2012. Las partes aéreas con flores de T. lucida (2 Kg) se recolectaron en Amatlán de Quetzacóatl, en la carretera que va hacia el centro del poblado mencionado, en el municipio de Tepoztlán, Morelos, a 18°58´16.32” N y 99°3´1.74” O, a una altitud de 1620 msnm, en un pastizal de selva baja caducifolia. Se recolectó el 24 de septiembre del 2011. La confirmación de la identificación de ambas especies estuvo a cargo de la M. en C. Abigail Aguilar Contreras. Los ejemplares de herbario comprobatorios se depositaron en el Herbario del Instituto Mexicano del Seguro Social de la Ciudad de México (T. erecta IMSSM No. 15987 y T. lucida IMSSM No. 15878). 6.2.4 Preparación de los extractos El material vegetal se recolectó fresco y enseguida se secó a temperatura ambiente extendido bajo la sombra. Una vez secas las plantas, solo las flores de T. erecta y las partes aéreas de T. lucida se pesaron y cortaron finamente para procesarlas. Las partes empleadas fueron según las formas de uso descritas en las entrevistas hechas. Las maceraciones se hicieron por separado: T. erecta (80 g de flores en 1200 mL de etanol) y de T. lucida (158 g de la parte aérea en 1450 mL de etanol). Cada 72 h se filtró la extracción obtenida y se concentró en un rotavapor Büchi Rotavapor R-210, colocándose en un frasco previamente pesado. Esto se repitió tres veces. Una vez seco el extracto se pesó para determinar el rendimiento. Para el fraccionamiento se utilizó la percolación tanto del extracto etanólico de T. erecta (1 g) como de T. lucida (11 g). El procedimiento fue el mismo para ambos extractos. Se separó en tres fracciones usando sílica gel (182 g), los solventes empleados fueron hexano (500 mL), acetato de etilo (750 mL) y metanol (600 ml); en la parte superior se colocó papel filtro. Las distintas fracciones de diferente polaridad se recolectaron por separado concentrándolas a presión reducida por medio de un rotavapor. 91 Para el caso de la fracción de acetato de etilo del extracto de T. lucida (4.67 g) se le hizo una segunda percolación para la obtención de la mezcla de compuestos que se observó como un tentativo precipitado en la fracción. Los disolventes puros y mezclas empleadas fueron: hexano (100%; 500 mL); hexano- acetato de etilo (50:50; 250 mL: 250 mL); acetato de etilo (100%; 500 mL); acetato de etilo-metanol (50:50; 250 mL: 250 mL) y metanol (100%, 500 mL). Todas las fracciones se concentraron a presión reducida y se les calculó el rendimiento. Para obtener el extracto acuoso las plantas secas se introdujeron en matraces (T. erecta: 39 g en 800 ml de agua destilada; T. lucida: 218.8 g en 1 L de agua destilada) y se pusieron a hervir en baño maría por una hora. Posteriormente el líquido se enfrío, filtró y se congeló en matraces florentinos con nitrógeno líquido. Los matraces se colocaron en una lifiolizadora “Labconco freeze dry/Shell” durante 12 horas hasta obtener el extracto seco. Los extractos acuosos se pesaron y colocaron en frascos para su posterior uso. 6.2.5 Determinación de la toxicidad (DL50) Antes de las pruebas farmacológicas se evaluó la DL50, vía i.p. Para ello se empleó el método de Lorke (1983) modificado. El cálculo corresponde a DL50= √(A) (B), donde A es la dosis más alta administrada en la que se observó 100% de mortalidad, mientras que la B es la dosis mínima en la que no hubo muerte (0% mortalidad). Una vez que los ratones fueron administrados, se mantuvieron en observación durante 14 días, registrando su peso y el último día se hizo un análisis macroscópico de los órganos. La dosis más alta que se empleo fue la de 2000 mg/kg siendo ésta permitida por los comités de ética a diferencia de la sugerida por Lorke (1983) que son 5000 mg/kg. 6.2.6 Pruebas experimentales de ansiedad y sedación Después de que se recolectó la planta, se obtuvieron los distintos extractos y se probó la toxicidad aguda se evaluó el efecto ansiolítico-sedante en los modelos de campo abierto, tablero con orificios, cilindro, cruz elevada y la interacción con el fármaco PBS. En el caso de los extractos y fracciones, éstos se administraron 60 min antes de que comenzaran las pruebas. En todas la pruebas, antes y despúes 92 de colocar a los ratones individualmente se limpió el aparato con etanol al 10% (Kumar et al., 2012). Los extractos evaluados de T. erecta fueron el acuoso (10, 30 y 100 mg/kg), el extracto etanólico (10, 30, 100 y 300 mg/kg), sus fracciones de AcOET (10, 30, 100 mg/kg) y de EtOH (3, 10, 30, 100 mg/kg). En el caso de T. lucida los extractos utilizados fueron el acuoso (10, 30 y 100 mg/kg), el extracto etanólico (100 y 300 mg/kg), la fracción AcOEt (30 y 100 mg/kg) y la mezcla aislada de la fracción AcOEt (3 y 10 mg/kg). Todas las dosis se probaron en comparación con el grupo control y el fármaco de referencia DZP (1mg/kg). 6.2.6.1 Modelo de campo abierto La prueba consiste en colocar al roedor en forma individual en una caja de acrílico con doce cuadros (9 cm x 9 cm) marcados en el piso de la caja. Durante el experimento se registra por 2 min el número de cuadros explorados, con las cuatro extremidades de cada roedor (Martínez et al., 2006; Pérez-Ortega et al., 2008). La disminución en la actividad ambulatoria comparado con el grupo control es un indicativo de una respuesta sedante (Oliva et al., 2004; Balderas et al., 2008) (Figura 23). Figura 23. Actividad ambulatoria. 93 6.2.6.2 Modelo de tablero con orificios Este modelo mide la conducta exploradora utilizando una caja de acrílico (40 cm x 40 cm) con un piso de madera de 16 orificios distribuidos equivalentemente. Los ratonesson colocados sobre el tablero y observados para el conteo del número de veces que los animales introducen la cabeza en cada orificio de 3 cm de diámetro, en un periodo de 3 min (Clark et al., 1997; Aguirre-Hernández et al., 2007a) (Figura 24). La disminución en el número de eventos indica un efecto de tipo ansiolítico. Figura 24. Exploración en tablero con orificios. 6.2.6.3 Modelo de exploración en cilindro Este modelo fue descrito por Hiller y Zetler (1996). El sujeto experimental se coloca de manera individual dentro de un cilindro de vidrio (30 cm de altura, 11 cm de diámetro, con una pared de 33 mm) con piso abierto que permite colocar y retirar la base cada vez que se introduce un ratón. La prueba consta de un periodo de 5 minutos en el cual se cuentan el número de veces que el animal se coloca sobre sus extremidades posteriores apoyando las dos extremidades anteriores sobre la pared del cilindro (Figura 25). La disminución significativa de los levantamientos es indicativa de un efecto de tipo sedante. 94 Figura 25. Cilindro. 6.2.6.4 Modelo de cruz elevada El modelo es un aparato en forma de cruz con dos brazos abiertos y dos brazos cerrados (paredes de 30 cm de alto) opuestos de las mismas dimensiones (30 cm x 5 cm). Dichos brazos se extienden a partir de una plataforma central (5 cm x 5 cm) y se encuentran elevados del suelo (50 cm). El roedor se coloca de forma individual en la parte central y se registra durante 5 min la preferencia por los brazos abiertos o cerrados (File, 2001; Yu et al., 2007), el número de entradas a brazos abiertos o cerrados y el tiempo que pasan en cada brazo (Lister, 1987; Kumar et al., 2013) (Figura 26). El aumento en el tiempo que explora y la frecuencia de entradas a los brazos abiertos indica el efecto como ansiolítico (Rabbani et al., 2003). Figura 26. Exploración en el modelo de cruz elevada. 95 6.2.6.5 Evaluación de la interacción farmacológica Esta prueba consiste en administrar PBS en la dosis de 42 mg/kg (González- Trujano et al., 1998) a los roedores que han recibido (en este caso 60 min antes) las diferentes dosis de los tratamientos de prueba, para enseguida registrar la latencia a la incoordinación motora o fase de sedación, la latencia a la pérdida del reflejo del enderezamiento o fase de hipnosis y la duración de la hipnosis o tiempo desde que inicia la pérdida del reflejo de enderezamiento y su recuperación (López- Rubalcava et al., 2006). Se evaluaron los posibles efectos tipo ansiolítico y/o sedante de los estándares de flavonoides (naringenina, canferol, canferitrina, quercetina y rutina), cumarinas (escopoletina y esculetina) y el β–sitosterol en todos los modelos experimentales descritos. 6.2.7 Búsqueda de mecanismos de acción Para explorar el posible mecanismo de acción de los extractos de T. erecta y de T. lucida se utilizaron dos antagonistas: un antagonista GABAérgico, el flumazenil (10 mg/kg, i.p.), el cual bloquea el sitio a benzodiacepinas (GABAA/BDZ) y el otro para inhibir el receptor 5-HT1A de serotonina (WAY100635, 0.32 mg/kg) (Valverde et al., 1995; Cao y Rodgers, 1997; González-Trujano et al., 2015). Los antagonistas se administraron 15 min antes de la administración de los extractos, fracciones y del compuesto a evaluar. Sesenta min después de la última administración comenzaron las pruebas conductuales. 6.2.8 Análisis estadístico Los datos se expresan como la media ± error estándar de al menos 6 repeticiones. Se procesaron mediante análisis de varianza (ANADEVA) de una vía seguida de la prueba de Dunnett o Tukey para comparar los tratamientos contra el control o entre dosis, respectivamente. En el caso de que se compararon dos grupos se empleó la prueba de t-student. El programa Sigma Stat versión 3.5 se utilizó considerándose como efecto significativo una *P<0.005. 96 6.3 ANÁLISIS FITOQUÍMICO En el análisis fitoquímico se utilizaron métodos de cromatografía de capa fina, además de métodos analíticos para cuantificar algún componente activo de las plantas evaluadas etnobotánica y farmacológicamente. Se emplearon técnicas de resonancia magnética nuclear, espectometría de masas, impácto electrónico y cromatografía líquida de alta eficacia. 6.3.1 Cromatografía de capa fina Los extractos de T. erecta y T. lucida, fracciones y estándares de flavonoides (naringenina, canferol, canferitrina, quercetina y rutina), cumarinas (esculetina y escopoletina) y el β-sitosterol, se analizaron en cromatofolios de gel de sílice (Merck, 0.2mm espesor). Se cortaron tiras de 9 cm de largo, donde se aplicaron las muestras y se colocaron dentro de una cámara con la fase móvil, la cámara estaba saturada con vapores de la fase móvil. El sistema de elución para los estándares, extractos y fracciones fue dependiendo de la polaridad, para T. erecta fue de 3.5:1:0.5 cloroformo-acetona- ácido fórmico y para la T. lucida 1:1 hexano-acetato de etilo. Después de la elución la placa se secó a temperatura ambiente en una campana de extracción por 10 min y se observó en un gabinete con una lámpara de luz UV a 365 nm. Las placas fueron expuestas a diferentes reveladores, tales como solución de sulfato cérico al 1% en ácido sulfúrico 2N y anisaldehído para la identificación de la naturaleza de los constituyentes. 6.3.2 Resonancia Magnética Nuclear. 1H-RMN, 13C-RMN Esta técnica se basa en la interacción entre los espines de los núcleos de 1H y 13C sometidos a un campo magnético intenso, con la radiación electromagnética (ondas de radio). La disolución de los compuestos se hizo con disolventes deuterados, principalmente cloroformo CDCl3 a una concentración aproximada de 10 mg/ml para el 1H y de 30 mg/ml para el 13C. Los espectros se registraron a 300MHz en un equipo Bruker, Avance. 97 6.3.3 Espectrometría de Masas El espectro de masas manifiesta la abundancia relativa de los iones y fragmentos separados respecto a su relación de masa/carga. El más importante es el ión molecular M+ equivalente al peso molecular del compuesto analizado (Martín y Ballesteros, 2010). El peso molecular [M++H] de la metilfraxetina se determinó con un espectrómetro de masas Jeol, The AccuTOF JMS-T100LCMS, mediante la técnica DART (por sus siglas en inglés Direct Analysis in Real Time). La muestra se introdujo al equipo, la cual se ionizó y se obtuvo su ión molecular más hidrógeno (M++H) obteniendo su relación m/z (masa/carga). Se utilizó además la técnica de ionización por impacto electrónico en un equipo Jeol Ax505 HA. 6.3.4 Cromatografía líquida de alta eficacia La cromatografía líquida se llevó a cabo con el equipo Acquity UHPLC® H (cromatografía líquida de alta eficacia, por sus siglas en inglés Ultra High Performance Liquid Cromatography) de la marca Waters, el cual está acoplado a un detector PDA eλ controlado por el software EmPower® 3; la columna fue Symmetry C18 100Å (150 mm x 4.6 mm, 5μm) marca Waters (Irlanda). La temperatura de la columna fue de 43°C, la fase móvil consistió en agua acidificada al 0.1% de ácido fosfórico (A) y metanol (B) grado HPLC. El gradiente inicial de elución fue A: 80% y B: 20% para alcanzar B: 100% (17 min). Las condiciones iniciales se reprodujeron durante 1 min (A: 80% B: 20%). El flujo de la fase móvil fue de 1.0 mL/min con una curva de elución de 6. Las muestras (extracto, fracciones, mezcla de cumarinas y la 6, 7, 8- trimetoxicumarina) fueron disueltas en metanol y preparadas a una concentración de 1mg/mL. Todas las muestras fueron filtradas con acrodiscos de 0.2 mm (GHP, Waters), de cada filtrado se tomaron 10 μL para inyectarse al UPLC. Las longitudes de onda máxima de ultravioleta (UVλmax) para la identificación de compuestos fueronde 347 y 280 nm. 98 7. RESULTADOS 7.1 ESTUDIO ETNOBOTÁNICO Para ser curanderos las personas entrevistadas tuvieron una forma de aprendizaje parcialmente por medio de la enseñanza en casa. Los saberes les fueron transmitidos de generación en generación por los adultos mayores de la familia, como los abuelos, tíos o padres, quienes los llevaban desde niños a los lugares donde se llevaban a cabo las actividades diarias en el campo, el huerto o dónde atendían a los pacientes. En otros casos, el aprendizaje se dió a partir de que los ahora médicos tradicionales presentaron alguna enfermedad y los médicos tradicionales con los que se curaron les comentaron que debían dedicarse a esta actividad pues les “vieron” cualidades, de lo contrario volverían a enfermar. De esta manera, los médicos tradicionales iniciaron su entrenamiento con alguna especialidad (masaje tradicional, temazcalli, herbolaria, etcétera), según las habilidades que traían de nacimiento. Algunos otros adquirieron la actividad de curación mediante el llamado “don”. Por ejemplo, el Sr. Aurelio Ramírez Cázarez obtuvo sus cualidades de curandero a partir de que le cayó un rayo, y al sobrevivir, esta acción le dió las habilidades de detectar y aliviar enfermedades tanto comunes (resfriados, dolores de estómago), como enfermedades de filiación cultural mediante la limpia con huevo, el empleo de plantas medicinales y el uso de la temazcalli. La partera María de la Paz Puebla Alvear comentó que a los diez años “sin tener la intención atendí por primera vez un parto en la calle y supe que ese era mi destino por cumplir”. Además de utilizar la Tagetes erecta y la T. lucida para tratar “los nervios” los curanderos emplean otras especies ya sea solas o mezcladas, secas o frescas como el arrayán, los azahares de distintos cítricos, el chicalote, la contrayerba, la damiana, el eneldo, la flor de manita, el guaco, la guanasana, las hojas de guayaba, el jícuri, el muicle, el laurel, la pasiflora, la prodigiosa, la tila, el tumbavaquero, la valeriana y el zapote blanco. Indicaron que “los nervios” es un desequilibrio entre las emociones el cual era causado por un susto, por las contradicciones entre el sentimiento y el hacer, o 99 por las preocupaciones de la vida diaria. Ellos adquieren las plantas ya sea cultivándolas en sus jardines o de la recolecta del campo. Generalmente recetaban consumir las plantas en infusiones o microdosis (extractos de plantas hidroalcohólicos diluídos en agua), en algunos casos en pomadas. Las personas que atendían eran hombres y mujeres por igual, aunque creen que “los nervios” afectan más a las mujeres. Mencionaron además, que los niños padecían com de “los nervios”. En general los vendedores de plantas dijeron que eran empleados a los cuales primero los entrenaban en el conocimiento e identificación de las especies y de los padecimientos que tratan. En algunos casos los dueños eran los propios encargados de los puestos de venta, quienes habían aprendido de sus padres o de algún otro negocio, incluso habían ido a cursos en Chapingo y en otros casos recetaban a partir de la literatura que han consultado. El espacio de venta en los mercados fijos estaba dividido en tres partes, uno donde tenían las plantas secas, en otro estaban las frescas y otro donde vendían artículos esotéricos, velas, figuras de porcelana, amuletos, etcétera. En el caso de los mercados ambulantes solo vendían plantas secas, frescas y en ocasiones productos elaborados de plantas medicinales, algunos etiquetados de fábricas, otros elaborados por ellos mismos. Los comerciantes mencionaron que “los nervios” son causados por el estrés, el cansancio, el exceso de trabajo, las preocupaciones, los problemas en casa o trabajo, los miedos o por un susto. Las plantas que recetan son los azahares, la damiana de California, la flor de manita, la flor de tilia, el floripondio, la hoja santa, las hojas de zapote blanco, el jazmín, la lechuga, la lavanda, la magnolia, la manzanilla, el neem, el eneldo o hinojo, el palo de Brasil, la pasiflora, el toloache, el toronjil blanco y el azul, el tumbavaquero, la valeriana, el xoloxochitl y el zompantle. Los comerciantes adquirían las plantas medicinales para tratar la ansiedad del Estado de México, Puebla, Guerrero, la Ciudad de México (mercado de Sonora o pasaje Catedral) y de algunas regiones de Morelos como Tetela del Volcán, Cuautla o Totolapan. Los precios a venta de las plantas para “los nervios” en 100 general eran desde los diez pesos para el hinojo hasta los $40.00 mn para la flor de manita o la magnolia. Los vendedores recomendaban consumirlas mejor frescas, pero hay plantas que no hay todo el año. Dependiendo de la época de floración (como es el caso del cempasúchil y el pericón), las secan colgadas o extendidas a la sombra y posteriormente las guardan en bolsas de plástico, lo cual incrementa el precio de venta en relación a la cantidad. Las personas que les compraban plantas para “los nervios” eran hombres y mujeres por igual. 7.1.1 Reportes de uso de Tagetes erecta Los curanderos comentaron que el cempasúchil era una planta sagrada, pues se utiliza en rituales culturalmente significativos como el Día de Muertos y en ofrendas de agradecimiento o de petición (Figura 27). El cempasúchil se considera de naturaleza caliente, esto determinado por su color (como del color del sol) y olor. Su uso es principalmente para tratar afecciones del aparato digestivo, infecciones asociadas a parásitos o a causa de un síndrome de filiación cultural como el empacho, provocado por un susto (enfermedad que se vincula con síntomas de la ansiedad o “los nervios”). La parte que se consume es toda la parte aérea. En el Estado de Morelos, esta especie es empleada para quitar “la frialdad” o durante el puerperio para restablecer el calor en el cuerpo mediante baños de asiento o en temazcalli, siempre y cuando la persona no tenga hipertensión. Mencionaron que la forma de empleo es tópica mediante pomadas, en baños de asiento (la parte aérea) y temazcalli. Se consume la planta oralmente en infusiones y tinturas (las flores). Para los problemas digestivos también se consume en forma de jarabe toda la parte aérea junto con otras especies como el estafiate (Artemisia ludoviciana). Un uso menor es para tratar afecciones del SNC; únicamente los pétalos de la flor se mezclan con otras especies en preparados con tila (Ternstroemia sylvatica), flores de los azahares (Citrus sp.) y flor de manita (Chiranthodendron pentadactylon) (Figura 28). 101 Figura 27. Imágenes de algunos usos del cempasúchil en el Estado de Morelos. Figura 28. Usos del cempasúchil comentados por los curanderos. En el recuadro se señalan los usos relacionados al SNC. 102 Los comerciantes le adjudican al cempasúchil diversos usos. El empleo más citado fue para contrarrestar padecimientos del aparato digestivo, utilizando toda la parte aérea, seguido del padecimiento de “los nervios” (la venta es mezclada con otras especies, como comentaron los curanderos), se usa contra la tos, como antiséptico, antidepresivo y contra la histeria (Figura 29). También es alimenticio para los animales. En diversos rituales se emplean únicamente los pétalos de la flor, como para sahumar las casas y alejar los malos espíritus; se utilizan mezclado con eucalipto (Eucalyptus sp.), azúcar, pericón (Tagetes lucida), cáscara de ajo (Allium sativum), canela (Cinnamomum sp.) y copal (Bursera sp.). La venta por manojo fresco en las festividades del Día de Muertos, los primeros días de noviembre de cada año, es de $15.00 mn. En esa temporada los comerciantes compran toda la parte aérea y lo secan a la sombra, le quitan el tallo y las hojas y embolsan la flor para su venta cuando no es temporada. La venta de la flor sola y mezclada es a partirde $20.00 mn. Figura 29. Usos del cempasúchil comentados por comerciantes de plantas medicinales. En los recuadros se señalan los usos relacionados al SNC. Dolor de estómago 19% “Los nervios" 18% Industrial 9% Ritual 9% Alimenticio 9% Tos 9% Histeria 9% Depresión 9% Antiséptico 9% Comerciantes 103 7.1.2 Reportes de uso de Tagetes lucida Los curanderos de Morelos comentaron que es una planta sagrada, se utiliza en rituales de protección contra el diablo en septiembre, el día 29, que se celebra al arcángel San Miguel. Además ésta planta se utiliza para recoger los primeros elotes que darán paso al maíz. En Morelos, la población en general coloca cruces equidistantes de la parte aérea de la planta y se colocan en las puertas y ventanas de las casas, las esquinas de las milpas, los negocios e incluso en las defensas los automóviles. Además se emplea para adornar figuras religiosas como cruces o decorar las iglesias. Las cruces son reemplazadas cada año por nuevas. Los curanderos señalan que es una planta de naturaleza caliente, de uso delicado, se emplea toda la parte aérea. Utilizan el pericón principalmente para tratar afecciones relativas a “los nervios”, seguido de la frialdad en enuresis de los niños o durante el puerperio, contra la tristeza, reumas y los flujos vaginales. La forma de uso es en baños de asiento, dentro del temazcal, en limpias, pomadas, tinturas e infusiones. En el caso de las infusiones para adultos es 1 pizca por taza de té o infusión cada cuatro horas, y de la tintura veinte gotas cada cuatro horas en poca agua durante siete días (Figura 30 y 31). Figura 30. Imágenes de algunos usos del pericón en el Estado de Morelos. 104 Figura 31. Usos del pericón comentados por los médicos tradicionales. En el recuadro se señalan los usos relacionados al SNC. En las entrevistas con los vendedores fue notoria la venta de las cruces de pericón fresco (a veces acompañado con otras flores al centro de la cruz) afuera de los mercados, en las calles y las carreteras. En general son familias enteras que se encargan de la venta de las mismas durante dos o tres días de septiembre. Otros vendedores que además venden calabazas (Cucurbita sp.), flores de calabaza, guajes (Leucaena sp.), y chiles (Capsicum sp.) de sus propios huertos, en estos días que venden las cruces o los ramos. Las cruces en comunidades más cercanas al campo se venden desde $5.00 mn. En las ciudades los precios van desde $10.00 hasta $20.00 mn dependiendo el tamaño y adorno. El pericón adicionalmente se vende con fines rituales (para sahumar casas y personas, para quitarle los malos espíritus y el susto), además como insecticida para alejar los mosquitos del dengue (se quema). El pericón que se vende con fines medicinales es adquirido por los dueños o vendedores de plantas medicinales en fresco o se recolecta en los campos, en lugares donde el agua se encharca. Se pone a secar colgado en manojos o extendido sobre papel o periódico, en un lugar dónde no le da el sol y está 105 ventilado, muchas veces en los mismos locales en los que trabajan. Una vez seco lo trozan y embolsan para tener durante todo el año. Su venta es como antiinflamatorio, contra el dolor de estómago, la frialdad, reumas (Figura 32). Los comerciantes lo recomiendan en té y para hacer tinturas, utilizando toda la parte aérea. La venta del pericón seco embolsado fue desde $20.00 mn para aproximadamente 30 g. Figura 32. Usos del pericón comentados por los comerciantes de plantas medicinales. En los recuadros se señalan los usos relacionados al SNC. 7.2 ESTUDIO FARMACOLÓGICO 7.2.1 Rendimiento de los extractos El rendimiento de los extractos, las fracciones y del compuesto aislado de T. erecta y T. lucida se indican en la tabla 19. En cada caso se encontró el rendimiento más alto para los extractos etanólicos en comparación con los acuosos. Para ambas especies la fracción del extracto que tuvo mayor rendimiento fue la de acetato de etilo. 106 Tabla 19. Rendimiento de los extractos, fracciones y mezcla de compuestos de T. erecta y T. lucida Extracto o fracciones Planta seca o extracto (g) Peso obtenido (g) Rendimiento (%) Tagetes erecta Etanólico (EtOH) 80 10.65 13.31 Acuoso 39 5.61 14.39 Hexano (Hex) 1 g del extracto EtOH 0.02 2 Fracciones Acetato de etilo (AcOEt) 1 g del extracto EtOH 0.41 41 Metanol (MeOH) 1 g del extracto EtOH 0.39 39 Tagetes lucida EtOH 158 14.34 9.07 Acuoso 218.8 8.94 4.08 Fracciones Hex 11 g del extracto EtOH 0.12 1.09 AcOEt 11 g del extracto EtOH 6.84 62.18 MeOH 11 g del extracto EtOH 3.26 29.61 Mezcla (Hex:AcOEt; 1:1) 4.67 de la fracción de AcOEt 1 21.41 7.2.2 Determinación de la toxicidad Las dosis administradas consideraron lo descrito por el método de Lorke, el cual fue modificado de acuerdo a las nuevas normas de toxicidad. Para T. erecta mostraron una DL50 mayor para el extracto orgánico que el acuoso, a diferencia de T. lucida en que el extracto acuoso presentó una dosis mayor en comparación con el orgánico (Tabla 20). 107 Tabla 20. Dosis letal aguda de los extractos orgánicos y acuosos de T. erecta y T. lucida 7.2.3 Evaluación del efecto tipo ansiolítico-sedante de Tagetes erecta A continuación se presentan los diferentes gráficos en los cuales se describe el efecto tipo ansiolítico-sedante de los extractos de T. erecta, tanto acuoso (10, 30 y 100 mg/kg) como orgánico (EtOH, 10, 30, 100, 300 mg/kg) y sus fracciones de AcOEt (10, 30, 100 mg/kg) y de EtOH (3, 10, 30, 100 mg/kg) obtenidas por percolación del extracto crudo EtOH en comparación con el grupo control y el fármaco de referencia DZP (1 mg/kg). Como se observa, la actividad ambuladora de los ratones disminuyó significativamente en el modelo de campo abierto en todos los tratamientos y en todas las dosis probadas, excepto en el extracto crudo EtOH que fue significativo solo en la dosis de 300 mg/kg (Figura 33A). Este efecto se asoció con la disminución significativa de las exploraciones de los ratones en el modelo de tablero con orificios en todos los casos (Figura 33B). En el modelo del cilindro, la disminución significativa en dicha actividad se observó a partir de las dosis de 30 y 100 mg/kg, y de 300 mg/kg para el extracto EtOH crudo (Figura 33C). Los experimentos apoyan un efecto ansiolítico-sedante de los extractos. Especie DL50 (mg/kg) hembras Tagetes erecta Extracto orgánico (EtOH) >2000 Extracto acuoso 707 Tagetes lucida Extracto orgánico (EtOH) 707 Extracto acuoso 2000 108 Figura 33. Efecto tipo ansiolítico-sedante de Tagetes erecta comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) campo abierto; B) tablero con orificios; C) cilindro y D) cruz elevada. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza seguida de la prueba de Dunnett. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 109 Figura 33. Efecto tipo ansiolítico-sedante de Tagetes erecta comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) campo abierto; B) tablero con orificios; C) cilindro y D) cruz elevada. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza seguida de la prueba de Dunnet. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. El efecto ansiolítico se corroboró con un aumento significativo en la exploración de los ratones en los brazos abiertos en el modelo de cruz elevada con todos los tratamientos evaluados (Figura 33D). El efecto ansiolítico-sedante de los extractos y fracciones fue similar al observado con el fármacode referencia (Figura 33A-33D). Las combinaciones del sedante-hipnótico PBS y los tratamientos aumentaron la duración de sueño inducido con este fármaco depresor del SNC (Figura 34C), donde una facilitación del inicio de la sedación y la hipnosis se observó con la dosis de 30 mg/kg del extracto crudo EtOH (Figura 34A y 34B). Sólo con diazepam se obtuvo un inicio más rápido de la sedación (Figura 34A) y la hipnosis se inició más temprano con la dosis de 100 mg/kg del extracto acuoso (Figura 34B). 110 Figura 34. Interacción farmacológica de Tagetes erecta con PBS comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) latencia a la sedación; B) latencia a la hipnosis y C) duración de la hipnosis. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 0 3 6 L a te n c ia ( m in ) dosis (mg/kg, i.p.) B & & acuoso EtOH fracción AcOEt fracción EtOH 0 1 2 L a te n c ia ( m in ) dosis (mg/kg, i.p.) acuoso EtOH & A fracción AcOEt fracción EtOH & 111 Figura 34. Interacción farmacológica de Tagetes erecta con PBS comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) latencia a la sedación; B) latencia a la hipnosis y C) duración de la hipnosis. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 7.2.4 Evaluación del efecto tipo ansiolítico-sedante de Tagetes lucida En el caso de T. lucida, la actividad ambuladora de los ratones tratados con los extractos crudos acuoso (10, 30 y 100 mg/kg) y EtOH (300 mg/kg), la fracción de AcOEt (30 y 100 mg/kg) y una mezcla de cumarinas (3 y 10 mg/kg) se redujo significativamente en el modelo de campo abierto (35A) y en el tablero con orificios (35B), donde además la dosis de 100 mg/kg del extracto crudo EtOH también presentó diferencia significativa en comparación con el control (Figura 35B). El efecto de tipo sedante se corroboró además con la respuesta observada en el modelo de cilindro donde todas las dosis disminuyeron significativamente el número de levantamientos, excepto la fracción AcOEt (100 mg/kg) (Figura 35C). El efecto ansiolítico se reforzó con la respuesta significativa de exploración en los brazos abiertos en el modelo de la cruz e levada con todas las dosis a excepción 0 35 70 D u ra c ió n ( m in ) dosis (mg/kg, i.p.) fracción EtOH fracción AcOEt EtOHacuoso C * *** *& & ** * * * * * * 112 de las dosis de 100 mg/kg y 30 mg/kg para el extracto EtOH crudo y la fracción de AcOEt, respectivamente (Figura 35D). Figura 35. Efecto tipo ansiolítico-sedante de Tagetes lucida comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) campo abierto; B) tablero con orificios; C) cilindro y D) cruz elevada. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 113 Figura 35. Efecto tipo ansiolítico-sedante de Tagetes lucida comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) campo abierto; B) tablero con orificios; C) cilindro y D) cruz elevada. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 114 Al evaluar la interacción con PBS, el inicio de la sedación se facilitó con el extracto acuoso (10 mg/kg), EtOH (300 mg/kg) y la mezcla de cumarinas (10 mg/kg) (Figura 36A). En lo que respecta al inicio de la hipnosis, sólo hubo significancia con el extracto acuoso (30 mg/kg) y la mezcla de cumarinas (10 mg/kg) (Figura 36B). Finalmente, la duración de la hipnosis se incrementó significativamente en todos los tratamientos y dosis evaluadas (Figura 36C). Estos resultados fueron similares a los observados con el fármaco de referencia que facilitó el inicio de la sedación y aumento la duración de la hipnosis (Fig. 36A-36C). Figura 36. Interacción farmacológica de Tagetes lucida con PBS comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) latencia a la sedación; B) latencia a la hipnosis y C) duración de la hipnosis. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 115 Figura 36. Interacción farmacológica de Tagetes lucida con PBS comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) latencia a la sedación; B) latencia a la hipnosis y C) duración de la hipnosis. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. B 4 I ro "g ~ 2 Q) E 1ií- --' O ,,0 " "C> , e:" "" ~' 1i<'If ~Qj ~e '&tb- e 100 * ro ü- e .~ 50 2 E ro- --' I ,l, & rr, T 'OC> c>C> " c>C> "C> " ~ EtOH acuoso dosis (mg/kg, i.p. ) * 1 * * * & T T T T acuoso EtOH I I 'OC> c>C> " fracción AcOEt * & T T 'OC> "c>C> fracción AcOEt dosis (mg/kg, i.p.) rr, * I " "C> mezcla * * T T mezcla 116 7.2.5 Evaluación del efecto tipo ansiolítico-sedante de los fármacos individuales Como se muestra más adelante se identificaron compuestos de tipo flavonoide y cumarínico en los extractos acuosos y EtOH. Por esto se evaluaron de manera individual los efectos ansiolítico-sedantes de canferol y quercetina a la dosis de 3 mg/kg y naringenina, canferitrina y rutina en la dosis de 10 mg/kg (Figura 37A-37D). Todos estos flavonoides redujeron significativamente la actividad exploradora de los ratones en el campo abierto (Figura 37A) y tablero con orificios (37B). Pero, la naringenina y quercetina no produjeron disminución en la exploración del cilindro en comparación con el control y los otros flavonoides (Figura 37C). Ninguno de los flavonoides presentó actividad ansiolítica en el modelo de cruz elevada como se observó con el fármaco de referencia (Figura 37D). Figura 37. Efecto tipo ansiolítico-sedante de algunos flavonoides comparados con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) campo abierto; B) tablero con orificios; C) cilindro y D) cruz elevada. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 0 40 80 A ct iv id ad a m b u la to ri a (e v en to s/ 2 m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * * ** ** A 117 Figura 37. Efecto tipo ansiolítico-sedante de los flavonoides comparados con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) campo abierto; B) tablero con orificios; C) cilindro y D) cruz elevada. Los datos se representan como el promedio± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 0 40 80 A ct iv id ad e x p lo ra to ri a (n o . d e o ri fi ci o s/ 3 m in ) dosis (mg/kg, i.p.) ** ** * * B 0 15 30 A ct iv id ad e x p lo ra to ri a (n o . d e le v an ta m ie n to s/ 5 m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * * * C & 0 80 160 T ie m p o e n b ra zo s ab ie rt o s (m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * D 118 En la evaluación de la interacción con PBS, sólo la duración de la hipnosis se incrementó significativamente en el tratamiento con naringenina y rutina a la dosis de 10 mg/kg. Los resultados fueron similares a los observados con el fármaco de referencia (Figura 38A-38C). Figura 38. Interacción farmacológica con PBS de algunos flavonoides comparados con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) latencia a la sedación; B) latencia a la hipnosis y C) duración de la hipnosis. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 0 1 2 L at en ci a (m in ) dosis (mg/kg, i.p.) A 0 2 4 L a te n c ia (m in ) dosis (mg/kg, i.p.) B 119 Figura 38. Interacción farmacológica con PBS de algunos flavonoides comparados con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) latencia a la sedación; B) latencia a la hipnosis y C) duración de la hipnosis. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. La mezcla de cumarinas (3 y 10 mg/kg), la escopoletina (10 mg/kg) y la esculetina (10 mg/kg) (cumarinas de referencia) redujeron significativamente la exploración de los ratones en los modelos de campo abierto (Figura 39A), el tablero con orificios (Figura 39B) y el cilindro de exploración (Figura 39C). Las cumarinas de referencia no aumentaron el tiempo en brazos abiertos en el modelo de cruz elevada como la mezcla de cumarinas y la cumarina identificada como escoparona (3 mg/kg) (Figura 39D). 0 40 80 D u ra ci ó n ( m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * * * C 120 Figura 39. Efecto tipo ansiolítico-sedante de algunas cumarinas comparadas con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) campo abierto; B) tablero con orificios; C) cilindro y D) cruz elevada. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 0 40 80 A ct iv id ad a m b u la to ri a (e v en to s/ 2 m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * A * * * * * 0 40 80 A ct iv id ad e x p lo ra to ri a (n o . d e o ri fi ci o s/ 3 m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * * * * B * * 0 15 30 A ct iv id ad e x p lo ra to ri a (n o . d e le v an ta m ie n to s/ 5 m in ) dosis (mg/kg, i.p.) *** C * * * 121 Figura 39. Efecto tipo ansiolítico-sedante de algunas cumarinas comparadas con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) campo abierto; B) tablero con orificios; C) cilindro y D) cruz elevada. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. En referencia a la interacción farmacológica, la mezcla (10 mg/kg) facilitó el inicio de la sedación y la hipnosis (Figuras 40A y 40B) y la escoparona (3 mg/kg) sólo la sedación (Figura 40A). La duración de la hipnosis aumentó significativamente con todos los compuestos probados (Figura 40C). Figura 40. Interacción farmacológica con PBS de algunas cumarinas comparados con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) latencia a la sedación; B) latencia a la hipnosis y C) duración de la hipnosis. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 0 80 160 T ie m p o e n b ra zo s ab ie rt o s (s eg ) dosis (mg/kg, i.p.) * * * * D 0 1 2 L at en ci a (m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * A * * 122 Figura 40. Interacción farmacológica con PBS de algunas cumarinas comparados con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) latencia a la sedación; B) latencia a la hipnosis y C) duración de la hipnosis. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 0 2 4 L at en ci a (m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * B 0 35 70 D u ra ci ó n ( m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * * * * ** C 123 El β–sitosterol (10 mg/kg), que se ha reportado en ambas especies y que fue identificado en las placas del extracto acuoso de T. lucida, produjo respuesta significativa en comparación con el grupo vehículo en todos los modelos de exploración evaluados (Figuras 41A-41D) con excepción del modelo de cilindro (Figura 41C). Figura 41. Efecto tipo ansiolítico-sedante del β–sitosterol comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) campo abierto; B) tablero con orificios; C) cilindro y D) cruz elevada. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 0 40 80 vehículo diazepam 1 β-sitosterol 10 A c ti v id a d e x p lo ra to ri a (n o . d e o ri fi c io s / 3 m in ) ** B dosis (mg/kg, i.p.) 0 40 80 vehículo diazepam 1 β-sitosterol 10 A c ti v id a d a m b u la to ri a (e v e n to s / 2 m in ) * * dosis (mg/kg, i.p.) A 124 Figura 41. Efecto tipo ansiolítico-sedante del β–sitosterol comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) campo abierto; B) tablero con orificios; C) cilindro y D) cruz elevada. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. La interacción farmacológica con éste terpeno facilitó el inicio de la sedación (Figura 42A) e hipnosis (Figura 42B) y aumentó la duración del sueño inducido con PBS (Figura 42C). 0 25 50 vehículo diazepam 1 β-sitosterol10 A c ti v id a d e x p lo ra to ri a (n o . d e l e v a n ta m ie n to s / 5 m in ) C & dosis (mg/kg, vía i.p.) 0 200 400 vehículo diazepam 1 β-sitosterol 10T ie m p o e n b ra z o s a b ie rt o s (s e g ) dosis (mg/kg, i.p.) * * D 125 Figura 42. Interacción farmacológica con PBS del β–sitosterol comparado con un grupo control y el fármaco de referencia diazepam en el modelo de A) latencia a la sedación; B) latencia a la hipnosis y C) duración de la hipnosis. Los datos se representan como el promedio ± error estándar. *Análisis de varianza (ANADEVA) seguida de la prueba de Dunnett. &T de Student en la comparación de 2 grupos. Se consideró un P<0.005 como significativo para una n de al menos 6 sujetos experimentales. 7.2.6 Mecanismos de acción de Tagetes erecta y Tagetes lucida Se observó que el efecto como ansiolítico-sedante del extracto acuoso de T. erecta se inhibió significativamente en la presencia del antagonista de los receptores 5- HT1A (WAY 1006355, 0.32 mg/kg) y no en la presencia del antagonista de benzodiacepinas (BDZ), el flumazenil (10 mg/kg) (Figura 43A y 43B). 0 1 2 vehículo diazepam 1 β-sitosterol 10 L a te n c ia ( m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * * A 0 2 4 vehículo diazepam 1 β-sitosterol 10 L a te n c ia ( m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * B 0 35 70 vehículo diazepam 1 β-sitosterol 10 D u ra c ió n (m in ) dosis (mg/kg, i.p.) * & C 126 Figura 43. Búsqueda del mecanismo de acción de Tagetes erecta, en el modelo de tablero con orificios. A) Antagonista del receptor 5-HT1A, WAY 1006355 y B) Antagonista de BDZ, flumazenil. El efecto de T. lucida y la mezcla de cumarinas se inhibió en la presencia de ambos antagonistas (Figura 44A y 44B). Estos resultados nos indican posibles mecanismos de acción. Figura 44. Búsqueda del mecanismo de acción de Tagetes lucida, en el modelo de tablero con orificios. A) Antagonista del receptor 5-HT1A, WAY 1006355 y B) Antagonista de BDZ, flumazenil. 127 7.3 ESTUDIO FITOQUÍMICO 7.3.1 Cromatografía de capa fina Los resultados de la cromatografía de capa fina del extracto acuoso y el EtOH de T. erecta mostraron manchas de color amarillo y blanco después de la aplicación del revelador de productos naturales semejantes a las de los estándares de canferol y quercetina, o de tonos púrpuras para el beta-sitosterol con el revelador de anisaldehído (terpenos). El perfil de manchas que se observó para los extractos de T. lucida son principalmente de tipo cumarina (Figura 45A). Ambos extractos EtOH de T. erecta y de T. lucida comprueban la presencia de β-sitosterol (Figura 45B). La cromatografía de capa fina con los estándares de las cumarinas escopoletina y esculetina muestra la presencia de este tipo de compuestos en el extracto orgánico y la fracción obtenida del extracto de T. erecta (Figura 45C), así como principalmente en T. lucida (Figura 45D). Figura 45. Cromatografía de capa fina A), B) Tagetes erecta y C), D) Tagetes lucida. 1) Extracto acuoso; 2) Extracto etanólico; 3) Fracción de AcOEt; 4) Fracción de EtOH; 5) Canferol; 6) Canferitrina; 7) Quercetina; 8) Luteolina; 9) Naringenina; 10) β–sitosterol. 1 2 3 4 10 110 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 B) ) A A) 128 Figura 45. Cromatografía de capa fina A), B) Tagetes erecta y C), D) Tagetes lucida. 1a) Extracto etanólico; 2a) Fracción de AcOEt; 3a) Mezcla de cumarinas; 4a) Canferitrina; 5a) Canferol; 6a) Escopoletina; 7a) Esculetina; 8a) β–sitosterol. 1a 2a 3a 4a 5a 6 a 7a C A D) 1a 2a 3a 8a 129 7.3.2 Resonancia Magnética Nuclear 1H-RMN, 13C-RMN y espectrometría de masas De la mezcla aislada del extracto etanólico de T. lucida se separaron tres compuestos. Dos identificados como la 6, 7, 8-trimetoxicumarina (dimetilfraxetina) (Figuras 46-48) y 6, 7-dimetoxicumarina (escoparona) (Figuras 49-51). El tercer compuesto no se identificó, pero tuvo el TR de 8.5 min (Figura 52). El espectro de 1H-RMN de la 6, 7, 8 trimetoxicumarina mostró tres señales singuletes (s) con un desplazamiento químico (δ) de 3.88, 3.98 y 4.03 ppm, que corresponden a los hidrógenos de grupos metoxilo unidos a los C6, C7 y C8, respectivamente; las señales de 6.32 y 7.58 ppm son dobletes (d) que conciernen a los hidrógenos unidos a los C3 y C4, respectivamente con un acoplamiento (J) J= 9 Hz. Finalmente, se manifestó una señal singulete (s) para el H unido al C5 en 6.65 ppm (Figura 46, Tabla 21). El espectro de 13C mostró señales para una cumarina, en donde la señal de 160.44 ppm corresponde a un grupo cetona en el C2, 115.25 ppm para el C3, 143.13 ppm para el C4, 114.35 ppm para el C4a, 150.16 ppm para el C5, 103.8 ppm para el C6, 146.04 ppm para el C7, 141.25 ppm para el C8 y 143.39 ppm para C8a. Finalmente, las señales correspondientes a los grupos metoxilos se encuentran en 56.38 (OCH3-C6), 61.52 (OCH3- C7) y 61.84 (OCH3-C8) ppm, respectivamente, indicando que la molécula se encuentra trisustituida. Este conjunto de señales nos indican el esqueleto de una cumarina (Figura 47, Tabla 21). En el espectro de masas (DART), se observa una señal a 237 relación masa carga (m/z) que corresponde a [C12H12O5]+ (M+H) para obtener el peso molecular de 236. Con base, a los resultados espectroscópicos y espectrométricos, se determinó que la estructura corresponde a la 6, 7 ,8-trimetoxicumarina o dimetilfratexina (Figura 48). 130 Figura 46. Espectro del hidrógeno de la dimetilfraxetina (6, 7, 8-trimetoxicumarina). '" UHAM, INSITlVTO DE QUIHICA"Ip¡) I)r. ~ ~ I JIrnoefw _ Q;we: lOe<icOn I _men IlIGog.¡OO- I ldy XIO MH" v.,<teon ( O) 6- 11-201" NO. Reg. 2231 , 5 7.' 7.' 6.' MeO MeO .. ,., ".0 ",.2;.~ , .. H H S • 6-9" .. ~ H , 7~ .. O , O OMe i ~ ••• ' .0 oO., 131 Figura 47. Espectro del carbono de la dimetilfraxetina (6, 7, 8-trimetoxicumarina). ~ UHNoI. IIIS'TrTUlO DI QU"~ 00. ___ , __ 00...: _1 011 ."._ <DO) a._u lIIOIqP - - --. (11) "U~I· _-.. W7 u i ". u- u ... -u • • - -~ • • O .;U , ' •• O O • • • • H H 6 )"""t/~ I : H .. O/ ~ 132 Figura 48. Espectro de masas de dimetilfraxetina (6, 7, 8-trimetoxicumarina). eopeo~ Tillo: · Cr.ation PBram.lert: Avet1IQ&(MSiI J TIme:G.22..O-21) Commant: Or RlyQ RIc:wl.!D Xl 03 loIalllit)' (8770001 ·· 237.Q588 ". ". "" "" Aeq. Olla. Narne : 3182l'lIriaIn l MeO H S 6~ OMe H 4 4a ~ O 3 2 H o 47H1966 490.1183 133 Tabla 21. Datos de los espectros de RMN 1H y 13C para la 6, 7, 8-trimetoxicumarina (dimetilfraxetina) Carbón δH(J) δC 2 160.44 3 6.32 d (9) 115.25 4 7.58 d (9) 143.13 4a 114.35 5 6.65 s 150.16 6 103.8 7 146.04 8 141.25 8a 143.39 OMe-C6 4.03 s 56.38 OMe-C7 3.98 s 61.52 OMe-C8 3.88 s 61.84 (300 MHz/ CDCl3) El espectro de 1H-RMN de la 6, 7 dimetoxicumarina mostró dos señales singuletes (s) con un desplazamiento químico (δ) de 3.925 y 3.951 ppm, que corresponden a los hidrógenos de grupos metoxilo unidos a los carbonos C6 y C7, respectivamente; las señales de 6.28 y 7.638 ppm son dobletes (d) que representan a los hidrógenos unidos a los carbonos C3 y C4, respectivamente con un acoplamiento (J) J=9.6 Hz. Finalmente se manifestaron dos señales singuletes (s) paralos hidrógenos unidos al C5 y C8 en 6.831 y 6.871 ppm (Figura 49, Tabla 22). El espectro de 13C mostró señales para una cumarina, en donde la señal 161.43 ppm corresponde a un grupo cetona en el C2, 113.57 ppm para el C3, 146.491 ppm para el C4, 111.54 ppm para el C4a, 108.14 ppm para el C5, 143.400 ppm para el C6, 152.918 ppm para el C7, 104.95 ppm para el C8 y 150.663 ppm para el C8a. Finalmente, las señales de los grupos metoxilos se encuentran en 56.527 ppm (OCH3-C6 y OCH3-C7) indicando que la molécula se encuentra disustituida. Este conjunto de señales nos indican el esqueleto de una cumarina (Figura 50, Tabla 22). 134 En el espectro de masas (IE), se observa una señal a 206 relaciones masa carga (m/z) que corresponde a la fórmula mínima C11H10O4. Con base a los resultados espectroscópicos y espectrométricos, se determinó que la estructura corresponde a la 6, 7 –dimetoxicumarina o escoparona (Figura 51). Tabla 22. Datos de los espectros de RMN 1H y 13C para la 6, 7-dimetoxicumarina (escoparona) Carbón δH (J) δC 2 161.43 3 6.28 d (9.6) 113.57 4 7.638 d (9.6) 146.491 4a 111.54 5 6.831 s 108.14 6 143.400 7 152.918 8 6.871 s 104.95 8a 150.663 6-OMe 3.925 s 56.527 7-OMe 3.951 s 56.527 1H 200 MHz/ CDCl3 13C 60 MHz /CDCl3 7.3.3 Identificación de las cumarinas y perfil cromatográfico en UPLC Los cromatogramas de T. lucida de los extractos acuosos y etanólicos y la mezcla de cumarinas (referencia página 84) se muestra en la Figura 52. Tenían tiempos de retención 7.2, 8.1 y 8.5. El pico 7.1 corresponde a la escoparona y el 8.1 a la dimetilfraxetina. Los cromatogramas de T. erecta del extracto acuoso y EtOH muestran tres picos (Figura 49A y 49B). Éstos posiblemente representan a componentes cumarínicos presentes en ambos extractos, aún no elucidados. Con TR de 5.9, 7.0 y 7.6 min. 135 Figura 49. Espectro del hidrógeno de la escoparona (6, 7-dimetoxicumarina) OIIC·MA SO ~ IUIN 111 CDC13 100IUIl U $[PTJ(M&It[ loa ... upa Udl .. SAIIPlC _t. s., n 2010 ,oll/,n t coca '11. up ACOUISITTON 'frq 1".113 In 111 _t 1.'H np I U1l ,w 3003.0 fD UOO " . tpwr S, rrw 1 .1 di 1.000 lor O nt 121 el UI • loe" n ~tn not UIII1 11 '" " . , ... " O< ~ ,- " ,ti '" " , .. nAG.~ " , , OI$PlAY ue ph ·34 .• 243f . • '" • ". '.11i $OO.O~ 1:1' .' • • 100 . OOe 11 Dte . • VT Ofr, Ut.t1S '" ,~, ~, .. -.. , PRIICt"S$1II0 ..trile "' .. O "'o , 200 pro!; fL fn nut uno lO 9 .. , :I: 8 00 , :I: ", , :I: .' o-.< o~ !t.n '. 0. "" . . . s.u , 5 ~ . . .. '" ",:",U u' ,O O ~ ~::;: ::;: ( , 4 12. '1 MeO 6 MeO 7 5 ~4 ~8a 8 , ------"-' .¡ '- 3 2 4 ~ 3 2 O 1 O pp. 136 Figura 50. Espectro del carbono de la escoparona (6, 7-dimetoxicumarina). - =.~~ ~&:iJ 5011HZ 1:1 Sl P 11 (fUSilE U 111 ... exp11 ndUc SAl\PL[ ... U sep 27 2fIO . ulvont Acct_ ti l. tlCp ACQutsITtOI 'fr. 51 . 211 tn en ., .... , np un ."" 12414 . 4 fa. 7"0 DO le tpWr 4' P'" 11.1 ell •. e .. tu1 o "1. 5110 c:t 126'1 .10cll n ,"1" r>OL ... U d " ,. .. .. "" ,. O< -. - " '" ," '" , .. ~ , , '20 , " ... n • , oap,,.,v · 1082 . 1\ 11414.4 7 .. " " , '$O u., .. ~OtJ.tJtJ UU.7 31$3.1\ , 100 . 000 '4', , '00 ,"o .. fr. .~ 11'.'71\ •• ...... .. , •• .-." " " " • yyy • 11316 . 1 NOC(SlII rro 1.0. wtf 11. "~ ,. j' lO. 01 ol . , '" U ~ o ., ~ , . N NJv~ U U U = • • 1 ... 160 o- -... ; : . .. · 0 _ -, . ~ .. - .1 , I , MeO 5 4 6 ~4 ~ 3 Z MeO 7 # 8. O O 8 . -n • n .... '" u u O ~ • ., :;; • "' n U !'i U " '" - ~ o : .... u "' : o .. -u"": o .N" O • . .. • ." .' .. ~ .- :;; n = f' l ' ¡' ' <1 l ' .. ~. 14' 120 100 8. " 40 20 • pp. 137 Figura 51. Espectro de masas de la escoparona (6, 7-dimetoxicumarina). 2 3 4 4a 5 6 7 8 8a 144 Figura 52. UPLC de extractos de Tagetes lucida A) Extracto acuoso; B) Extracto etanólico; C) Mezcla de cumarinas; D) 6, 7-dimetocumarina (dimetilfraxetina); E) 6, 7, 8 trimetoxicumarina (escoparona). Longitud de onda 347 nm. Extracto acuoso Extracto etanólico Mezcla de cumarinas 6, 7, 8 trimetoxicumarina A B E C D 6, 7- 8 dimetoxicumarina minutos 145 Figura 53. UPLC de Tagetes erecta. A) Extracto acuoso. B) Extracto etanólico. Longitud de onda 347 nm. A B Extracto acuoso Extracto etanólico minutos 146 8. DISCUSIÓN Esta investigación contribuye al análisis sistemático de la medicina tradicional mexicana. Se entrevistaron a curanderos y comerciantes del Estado de Morelos para conocer el uso actual de Tagetes erecta y T. lucida en el tratamiento de “los nervios”. El estudio farmacológico corroboró el efecto de tipo ansiolítico-sedante de los extractos acuosos y orgánicos del cempasúchil y del pericón y se sugirió la participación del mecanismo de acción serotoninérgico, para ambas especies y el gabaérgico para la T. lucida. Finalmente, para el pericón mediante técnicas fitoquímicas se elucidaron dos cumarinas responsables del efecto de tipo ansiolítico-sedante. La ansiedad es una de las enfermedades mentales más prevalentes a nivel mundial (Baxter et al., 2013). Generalmente se trata con terapias psicológicas asociadas con la prescripción de fármacos ansiolíticos de los grupos de las BDZ, tricíclicos e inhibidores selectivos de la recaptura de serotonina. A pesar de la conocida eficacia de los fármacos (Schubert et al., 2014), se sabe que éstos generan efectos adversos como sedación, relajación muscular, mareo, ataxia o estados hipnóticos que afectan la calidad de vida de los pacientes (Dell´Osso y Lader, 2013; Dell´Osso et al., 2014). Requieren de una latencia prolongada antes de producir sus efectos e incluso pueden generar adicción (dependencia y tolerancia) por el uso crónico, tal es el caso de las BDZ (Uzun et al., 2010; Dell´Osso y Lader, 2013). Las plantas medicinales son alternativas de terapéutica para la ansiedad, las cuales a veces son utilizadas por considerarse más económicas y por tanto más accesibles, en lo que se refiere a la población rural (Druss y Rosenheck, 2000; Da Silva et al., 2009). Éstas tienen incluso gran demanda en la zona urbana y se combinan con actividades físicas como el yoga, masajes de relajación, entre otras. La herbolaria tiene reconocida utilidad medicinal en todo el mundo (Sarris et al., 2011). Es una práctica que se incluye en sistemas medicinales tradicionales como el Mediterráneo, Chino, Ayurvédico o Mesoamericano. Entre las plantas que se utilizan para tratar diversas enfermedades, se emplean especies vegetales para 147 la terapéutica de los desórdenes mentales (Tortoriello y Romero, 1992; Singhuber et al., 2012). A pesar de ello, una gran cantidad de especies medicinales no cuentan con estudios preclínicos, y menos los clínicos, que avalen sus beneficios para el tratamiento de las enfermedades mentales como la ansiedad. Etnobotánica El estudio etnobotánico de este proyecto corroboró los usos tradicionales actuales de T. erecta y T. lucida para el tratamiento de tipo ansiolítico-sedante (Linares et al., 1990; Monroy-Ortiz y Castillo-España, 2007). Ambas especies se recomendaron por los curanderos y comerciantes para el tratamiento de diversos síndromes de filiación cultural, particularmente “los nervios” y “susto”. Los entrevistados consideran ambas especies de gran valor cultural y las clasifican como de tipo caliente(García-Hernández et al., 2015) para tratar padecimientos como “la frialdad” y, con menor frecuencia, su utilidad como antiinflamatorio o insecticida. Las entrevistas hechas en el Estado de Morelos permitieron notar que el uso de las flores de cempasúchil para tratar “los nervios” es menos conocido, mientras que el uso del pericón para el mismo tratamiento es ampliamente sabido. El conocimiento del uso del cempasúchil como tranquilizante puede estar influido por la migración de Morelos a los Estados Unidos o a otros estados afectando la cadena de transmisión oral de los usos tradicionales medicinales. Otro factor son los medios modernos de comunicación que propician la inclusión de especies medicinales populares y el ingreso de productos hechos a base de plantas medicinales de diversos estados e incluso países. El que se haya conservado el uso del pericón para tranquilizar es posible que se deba a que es una especie con tradiciones profundamente arraigadas a las creencias de los pobladores morelenses. Otra posibilidad es que el empleo del pericón sea más efectivo para el tratamiento de “los nervios” que el cempasúchil, por alguna de sus cualidades, como la aromática “es una planta con perfumado olor, que áun conserva, no como el cempasúchil…Su aroma ayuda a reanimar y tranquilizar a las personas”. Finalmente, un aspecto que pueden influenciar es 148 como señala Sierra (2007), que el uso de esta planta fue muy valorado desde la época prehispánica dentro del grupo de plantas psicotrópicas con efectos notorios sobre la mente humana en que se incluía además del pericón, el ololiuqui, el nanácatl o el peyotl. Toxicología Los extractos acuosos y orgánicos de T. erecta y T. lucida mostraron valores altos del parámetro DL50 y ninguna producción de alteraciones morfológicas macroscópicas valoradas 14 días después de la administración única de los extractos, lo cual indica baja toxicidad de acuerdo con los valores sugeridos y permitidos para la administración aguda (Lorke, 1983). Ello sugiere la seguridad en el consumo de ambas especies. Las diferencias de valores obtenidos de las DL50 de las dos especies aquí evaluadas refieren que contienen componentes químicos que comparten y otros que no. Los experimentos de toxicidad estuvieron de acuerdo con las normas dictadas por la OECD (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico por sus siglas en inglés Organisation for Economic Co-operation and Development, 2001) quien aprueba el uso de pocos animales para observar la toxicidad de aguda, la cual no necesariamente debe referir muerte como punto final. En 1984, la British Toxicology Society determinó que se aplicaran niveles de dosis fija, por ejemplo: como máximo 2000 mg/kg para determinar si una substancia es segura o tóxica. Los valores de eficacia obtenidos estuvieron alejados entre 140 y 200 veces de este máximo lo que refuerza y sugiere la carencia de toxicidad en el consumo de los extractos de ambas Tagetes. Farmacología Los extractos de ambas especies, sus respectivas fracciones y compuestos aislados de las especies se asociaron con efectos de tipo ansiolítico-sedante significativo y similar al observado con el fármaco de referencia DZP (Takeda et al., 1998) corroborando su actividad depresora sobre el SNC como tranquilizante en los diferentes modelos. 149 El extracto acuoso de ambas especies presentó actividad ansiolítico- sedante en forma significativa en dosis menores a las observadas con el extracto etanólico. Lo anterior apoya que la preparación de estas plantas medicinales sea en forma de infusión más que en tintura para el propósito de generar un efecto tranquilizante. Un dato a considerar es que los usuarios suelen combinar terapias depresoras para facilitar el inicio o aumentar la duración de los efectos del tratamiento. A este respecto, todos los extractos, las fracciones evaluadas y los compuestos aislados potenciaron el efecto depresor del sedante-hipnótico PBS demostrando un sinergismo farmacológico en la combinación de sustancias que deprimen el SNC. El efecto central del PBS es bien conocido, ya que se sabe que actúa como un agonista del receptor a GABA aumentando su actividad inhibidora por un incremento en el tiempo en que permanece abierto del canal de cloro y la consecuente generación de respuesta hiperpolarizante (Muroi et al., 2009). Sin embargo, el efecto prolongado del PBS se ha asociado a la posible acción de los constituyentes de los extractos administrados. Con la inhibición de las enzimas responsables de su metabolismo se aumenta el tiempo que éste se encuentra en el organismo a concentraciones efectivas como sedante-hipnótico, pudiendo incluso incrementar su eficacia (Marvin, 1972). La actividad central de la T. erecta y la T. lucida fue originalmente descrita al evaluar sus efectos como antidepresivo en las dosis de 12.5, 25 y 50 mg/kg (Khulbe et al, 2013) y de 10 a 100 mg/kg (Guadarrama et al., 2008) respectivamente, en el modelo de nado forzado. Por lo tanto, los resultados obtenidos corroboran la actividad central de los extractos polares de ambas especies. Adicionalmente, cabe señalar que los efectos antidepresivos reportados para ambas especies se asociaron con la activación de mecanismos serotoninérgicos, donde se probaron ratas pretratadas con p-clorofenilalanina, un inhibidor de la síntesis de serotonina (Guadarrama et al., 2012) y antagonistas de los receptores 5-HT1A y 5-HT2A de serotonina (Guadarrama et al., 2008; Khulbe et al., 2013; Bonilla-Jaime et al., 2015). 150 En relación al mecanismo de acción, el efecto de tipo ansiolítico-sedante del extracto acuoso de T. erecta fue inhibido por la presencia del antagonista de los receptores 5-HT1A, pero no por el antagonista de BDZ. Mientras que en el caso del extracto acuoso y la mezcla aislada del extracto etanólico de T. lucida, ambos antagonistas bloquearon la respuesta ansiolítico-sedante. Estos resultados sugieren que la neurotransmisión serotoninérgica está implicada en los efectos centrales de ambas especies y, que se esperaría mejor eficacia ansiolítica en el caso de T. lucida. A nivel central, los receptores GABA-BDZ y 5HT1A de serotonina son blancos de acción de los principales anisolíticos, tales como las benzodiacepinas (como DZP, triazolam y loracepam) y los agonistas parciales (como buspirona, gespirona e ipsapirona) (Argyropoulos et al., 2000; Dell´Osso y Lader, 2013). Los datos experimentales corroboran mayor eficacia en T. lucida en comparación con T. erecta. Estas evidencias experimentales refuerzan que el uso de T. lucida para tratar la ansiedad o “los nervios” en la medicina tradicional fuera más citado por los entrevistados que en el caso de T. erecta. Fitoquímica Después de corroborar la actividad ansiolítico-sedante de los extractos y sus fracciones, la composición de los constituyentes se analizó mediante cromatografía en capa fina y líquida de ultra resolución para identificar aquellos que se podrían aislar para su evaluación como metabolitos puros. El extracto etanólico de T. lucida mostró mayor abundancia en constituyentes que también se identificaron en el extracto acuoso. Se logró aislar una mezcla de cumarinas identificadas de manera individual como la dimetilfraxetina (6, 7, 8-trimetoxicumarina) y la escoparona (6,7- dimetoxicumarina). Estudios fitoquímicos previos ya habían reportado la presencia de dimetilfraxetina aislada de la T. florida (sinonimia de T. lucida) recolectada en México (Ríos et al., 1976), así como la síntesis de la misma (Gao et al., 2013), pero no su actividad ansiolítico-sedante. No obstante, los estudios fitoquímicos de ambas especies muestran que poseen componentes de naturaleza flavonoide, 151 terpenoide y de tipo cumarínico, principalmente en el caso de T. lucida (Xu et al., 2012; Gong et al.,2012; Céspedes et al., 2006). La escoparona fue una de las cumarinas purificadas de la mezcla activa obtenida del extracto etanólico de T. lucida, que mostró efectos ansiolítico y/o sedante corroborado en forma individual en todos los modelos experimentales y en comparación con la mezcla y con los estándares de escopoletina y esculetina. Compuestos de tipo cumarínicos como la esculetina se han asociado con actividad en el SNC o han sido identificados en especies medicinales con estas propiedades como en Bierbesteinia multifida (De Souza Márques et al., 2015; Monsef-Esfahani et al., 2013). Sin embargo, esta es la primera vez que se determina la escoparona como uno de los responsables del efecto de tipo ansiolítico-sedante de T. lucida. Algunos reportes en la literatura avalan el potencial de los flavonoides, las cumarinas o los terpenos para el tratamiento de afecciones del SNC como la ansiedad. Este tipo de compuestos se han reportado en alguna o ambas de las especies estudiadas en este proyecto, tales como: quercetina, canferol, canferitrina, naringenina, rutina, β–sitosterol y cumarinas. Quercetina y canferol se han evaluado o relacionado como agliconas con potencial ansiolítico en el modelo de cruz elevada (Vissiennon et al., 2012; Pérez-Ortega et al., 2008) y como derivados de ambos flavonoides y el β–sitosterol se han valorado sus efectos ansiolítico-sedantes en los modelos utilizados en este proyecto, todos ellos identificados en la Tilia americana var. mexicana (Aguirre-Hernández et al., 2010; Noguerón-Merino et al., 2015), especie con propiedades ansiolítico-sedantes (Aguirre-Hernández et al., 2007a; Pérez-Ortega et al., 2008; Herrera-Ruíz et al., 2008). Los efectos de naringenina también se han detectado en el modelo de campo abierto y la cruz elevada, además del modelo de enterramiento de canicas (Chtourou et al., 2015). 152 9. CONCLUSIONES Las flores de T. erecta se reconocen por sus propiedades tranquilizantes por los médicos tradicionales y los comerciantes de plantas medicinales entrevistados en el Estado de Morelos. La parte aérea de T. lucida es conocida por sus propiedades tranquilizantes por todas las personas entrevistadas como uno de los principales usos. T. erecta y T. lucida poseen actividad de tipo ansiolítico-sedante como se reporta en la medicina tradicional. La DL50 calculada para los extractos de ambas especies sugiere seguridad en el consumo. El efecto ansiolítico-sedante de T. erecta probablemente se debe a mecanismos de acción con la participación del receptor 5HT1A, mientras que en el caso de T. lucida se observa la participación tanto de la neurotransmisión serotoninérgica mediada por 5HT1A como GABAérgica con el receptor GABAA/BDZ. Componentes de naturaleza flavonoide y terpenoide participan en la actividad ansiolítico-sedante de T. erecta y T. lucida; para el caso de T. lucida participan tres cumarinas entre ellas la escoparona y dimetilfraxetina. El extracto acuoso y el etanólico de Tagetes erecta contiene cumarinas, una de ellas posiblemente sea la escoparona. 153 10. PERSPECTIVAS A partir de los resultados obtenidos en este proyecto se propone: Hacer la revisión histórica con mayor profundidad de los usos tradicionales de ambas especies. Obtener un mayor número de entrevistas a los curanderos, usuarios y comerciantes de plantas medicinales en el Estado de Morelos con la finalidad de generar índices de valor de uso. Con los datos obtenidos en las entrevistas hacer las historias de vida de los curanderos y un análisis actual del padecimiento de “los nervios”. Dar el seguimiento clínico del uso tradicional de la Tagetes erecta y la T. lucida. Elucidar la estructura de la cumarina faltante de la mezcla de T. lucida aquí encontrada y hacer pruebas farmacológicas de conducta. Elucidar el principio activo responsable de la actividad como ansiolítica-sedante de T. erecta. 154 11. LITERATURA CITADA Abdala L. 1999. Flavonoids of the aerial parts from Tagetes lucida (Asteraceae). Biochemical Systematics and Ecology 27:753-754. Aguilar S. 1990. Dimensiones Ecológicas del Estado de Morelos. Universidad Nacional Autónoma del Estado de Morelos, Centro Regional de Investigaciones Multidisciplinarias. Ciudad de México, México, 221 p. 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Dirección de Investigaciones en Neurociencias del Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de Fuente, Calz. México-Xochimilco 101, Col. Sn Lorenzo Huipulco, 14370 México, D.F., México b Posgrado en Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Del. Coyoacán, C.P. 04510 México D.F., México c Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Del. Coyoacán, C.P. 04510 México D.F., México d Postgrado en Botánica, Colegio de Postgraduados, Carr. México-Texcoco Km. 36.5, Montecillo, 56230 Estado de México, México e Laboratorio Multidisciplinario de Investigación. Escuela Militar de Graduados de Sanidad. SEDENA, Mex́ico, D.F. México a r t i c l e i n f o Article history: Received 25 August 2015 Received in revised form 27 January 2016 Accepted 27 January 2016 Available online 9 February 2016 Keywords: Anxiety Central nervous system Coumarins Ethnobotany Sedative Tagetes lucida Chemical compounds studied in this article: Dimethylfraxetin (6,7,8-Trimethoxycoumar- in) (PubChem CID: 3083928) Diazepam (PubChem CID: 3016) Flumazenil (PubChem CID: 3373) Sodium pentobarbital (PubChem CID: 23676152) WAY100635 maleate salt (PubChem CID: 11957721) x.doi.org/10.1016/j.jep.2016.01.040 41/& 2016 Elsevier Ireland Ltd. All rights rese espondence to: Instituto Nacional de Psiquia Xochimilco No. 101, Col. Sn Lorenzo Huipulco o. ail address: evag@imp.edu.mx (M.E. González a b s t r a c t Ethnopharmacological relevance: Morelos State is one of the most important regions of Mexico where several plant species are used in traditional medicine to influence central nervous system (CNS) activity; for example Tagetes lucida Cav. Aim of the study: To investigate the ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of the tranquilizing properties of T. lucida aerial parts. Material and methods: Data on the medicinal uses of T. lucida were explored by interviewing healers and merchants of local markets in different regions of Morelos State by using a questionnaire. Anxiolytic and/ or sedative-like responses of the T. lucida were investigated in experimental models in mice such as: open-field, exploration cylinder, hole-board, plus-maze, and the barbituric-induced hypnosis potentia- tion. The possible mechanism of action was explored in the presence of WAY100635 (0.32 mg/kg, i.p.) and flumazenil (10 mg/kg, i.p.) antagonists. A feasible active compound was isolated and identified by using conventional chromatography, including UHPLC and MS (DART) [MþH]þ techniques. Results: Interviews of healers and merchants from ten local regions of Morelos State showed that they recommended T. lucida as infusion and as tincture for several culture-bound syndromes associated with the CNS. Anxiolytic and sedative-like activities of polar extracts were corroborated in the experimental models; these effects were inhibited in the presence of 5-HT1A and GABA/BDZ receptor antagonists. Dimethylfraxetin was identified as one possible active compound. Conclusions: The results support the anxiolytic and sedative-like properties of T. lucida in traditional medicine by involving serotonergic and GABAergic neurotransmission and coumarinic constituents. & 2016 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. 1. Introduction Anxiety disorder is by far the most prevalent mental affection worldwide (Baxter et al., 2013). The most commonly prescribedanxiolytics are benzodiazepines, tricyclics, and selective serotonin reuptake inhibitors. Though they are efficacious (Schubert et al., 2014), they often come with side effects such as marked sedation, muscle relaxation, drowsiness, ataxia, and production of hypnotic states (Dell´osso and Lader, 2013; Dell´Osso et al., 2014). Moreover, some substances like benzodiazepines produce tolerance and rved. tría “Ramón de la Fuente”Av. Delegación Tlalpan 14370, D. -Trujano). dependence (Uzun et al., 2010; Dell´osso and Lader, 2013). Other alternatives available to the population for the therapy of mental disorders are chiropractic methods, yoga, physical activity (Druss and Rosenheck, 2000; Da Silva et al., 2009). Worldwide, many people also use herbal medicine (Sarris et al., 2011). In fact, plants known from traditional medicinal systems (Mediterranean, Chi- nese, Ayurvedic, Mesoamerican) are the most common treatment for anxiety disorders (Tortoriello and Romero, 1992; Singhuber et al., 2012). However, herbal therapies continue to have poor support in preclinical and clinical studies. A previous review of Mexican medicinal plants showed that 89 common species are associated with sedative and anxiolytic-like effects (Lozoya, 1990; Tortoriello and Romero, 1992). Traditional Mexican healers recommend these species for reassurance and for treating stress, “nervios”, “susto”, shock, nervousness and nervous www.sciencedirect.com/science/journal/03788741 www.elsevier.com/locate/jep http://dx.doi.org/10.1016/j.jep.2016.01.040 http://dx.doi.org/10.1016/j.jep.2016.01.040 http://dx.doi.org/10.1016/j.jep.2016.01.040 http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.jep.2016.01.040&domain=pdf http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.jep.2016.01.040&domain=pdf http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1016/j.jep.2016.01.040&domain=pdf mailto:evag@imp.edu.mx http://dx.doi.org/10.1016/j.jep.2016.01.040 G. Pérez-Ortega et al. / Journal of Ethnopharmacology 181 (2016) 221–228222 excitement. Tagetes lucida Cav. is a native aromatic plant that was and remains being one of the most important ritual plants used frequently in Mexico. Its common names include “pericón”, “yauhtli” (nahualt), “hierba anis” or “hierba de Santa María”; in English it is called Mexican mint marigold (Duke et al., 2009). It is a common weed and not of conservation concern. Previous work from the State of Morelos, Mexico, showed that T. lucida is widely used in this state for anxiety treatment; it is also recorded as a depressant medicinal species from other regions of Mexico (Gua- darrama-Cruz et al., 2008). The aerial parts of T. lucida are con- sumed orally in infusions and hidroalcoholic extracts in several regions of Mexico. Pharmacological studies of T. lucida aerial parts or flowers have reported antibacterial (Cáceres et al., 1993; Castillo-Juárez et al., 2009), insecticidal (Vera et al., 2014), cytotoxic (Vega-Ávila et al., 2009; Mejía-Barajas et al., 2012) antioxidant (Aquino et al., 2002) and antidepressant-like effects (Guadarrama-Cruz et al., 2008; 2012). However, anxiolytic, sedative or anticonvulsant effects have not yet been studied. This study contributes to the systematic analysis of Mexican traditional medicine by evaluating the anxiolytic and/or sedative activities of T. lucida (aqueous and ethanol crude extracts) in dif- ferent experimental models in mice, identifying at least one me- tabolite, and exploring the possible anxiolytic and/or sedative mechanism of action by observing the action of the 5-HT1A and GABA/BDZ receptors in the presence of the extract. HEALERS Nerves and fear 32% Coldness 21% Puerperium 11% Sadness 6% Rheumatism 5% Common cold 5% Ulcers 5% Vaginal fluids 5% Digestive system 5% Kidneys 5% Digestive 18% Coldness Nerves Rituals 13% Dysmenorrhea and muscle pain 11% Anti- inflammatory 7% Post-partum 5% Alimentary 4% Antiseptic 4% Rheumatism 2% Bronchitis 2% Antipyretic 2% Insecticide 2% Dye 2% 15% 13% MERCHANTS Fig. 1. Ethnobotanical survey of healers and merchants of several regions of Mor- elos State, Mexico, on the use of Tagetes lucida Cav. as tranquilizer. 2. Material and methods 2.1. Ethnobotanical survey Morelos State was selected because it is located in a con- vergence zone between two biogeographic kingdoms and cultural areas formerly inhabited by Olmecs, Tlahuicas and Xochimilcas (Monroy-Ortiz and Monroy, 2004). Therefore, it has a large bio- cultural heritage that is reflected in the traditional knowledge of the use and management of plants. One example of such knowl- edge is Tagetes lucida or “pericón”, which is reported to soothe anxiety (Monroy-Ortiz and Castillo-España, 2007). To explore the medicinal uses of T. lucida aerial parts, we interviewed eight healers (five women and three men) and twenty five merchants (17 women, 8 men) from Alpuyeca, Amatlán de Quetzalcóatl, Cuernavaca, Cuautla, Temixco, Tepoztlán, Tetela del Volcán, Tlayapacan, Yautepec and Yecapixtla, all regions of the Morelos State, on the past and current ways to use T. lucida Cav. to treat anxiety. Healers and merchants of medicinal plants were interviewed by asking the following questions: How do you recommend treating the condition of “nerves”? What species of plants are commonly used for treating anxiety? When the interviewee did not list the use of T. lucida, we asked them: How common is the use of “pericón”? Healers were interviewed for this study because they are specialists in the management of traditional medicine. Merchants were included in the interviews because they are trained to sell the most common medicinal plants. Answers were registered in writing or by audio recording, after briefly explaining the project and asking for the consent of the participants. 2.2. Phytochemical analysis 2.2.1. Plant material The aerial parts of Tagetes lucida Cav (Asteraceae), tribe Tage- teae, were obtained in Amatlán de Quetzalcóatl, municipality of Tepoztlán (18° 58′16.32″ N; 99°3′1.74″ W, with an altitude of 1620 m), in the state of Morelos, Mexico, in September of 2011. The species identification was confirmed by M.Sc. Abigail Aguilar Contreras, a medicinal plant specialist. A voucher specimen was deposited in the herbarium of the Instituto Mexicano del Seguro Social in Mexico City for future reference (accession number IMSSM No. 15878). 2.2.2. Extracts preparation The T. lucida plant material was dried under shaded conditions at room temperature (2275 °C). For the ethanol extract 158 g of the dry aerial parts were cut into small pieces and submerged in 680 mL of absolute ethanol. Every 72 h the extract was con- centrated in a rotating evaporator (model Büchi Rotavapor R-210) under reduced pressure; this was repeated tree times. The aqueous extract was obtained by infusing 218.80 g of plant material in 1000 mL of water so it was covered, and inserting it into a bain-marie for 1 h. The resulting liquid was frozen in liquid nitrogen and freeze-dried for 12 h in a lyophilizer model Labconco freeze dry/shell. The dry weight yielded of the final crude extracts expressed in grams and percentage of the plant material was 14.34 g (9.08% d. w.) for the ethanol extract and 8.94 g (4.08% d.w.) for the aqueous extract. Fractionation of the ethanol extract. The (Fig. 1) ethanol extract (11 g) was separated in three fractions using percolation on silica gel (182 g) and the solvents hexane (500 mL), ethyl acetate (750 mL) and methanol (600 mL). The yield of these fractions was 1.09% (0.12 g), 62.18% (6.84 g) and 29.61% (3.26 g), respectively. As the largest yield was obtained with the ethyl acetate solvent, 4.67 g of this dried fraction were taken and subjected to a second percolation on silica gel (96 g) by using solvents in gradient: Aqueous crude extract Ethanol crude extract 6,7,8-trimethoxycoumarin Mixture of coumarins Fig. 2. UHPLC chromatogram of the T. lucida extracts at 280 nm representing and comparing the peaks profile obtained from the aqueous extract(A), crude ethanol extract (B), mixture of crystals of coumarinic nature (C) and 6,7,8-trimethoxy- coumarin (dimethylfraxetin) (D). G. Pérez-Ortega et al. / Journal of Ethnopharmacology 181 (2016) 221–228 223 hexane (500 mL), hexane-ethyl acetate 50:50 (500 mL), ethyl acetate (500 mL), ethyl acetate-methanol 50:50 (500 mL) and methanol (500 mL), respectively. Twenty-four fractions of 50 mL were grouped in 5 pools to be concentrated in a rotating eva- porator under reduced pressure after comparison to the similar thin chromatographic profile. The pool 2 (obtained from a mixture of hexane:ethyl acetate, 50:50), after being totally dried at room temperature formed a pale yellow powder with a yield of 20.53% (0.96 g). This was used in the experiments as a mixture (Fig. 2). 2.2.3. Ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) analysis An Acquity UHPLC H class Waters with a PDA eλ detector controlled by EmPower 3TM software was equipped with a Sym- metry C18 100 Å (150 mm�4.6 mm, 5 mm) column (Waters, made in Ireland), the thermostat was set at 43 °C. The mobile phase consisted of acidified water at 0.1% phosphoric acid (A) and me- thanol (B) (HPLC grade). The initial gradient elution was 80% A: 20% B to reach 100% B (17 min). The initial conditions were regenerated during 1 min (80% A: 20% B). The flow rate was 1.0 mL/min with an elution curve of 6. Extract, fractions and a compound mixture (1 mg/mL) were injected directly (10 mL in- jection volume) after filtration through 0.2 mm (GHP, acrodisc 13, Waters). The extract, fractions, mixture or pure compounds were diluted in methanol. The peak profile was identified at UVλmax 347 and 280 nm. 1H and 13CNMR data; also, its molecular weight was determined by MS (DART) [MþH]þ . 2.3. Pharmacological study 2.3.1. Animals The animals used in the pharmacological tests were male Ta- conic SW mice (25–30 g). Females of the same strain were also used for determining toxicity as lethal dose fifty (LD50). Mice were obtained from the Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz. The animals were kept at a controlled temperature (2271 °C) with a light/dark cycle of 12 h and fed ad libitum with standard food and water. The acute toxicity and tests for the an- xiolytic and sedative effects followed the specifications issued by the Committee of Ethics and Research of the institute with the approval number of the project INP-NC123280; it also observed the Mexican Official Norm for Animal Care and Handling (NOM- 062-ZOO-1999), and international rules on the care and use of laboratory animals. 2.3.2. Drugs Tween 80, dimethyl sulfoxide (DMSO), naringenin, kaempferol, kampferitrin, quercetin, rutin, scopoletin, aesculetin, β-sitosterol, WAY100635 and flumazenil were purchased at Sigma (St. Louis MO, USA). Diazepam (DZP) and sodium pentobarbital (SP) were acquired from Psicofarma S.A. de C.V. and PiSA Farmacéutica, re- spectively (Mexico City). The extracts and standards were suspended in Tween 80, DMSO, saline solution (s.s.) 0.9% or distilled water depending of their solubility. DZP was suspended in 0.5% Tween 80 and distilled water, and SP in s.s. 0.9%. All substances, drugs, extracts, fraction, and the mixture integrated for 3 coumarins were used in fresh preparation and then administered intraperitoneally (i.p.) at a volume of 10 mg/kg body weight. For percolations, Silica gel 60 was purchased from Merck, S.A. de C.V. 2.3.3. Acute toxicity (LD50) The lethal dose fifty was calculated by the intraperitoneal (i.p.) route using a modified method reported by Lorke (1983). This method was selected because it requires a minimum of experi- mental animals (Lorke, 1983). The ethanol and aqueous extracts were given in a preliminary dosage of 2000 mg/kg, i.p. In the case of the isolated compounds, they were evaluated first for acute toxicity at 1000 mg/kg, i.p. After administration, mice were kept under observation for the following 14 days to observe mortality. Mice surviving were sacrificed in a CO2 gas chamber to determine macroscopic alterations of tissues. 2.3.4. Pharmacological evaluations All mice were adapted to manipulation three days before the treatments were initiated. For each treatment, animals were se- parated as independent groups of at least six mice. Tests were performed 30 min after the administration of the aqueous (10, 30 and 100 mg/kg, i.p.) and the ethanol (100 and 300 mg/kg, i.p.) extracts, the ethyl acetate fraction (100 and 300 mg/kg, i.p.), the mixture of metabolites (3 and 10 mg/kg, i.p.) and the reference drug diazepam (1 mg/kg, i.p.) or flavonoids and coumarin stan- dards. The anxiety and/or sedative tests were applied to each mouse consecutively as follows: Ambulatory activity. As a preliminary analysis, the ambulatory G. Pérez-Ortega et al. / Journal of Ethnopharmacology 181 (2016) 221–228224 activity of the mice was performed in the open-field test. It con- sisted of placing each mouse into an acrylic box divided into 12 squares (9 cm�9 cm). The number of squares occupied by the mouse with all four limbs during a two-minute interval was counted. Before and after using the box it was cleaned with a solution at 30% ethanol. If there was a significant decrease in lo- comotor activity of treated mice compared with the control group count, this response was taken as indicative of a sedative-like ef- fect (Oliva et al., 2004). Hole-board test. Each mouse was placed on a wooden floor- board with 16 holes of 3 cm in diameter distributed evenly, ele- vated walls made of acrylic (40 cm�40 cm�25 cm) closed the space of the hole-board. Number of head-dips was registered for a period of three minutes. A significant decrease in the head-dipping behavior in comparison to the control group was taken as a po- sitive anxiolytic-like response. Exploration cylinder. The model was previously described by Hiller and Zetler (1996). Mice were placed individually in a glass cylinder (30 cm in height, 11 cm in diameter, with a wall of 33 mm) with an open floor (with paper) for a period of five min- utes. The number of times that the animal stood on its hind legs supporting both forelimbs in the cylinder wall was counted for a period of five minutes. The decrease in the number of rearings was indicative of a tranquilizing effect (Hiller and Zetler, 1996; Guz- mán-Gutiérrez and Navarrete, 2009). Plus-Maze test. The elevated plus-maze used in this study was modified from Lister (1987). The model is an elevated cross- shaped device with two opposite open arms and two closed arms (walls of 30 cm in height) of the same dimensions (30�5 cm). These arms are extended from a central platform (5 cm�5 cm) and are raised from the ground (50 cm). The mouse was placed individually on the central site for five minutes (File, 2001; Yu et al., 2007) to observe its preference for open or closed arms re- gistering the number of entries into the open arms, and the time spent in each arm (Lister, 1987; Kumar. et al., 2013). The increase in time exploring and frequency of entry into the open arms was considered as an anxiolytic-like effect. Sodium pentobarbital (SP)-induced hypnosis potentiation. This test consisted of the administration of the extract, fractions or compounds to the mice, 60 min after they received an injection of SP at the dose of 42 mg/kg i.p. (González-Trujano et al., 1998). Then, the latency of motor incoordination (phase sedation), Table 1 Ethnobotanic survey of the medicinal uses of T. lucida Cav. to healers and merchants fro No. Gender Age (years) Occupation Location 1 Male 75 Healer, peasant, “granicero” Amatlán de Quetzalcóa 2 Female 49 Healer, health promoter Cuernavaca 3 Female 58 Healer, midwife Cuernavaca 4 Female 37 Healer, temazcalera Cuernavaca 5 Male 36 Healer, bone setter Amatlán de Quetzalcóa 6 Male 55 Healer, temazcalero Cuernavaca 7 Female 54 Healer, temazcalera, bone setter Cuernavaca 8 Female 42 Healer, masseur Cuernavaca 9 Male 36 Merchant Tepoztlán 10 Female 47 Merchant Cuernavaca 11 Female 59 Merchant Yecapixtla12 Female 39 Merchant Cuautla 13 Female 55 Merchant Yautepec 14 Male 50 Merchant Cuernavaca “Temazcalero”: Healer who uses the “Temazcal” (“Temazcal” is a sweat lodge; plants ar “granicero” (weather worker): Healer of importance to agriculture, whose main activity “frialdad”: It is a state of body imbalance, an ill body is out of balance (either too hot o “nervios”: It is a state of unrest, often insomnia, loss or increased appetite, rapid pulse, “susto”: Disease caused by a surprising and strong impression due to a fall or the enco http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/alfa.php?opcion¼D&p¼a latency to loss posture (stage of hypnosis), and duration of hyp- nosis or sleep was recorded. The time between loss and recovery of the righting reflex was recorded as sleeping time. 2.3.5. Analysis of the mechanism of action In order to investigate the participation of the GABAergic and serotoninergic neurotransmission in the anxiolytic and sedative- like responses of T. lucida aqueous or the active metabolite from the ethanol extract, WAY100635 (0.32 mg/kg, i.p.), a selective 5-HT1A antagonist (Cao and Rodgers, 1997; González-Trujano et al., 2015) and flumazenil (10 mg/kg, i.p.), a selective GABAA/BDZ an- tagonist (Valverde et al., 1995) were given 15 min before the an- xiolytic treatment administration or vehicle injection. The beha- vior was evaluated 30 min after treatment administration. 2.4. Statistical analysis Results are presented as mean7standard error S.E.M. of at least six repetitions, and were processed by a one-way analysis of variance (ANOVA) of one way followed by Dunnett´s or Tukey´s tests to compare treatments against the control or between doses or treatments, respectively, using the statistical program Sigma Stat version 2.3. *Po0.05 indicates a significant difference for n of at least six experimental subjects. 3. Results and discussion We investigated the anxiolytic and sedative-like activities of an aqueous and ethanol polar extract of the aerial parts of T. lucida. The aqueous extract was examined as this species is usually pre- pared as an infusion or in baths by the population. The ethanol extract of T. lucida was considered not only because of its pre- paration as a tincture, but also to search for some active metabo- lites which in this study were identified as a mixture of three coumarins. A feasible mechanism of action was also explored by testing the participation of GABA/BDZ and 5-HT1A receptors. 3.1. Ethnobotany The ethnobotanical survey in this study (Table 1) confirmed the data obtained from the literature (Linares et al., 1995; Monroy- m local markets of different regions in the Morelos State, Mexico. Medicinal uses of T. lucida Cav. tl Against “nervios” For treating rheumatism, postpartum, againts “frialdad”, and common cold, sadness. For treating empachos (caused by “nervios”) and “frialdad” in enuresis Against “susto” and in puerperium tl Against ulcers in mucus membranes and vaginal fluids Against “nervios” Against “susto” and “frialdad” Against “susto”, “frialdad” in stomach, digestive and kidney problems Mainly for “nervios”, “frialdad” and pain Mainly for “nervios”, “frialdad” and pain Mainly for “nervios”, “frialdad” and pain Mainly for “nervios”, “frialdad” and pain Mainly for “nervios”, “frialdad” and pain Mainly for “nervios”, “frialdad” and pain e used for medicinal purposes). is to influence weather (meteorological phenomena). r too cold) and balance tends to cold and heat is required to re-establish. despair, among others. unter with animals, inanimate objects and supernatural entities. http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/alfa.php?opcion=D&p=a http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/alfa.php?opcion=D&p=a http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/alfa.php?opcion=D&p=a http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/alfa.php?opcion=D&p=a http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/alfa.php?opcion=D&p=a http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/alfa.php?opcion=D&p=a http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/alfa.php?opcion=D&p=a http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/alfa.php?opcion=D&p=a Fig. 3. Chemical structure of coumarins in the T. lucida aqueous and ethanol extracts. Table 2 1H and 13C NMR data analysis of the 6,7,8-trimethoxy-coumarin (dimethylfraxetin). Position 1Ha (J, Hz) 13Cb C¼O 160.44 s 3 6.32 d (9) 115.25 d 4 7.58 d (9) 143.13 d 5 114.35 6 150.16 7 6.65 s 103.8 d 8 146.04 9 141.25 10 143.39 OMe- 4.03 s 56.38 q OMe- 3.98 s 61.52 q OMe- 3.88 s 61.84 q a 300 MHz/CDCl3. b 75 MHz. 0 40 80 O pe n- fie ld (A m bu la to ry a ct iv ity in 2 m in ) Dose (mg/kg, i.p.) Aqueous crude extract Ethyl acetate fraction Mixture of coumarins * * Ethanol crude extract * * * * * * * 0 15 30 Ex pl or at io n ac tiv ity in c yl in de r (R ea rin gs in 5 m in ) Dose (mg/kg, i.p.) * * * * ** * * ** Aqueous crude extract Ethanol crude extract Ethyl acetate fraction Mixture of coumarins A B Fig. 4. Sedative-like effects of the aqueous (10–100 mg/kg, i.p.) and ethanol crude extract (100 and 300 mg/kg, i.p.) in comparison to the ethyl acetate fraction (30 and 100 mg/kg, i.p.) containing a mixture of coumarins (3 and 10 mg/kg, i.p.) evaluated in the open field (A) and cylinder of exploration (B) behavior tests in mice. Each bar represents the mean7S.E.M. of at least six animals.*Po0.05, one way ANOVA followed by Dunnett's test. G. Pérez-Ortega et al. / Journal of Ethnopharmacology 181 (2016) 221–228 225 Ortiz and Castillo-España, 2007). In Morelos, T. lucida is a widely used medicinal plant, mainly for treating digestive tract ailments. Illnesses related to the nervous system, such as anxiety and de- pression, are in second place (Fig. 1). Related to these, the plant was also recommended for several culture-bound syndromes, particularly “nervios” and “susto” (Table 1). It is an important plant with hot properties (for an explanation of the hot-cold system underlying the Mesoamerican medical system, see García-Her- nández et al. (2015)) used to treat illnesses considered cold, “frialdad”. There are several minor uses, for example, as anti-in- flammatory and insecticide (Fig. 1). Corn on the cob that is eaten during its flowering season is colored yellow with flowering branches of T. lucida. It is also an important ritual plant which is believed to protect from evil influences. Small crosses made of T. lucida are a common sight in houses, shops, churches, “milpas” (maize fields) and cars around the 29th of September, “día de San Miguel” (Saint Michael's day). Also, it is used for producing a fra- grant smoke (sahumar) to ritually clean houses of evil spirits. The use in sweat baths (temazcal) and ritual cleansings of persons (“limpias”) are related. T. lucida was not the most important species for treating ail- ments of the nervous system, but it was well-known for these properties (Table 1, Fig. 1). Recommended preparations were often mixtures with other well-known anxiolytic plants, such as Tern- stroemia sylvatica or T. pringlei, Citrus sinensis, Passiflora incarnata or Agastache mexicana (Tortoriello and Romero, 1992). They are often sold together at the weekly markets. The recommendations of the healers and merchants coincided generally, but there were some differences in details. Merchants cited more uses (though that may be related to the larger number interviewed) (Fig. 1). In the markets, the plant is almost always sold as part of a mixture; it is only sold as a single species as an insecticide and as incense. Healers collect their medicinal plants themselves; mer- chants buy from wholesalers, often at the Mercado de Sonora in Mexico City. 3.2. Phytochemistry Preliminary thin layer chromatography of the aqueous and ethanol extracts showed similar patterns, but the aqueous extract resulted in the largest spots of a light blue color (graphical ab- stract); these were indicative ofthe presence of coumarinic con- stituents. Both extracts were also analyzed by the UHPLC techni- que (Fig. 2A and B); the aqueous extract had the largest number of peaks (Fig. 2A) as compared to the ethanol crude extract (Fig. 2B). Since the presence of the major peaks was also well-represented in the ethanol extract, it was processed to isolate the main com- pounds and to identify the chemical structure. These substances were found concentrated in the ethyl acetate fraction after a pre- liminary flash liquid chromatography. A second flash liquid chro- matography with hexane:ethyl acetate (50:50) and subsequent drying yielded a mixture of three suspected coumarins (Fig. 2C). According to the UHPLC profile, the retention times (RT) of the main peaks of this mixture were 7.1, 8.0 and 8.5 min (Fig. 2C). Pale- yellowish solid crystals (m.p. 110–113 °C) were observed at 8.0 min of RT (Fig. 2D). After comparison with 1H and 13CNMR data, as well as its molecular weight determined by MS (DART) [MþH]þ¼237 (C12H12O5)þH, the results indicated that the substance was 6,7,8-trimethoxy-coumarin (dimethylfraxetin) (1) (Fig. 3, Table 2). Our results confirms previous findings, since this compound has been previously isolated from T. florida (a synonym of T. lucida) collected in Mexico (Ríos and Flores, 1976). Compound 1 was further synthesized (Gao et al., 2013). In addition to dimethyl- fraxetin (1), other coumarins have also been reported from the species, such as: herniarine (7-methoxycoumarin) (2), scoparone 0 40 80 H ol e- bo ar d (H ea d- de pp in g in 3 m in ) Dose (mg/kg, i.p.) * ** * * * * * * * Aqueous crude extract Ethanol crude extract Ethyl acetate fraction Mixture of coumarins 0 70 140 Pl us -m az e (T im e in o pe n- si de d ar m s in m in ) Dose (mg/kg, i.p.) * * * * * * * * * * * * * * Aqueous crude extract Ethanol crude extract Ethyl acetate fraction Mixture of coumarins A B Fig. 5. Anxiolytic-like effects of the aqueous (10–100 mg/kg, i.p.) and ethanol crude extract (100 and 300 mg/kg, i.p.) in comparison with the ethyl acetate fraction (30 and 100 mg/kg, i.p.) containing a mixture of coumarins (3 and 10 mg/kg, i.p.) evaluated in the hole-board (A) and plus-maze (B) behavior tests in mice. Each bar represents the mean7S.E.M. of at least six animals.*Po0.05, one way ANOVA followed by Dunnett's test. Table 3 Effects of Tagetes lucida crude extracts, ethyl acetate fraction and mixture of cou- marins on the pentobarbital-induced sleeping time in mice. Treatment Dose Latency (min) Hypnosis Duration of the hypnosis (min) (mg/kg) Sedation – 0.8770.08 3.1570.32 18.3571.95 SPBþvehicle (0.2% tween 80 in s.s.) SPBþT. lucida aqu- eous crude extract 10 0.9370.05 2.8970.13 29.7976.11* 30 1.0970.07 2.3770.16 82.69710.45* 100 1.1270.09 2.9570.24 36.7574.40* SPBþT. lucida etha- nol crude extract 100 1.1970.10 3.4670.11 41.2375.05* 300 0.9770.06 3.1570.31 45.0972.40* SPBþT. lucida ethyl acetate fraction 30 1.1170.08 2.7370.12 37.9274.71* 100 1.0370.08 2.7970.12 29.8275.70* SPBþmixture of coumarins 3 0.9770.09 2.8870.25 44.4473.18* 10 0.9270.02 2.1770.15* 41.18712.03* SPBþdiazepam 1 0.9570.03 2.9770.29 51.9476.09* SPB Sodium pentobarbital 42 mg/kg, i.p. ANOVA followed by Dunnett's test. * Po0.05. 0 70 140 Pl us -m az e (T im e in o pe n- si de d ar m s in 5 m in ) Dose (mg/kg, i.p.) * & * Fig. 6. Anxiolytic-like responses of the aqueous extract and a mixture of coumarins obtained from the ethanol extract, both tested at 10 mg/kg, i.p., in the presence of GABAA/BDZs (Flumazenil, 10 mg/kg, i.p.) and 5-HT1A (WAY100635, 0.32 mg/kg, i.p.) receptors antagonists evaluated in the plus-maze behavior test. Each bar represents the mean7S.E.M. of at least six animals. *Po0.05, one way ANOVA followed by Tukey's test. G. Pérez-Ortega et al. / Journal of Ethnopharmacology 181 (2016) 221–228226 (6,7-dimethoxycoumarin) (3) (Fig. 3), and the dimethyl allyl ether of 7-hydroxy-coumarin (Ríos and Flores, 1976). Other authors have also reported the isolation of coumarins in the water-MeOH (1:1) and MeOH extracts of T. lucida, such as: 2, 3, 7-8-dihydrox- ycoumarin, umbelliferone (7-hydroxycoumarin), 6-hydroxy-7- methoxycoumarin, esculetin (6,7-dihydroxy-coumarin), and sco- poletin (6-methoxy-7-hydroxycoumarin), showing antibacterial and antifungical activities (Céspedes et al., 2006). Not only cou- marins but also flavonoids, some of them with known anxiolytic- like activity, have been reported in polar extracts of this species; for example: patuletin, isorhamnetin, quercetagetin 3-O-arabino- syl galactoside, isorhamnetin 7-O-glucoside, quercetin, rutin, quercetagenin and naringenin (Abdala, 1999; Céspedes et al., 2006; Xu et al., 2012). 3.3. Toxicology Both, the aqueous and ethanol extracts of T. lucida showed very low acute toxicity. According to the modified method of Lorke (1983), LD50 for the aqueous extract was calculated to be 2000 mg/ kg in female and male mice, while for the ethanol extract it was 707 and 970 mg/kg, respectively, vía i.p. In the case of the cou- marin mixture, a LD50 of 548 mg/kg was calculated in female mice. Mice did not show macroscopic tissue injury or weight loss during the 14-days observation period. 3.4. Pharmacology Both Fig. 4 polar extracts of T. lucida aerial parts produced an- xiolytic-like effects (Fig. 5) associated with sedative activity (Fig. 5) in most models. However, several did not show a strict dose-de- pendency (Figs. 4 and 5). In the open-field and cylinder tests, the mice treated with the aqueous extract showed a significant but non-dependent decrease in the ambulatory and exploratory activities (Figs. 4A and B). This decrease was equivalent to the effect of 1 mg/kg, i.p., of diazepam (Fig. 4). The ethanol crude extract produced the same response but at a higher dosage (100 and/or 300 mg/kg, i.p.) (Figs. 4A and B). As observed in the cylinder test (Ugalde et al., 2005), it has been reported that first minutes in the open-field test involve a greater component of novelty exploration and stress-induced anxiety-like behavior in mice (Zhang et al., 2011). This behavior was dimin- ished with all treatments taken as depressants of CNS in this study suggesting an anxiolytic-like response. This activity was reinforced in the extracts that also produced anxiolytic-like effects in the well-known and validated hole-board and plus-maze tests Table 4 GABAergic and serotonergic involvement in the mechanism of action of the sedative-like effects of Tagetes lucida and An active mixture of coumarins on the pentobarbital- induced sleeping time in mice. Treatment Dose Latency Hypnosis Duration of the hypnosis (mg/kg, i.p.) Sedation (min) (min) SPBþvehicle (saline solution, s.s.) – 1.1870.04 3.0070.21 12.1971.38 WAY100635 (i.p.) plus SPB 0.32 0.8170.11 3.0270.31 22.9472.84 WAY100635 plus mixture of coumarins plus SPB 1.0070.09 3.2370.17 17.2171.20 Flumazenil (i.p.) plus SPB 10 1.2570.08 2.8870.21 40.8078.38* Flumazenil plus mixture of coumarins plus SPB 10 1.0070.09 2.9770.29 75.8275.28* SPB Sodium pentobarbital 42 mg/kg, i.p. ANOVA followed by Dunnett's test. * Po0.05 vs vehicle. G. Pérez-Ortega et al. / Journal of Ethnopharmacology 181 (2016) 221–228 227 (Figs. 5A and B, respectively). Here, significant effects were found from 10 mg/kg onward in the aqueous extract, and again at a higher dosage of the ethanol extract (100 or 300 mg/kg, i.p.). All the tested extracts and compounds significantly increased the SPB-induced hypnosis (Table 3); only the coumarin mixture at dosage of 10 mg/kg, i.p. facilitated the onset of hypnotic response (Table 3). Again, results did not show dose-dependency (Table 3). These anxio- lytic-like responses resembled those observed in mice receiving the reference drug, diazepam (1 mg/kg, i.p.), associated with sedative-like responses as previously reported (Takeda et al., 1998) (Fig. 5A and B, respectively, Table 3). Our results might indicatea synergistic response because of different allosteric activation of the GABA receptors or the facilitation of other depressant neurotransmission systems. However, the prolonged pentobarbital effect has also been associated to an in- teraction with the enzymes responsible for its metabolism (Peters, 1972); this is another possibility that was not explored in this study. Central nervous system activity of T. lucida was early described as an anti-depressant by using doses from 10 to 100 mg/kg in the forced swimming test (Guadarrama-Cruz et al., 2008); our results in this study support the central activity of polar extracts of T. lucida aerial parts; where isolated coumarins (Figs. 4 and 5). According to the results of the chromatographic profile (Fig. 3) and the anxiolytic and sedative-like effects of both aqueous and ethanol extracts of the T. lucida aerial parts (Figs. 4 and 5), we suggest that the coumarins are mainly responsible for both ac- tivities. Nevertheless, it is possible that flavonoids, also reported for this species, interact with these-either by strengthening the effects or by competing with them. Concerning to the mechanism of action, the anxiolytic-like ef- fects of the aqueous extract and the mixture of coumarins ob- served in the plus-maze model were inhibited in the presence of both GABA/BDZ (flumazenil 10 mg/kg, i.p.) and 5-HT1A (WAY100635, 0.32 mg/kg, i.p.) receptor antagonists. GABAergic neurotransmission is recognized as a common mechanism of ac- tion in the anxiolytic-like effects of plants (López-Rubalcava et al., 2006). Nevertheless, in our study, the 5-HT1A receptor participa- tion was more evident in the anxiolytic-like response inhibition of T. lucida (Fig. 6). The 5-HT1A receptor antagonism also inhibited the SPB-induced sleeping time potentiation of the mixture of cou- marins (Table 4), whereas pretreatment with flumazenil per se produced a significant increase in the SPB-induced hypnosis that was enhanced in the presence of the mixture (Table 4). An influence on serotonergic neurotransmission by T. lucida was also reported preliminarily in order to explain its antidepressant effects in rats pretreated with ρ-chlorophenylalanine, an inhibitor of serotonin synthesis (Guadarrama-Cruz et al., 2012), and antagonists of the 5-HT1A and 5-HT2A receptors (Bonilla-Jaime et al., 2015). These results together support not only a significant involvement of the serotonin neurotransmission in the mechanisms of central ef- fects of this species, but also GABAergic participation. 4. Conclusions The use of Tagetes lucida aerial parts as a tranquilizer in Mex- ican traditional medicine has a factual basis. An aqueous and al- coholic preparation of this species produces anxiolytic and seda- tive-like effects by involving serotonergic and GABAergic neuro- transmission. The main effective substances appears to be cou- marins, prominent among them 6,7,8-trimethoxy-coumarin. The identified coumarins showed more possible toxicity than the crude extracts; since specific negative effects were not explored in this study, they should be investigated in the future. In addition, other active compounds are expected to be identified. Conflict of interest None. Acknowledgments We thank Dr. Abigail Aguilar for plant identification, and Dr. Javier Pérez-Flores and Dr. Beatriz Quiroz for recording the MS and NMR spectra. We also thank Mr. Raúl Cardoso and Mr. JoséLuis Calderon, as well as to the student Omar Guadarrama Enríquez for their technical assistance and Aide González for proof reading the English version of this manuscript. This study was partially sup- ported by CONACYT No. 226454 and INP-NC123280. Gimena Pérez Ortega is also grateful to Posgrado en Ciencias Biológicas of UNAM for having received academic training and CONACYT–332465 fel- lowship to obtain her doctorate degree. References Abdala, L.R., 1999. Flavonoids of the aerial parts from Tagetes lucida (Asteraceae). Biochem. Syst. Ecol. 27, 753–754. Aquino, R., Cáceres, A., Morrelli, S., Rastrelli, L., 2002. An extract of Tagetes lucida and its phenolic constituents as antioxidants. J. Nat. Prod. 65, 1773–1776. Baxter, A.J., Patton, G., Scott, K.M., Degenhardt, L., Whiteford, H.A., 2013. Global epidemiology of mental disorders: what are we missing? PLoS One 8, e.65514. Bonilla-Jaime, H., Guadarrama-Cruz, G., Alarcón-Aguilar, F.J., Limón-Morales, O., Vázquez-Palacios, G., 2015. Antidepressant-like activity of Tagetes lucida Cav. is mediated by 5-HT1A and 5-HT2A receptors. J. Nat. Med. 69, 463–470. 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Artículo de divulgación Gimena Pérez Ortega y María Eva González Trujano nnnnnnn Plantas medicinales contra la ansiedad L a s p l a n t a s m e d i c i n a l e s c o n p r o p i e d a d e s t r a n q u i l i z a n t e s s o n ú t i l e s p a r a c a l m a r e l e s t r é s , l a a n g u s t i a , l a e x c i t a b i l i d a d y l a i r r i t a b i l i d a d , e m o c i o n e s q u e a f e c t a n n e g a t i v a m e n t e a l o r g a n i s m o y , p o r e n d e , l a s a c t i v i d a d e s c o - t i d i a n a s . L a t a r e a c i e n t í f i c a e s r e c o n o c e r s u p o t e n c i a l p a r a l a t e r a p é u t i c a c o n e l f i n d e b r i n d a r n o s b i e n e st a r e n f o r m a s e g u r a . La prevalencia de los trastornos mentales L os trastornos mentales constituyen un serio problema de salud pública. Se trata de un grupo de enfermedades que afectan al ser humano en cualquier etapa de su vida. En el caso específico de México, en 1996, la prevalencia de los trastor- nos psiquiátricos para la población urbana adulta se estimó en 16.7%, con ma- yor incidencia en el género femenino. Aquí cabe señalar que tres áreas metropolitanas mostraron la tendencia más elevada a trastornos de ansiedad, con 3.4%. En 1999, la población adulta de la ciudad de México con edades entre 18 y 65 años refirió en 28% presentar a lo largo de su vida un trastorno mental, mientras que 9.5% manifestó dos o más trastornos. Ansiedad general izada El término ansiedad se define como una emoción universal que normalmente ex- perimentamos cuando enfrentamos peligros externos o conflictos internos con un gran valor adaptativo, que nos alerta y nos obliga a actuar según nuestro instinto de autoconservación. De acuerdo con su intensidad, duración y el grado de alteración del comportamiento y funcionamiento de la persona, se suele diferenciar la ansiedad normal y la patológica. La ansiedad patológica puede estar representada por fobias, obsesiones y compul- siones, o puede estar somatizada por otro tipo de enfermedades. De acuerdo con la En- cuesta Nacional de Epidemiología Psiquiátrica en México, los trastornos de ansiedad son los más prevalentes y crónicos entre los trastornos mentales que se presentan en la vida adulta; sin embargo, éstos se inician en edades tempranas. Para poder diagnosti- carla clínicamente, esta sensación de preocupación excesiva debe presentarse durante más de seis meses; no se restringe a circunstancias particulares e incluye síntomas como aprensión, tensión, dificultad para concentrarse y molestia abdominal. Usos de plantas mexicanas 7 0 ciencia • julio-septiembre de 2015 Terapia de la ansiedad Las personas que padecen de ansiedad patológica recurren a especialistas de la salud, como el psiquiatra, el psicólogo, el psicoterapeuta, el enfermero o trabaja- dor social especializado en la salud mental, el médico general o familiar y el terapeuta ocupacional. En Mé- xico, diversas encuestas señalan que aproximadamente sólo 5% de la población con estos padecimientos emo- cionales acude a servicios especializados. Los datos pro- venientes de la Encuesta Nacional de Epidemiología Psiquiátrica del año 2002 informan que 6.5% de per- sonas con trastornos afectivos utilizó algún tipo de medicina alternativa en los 12 meses previos al estu- dio. Además pueden acudir con el consejero espiritual, el cura, el rabino, el quiropráctico, el espiritista o el hierbero. La terapia de los médicos alópatas incluye los fárma- cos denominados ansiolíticos. Entre los más utilizados están las benzodiacepinas: alprazolam y el clonazepam; los tricíclicos, como la clomipramina y la amitriptilina; y los inhibidores selectivos de la recaptura de la sero- tonina, como la fluvoxamina. A pesar de ser estos últi- mos los más empleados, se sabe que producen una serie de efectos colaterales, tales como sedación, relajación muscular, disminución de la coordinación motora en mo- vimientos finos y producción de estados hipnóticos; destaca además la característica de generar tolerancia y dependencia a los mismos. Respecto a las medicinas alternativas o complemen- tarias, se emplean técnicas de relajación, terapias físi- cas, quiropraxis, sanación espiritual y la herbolaria; así como otros recursos de la medicina tradicional mexica- na, ya sean animales, el agua, la tierra o los minerales. Plantas medic inales con uso como ansiol ít ico-sedantes en México Los distintos grupos étnicos mexicanos poseen una manera específica de comprender y ver el mundo; ello corresponde con la relación entre el medio ambiente, el individuo y la comunidad que norma; igualmente, la forma de utilizar los recursos naturales. Existen distin- tos reportes y listados florísticos de los usos que se les da a las plantas en diferentes comunidades de México. Dentro de las clasificaciones encontramos a las me- dicinales, y a su vez, al conjunto de plantas utilizadas para tratar padecimientos del sistema nervioso central (snc), con un porcentaje aproximado de 3.3%, segui- das de las plantas utilizadas para el sistema digestivo, el respiratorio, para traumatismos o para la piel. Los componentes químicos de las especies vegetales actúan por medio de diferentes mecanismos a nivel cerebral; dependiendo de ello pueden producir una diferente ac- ción farmacológica, y por lo tanto se pueden clasificar en psicoanalépticas (estimulantes), psicodislépticas (alucinógenas) y psicolépticas (depresoras). El conocimiento de las plantas medicinales se ex- tiende a cualquier parte del mundo donde el hombre Para el tratamiento de “los nervios”: las plantas de naturaleza más fuerte se deben tomar en infusiones ocho por ocho; ocho días se toma y ocho días se descansa y podemos cambiar a plantas más nobles. María de la Paz Puebla alvear • Plantas medicinales contra la ansiedad julio-septiembre de 2015 • ciencia 7 1 tradicionalmente ha necesitado de éstas para curar sus enfermedades. Así, mezcla de magia y religión, combi- nada con necesidad y casualidad, de ensayo y error, el paso de las diferentes culturas ha creado todo un co- nocimiento de remedios vegetales que ha constituido la base de la medicina moderna. La etnobotánica se refiere al estudio de las relaciones que existen entre las plantas y los grupos locales, cómo se conectan y cómo influyen en el desarrollo de las culturas. Su estudio es importante porque representa una aproximación al uso y manejo de los recursos naturales. En las comunidades mexicanas, las plantas de ma- yor demanda son aquellas con propiedades sobre el snc; la población las describe como para tratar: “los ner- vios”, “el susto” y “el espanto”, o contra el insomnio, el nerviosismo, la excitación nerviosa, para tranquilizar y contra el dolor. Los médicos tradicionales y comer- ciantes de dichas plantas mantienen el recurso de la herbolaria en activo. Ejemplo de ello son las entrevis- tas realizadas durante 2013 sobre las especies vegeta- les que de manera general y comúnmente se utilizan para el tratamiento de “los nervios” en Morelos, uno de los estados con mayor biodiversidad y aplicación de la herbolaria (véase Tabla 1). De modo particular, se ejemplifica la información de entrevistas realizadas a curanderos sobre tres especies medicinales que fue- ron seleccionadas debido a que no cuentan con estu- dios preclínicos: muicle, pericón y cempasúchil (véase Tabla 2). Tabla 1 . E spec ie s vegeta le s emp leadas por curanderos y comerc i antes de l e s tado de More los para e l t ra tamiento de “ los nerv ios” . Curanderos Hojas de laurel, hojas de guayaba, arrayán, pasiflora, damiana, tila, tilia, valeriana, hojas de zapote blanco, muicle, pericón, guanasana, prodigiosa, tumbavaquero, guaco, pasiflora, contra yerba blanca, cenizo de Monterrey, ruda, orégano, canela, floripondio, azahares de todos los cítricos, jícuri, flor de cempasúchil, jengibre, flores de magnolia, flores de manzana, xompantle, jazmín y lechuga. Comerciantes Magnolia, azahares, manita, tila, toronjil, eneldo o hinojo, xoloxóchitl, manzanilla, damiana de California, flor de manita, hojas de zapote blanco, pericón, toronjil, neem, hoja santa, valeriana, pasiflora, ajenjo y tumbavaquero. Tabla 2 . Ent rev i s ta s e spec í f i ca s a curanderos de l e s tado de More los respecto a t res e spec ie s vegeta le s u t i l i z adas para e l t ra tamiento de “ los nerv ios” . Nombre Edad Ocupación Originario Plantas para “los nervios” Plantas en estudio Uso medicinal Forma de administración Aurelio Ramírez Cázarez 75 años Campesino, granicero Amatlán de Quetzalcóatl,Tepoztlán • Laurel • Hojas de guayaba • Arrayán • Pasiflora • Damiana Muicle • Limpiar sangre • Para “los nervios” Infusión Pericón • Contra “los nervios” Temazcal con hierbas (laurel, romero, eucalipto y pirul) Cempasúchil • Empacho Infusión Sofía Díaz Hernández 49 años Promotora de salud Solusuchia- pa, Chiapas • Tilia • Valeriana • Zapote blanco Muicle • Depurador de sangre Infusión Pericón • Posparto • Quita la frialdad En baños Cempasúchil • Contra el dolor de estómago • Contra infecciones vaginales Infusión María de la Paz Puebla Alvear 58 años Partera, curandera Santa María, Cuernavaca • Guanasana • Prodigiosa • Tumbavaquero • Guaco • Contra yerba blanca Muicle • Depurador de sangre • Multivitamínico • Oxigena al cuerpo Infusión Pericón • Quita empachos (causados por “los nervios”) • “Saca el frío” • Cuando los niños orinan Pomadas Cempasúchil • Quita empachos (causados por “los nervios”) • “Saca el frío” • Cuando los niños orinan Pomadas Usos de plantas mexicanas 7 2 ciencia • julio-septiembre de 2015 La evaluación precl ín ica de la ansiedad Los roedores y el humano son especies que compar- ten más de 90% de sus genes, por lo que los modelos experimentales para evaluar estrategias terapéuticas de la ansiedad en estos animales resultan ser una herra- mienta de utilidad para la aplicación terapéutica en el humano. Aun así, la selección del modelo adecuado para explorar una alternativa terapéutica no es fácil, ya que implica conocer: a) las diferencias entre los sis- temas nerviosos de ambas especies; b) la dificultad de encontrar conductas análogas entre ellas; y c) la seme- janza de los datos para ser extrapolados al humano. Es así que se han desarrollo e investigado varios modelos experimentales en animales con base en la reactividad emocional de los roedores, y dentro de ella, su sensibilidad al estrés. Entre los modelos más empleados se encuentran: el campo abierto para va- lorar la actividad ambulatoria; el rota-rod para anali- zar la coordinación motora; el tablero con orificios, la exploración en cilindro y la cruz elevada para evaluar los efectos de tipo ansiolítico; y la potenciación de la hipnosis inducida con un sedante-hipnótico, como el pentobarbital sódico, para indicar el sinergismo entre agentes depresores del snc y los efectos sedantes de nuevos compuestos. Dichos modelos se han validado con fármacos empleados en la clínica. Los modelos experimentales de ansiedad Los modelos experimentales son parte medular en los estudios preclínicos que se realizan principalmente en roedores, donde el término modelo usualmente re- fiere una construcción teórica en la cual una hipótesis específica puede ser deducida o probada experimental- mente. Los protocolos desarrollados en organismos que no son humanos se efectúan con la finalidad de replicar características patológicas, fisiológicas o de comporta- miento de pacientes con distintos padecimientos. En éstos se miden respuestas conductuales a situaciones de conflicto o de novedad. Las pruebas para detectar actividad de los extractos de plantas medicinales o de los productos naturales obtenidos de éstas con propie- dades ansiolíticas potenciales se pueden clasificar en: pruebas de conflicto, neofobia, miedo condicionado, ansiedad social y pánico. Existen más de 30 modelos experimentales preclínicos para la investigación de fármacos con acción sobre el snc, entre los cuales se incluyen aquellos para evaluar la ansiedad. Éstos se ba- san en respuestas incondicionadas, es decir, las que no requieren de entrenamiento previo, y en las condicio- nadas. En este caso, los roedores deben tener un entre- namiento antes del experimento y su comportamiento demuestra interferencia con los procesos motivacio- ■n Fray Bernardino de Sahagún, Historia General de las Cosas de la Nueva España . Libro décimo: del pueblo, sus virtudes y vicios , y otras naciones. Tomado de: http://www.wdl.org/es/item/10621/ view/1/43/ • Plantas medicinales contra la ansiedad julio-septiembre de 2015 • ciencia 7 3 nales o nemotécnicos. Los modelos que no requieren entrenamiento son los que evalúan la actuación en la transición de la luz y oscuridad, la conducta social de defensa, la supresión de la ingesta inducida por nove- dad y el comportamiento exploratorio, como la evalua- ción de la actividad ambulatoria, la exploración en el tablero con orificios, en cilindro y la cruz elevada. Cabe señalar que independientemente del empleo de uno u otro modelo y de lo que se pretende evaluar, es necesario considerar metodológicamente las varia- bles asociadas con la especie del animal, la raza, la edad y el género, así como las variables de procedimiento, las condiciones del bioterio, el nivel de iluminación, el tiempo de la prueba y la duración de la misma, las ma- nipulaciones previas realizadas al animal, la presencia del experimentador, el material del que fue construido y el tamaño del instrumento para inducir la conduc- ta tipo ansiedad, las mediciones técnicas y si se trata de aparatos automatizados u observadores entrenados. A continuación se presenta una descripción breve de algunos de los modelos más utilizados en la actualidad para la búsqueda de evidencia y validación de plantas medicinales con actividad ansiolítico-sedante: n Campo abierto. La prueba consiste en colocar al roedor de manera individual en una caja de acríli- co. Hay de 9 a 12 cuadros marcados en el piso de la caja para registrar la frecuencia de exploración en sesiones de 2 a 5 minutos. El comportamiento tipo ansiedad que se provoca en esta prueba se debe a que el animal es gregario; primero se le separa de su grupo social y posteriormente se le enfrenta a un tipo de agorafobia. Si en el conteo de cuadros hay una disminución en comparación con un grupo control, se considera que es un indicativo de una respuesta sedante. n Tablero con orificios. Este modelo mide la conduc- ta exploradora a través de un campo elevado con 16 orificios distribuidos de manera uniforme en un tablero. Se observa a los ratones que son colocados sobre éste para contar las veces que introducen la cabeza en cada orificio en un periodo de 3 o 5 mi- nutos. La disminución en la duración de explora- ción de cada orificio y el aumento en la latencia de sumergir la cabeza son indicativos de un efecto tipo ansiolítico. En el modelo se observa que el animal está expuesto a una manifestación aguda de estrés, por lo tanto, se pueden evaluar los cambios en los diferentes estados emocionales del roedor. n Exploración en cilindro. Este modelo consiste en colocar al sujeto experimental de manera indivi- dual dentro de un cilindro de vidrio y contar el nú- mero de veces que el animal se para sobre sus extre- midades posteriores apoyando ambas extremidades anteriores en la pared del cilindro en un periodo de 5 minutos. Una disminución en los levantamientos indica el efecto tranquilizante sobre el ansiogénico que se genera al colocar al animal en un lugar no familiar. n Cruz elevada. Este modelo es claramente uno de los más utilizados y justificados para evaluar conducta de tipo ansiedad con roedores, puesto que permite conocer los efectos de fármacos tanto ansiolí- ticos como ansiogénicos. Se encontró que existen 4 475 reportes según el buscador PubMed y 13 504 en Science Direct sobre el uso del modelo de laberin- to de cruz elevada en la actividad experimental. La ventaja de este modelo es que permite la medición del miedo innato de esta especie por los espacios abiertos y de la carga alostática en donde los fár- macos se pueden administrar en la ausencia de un estresor y después de la exposición al estresante. El aumento en el tiempo que el roedor explora los bra- zos abiertos de la cruz y la frecuencia de entradas a éstos indican el efecto como ansiolítico. Usos de plantas mexicanas 7 4 ciencia • julio-septiembre de 2015 glauca (árnica roja), Heteropterys brachiata(palo de margarita), Ipomoea tyrianthina (quiebra plato), Litsea glaucescens (laurel), Loeselia mexicana (espinosilla), Magnolia dealbata (magnolia), Magnolia grandiflora (magnolia), Montanoa frutescens (zoapatle), Salvia ele- gans (mirto o salvia roja), Ternstroemia pringlei (tila), Ternstroemia sylvatica (tila), Tilia americana var. mexi- cana (tilia), Valeriana edulis spp. procera (valeriana) y Justicia spicigera (muicle). De las especies mencionadas se pueden utilizar las flores, las hojas, las raíces o toda la parte aérea. Las evidencias de su potencial para la terapéutica se han publicado en revistas como Journal of Ethnopharmacology, Planta Medica, Phytomedicine, Journal of Natural Products, Food Chemistry y Phyto- therapy Research. Los escritos reportan datos farmaco- lógicos de las pruebas realizadas con los extractos crudos, en general polares, así como de sus fracciones o compuestos puros aislados por estrategias como el fraccionamiento biodirigido o de manera directa sobre los extractos acuosos u orgánicos polares. En realidad, en lo que se refie- re a la investigación de la herbo- laria en psicofarmacología, ésta ha sido muy limitada. No obs- tante, se observa un incremen- to en las evidencias científicas de las últimas décadas. Como referencia se tiene que a finales del 2012, en una muestra de 1 525 artículos científicos sobre los desórdenes de la ansiedad, incluidos en el buscador de medline y PubMed, se refieren 53 estudios de ex- tractos de diferentes especies, de los cuales 32 presentan evidencias preclínicas y 21 refieren pruebas clí- nicas. De estos casos, los ejemplares ve- getales con mayor estudio reportados a nivel mundial son: Hypericum perfora- tum, Piper methysticum, Matricaria recu- tita, Ginkgo biloba, Passiflora incarnata y Scutellaria lateriflora. Los estudios precl ín icos de plantas ans iol ít ico-sedantes mexicanas En el descubrimiento de nuevos fármacos se han utilizado metodologías y conocimientos de áreas cien- tíficas como la etnobotánica y la etnofarmacología. Un estudio interdisciplinario que incluya a la antropología, arqueología, botánica, química, ecología, farmacología y la fisiología será el que nos permita comprender las relaciones entre las sociedades humanas y las plantas, así como entender la dinámica y evolución del uso de las plantas por los humanos. Desafortunadamente, son pocos los trabajos interdisciplinarios sobre estudios de plantas medicinales mexicanas empleadas para tratar diversos padecimientos, entre ellos los del snc. En su mayoría se han abordado de forma separada, ya sea des- de la perspectiva farmacológica, química o histórica. Como ejemplo se encuentran estudios sobre especies tales como Salvia divinorum, Hypericum perforatum o Rosmarinus officinalis. A pesar de la existencia de una gran diversidad biológica y saberes tradicionales de diversas partes del mun- do, las especies medicinales han sido poco evaluadas. Como se ha mencionado, los estudios utilizan primordial- mente roedores como reac- tivo biológico, y esencia- mente ratones de diferentes cepas, en diversos modelos experimentales. En esto se evalúan los efectos en diferentes vías de adminis- tración, entre las que predominan la in- traperitoneal (i.p.) y la esofágica (p.o.). Asimismo, se realiza investigación sobre los posibles metabolitos secundarios res- ponsables de la actividad ansiolítico- sedante o sus mecanismos de acción molecular. Algunos de los estudios ex- perimentales preclínicos efectuados a especies propiamente mexicanas, o introdu- cidas pero que habitan o se usan en México, por sus propiedades ansiolítico-sedantes, son: Annona macrophyllata (zapote), Citrus sinensis (azahares de naranja dulce), Dracocephalum moldavica (toronjil extranjero), Galphimia ■n Hypericum perforatum. • Plantas medicinales contra la ansiedad julio-septiembre de 2015 • ciencia 7 5 Conclus ión Considerando que la ansiedad es un trastorno mental cuya incidencia se incrementa de manera in- dependiente a la raza, edad o situación económica, y la cual además se facilita con las condiciones de vida sociales, ambientales y económicas, entre otras, es im- perante realizar la búsqueda de terapias eficaces para su control y tratamiento, situación que será imposi- ble atender sin el conocimiento de los aspectos tan- to clínicos como biológicos que permitan ofrecer una estrategia de tratamiento efectiva para los pacientes. Es necesario continuar con el estudio de las terapias tradicionales y alternativas, así como con el empleo de los recursos que la medicina tradicional mexicana nos brinda; que si bien es cierto que se reconoce que los sa- beres provienen de comprobaciones de miles de años, es imperioso corroborar con experimentos científicos datos puntuales como la dosificación. Asimismo, si se realizan los estudios preclínicos, clínicos y sociales pertinentes, se podrá sistematizar, contextualizar y dar respuestas a problemáticas es- pecíficas, a partir de entender cómo las comunidades aprovechan los recursos y si es posible extender el be- neficio a toda la población. Cabe señalar que tales es- tudios se deben realizar con respeto hacia los saberes de las comunidades y hacia las comunidades mismas, igualmente que hacia las poblaciones vegetales, para el consumo y manejo responsable de éstas, sin fines de lucro o biopiratería. Agradecemos a los comerciantes y médicos tradi- cionales del estado de Morelos por compartir sus sabe- res sobre plantas que se emplean como tranquilizantes. Gimena Pérez Ortega es egresada de la carrera de Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Autónoma de Mé- xico y realizó sus estudios de maestría en Ciencias Biológicas en el Posgrado de la unaM . Actualmente cursa los estudios de doctorado en el Laboratorio de Neurofarmacología de Productos Naturales de la Dirección de Investigaciones en Neurociencias del Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz, y su proyecto se relaciona con el estudio de plantas medicinales del estado de Morelos con actividad ansiolítico-sedante, un estudio etnobotánico, farmacológico y fitoquímico. igmena@hotmail.com María Eva González Trujano es egresada de la carrera de Quí- mico Farmacéutico Biólogo de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza. Realizó estudios de maestría y doctorado en el Depar- tamento de Farmacobiología del Centro de Investigación y de Es- tudios Avanzados, Sede Sur. Pertenece al Sistema Nacional de Investigadores, nivel II, y al grupo de profesores de Farmacología de la Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México. Actualmente está a cargo del Laboratorio de Neurofarma- cología de Productos Naturales de la Dirección en Investigaciones en Neurociencias del Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz, en la línea de investigación de farmacología de plan- tas medicinales con actividad sobre el sistema nervioso central. evag@imp.edu.mx Bibl iograf ía Argueta, A., C. Zolla, S. Mata et al. (2012), “La medicina tradicional indígena de México: el largo camino para su legalización y reconocimiento”, en A. Argueta, M. Gómez y J. Navia (eds.), Conocimiento tradicional, inno- vación y reapropiación social, México, Siglo XXI/unam. Benjet, C., L. Casanova, G. Borges y M. E. Medina-Mora (2013), “Impacto de los trastornos psiquiátricos comu- nes y las condiciones crónicas físicas en el individuo y la sociedad”, Salud Pública de México, 55:248-256. Berenson, S., S. Alanís y N. Saavedra (2009), “El uso de las terapias alternativas y complementarias en población mexicana con trastornos depresivos y de ansiedad: re- sultados de una encuesta en la ciudad de México”, Salud Mental, 31:107-115. Caraveo-Anduaga, J., E. Colmenares y G. Saldívar (1999), “Morbilidad psiquiátrica en la ciudad de México: pre- valencia y comorbilidad a lo largo de la vida”, Salud Mental, 22: 62-67.Medina-Mora, M. E., G. Borges, C. Lara et al. (2003), “Prevalencia de trastornos mentales y uso de servicios: resultados de la Encuesta Nacional de Epidemiología Psiquiátrica en México”, Salud Mental, 26: 1-16. Monroy-Ortiz, C. y P. Castillo-España (2007), Plantas me- dicinales utilizadas en el estado de Morelos, 2ª ed., México, Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Polanco, L., C. Vargas-Irwin y M. Góngora (2011), “Mode- los animales: una revisión desde tres pruebas utilizadas en ansiedad”, Suma psicológica, 18:141-148. ANEXO C. Asistencia a congresos y ponencias CONGRESOS NACIONALES VIII Congreso Mexicano de Etnobiología. Villahermosa, Tabasco, México. 23 al 27 de abril del 2012. “Revisión preliminar de las plantas medicinales utilizadas como ansiolíticas/sedantes en el Estado de Morelos”. 8va Reunión Internacional de Investigación en Productos Naturales “Dr. Alfredo Ortega Hernández”. Huatulco, Oaxaca, México. 17 al 19 de mayo del 2012. “Evaluación del efecto como ansiolítico-sedante de Justicia spicigera. Planta medicinal del Estado de Morelos”. XXVIII Reunión Anual de Investigación del Instituto Nacional de Psiquiatría “Ramón de la Fuente Muñíz”. Ciudad de México, México. 2 al 4 de octubre de 2013. “Estudio etnobotánico y farmacológico del efecto ansiolítico-sedante de Justicia spicigera Schltdl.” IX Congreso Mexicano de Etnobiología. San Cristóbal de las Casas, Chiapas, México. 27 de abril al 02 de mayo del 2014. “Saberes tradicionales y experimentales del cempasúchil, en el Estado de Morelos, México, frente alteraciones del Sistema Nervioso Central”. XXXVI Congreso Nacional de Farmacología. XII Congreso de Investigación en Medicina de la ESM-IPN. XVI Congreso Estudiantil de Farmacología en honor al Dr. Sergio Estrada Parra. Ciudad de México, México. 12 al 14 de mayo de 2014. “Efecto como ansiolítico-sedante del extracto crudo y la fracción etanólica de Tagetes erecta L.” XXIX Reunión Anual de Investigación Instituto Nacional de Psiquiatría “Ramón de la Fuente Muñíz”. Ciudad de México, México. 8 al 10 de octubre de 2014. “Efecto como ansiolítico sedante del extracto acuoso de Tagetes erecta L.” 11va Reunión Internacional de Investigación en Productos Naturales. San Carlos, Sonora, México. 20 al 22 de mayo de 2015. “Efecto tipo ansiolítico-sedante del extracto acuoso de Tagetes lucida Cav.” XXX Reunión Anual de Investigación del Instituto Nacional de Psiquitría “Ramón de la Fuente Muñíz”. 7 al 9 de octubre 2015. Ciudad de México, México. “El cempasúchil, planta tranquilizante, potencia el efecto depresor del pentobarbital sódico”. CONGRESOS INTERNACIONALES IX Congreso Centroamericano de Antropología. Ciudad de Guatemala, Guatemala. 18 al 22 de febrero de 2013. “Saberes locales y usos medicinales actuales del muicle”. IVth International Congress of Ethnobotany. Córdoba, España. 17 al 21 de noviembre del 2014. “Review. Preclinic investigation of traditional mexican plants used like anxiolytics or sedatives”. IV Congreso Latinoamericano de Etnobiología y V Congreso Colombiano de Etnobiología. Popayán, Colombia. 27 de septiembre al 02 de octubre de 2015. ”El pericón (Tagetes lucida Cav.), especie de la medicina tradicional mexicana utilizada como tranquilizante”. PONENCIAS Museo de Historia de Tlalpan. Secretaría de Desarrollo Rural y Equidad para las Comunidades. Ciudad de México, México. “Las plantas medicinales del Estado de Morelos utilizadas para tratar el susto o espanto”. 22 de octubre de 2012. Universidad de San Carlos. Ciudad de Guatemala, Guatemala. “Usos medicinales actuales del muicle en el Estado de Morelos”. 22 de febrero de 2013. Brújula Metropolitana. Ciudad de México, México. “En tiempos de crisis… hierbas para los nervios. Plantas contra la ansiedad, un estudio científico“. 24 de febrero de 2016. Portada Índice Resumen 1. Introducción 2. Marco Teórico 3. Planteamiento del Problema 4. Hipótesis 5. Objetivos 6. Materiales y Métodos 7. Resultados 8. Discusión 9. Conclusiones 10. Perspectivas 11. Literatura Citada Anexos