Vista previa del material en texto
al DNA bicatenario pero mucho más fuertemente al promotor
lac. La secuencia del promotor que el represor Iac protege de
la digestión con nucleasa posee una simetría prácticamente
palindrómica. Pese a ello, los experimentos de protección
a la metilación y los estudios mutacionales índican que el
represor no está unido al promotor de forma simétríca.
El represor y la RNA polimerasa compiten por los mismos
sitios de unión en el promotor.
La presencia de glucosa reprime la transcripción de ope-
rones que especifican ciertos enzimas catabólicos, a través
de la mediación de AMPc. Tras unirse a AMPc, que sólo es
producido en ausencia de glucosa, la proteína activadora de
los genes de los catabolitos (CAP) se une a los promotores
de ciertos operones, como el operón lac, activando su trans-
cripción. Los dos dominios equivalentes de unión al DNA
de CAP, que presentan una simetría doble, se unen cada
uno de ellos al surco mayor de su DNA diana a través de un
motivo hélice-vuelta-hélice, que está presente en numero-
sos represores procarióticos. La unión entre estos represores
y sus DNAs diana está mediada por asociaciones mutua-
mente favorables entre estas macromoléculas, más que por
cualquier tipo de interacción específica entre los pares de
bases y las cadenas laterales de los aminoácidos análogas al
apareamiento de bases de Watson y Crick. La transcripción
de araBAD está controlada por CAP-AMPc y AraC a través
de un complejo de AraC con dos sitios de unión, ara02 y
aral, interacción que provoca la formación de un lazo en el
DNA. En este sistema, AraC regula también su propia
síntesis uniéndose al sitio ara01 de forma que reprime la
transcripción del gen araC. La expresión del operón trp, de
E. coli, está regulada tanto por represión como por atenua-
ción. Tras unirse al triptófano, que actúa de correpresor, el
represor trp se une al operadór trp bloqueando la transcrip-
ción del operón trp. Cuando el triptófano está disponible,
gran parte de los transcritos de trp que han escapado a la
represión son terminados prematuramente en la secuencia
trpL, debido a que el transcrito contiene un segmento que
forma una estructura de terminador normal. Cuando el
triptofanil-tRNATrp escasea, los ribosomas se detienen en
dos codones Trp en tándem del transcrito trpL. Esto permite
que el RNA recién sintetizado forme una estructura de
horquilla alternativa que impide la formación del termina-
dor. Existen otros operones regulados por atenuación. La
respuesta severa es otro mecanismo por el cual E. coli
acopla la velocidad de transcripción a la disponibilidad de
tRNAs cargados para la traducción. Cuando un tRNA car-
gado especificado por la secuencia del mRNA es escaso, el
factor severo en los ribosomas activos sintetiza ppGpp,
compuesto que inhibe la transcripción del rRNA y de algu-
nos mRNAs al tiempo que estimula la transcripción de otros
mRNAs.
Los transcritos de mRNA procarióticos no requieren de
procesamiento adicional. Sin embargo, los mRNAs eucarió-
ticos poseen una caperuza en el extremo 5' que es añadida
enzimáticamente, y en la mayoría de los casos presentan
una cola de poli(A) también producida enzimáticamente.
Además, los intrones de los transcritos primarios de los
· mRNA eucarióticos (hnRNAs) son escindidos de forma pre-
cisa, y sus exones flanqueantes son empalmados para gene-
rar los mRNAs maduros en un proceso mediado por
El dogma central de la biología molecular establece que
'DNA produce RNA produce proteína· (pese a que el RNA
puede también "producir" DNA). Sin embargo, existen
enormes variaciones en la velocidad con que las diferentes
proteínas son producidas. Ciertos enzimas, como los del
operón lac, se sintetizan únicamente cuando las sustancias
que metabolizan están presentes. El operón lac está forma-
do por las secuencias de control lacP y lacO, seguidas por
los genes organizados en tándem de la ~-galactosidasa
(lacZ), de la galactósido permeasa (lacY) y de la tiogalactósi-
do transacetilasa (lacA). En ausencia de inductor, que fisio-
lógicamente es la alolactosa, el represor lac, que es el pro-
ducto del gen lacl, se une al operador (lacO), de forma que
impide la transcripción del operón lac por parte de la RNA
polimerasa. La unión del inductor provoca que el represor
libere el operador, lo que permite que los genes estructura-
les lac sean transcritos a un único mRNA policistrónico. Los
mRNAs se asocian transitoriamente con los ribosomas, diri-
giéndolos para la síntesis de los polípéptidos codificados
por ellos. '
El holoenzima RNA polimerasa, de E. coii, posee una
estructura de subunidades a2~P' <J. Comienza la transcrip-
ción sobre la cadena con sentido de un gen en una posición
designada por su promotor. La región más conservada del
promotor es la caja de Pribnow, centrada sobre la posición
-10, que tiene la secuencia consenso TATAAT. La región
de -35 está también conservada en los promotores eficien-
tes. Los estudios de protección a la metilación indican que
el holoenzima forma un complejo de iniciación "abierto"
con el promotor. Tras la iniciación de la síntesis de RNA, la
subunidad o se disocia del núcleo del enzima, el cual catali-
za entonces la elongación de la cadena en dirección 5' - 3'
de manera autónoma. La síntesis de RNA es terminada por
un segmento del transcrito que forma una horquilla rica en
G + C, con una cola de oligo(U) que se disocia de forma
espontánea del DNA. Las secuencias de terminación que
carecen de estas secuencias requieren la ayuda del factor
rho para realizar una terminación correcta de la cadena. En
el núcleo de las células eucarióticas, las RNA polimerasas 1,
II y III catalizan, respectivamente, la síntesis de los precur-
sores de rRNA, de los hnRNAs y de los tRNAs + RNA de
SS. El promotor mínimo de la RNA polimerasa I se extiende
entre los nucleótidos -7 y +6. Muchos promotores de la
RNA polimerasa II contienen una secuencia conservada
TATAAAA, la caja TATA, situada alrededor de la posición
-27. Los potenciadores o aumentadores son activadores de
la transcripción que pueden ocupar posiciones y orientacio-
nes variables respecto del sitio de inicio de la transcripción.
Los promotores de la RNA polimerasa III están situados
dentro de las regiones transcritas de sus genes, entre las
posiciones +40 y +80.
Los procariotas pueden responder rápidamente a cambios
ambientales, en parte gracias a que la traducción de los
mRNAs comienza durante su transcripción, y en parte debi-
do a que la mayoría de los mRNAs son degradados entre 1
y 3 minutos después de su síntesis. La expresión ordenada
en el tiempo de conjuntos de genes en algunos bacteriófa-
gos está controlada por cascadas de factores o. El represor
lac es una proteína tetramérica de subunidades idénticas
que, en ausencia de inductor, se une de forma no específica
Resumen del capítulo
950 Resumen
<
Pribnow, D., Genetic control signals in DNA, en Coldber-
ger, R. F. (Ed.), Biological Regulation and Development, Vol.
1, pp. 217-277, Plenum Press (1979).
Richardson, J. P., Preventing the synthesis of unused trans-
cripts by rho factor, Cell 64, 1047-1049 (1991).
Richardson, J. P., Rho-dependent transcription termination,
Biochim. Biophys. Acta 1048, 127-138 (1990).
Darst, 5. A., Kubalek, E. W. y Kornberg, R. D., Three-
dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase
holoenzyme determined by electron crystallography, Natu-
re 340, 731-732 (1989).
Futcher, B., 5upercoiling and transcription, or vice versa?
Trends Genet. 4, 271-272 (1988).
Gannan, F., O'Hare, K., Perrin, F., LePennec, J. P., Benoist,
C., Cochet, M., · Breathnach, R., Royal, A., Garapin, A.,
Cami, B. y Chambon, P., Organization and sequences of the
5' end of a cloned complete ovalbumin gene, Nature 278,
·428-434 (1979).
Cale, E. F., Cundliffe, E., Reynolds, P. E., Richmond, M. H.
y Waring, M. J., The Molecular Basis of Antibiotic Action (2.ª
ed.), Capítulo 5-, Wiley (1981).
Geiduschek,E. P. y Tocchini-Valentini, G. P., Transcription
by RNA polymerase 114 Annu. Rev. Biochem. 57, 873-914
(1988).
Hansen, U. y Sharp, P. A., Transcription by RNA polyme-
rase II, en Fraenkel-Conrat, H. y Wagner, R. R. (Eds.),
Comprehensive Vírology, Vol. 19, pp. 65-97, Plenum Press
(1984).
Khoury, G. y Gruss, P., Enhancer elements, Cell 33, 313-
314 (1983).
Lewis, M. K. y Burgess, R. R., Eukaryotic RNA polymerases,
en Boyer, P. D. (~d.), The Enzymes (3.ª ed.), Vol. 15, pp.
110-153, Academic Press (1982).
Losick, R. y Chamberlain, M. (Eds.), RNA Polymerase, Cold
5pring Harbor Laboratory (1976). [Una serie de artículos
por expertos en diversos aspectos de la RNA polimerasa.]
McKnight, S. L. y Kingsbury, R., Transcriptional control
signals of an eukaryotic protein-coding gene, Science 217,
316-324 (1982).
Paule, M. R., Comparative subunit composition of eukaryo-
tic nuclear RNA polymerases, Trends Biochem. Sci. 6, 128-
131 (1981).
·Platt, T., Transcription termination and the regulation of
gene expressíbn, Annu. Rev. Biochem. 55, 333,-372 (1986).
RNA polimerasa y mRNA
Adhya, 5. y Gottesman, M., Control of transcription termi-
nation, Annu. Rev. Biochem. 47, 967-996 (1978).
Bear, D. G. y Peabody. D. 5., The E. coli rho protein: an
A TPase that termina tes transcription, Trends Biochem. Sci.
13, 343-347 (19~8).
Berman, H. M. y Young, P. R., The interaction of intercalcu-
lating drugs with nucleic acids, Annu. Rev. Biophys. Bioeng.
10, 87-114 (1981).
Chamberlain, M. J., Bacteria! DNA-dependent RNA poly-
merases, en Boyer, P. D. (Ed.), The Enzymes (3.ª ed.), Vol.
15, pp. 61-86, Academic Press (1982).
Corden, J. L., Tails of RNA polymerase 11, Trends Biochem.
Sci. 15, 383-387 (1 ~90).
La función genética del RN A
Brenner, S., Jacob, I:. y Meselson, M., An unstable interme-
diate carrying information from genes to ribosomes for
protein synthesis, Nature 190, 576-581 (1960). [La verifica-
ción experimental dé la existencia del mRNA.]
' Brachet, J., Reminiscences about nucleic acid cytochemistry
and biochemistry, Trends Biochem. Sci. 12, 244-246 (1987).
Crick, F., Central dogma of molecular biology, Nature 227,
561-563 (1970).
Hall, B. D. y 5piegelman, S., Sequence complementarity of
T2-DNA and T2-specific RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. 47,
137-146 (1964). [La primera utilización de la hibridación
RNA-DNA.}
Jacob, F. y Monod, J., Genetic regulatory mechanisms in the
synthesis of proteins, J. Mol. Biol. 3, 318-356 ( 1961 ). [El
artículo clásico proponiendo la existencia de mRNA y ope-
rones y explicando cómo se regula la transcripción de los
operones.]
Spiegelman, S., Hybrid nucleic acid, Sci. Am. 210(5): 48-56
(1964).
General
Lewin, B., Genes (3.ª ed.), Capítulos 8-11 y 22-24, Wiley
(1987).
Watson, J. D., Hopkins, N. H., Roberts, J. W., 5teitz, J. A. y
Weiner, A. M., Molecular Biology of the Gene (4.ª ed.), Capí-
tulos 16 y 20, Benjamin/Cummings (1987).
es eliminado en una reacción de corte y empalme autocata-
lítico, catalizada por el propio RNA del intrón. Los tRNAs
procarióticos son escindidos de sus transcritos primarios y
recortados de forma muy parecida a los rRNAs. En la
RNasa P, uno de los enzimas que intervienen en este proce-
samiento, la subunidad catalítica es un RNA. Los transcritos
de tRNA eucarióticos también requieren la escisión de un
corto intrón y la adición enzimática de una secuencia -CCA
3' -terminal para formar el tRNA maduro.
Capítulo 29. Transcripción 951
Bibliografía
snRNPs que tiene lugar en los espliceosomas. El transcrito
primario de los rRNAs de E. coli contiene los tres rRNAs
junto con algunos tRNAs. Estos son escindidos y recortados
por endonucleasas y exonucleasas específicas. Los rRNAs
están también modificados por la metilación de nucleósidos
específicos. Los rRNAs eucarióticos de 185, de 5,85 y de
285 son transcritos de manera similar a los procarióticos, en
un precursor de 455 que es procesado de forma análoga a
los rRNAs de E. coli. El intrón del pre-rRNA de Tetrahymena
Gallant, J. A., Stringent control in E. coli, Annu. Rev. Genet.
13, 393-415 (1979).
Gilbert, W. y Müller-Hill, B., Isolation of the lac repressor,
Proc. Natl. Acad. Sci. 56, 1891-1898 (1966).
Gralla, J. D., Specific repression in the lac repressor -the
1988 versión, en Gralla, J. D. (Ed.), DNA-Protein lnteractions
in Transcription, pp. 3-10, Liss (1989).
Harrison, S. C. y Aggarwal, A. K., DNA recognition by
proteins with the helix-tum-helix motif, Ann. Rev. Biochem.
59, 933-969 (1990).
Helmann, J. D. y Chamberlain, M. J., Structure and function
of bacteria! sigma factors. Annu. Rev. Biochem. 57, 839-872
(1988).
Kolter, R. y Yanofsky, C., Attenuation in amino acid
biosynthetic operons, Annu. Rev. Genet. 16, 113-134 (1982).
Lamond, A. l. y Travers, A. A., Stringent control of bacteria!
transcription, Cell 41, 6-8 (1985).
Lobel, R. B. y Schleif, R. F., DNA looping and unlooping by
AraC protein, Science 250, 528-532 (1990).
Lobel, R. B. y Schleif, R. F., AraC-DNA looping: Orienta-
tion and distance-dependent loop breaking by the cyclic
AMP receptor protein, J. Mol. Biol. 218, 45-53 (1990).
Losick, R. y Pero, J., Cascades of sigma factors, Cell 25,
582-584 (1981).
Luisi, B. F., y Sigler, P. B., The stereochemistry of the trp
repressor-operator complex, Biochim. Biophys. Acta 1048,
113-126 (1990).
McClure, W. R., Mechanism and' control of transcription
initiation in prokaryotes, Annu. Rev. Biochem. 54, 171-204
(1985).
Miller, J. H. y Reznikoff, W. S. (Eds.), The Operan, Cold
Spring Harbor Laboratory (1978). [Una colección informati-
va de revisiones sobre el operón lac, así como de otros ope-
rones. J
Otwinowski, Z., Schevitz, R. W., Zhang, R.-G., Lawson, C.
L., Joachimiak, A., Marmorstein, R. Q., Luisi, B. F. y Sigler,
P. B., Crystal structure of trp repressor/operator complex at
atomic resolution, Nature 335, 321-329 (1988).
Pabo C. O. y Sauer, R. T., Protein-DNA recognition, Annu.
Rev. Biochem. 53, 293-321 (1984).
Pastan, l. y Adhya, S., Cyclic adenosine 5' -monophos-
phate in Escherichia coli, Bacteriol. Rev. 40, 527-551 (1976).
Rafferty, J. B., Somers, W. S., Saint-Girons, l. y Phillips, S.
E. V., Three-dimensional crystal structures of Escherichia
I coli met repressor with and without corepressor, Nature 341,
7-05-710 (1989). [Véase, en particular, la nota añadida al
final del artículo.]
Raibaud, O. y Schwartz, O., Positive control of transcription
in bacteria, Annu. Rev. Genet. 18, 173-206 (1984).
Reznikoff, W. S., Siegele, D. A., Cowing, D. W. y Cross, C.
A., The regulation of transcription initiation in bacteria,
Annu. Rev. Genet. 19, 355-387 (1985).
Schleif, R., DNA looping and regulation of the arabinose
operon, Harvey Lectures 84, 27-39 (1990).
Steitz, T. A., Ohlendorf, D. H., McKay, D. B., Anderson, W.
F. y Matthews, B. W., Structural similarity in the DNA-
binding domains of catabolite gene activator ero repressor
Control de la transcripción
Adhya, S. y Garges, S., Positive control, J. Biol. Chem. 265,
10797-10800 (1990).
Aggarwal, A. K., Rogers, D. W., Drottar, M., Ptashne, M. y
Harrison, S. C., Recognition of the DNA operator by the
repressor of phage 434: a view at high resolution, Science
242, 899-907 (1988); y Anderson, J. E., Ptashne, M. y Harri-
son, S. C., Toe structure of the repressor-operator complex
of bacteriophage 434, Nature 326, 846-852 (1987).
Breg, J. N., van Opheusden, J. H. J., Burgering, M. J. M.,
Boelens, R. y Kaptein, R., Structure of Are repressor in
solution: evidence for a family of ~-sheet DNA-binding
proteins, Nature 346, 586-589 (1990).
Brennan, R. G. y Matthews, B. W., The helix-turn-helix
DNA binding motif, J. Biol. Chem. 264, 1903-1906 (1989).
de Crombrugghe, B., Busby, S. y Bue, H., Cyclic AMP
receptor protein: role in transcription activation, Science
244, 831-838 (1984).
Dickson, R. C., Abelson, J., Bames, W. M. y Reznikoff, W.
S., Genetic regulation: The lac control region, Science 187,
27-35 (1975).Dunn, T. M., Hahn, S., Ogden, S. y Schleif, R. F., An
operator at - 280 base pairs that is required for repression
of araBAD operon promoter: addition of DNA helical tums
between the operator and promoter cyclically hinders re-
pression, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 5017-5020 (1984).
Friedman, D. r.. Imperiale, M. J. y Adhya. S. L., RNA 3' end
formation in the control of gene expression, Annu. Rev.
Genet. 21, 453-488 (1987).
Rosenberg, M. y Court, D., Regulatory sequences involved
in the promotion and termination of RNA transcription,
Annu. Rev. Genet. 13, 319-353 (1979).
Sakonju, S., Bogenhagen, D. F. y Brown, D. D., A control
region in the center of the SS RNA gene directs specific
initiation of transcription: l. The 5' border of the region; y II.
The 3' border of the region, Cell 19, 13-25, 27-35 (1980).
Sawadogo, M. y Sentenac, A., RNA polymerase B (II) and
general transcription factors. Ann. Rev. Biochem, 59, 711-754
(1990).
Sentenac, A., Eukaryotic RNA polymerases, CRC Crit. Rev.
Biochem. 18, 31-90 (1985).
Siebenlist, U., RNA polymerase unwinds an 11-base pair
segment of phage T7 promoter, Nature 279, 651-652 (1979).
Sollner-Webb, B., Wilkinson, J. A. K., Roan, J. y Reeder, R.
H., Nested control regions promote Xenopus ribosomal
RNA synthesis by RNA polymerase 1, Cell 35, 199-206
(1983).
Wang, A. H.J., Ughetto, G., Quigley, G. J. y Rich, A.,
Interactions between an anthracycline antibiotic and DNA:
molecular structure of daunomycin complexed to
d(CpGpTpApCpG) at 1.2 A resolution, Biochemistry 26,
1152-1163 (1987).
Woychik, N.A. y Young, R. A., RNA polymerase II: subunit
structure and function, Trends Biochem. Sci. 15, 347-351
(1990).
952 Bibliografía
/'"
'
Darnell, J. E., Jr., The processing of RNA, Sci. Am. 249(4):
90-100 (1983).
Deutscher, M. P., The metabolic role of RNases, Trends
Biochem. Sci. 13, 137-138 (1988).
Feagin, J. E., RNA editing in kinetoplastid mitochondria, J .
Biol. Chem. 265, 19373-19376 (1990).
Gegenheimer, P. y Apiron, D., Processing of prokaryotic
ribonucleic acid, Microbio[. Rev. 45, 502-541 (1981).
Guthrie, C. y Patterson, B., Splicosomal snRNAs, Annu.
Rev. Genet. 22, 387-419 (1988).
Humphrey, T. y Proudfoot, N. J., A beginning to the bio-
chemistry of polyadenylation, Trends Genet. 4, 243-245
(1988).
Littauer, U. Z. y Soreq, H., The regulatory function of
poly(A) and adjacent 3' sequences in translated RNA, Prog.
Nucleic Acid Res. Biol. 27, 53-83 (1982).
Maniatis, T. y Reed R., The role of small ribonucleoprotein
particles in pre-mRNA splicing, Nature 325, 673-678 (1987).
Mattaj, l. W., snRNAs: from gene architecture to RNA
processing, Trends Biochem. Sci. 9, 435-437 (1984).
Mowry, K. L. y Steitz, J. A., snRNP mediators of 3' end
processing: functional fossils?, Trends Biochem. Sci. 13, 447-
451 (1988).
Nagai, K., Oubridge, C., Jessen, T. H., Li, J. y Evans, P. R.,
Crystal structure of the RNA-binding domaín of the Ul
small nuclear ribonucleoprotein A, Nature 348, 515-520
(1990).
Ogden, R. C., Knapp, G., Peebles, C. L., Johnson, J. y
Abelson, J., The mechanism of tRNA splicing, Trends Bio-
chem. Sci. 6, 154-158 (1981).
Pace, N. R. y Smith, D., Ribonuclease P: Function and
variation, J. Biol. Chem. 265, 3587-3590 (1990).
Padgett, R. A., Grabowski, P. J., Konarska, M. M., Seiler, S.
y Sharp, P. A., Splicing of messenger RNA precursors,
Annu. Rev. Bíochem. 55, 1119-1150 (1986).
Proudfoot, N. J., How RNA polymerase II terminates trans-
cription in higher eukaryotes, Trends Biochem. Sci. 14, 105-
110 (1989). .,
Sharp, P. A., Splicing of messenger RNA precursor, Science
235, 766-771 (1987). ·
Si1:1pson, L., RNA editmg - A novel genetic phenomenon,
Science 250, 512-513 (1990).
sen. D.,. Ab:lson, J. N. y Schimmel, P. R. (Eds.), Transfer
RNA: Biological Aspects, Cold Spring Harbor Laboratory
(1980). [Contiene varios artículos sobre el procesamiento
del tRNA y del rRNA.] '
Steitz, J. A., "Snurps", Sci. Am. 258(6): 56-63 (1988).
Weintraub, H. M., Antisense RNA and DNA, Sci. Amer.
262(1): 40-~(> (1990).
Wic~e,.PS, M., How the messenger got its tail: addition of
polyf A) in the nucleus, Trends Biochem Sci. 15, 277-281
(1990). - .
Zamore, P. D., Zapp, M. L. y Green, M. R., RNA birtding: ~s
and basics, Nature 348, 485-486 (1990).
Capi tul o 29. Transcripción 953
Procesamiento postranscripcional
Altman, S., Ribonuclease, P. J. Bíol. Chem. 265, 20053-20056
(1990).
Altman, S., Baer, M., Cuerrier-Takada, C. y Vioque, A., ·
Enzymatic cleavage of RNA by RNA, Trends Biochem. Sci.
11, 515-518 (1986). [Discusión sobre la RNasa P.]
Banerjee, .A. K., 5' -Terminal cap structure in eukaryotic
messenger ribonucleic acids, Microbio[. Rev. 44, 175-205
(1980).
Bernstein, P. y Ross, R., Poly(A), poly(A) binding protein
and the regulation of mRNA stability, Trends Biochem. Sci.
14, 373-377 (1989,).
Bimstiel, M. L., Busslinger, M. y Strub, K., Transcription
termination and '3' processing: the end is in sight! Cell 41,
349-359 (19.85).
Boyer, P. D. (Ed.), The Enzymes (3.ª ed.), Vol. 15, Academic
Press (1982). [Contiene artículos sobre enzimas que proce-
san RNA.) ·
Breathnach, R. y Chambon, P., Organization and expres-
sion of eucaryotic split genes coding for proteins, Annu.
Rev. Biochem. 50, 349-383 (1981).
Cech, T. R. The chemistry of self-splicing RNA and RNA
enzymes, Science 236, 1532-1539 (1987).
Cech, T. R. y Bass, B. L., Biological catalysis by RNA, Annu.
Rev. Biochem. 55, 599-629 (1986).
Cech, T. R., RNA as an enzyme, Sci. Am. 255(5): 64-75
(1986).
Cech, T. R., Self-splicing of group I introns, Ann. Rev.
Biochem. 59, 543-568 (1990).
Chambon, P., Split gen~_s, Sci. Am. 244(5): 60-71 (1981).
Darnell, J. E., Jr., RNA, Sci. Am. 253(4): 68-78 (1985).
proteins, Proc. Natl. Acad. Scí. 79, 3097-3100 (1982).
Steitz, T. A., Structural studies of protein-nucleic interac-
ti?n: the sources of sequence-specific binding, Quart. Rev.
Btophys. 23, 205-280 (1990). [Una revisión autorizada. La
Sección 5.1.1.(a) explica el CAP y su complejo con el
.-DNA.)
von Hippel, P. H., Bear, D. G., Morgan, W. D. y McSwig-
gen, J. A., Protein-nucleic acid interactions in transcription:
a molecular analysis, Annu. Rev. Biochem. 53, 309-346
(1984).
Weber, l. T. y Steitz, T. A., Model of specific complex
between catabolite gene activator protein and B-DNA sug-
gested by electrostatic complementarity, Proc. Natl. Acad.
Sci. 81, 3973-3977 (198.4).
Wolberger, C., Dong, Y., Ptashne, M. y Harrison, S. C.,
Structure of phage 434 Cro/DNA complex, Nature 335,
789-795 (1988).
Yanofsky, C., Transcription attenuation, J. Bíol. Chem. 263,
609-612 (1988).
Yanofsky, C., Attenuation in the control of expression of
bacteria! operons, Nature 289, 751-758 (1981).
14. ¿Por qué no se observan transcritos primarios de rRNA
en E. co/i silvestres?
13. ¿Por qué los mutantes rets: son defectuosos en la trans-
cripción in vivo de los operones his y trp?
12. Charles Yanofsky y sus colaboradores han sintetizado
un RNA de 15 nucleótidos que es complementario al
segmento 1 del mRNA de trpL (pero sólo parcialmente
complementario al segmento 3). ¿Cuál es su efecto so-
bre la transcripción in vitro del operón trp? ¿Cuál es su
efecto si el gen trpL contiene una mutación en el seg-
mento 2 que desestabiliza la horquilla 2 · 3?
11. ¿Por qué la transcripción eucariótica no puede estar
regulada por atenuación?
10. Describir la transcripción del operón trp en ausencia de
ribosomas activos y de triptófano.
9. ¿Por qué la inhibición de la DNA gírasa en E. co/i inhibe
la expresión de los operones sensibles a los catabolitos?
8. ¿Cuál es la probabilidad de que la simetría del operador
lac sea puramente accidental?
7. ¿Cuál es la probabilidad de que la secuencia de 4026
nucleótidos de DNA que codifica para la subunidad P
de la RNA polimerasa de E. coli sea transcrita con la
secuencia de bases correcta? Háganse los cálculos supo-
niendo probabilidades de 0,0001, 0,001 y 0,01 de que
cadabase sea transcrita incorrectamente.
5' CAACGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCT T CCCGATA 3'
3' GTTGCATTGTGAAATGTCGCCGCGCAGTAAACTATACTACGCGGGGCGAAGGGCTAT 5'
*6. ¿Por qué las E. coli que son diploides para la resistencia
a la rifamicina y la sensibilidad a la rifamicina (rif /rif)
son sensibles a la rifamicina?
5. Indicar la caja de Pribnow, la región de -35 y el nucleó-
tido inicial sobre la hebra antisentido del promotor del
gen de tRNA Tyr de E. coli que se muestra debajo.
4. ¿Cuál es la ventaja experimental de utilizar IPTG en
lugar de 1,6-alolactosa como inductor del operón lac?
*3. ¿Por qué E. coli lacz- no exhibe actividad galactósido
permeasa tras la adición de lactosa en ausencia de
glucosa? ¿Por qué los mutantes lac y- carecen de activi-
dad P-galactosidasa en las mismas condiciones?
2. Los mutantes superreprímídos, I', codifican para repre-
sores lac que se unen al operador pero que no respon-
den a la presencia de inductor. Indicar los fenotipos de
los siguientes genotipos en términos de inducibilidad y
producción de enzimas.
' (a) I'O+z+ (b) l'O'Z: (c).J+o+z+ /I'O+z+
l. Indicar los fenotipos de los siguientes diploides parcia-
les lac de E. coli, en términos de inducibilidad y de
enzimas activos sintetizados.
(a) ¡-p+o+z+y- /rr-o-z-v-
(b) ¡-p+ocz+y-¡¡+p+o+-z-y+
(c) ¡-p+ocz+y+ ¡¡-p+o+z+y+
(d) ¡+p-ocz+y+ ¡¡-p+ocz-y-
Problemas
954 Problemas
3. Ribosomas
A. Estructura del ribosoma
B. Síntesis de polipéptidos: una visión general
C. Iniciación de cadenas
D. Elongación de cadenas
E. Terminación de cadenas
F. Precisión traduccional
G. lnhibidores de la síntesis proteica: antibióticos
, En este capítulo consideramos la traducción, es
decir, la . biosíntesis de polipéptidos dirigida por
mRNA. A pesar de que la formación del enlace peptí-
dico es una reacción relativamente sencilla, la com-
plejidad del proceso · de traducción, que implica la
participación coordinada de cerca de 100 macromolé-
culas, viene condicionada por la necesidad de unir de
manera precisa 20 restos de aminoácidos diferentes
en el orden especificado por un mRNA particular.
, Comenzaremos considerando el código genético,
que matea la correspondencia entre las secuencias de
los ácidos nucleicos y las secuencias de los polipépti-
dos. Segúidamente examinaremos las propiedades de
los tRNAS:, moléculas capaces de ser portadoras de
amínoácídos.y que, actúan de intermediarios durante
el proceso de traducción. Tras esto, estudiaremos lo
que se conoce de los ribosomas, las complejas máqui-
nas moleculares que catalizan la formación de los
enlaces peptídicos entre los aminoácidos especifica-
dos por el mRNA. De todas formas, la formación del
4. Control de la traducción eucariótica
A. Control traduccional por el grupo hemo
.r:
B. lnterferón
C. Enmascaramiento del mRNA
7. Síntesis no ribosomal de polipéptidos
2. RNA de transferencia
A. Estructura primaria y estructura secundaria
B. Estructura terciaria r
C. Aminoacil-tRNA sintetasas
D. Interacciones codón-anticodón-
E. Supresión de falta de sentido
6. Degradación de proteínas
A. Especificidad de la degradación
B. Mecanismos de degradación
r.
5. Modificación pé>straduccional
A. Digestión proteoütíca
B. Modificación covalente
1. El código genético
A. Mutagénesis química
B. Los codones son tripletes
C. Los genes son colineales con los polipéptidos que
especifican <'
D. Descifrando el código genético
E. La naturaleza del código
J
Capítulo 30
r º ~.ID)lLJJCCllOM
Figura 30-1
La forma cetónica del 5-bromouracilo (izquierda) es su
tautómero más frecuente. Sin embargo, a menudo asume
la forma enólica (derecha), la cual se aparea con la guanina.
Guanina
5-Bromouracilo (5BU) 5BU
(tautómero cetónico) (tautómero enólico)
is 4
6 3 N-H ....,...----
N~ / o
0-H .. ,O Br
N~
lj ~N···H-N ~ N
N--{ '>==N \
/ O ···H-N
\
H
o Br
Las mutaciones puntuales se generan por
alteración de bases ·
Las mutaciones puntuales pueden producirse como
consecuencia del tratamiento de un organismo con aná-
logos de bases o sustancias, que modifican químicamente
a las bases. Así, por ejemplo, el análogo de base
5-bromouracilo (SBU) se parece estéricamente a la
timina (5-metiluracilo) pero, gracias a la influencia de
su átomo de Br, electronegativo, adopta con frecuen-
cia una forma tautomérica que se aparea con la guani-
na, en lugar de hacerlo con la adenina (Fig. 30-1 ). En
consecuencia, cuando el SBU se incorpora en el DNA
en lugar de la timina, es capaz de inducir ocasional-
(a) Transiciones, en las que una purina (o una
pirimidina) es sustituida por otra purina o piri-
midina, respectivamente.
(b) Transversiones, en las que una purina es sus-
tituida por una pirimidina, o viceversa.
2. Mutaciones por inserción/deleción, en las que
uno o más pares de nucleótidos son insertados en
o delecionados del DNA.
Una mutación de cualquiera de estas tres clases sólo
puede ser revertida por otra mutación de su misma
clase, nunca por las otras.
A. Mutagénesis química
La organización en tripletes del código genético,
como veremos más adelante, fue establecida utilizan-
do mutágenos químicos, sustancias que inducen mu-
taciones. Por tanto, antes de entrar a estudiar el códi-
go genético discutiremos un poco acerca de estas
sustancias. Existen dos clases de mutaciones:
l. Mutaciones puntuales, en las que un par de bases
sustituye a otro. Estas a su vez pueden subclasifi-
carse en:
relacionada es cómo el código genético especifica el
principio y el final de una cadena polipeptídica.
De hecho, el código genético es un código de tripletes
que carece de comas, está degenerado y es no solapante.
En esta sección se describirá cómo fue determinado
esto y cómo fue descifrado el diccionario del código
genético.
ABCDEFGHIJ ...
ABC podría codificar para un aminoácido, BCD para
un segundo aminoácido, CDE para un tercero, etc.
Como alternativa, el código podría ser no solapante,
de forma que ABC especificara un primer aminoáci-
do, DEF un segundo, HIJ un tercero, etc. El código
podría, también, contener "signos de puntuación" in-
ternos, como en el código de tripletes no solapante
ABC, DEF, GHI, ...
En este código las comas estarían representadas por
bases o secuencias de bases particulares. Una cuestión
¿ Cómo está codificada la información genética en el
DNA? De acuerdo con la hipótesis un gen-una proteí-
na, el mensaje genético dieta las secuencias de ami-
noácidos de las proteínas. Dado que la secilencia de
bases del DNA es el único elemento variable de este
' polímero, que a excepción de esto es rnonótonamente
repetitivo, la secuencia de aminoácidos de una proteí-
na debe estar especificada de algún modo por la
secuencia de bases del segmento correpondiente de
DNA.
Una secuencia de bases de DNA podría especificar
una secuencia de aminoácidos de muchas maneras
imaginables. Con sólo 4 bases para codificar 20 ami-
noácídos,.' se requiere una combinación de varias de
ellas (un codón) para especificar un único aminoáci-
do. El mínimo requerido es un código de tripletes,
esto es, uno que utilice tres bases por cada codón.
Esto se debe a que existen 43 = 64 tripletes, o combi-
naciones diferentes de tres bases, mientras que con
dobletes el número de combinaciones posibles sería
de 42 = 16. Este último número resulta insuficiente
para especificar todos los aminoácidos. En un código
de tripletes, existirían hasta 44 codones que podrían
no codificar para aminoácido alguno. Por otra parte,
muchos aminoácidos podrían estar codificados por
más de un codón. Un código de este estilo sería,
utilizando un término prestado por las matemáticas,
un código degenerado. ~
Otro misterio era el mecanismo por el cual el apara-
to de síntesis de polipéptidos es capaz de identificar
codones en una secuencia continua de DNA. Por ejem-
plo, el código podría ser solapante, es decir, en la se-
cuencia
1. EL CÓDIGOGEN~TICO
enlace peptídico no genera necesariamente una pro-
teína funcional; muchos polipéptidos deben ser pri-
mero modificados postraduccionalmente, de una ma-
nera que estudiaremos en la sección siguiente. Tras
esto, estudiaremos los mecanismos que utilizan las
células para degradar proteínas, en .. un proceso que
debe equilibrarse con la síntesis de proteínas. Final-
mente, consideraremos la síntesis no ribosómica de
ciertos polipéptidos pequeños y poco habituales.
956 Sección 30-1. El código genético
Etilnitrosourea Mostaza de nítrégeno
· humanos. Los defensores de la· conservación
con nitrito argumentan que no utilizarlo pro-
vocaría aún más problemas. Esto es debido a
que sin este tratamiento aumentaría notable-
mente la incidencia del botulismo, una forma
de envenenamiento que a. menudo resulta fa- :
tal, provocada por la ingestión de neurotoxinas
proteicas secretadas por la bacteria anaeróbica
Clostridium botulinum (Sección 34-4C).
La hidroxilamina (NH20H) también induce transi-
ciones G · C ,. A· T, reaccionando específicamente
con la citosina para convertirla en un compuesto que
· se aparea con la adenina (Fig, 30-4). La utilización de
compuestos alquilantes como el dimetil sulfato,· la
mostaza de nítrógeno y la etilnitrosourea
o
· 11 ¡ CI~I2 - CH3
H N·-C-N 2
\N=O
Figura 30-4
La reacción con hidroxilamina convierte a la citosina en un
derivado que se aparea con la adenina.
Adenina. Citosina
lj -~N
. --{_·· N . / . o
H-0 H _
\ ¡·
__ 1/N • • • H - N)-----< ~
1/ '/ \\. N N-H···N ' \ .· N-{ "=~
I . o
H
\
N~H
Figura 30-3 .
La reacción con el ácido nitroso convierte (a) la citosina en
uracilo, que se aparea con la aoenína: y (b) la adenina en
hipoxantina, un derívado de la guanina (que carece del
grupo 2-amino de la guanina) capaz de aparearse con la
citosina.
Citosina . .
' Hípoxaneína.. .. , Adenina
(b)
Adenina Uracilo
..
Citosina
lj \ N
H
I
·O···H-N N
1/. N-H···N . t\
· N-{ · "=N
I o .
H
\ N-H
(a)
Capítulo 30. Traducción 957
que reaccionan para dar ácido nitroso, provocan tran-
siciones tanto A· T ,. G · C como G · C ,. A· T.
El nitrito, la base conjugada del ácido nitroso,
ha sido utilizado durante mucho tiempo como
un conservante para comidas preparadas. Sin
embargo, la observación de que muchos mutá-
genos también pueden ser carcinógenos (Sec-
ción 31-SE) sugiere que el consumo de comida
: que contiene nitrito es dañino para los seres
Nitrosaminas
R1
\
N-N=(J
R /
2
mente una transición A · T ,. G · C en rondas poste-
. riores de replicación del DNA. A veces, también, el
SBU puede incorporarse sustituyendo a la citosina, lo
cual provoca una transición G · C . ,. A · T.
El análogo de la adenina 2-aminopurina (2AP), se
aparea normalmente con la timina (Fig. 30-2a), pero a
veces forma ·un par de bases no distorsionado con la
citosina, pese a estar unido por un único puente de
hidrógeno (Fig. 30-2b). Por tanto, la 2AP también
,genera transiciones A · T • G · C y G · C ,. A.· T. ·
. En soluciones acuosas,· el ácido nitroso . (HN02) ·
desamina oxidativamente ·1as aminas primarias aro-
máticas, de forma que convierte la cítosína en uracílo
(Fig. 30-3a) y la adenina en hipoxantina, compuesto
similar a la guanina, capaz de formar dos de los tres
puentes de hidrógeno que forma la guanina con la
citosina (Fig. 30-3b). Por tanto, el tratamiento del
· DNA con ácido nitroso, o· con compuestos como las
• • nítrosamínas
Figura 30-2
El análogo de adenina 2-aminopurina se aparea
normalmente con (a) timina, pero en ocasiones lo hace
también con (b) citosina.
\ 1/
N N
N=< ' }--N
N-I-I···O . \
/
JI
2AP Citosina
H
I H-N
(b)
(a) N O CH
~7
1119 f 5 6\
IN 4 1 N···H-N J=« }--N.
N-If ••• O \
/
H.
2-Aminopurina (2AP) Timina
se restablece la pauta de lectura original. Consecuen-
temente, sólo las palabras que están entré los dos
cambios (mutaciones) . resultan modificadas. Como
ocurre en el ejemplo, una oración podría seguir te-
ASA OYU NAX OCA CON ESE AJO
de manera que todas las palabras posteriores al pun-
to de deleción son ininteligibles ( especifican aminoáci-
dos erróneos). Sin embargo, si se inserta una letra,
por ejemplo en la posición 9,
ASA OYU NAO CAC ONE SEA JO
(Aquí los espacios que separan las palabras no tienen
significado físico; sólo se han colocado para indicar la
pauta de lectura.) La delecíón de la cuarta letra, que
desplaza la pauta de lectura, transforma la oración
en
ASA HOY UNA OCA CON ESE AJO
génico de FCl. Operando de esta forma iterativa,
Crick y Brenner reunieron una colección de diferentes
mutantes rIIB, FC3, FC4, FCS, etc., en la que cada mu-
tante FC(n) es un supresor intragénico de su predece-
sor, FC(n-1). Los estudios de recombinación mostra-
ron, además, que las mutaciones impares son supre-
soras intragénicas de las pares, pero ningún par de
mutaciones impares diferentes ni de mutaciones pares
diferentes se suprimen entre sí. Sin embargo, los re-
combinantes que contenían tres mutaciones impares,
o tres mutaciones pares, sí que son fenotípicamente
de tipo salvaje.
Crick y Brenner explicaron estas observaciones _ a
través del siguiente conjunto de suposiciones: ·
1. La mutación inducida por proflavina FCO es o bien
una inserción o bien una deleción de un par de
· nucleótidos en el cistrón rllB. Si es una deleción,
tenemos que fCl es una inserción, fC2 una dele- . ~ . cion, etc., y viceversa.
2. El código es leído deforma secuencial, comenzando en
un punto fijo del gen. La inserción o la deleción de
un nucleótido desplaza la pauta de lectura de los
codones que forman los nucleótidos sucesivos (las
inserciones o deleciones de nucleótidos, por tanto,
reciben la denominación de mutaciones de pauta
de lectura). Así, el código no posee ningún tipo de
puntuación interna que indique la pauta de lectura
correcta; esto es, el código carece de comas.
3. El código está basado en tripletes.
4. ·Todos o casi todos los 64 tripletes o codones codifi-
can para un aminoácido; esto es, el código está de-
generado,
Estos · principios están ilustrados en la siguiente
analogía. Considérese tina oración (gen), en la cual las
palabras (codones) tienen todas tres letras (bases).
'·
B. Los codones son tripletes
En 1961, Francís Crick y Sydney Brenner, mediante
investigaciones genéticas acerca del carácter genético
previamente. desconocido de las mutaciones induci-
das por proflavina, determinaron que el código gené-
tico está organizado en tripletes. En el bacteriófago T4
una mutación particular inducida por proflavina, de-
nominada FCO, se encuentra situada en el cistrón rlIB
(Sección 27-lE). El crecimiento de este fago mutante
en un hospedador tolerante (E. coli B) resultaba en la
aparición ocasional de fagos que fenotípicamente
eran de --tipo salvaje, ya que eran capaces de crecer
en un hospedador restrictivo [E. coli K12(A); cabe
recordar que los mutantes rlIB producen unas calvas
grandes características en E. coli B, pero no pueden
lisar E. coli K12 (A)]. Sin embargo, estos fagos dobles
mutantes no son genotípicamente salvajes; la infec-
ción simultánea de un hospedador permisivo con un
fago doble mutante y un fago salvaje, producía pro- _
genie recombinante que poseía o bien la mutación .
FCO o bien una . mutación nueva que se denominó
FCl. Así, el fago que fenotípicamente es. salvaje es
en realidad un doble mutante que contiene las . dos
mutaciones, FCO y FCl. Estoe dos genes. son por tanto
supresores cada uno· del otro; esto es, son capaces de
eliminar las características mutantes del otro gen. Ade-
más, dado que se sitúan juntos en el cistrón rllB, son
supresores íntragénícos mutuos (supresores situados
en el mismo gen).
El tratamiento de FCl de manera idéntica al descri-
to para FCO arrojó resultados similares: la. aparición
de un nuevo mutante, FC2, que es un supresor intra-
Las mutaciones por inserción/deleción son
generadaspor agentes intercalantes
Las mutaciones por inserción o por delecton pueden
aparecer como consecuencia del tratamiento del DNA ·
con agentes intercalantes como el naranja de acridina o
la proflavina (Sección 28-4C). La distancia entre dos
pares de bases consecutivos se duplica como conse-
cuencia del intercalamiento de una de estas moléculas
entre ellas. La replicación de este DNA distorsionado
puede dar lugar a la inserción o delecíón ocasional de
uno o .más nucleótidos en el polinucleótido de nueva
síntesis. (Las inserciones o deleciones de grandes seg-
mentos de DNA surgen generalmente debido a entre-
cruzamientos aberrantes; Sección 33-2C.)
provoca frecuentemente la aparición ·de transversio-
nes. La alquilación de la posición N(7) de un nucleóti-
do de purina provoca su posterior despurinación en ·
una reacción semejante ~ la esquematizada en la Fig.
28-52a. El hueco que queda en la secuencia es relle-
nado por un sistema enzimático de reparación que
corrige errores (Sección 31-SB). Las transversiones
surgen cuando la purina perdida es sustituida por una
pirimidina. La reparación enzimática del DNA que ha'
sido dañado por la radiación UV también puede ge-
nerar transversiones.
· 958 Sección 30-1. El código genético
UUU especifica Phe
En principio, el código genético podría haberse de-
terminado simplemente comparando la secuencia de
bases de un mRNA con la secuencia de aminoácidos
del polipéptido que especifica. Sin embargo, en los
años 60, las técnicas de purificación y de secuencia-
ción de mRNAs no habían sido todavía desarrolladas.
Por ello, descifrar el código genético constituyó una
tarea muy difícil.
La punta de lanza más importante en el descifrado.
del código genético· fue el descubrimiento realizado
ASA HXO YYU NAZ OCA CON ESf~ AJO
lo cual, a partir de la tercera inserción, restablece la
pauta de lectura original. Lo mismo ocurriría para tres
deleciones. Como antes, cuanto más próximos están
los cambios más probabilidades existen de que la
oración mantenga su significado original.
Crick y Brenner no demostraron de manera conclu-
yente que el código genético está organizado en tri-
pletes debido a que no probaron que sus inserciones y
deleciones afectaran solamente a nucleótidos únicos.
Siendo estrictos, ellos demostraron que un codón está
formado Pº! 3r nucleótidos, donde r es el número de
nucleótidos en una inserción o en una deleción. A
pesar de que se asumió en ese momento que r = l, la
prueba definitiva de esta afirmación tuvo que esperar
a que se descifrara el código genético (Sección 30-10).
D. Descifrando el código genético
A fin de entender la manera cómo fue descubierto
el diccionario del código debemos primero revisar el
mecanismo de síntesis -de las proteínas. Los mRNAs
son incapaces de reconocer directamente a los ami-
noácidos. En lugar de ello, los mRNAs se unen específi-
camente a moléculas de tRNA, capaces de cargar· con el
aminoácido correspondiente (Fig. 30-6). Cada tRNA
contiene una secuencia de tres nucleótidos, su antíco-
dón, . la cual es complementaria a un codón en el
mRNA, que especifica el aminoácido transportado
por ese tRNA. Un aminoácido se une de forma cova-
lente a su tRNA correspondiente gracias a la acción
de un enzima específico que reconoce ambas molécu-
las (este proceso recibe la denominación de "carga"
del tRNA). Durante la traducción, el mRNA pasa por
el ribosoma de manera que cada codón, de forma
secuencial, se une a su correspondiente tRNA cargado
(Fig. 30-7). A. medida que este proceso va teniendo
lugar, el ribosoma transfiere el aminoácido unido al
tRNA al extremo de la cadenapolípeptídica en creci-
miento. C .. Los genes son colineales con Ios
polipéptídos que especifican
Al comenzar los años 60, Charles Yanofsky demos-
tró la colinealidad de genes y polipéptidos. Su demos-
tración se basó en el aislamiento de un conjunto de
mutantes de la cadena a de la triptófano sintasa de
E. coii, de 268 restos de aminoácidos, que está codifi-
cada por el gen trpA (Sección 29-3E). El mapa genético
de estos mutantes .se dedujo por cartografiado trans-
duccional (Sección 27-lE) y los cambios de aminoáci-
dos a los que daban lugar fueron establecidos por
análisis · de huellas (Sección 6- lJ). El orden de los
mutantes en el gen es el mismo que el orden de los
cambios de aminoácidos correspondientes en la pro-
teína (Fig. 30-5). Por tanto, el gen TrpA de E. coli es
colineal con el polipéptido que especifica.
niendo sentido ( el gen podría aún especificar una
proteína funcional), particularmente si los cambios
son próximos unos a otros. Dos deleciones o dos
inserciones, independientemente de lo próximas que
estén una de otra, no se suprimirían mutuamente sino
que desplazarían aún más la pauta de lectura. Sin
embargo, tres inserciones, por ejemplo de una X, una
Y y una Zen las posiciones 5, 8 y 12, respectivamen-
te, cambiarían la oración a
cartografiado transduccional, poseen el mismo orden que
los cambios de aminoácidos correspondientes en el.
polipéptido, determinados por análisis de huellas. .
Figura 30-5
Colinealidad del gen trpA de E. coli con el polipéptido para
el que codifica, la cadena a de la triptófano sintasa. Las
posiciones de las mutaciones del gen, determinadas por
Posición de
Gen trpA las mutaciones
¡
I
Cadena a de /
la triptófano + H3N coo
sintasa
~\\
/'
'""· 1 -: /' / /' -,
1 15 22 49 175 177 183 211 213 234 235 243 268
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Lys Phe Glu Tyr Leu Thr Gly Gly Gly Ser Gin Restos
t t t t t t t t t t t salvajes
Stop Leu . Val Cys Arg lle- Arg Val Cys Leu Stop Restos.
Gin Glu Asp mutantes
Met
Capítulo 30. Traducción 959
Figura 30·7 Dirección del movimiento
Diagrama esquemático de los procesos de traducción · del ribosoma sobre el mRNA
(síntesis ribosomal de un polipéptido ·a partir de un
molde de mRNA).
RNA mensajero .
3' 5'
RNA de
tra nsferenc,a
NH¿ OH
NH+
./ 3
Resto de
aminoácido
NH¿ Cadena polipeptídica en .. ···· -····
crecimiento
(RNA)n + NDP ' ' (RNA)n+l + P¡
en donde NDP representa un ribonucleósido difosfa-
to. En contraste con la RNA polimerasa, la polinu-
en 1961 por Marshall Nirenberg y Heinrich Matthaei,
quienes establecieron que ·UUU es el codón que espe-
cifica Phe. Ellos demostraron que la adición de po-
li(U) a un sistema de síntesis proteica libre de células
estimula únicamente la ·síntesis de poli(Phe). El siste-
Figura 30-6
Forma de "hola de· trébor' del RNA de transferencia,
mostrando su resto de aminoácido unido covalentemente
(parte superior) y su anticodón (parte interior; un segmento
de tres nucleótidos que se aparea con. el codón
complementario en el mRNA durante la traducción).
Anticodón
5'
ma de síntesis proteica libre de células fue preparado
lisando suavemente células de E. coli utilizando pol-
vos de aluminio. Tras la rotura de· las células se
centrifugaba el homogenado resultante para eliminar
las paredes celulares y las membranas. Este extracto
contenía DNA, mRNA, ríbosomas, enzimas y otros
constituyentes celulares necesarios para la síntesis
proteica. Cuando se añadían ATP, GTP y aminoáci-
dos, el sistema sintetizaba pequeñas cantidades · de
proteína. Esto fue demostrado suministrando al siste-
ma aminoácidos marcados con 14C y precipitando
las proteínas añadiendo ácido tricloroacético al final
de la incubación. El precipitado que se obtenía era
radiactivo.
Por supuesto que un sistema de síntesis ·proteica
libre de células produce las proteínas · especificadas
por el DNA celular. Sin embargo, tras la adición de
DNasa la síntesis de proteínas se detiene en unos
pocos· minutos, debido a que el sistema ya no puede
sintetizar mRNA y a que el mRNA original es degra-
dado rápidamente. Nirenberg · halló que fracciones
crudas que contenían mRNA de otros organismos
poseían una elevada actividad estimulando la síntesis
proteica en un sistema de síntesis de proteínas tratado
con DNasa.Este tipo de sistema, por tanto, sería
probablemente capaz de responder también a
mRNAs sintéticos.
En posteriores experimentos, los mRNAs sintéticos
utilizados por Nirenberg fueron obtenidos utilizando
el enzima polinucleótido fosforilasa, de Azotobac-
ter uinelandii. Este enzima, que fue descubierto por
Severo Ochoa y Marianne Grunberg-Manago, une
nucleótidos en la reacción
Resto de
aminoácido
+ NH3
. 1
R-C-H
1 C=O
1 o
960 Sección 30-1. El código genético
ª La incidencia relativa se define aquí como 100 x la probabilidad de
presencia / 0,44.
Fuente: Matthaei, J.H., Jones, O.W., Martín, R.G. y Nirenberg, M., Proc.
Natl. Acad. Sci. 48, 666 (1962).
2 0,01 GGG
12 Gly
36
35
37
14 Trp
Leu
Cys
Val
32
32
32
9
9
9
0,14
0,14
0,14
0,04
0,04
0,04
UUG
UGU
GUU
UGG
GUG
GGU
100 Phe 100 0,44 uuu
Cantidad
relativa de
aminoácido
Aminoácido incorporada
Probabilidad Incidencia
Codón de presencia relativaª El código genético se dedujo 'por medio de un
ensayo de unión a tripletes y la utilización de
polirribonucleótidos de secuencia conocida
En ausencia de GTP, que es necesario para la sínte-
sis proteica, los trinucleótidos, pero no los dinucleóti-
dos, son casi tan efectivos como los mRNAs promo-
viendo la unión a los ribosomas de tRNAs específicos.
Este fenómeno, que Nirenberg y Philip Leder descu-
brieron en 1964, permitió que se identificaran los
diferentes codones mediante un sencillo ensayo de
unión. Los ribosomas, junto con los tRNAs unidos a
ellos, son retenidos por un filtro de nitrocelulosa. Sin
embargo, el tRNA libre no queda retenido. El tRNA
particular que quedaba unido a los ribosomas fue
identificado utilizando mezclas de tRNAs cargados en
las que sólo uno de los restos de aminoácido unidos
a los tRNAs se encontraba marcado radiactiva-
mente. Por ejemplo, como era de esperar, se halló que
Tabla 30-1
Incorporación de aminoácidos estimulada por. un
copolímero aleatorio de U y G cuya relación molar
es 0,76:0,24
lo cual indica que o bien UCU o bien CUC especifica
Ser, mientras que el otro especifica Leu. Esta informa-
ción, junto con los datos de unión del tRNA, permi-
tieron asignar UCU a Ser y CUC _a Leu. Estos datos
probaron también que. los codones están formados
por un número impar de nucleótidos, eliminando
cualquier sospecha residual de que los codones estu-
vieran formados por seis nucleótidos en lugar de
tres.
Se·r - I. ... eu - Ser - Leu - Ser - Leu - • • •
de forma que especifica una cadena polipeptídica de
dos restos de aminoácidos que se alternan. De hecho,
se observó que este mRNA estimulaba la produc-
ción de
ucu cuc ucu cuc ucu c ...
UUU estimula la unión a los ribosomas solamente del
tRNA cargado con Phe. De ·1a misma manera, UUG,
UGU y GUU estimulan la unión de Leu, Cys y Val,
respectivamente. De esta forma se pudieron identifi-
car los aminoácidos especificados por unos 50 codo-
nes. Para los codones restantes, el ensayo de unión
resultaba o bien negativo (no había tRNA unido), o
bien ambiguo.
El diccionario del código genético fue completado y
los resultados previos confirmados gracias a la sínte-
sis de H. Gobind Khorana de polirribonucleótidos con
secuencias repetidas específicas. En un sistema de
síntesis proteica libre de células, UCUCUCUC ···, por
ejemplo, es leído
cleótido fosforilasa no utiliza molde. En lugar de ello,
une los nucleótidos disponibles en el medio de una
manera aleatoria, de forma que la composición. de
bases del RNA que se produce refleja la composición
de NDPs de la mezcla de reacción.
Nirenberg y Matthaei demostraron que el poli(U)
estimula la síntesis de poli(Phe), incubando poli(U) y
una mezcla de 1 aminoácido radiactivo y los 19
restantes no marcados en un sistema de síntesis pro-
teica tratado con DNasa. El precipitado proteico con-
tenía una cantidad significativa de radiactividad so-
lamente cuando el aminoácido marcado era la fenila-
lanina. En consecuencia, el codón UUU debe ser el que
especifica Phe. En experimentos similares utilizando
poli(A) y poli (C) se halló que se sintetizaban po-
li(Lys) y poli(Pro), respectivamente. Por tanto, AAA
especifica Lys y CCC especifica Pro. [El poli(G) no
puede funcionar como mRNA sintético debido a que,
en condiciones desnaturalizantes, se agrega· para for-
mar lo que se cree que es una hélice de cuatro hebras.
Un mRNA debe estar en forma de cadena sencilla
para poder dirigir su traducción; Sección 30-20.]
Nirenberg y Ochoa, independientemente, emplea-
ron copolímeros de ribonucleótidos para seguir desci-
frando el código genético. · Por ejemplo, en un po-
li(UG) que contenía un 76 °/o de U y un 24 o/o de G, la
probabilidad de que un triplete sea UUU es de 0,76 x
0,76 x 0,76 = 0,44. De la misma manera, la probabili-
dad de un triplete que contenga dos U y una G, es
decir, UUG, UGU o GUU, es de 0,76 x 0,76 x 0,24 =
0,14. La utilización del poli(UG) como mRNA indica-
ba por tanto la composición de bases, aunque no la
secuencia, de los codones que especificaban algunos
aminoácidos (Tabla 30-1). Utilizando copolímeros
que contenían 2, 3 y 4 bases, se dedujo la composi-
ción de bases de los codones que específícaban cada
uno de los 20 aminoácidos de las proteínas. Además,
estos experimentos demostraron que el código genético
está degenerado dado que, por ejemplo, poli(UA), po-
li(UC) y poli(UG) dirigen los tres la incorporación de Leu
a un polipéptido.
Capítulo 30. Traducción 961
E. La naturaleza del código .
EL diccionario del código genético, tal como fue
deducido utilizando los métodos antes descritos, se
presenta en la Tabla 30-2. El examen. de esta tabla
indica que el código genético presenta algunas carac-
terísticas destacables:
1. El grado de degeneración del código es muy elevado.
Tres aminoácidos, Arg, Leu y Ser, son especifica-,
dos cada uno por seis codones, y la mayoría de los
restantes aminoácidos lo son o bien por cuatro, o
por tres o por dos codones. Sólo existen dos ami-
noácidos, Met y Trp,' especificados por un único
codón. Los codones que especifican el mismo ami-
noácido reciben la denominación de sinónimos.
2. La organización de la tabla del código no es al.eatoria.
La mayoría de los sinónimos ocupan el mismo
recuadro de la Tabla 30-2; esto es, difieren única-
. mente en su tercer nucleótido. Las únicas excepcio-
nes son Arg, Leu y Ser los cuales, al ser codificados
por seis codones, deben ocupar más de un recua-
dro. XYU y XYC siempre especifican el mismo
aminoácido; XYA y XYG también, exceptuando
.dos casos. Además, los cambios en la primera posi-
ción del codón tienden a especificar aminoácidos
similares, cuando no el mismo, mientras que los
codones que poseen· pirimidinas en su segunda
posición codifican en su mayoría para aminoácidos
(Sección 30-3C). Sin embargo, especifican también
los restos de aminoácidos Met y Val, respectiva-
mente, en posiciones internas de las cadenas polipep-
tídicas. (El descubrimiento de Nirenberg y Matthaei
de que UUU especifica Phe fue posible gracias a que
los ribosomas inician la síntesis · de polipéptidos a ·
partir de un mRNA de manera indiscriminada si la
· concentración de Mg2+ se eleva a niveles no fisiológi-
cos. En sus experimentos esto era así, aunque de
manera no intencionada.)
Figura 30-8
Un mRN-A puede leerse siguiendo una cualquiera de tres
pautas de lectura posibles, cada una de las cuales da lugar
a un polipéptido diferente.
••• Tercera pauta
de lectura 1
••• Segunda pauta
de lectura 1
••• Primera pauta
de lectura
·I
Inicio de la primera
pauta de lectura. l
•U •A •C •U •A •C ·U •A •C •U •A •C
Inicio de la segunda
pauta de lectura
Inicio de la tercera
pauta de lectura
Val - Ser - Lys Stop Val - Ser - ••• .
UGA es la tercera señal de terminación. Estos codo-
nes de terminación (ustop codons"), cuya existencia ya
había sido inferida de experimentos genéticos, se co-
nocen, de forma quizás un tantoinapropiada, como
codones sin sentido. debido a que son los únicos
codones que no especifican aminoácidos. UAG, UAA
y UGA son conocidos también como los codones
ámbar, ocre y ópalo,. respectivamente. [Estos nom-
bres derivan de una broma de laboratorio: la palabra
alemana para ámbar es Bemstein, el nombre de un
individuo que colaboró en el descubrimiento de las
mutaciones .. ámbar (mutaciones que convierten - cual- ·
quier otro codón en UAG); ocre y ópalo son juegos de
palabras derivados de ámbar.]
AUG y GUG son codones de iniciación de cadenas
Los codones AUG y con menos frecuencia GUG
forman parte de la secuencia de iniciación de cadenas
GUA AGU AAG lTAA GUA AGU •••
De la misma manera, el poli(GUAA) da lugar a dípép-
tidos y tripéptidos debido a que UAA es también una
señal de terminación de cadenas:
lle - Asp - Arg Stop . lle - Asp - • • •
Los codones UAG, UAA y UGA son codones de
terminación
En contraste con los resultados anteriores, el po-
li(AUAG) sólo permite obtener dípéptídos y tripépti-
dos. Esto es debido a que UAG es una señal para que el
ribosoma acabe la síntesis de proteínas: ·
AUA GAU AGA UAG AUA GAU •••
Tyr - Leu - Ser - lle - Tyr - Leu- ··•
La secuencia de aminoácidos de este polipéptido indi-
ca que el extremo 5' del mRNA corresponde al extre-
mo N; esto es, ·ez nzRNA se lee en la dirección 5' • 3'.
Los mRNAs son leídos en· dirección S' • 3'
La utilización de tetranucleótidos repetitivos indicó
la dirección de lectura del código e identificó los
codones de terminación de cadenas. El poli(UAUC)
especifica, como se espera, un polipéptido con una
repetición tetrapeptídica:
51 . . . ' 3'
UAU CUA UCU AUC UAU CUA •••
Secuencias alternadas de tres nucleótidos, como
poli(UAC), especifican tres homopolipéptidos diferen-
tes, debido a que los ribosomas pueden · iniciar la
síntesis a partir de estos mRNAs sintéticos en cual-
quiera de las tres pautas de lectura posibles (Fig.
30-8). Los análisis de los polipéptidos especificados
por varias secuencias alternadas de dos ytres nucleó-
tidos confirmaron la identidad de muchos codones y
acabaron de completar partes perdidas del código ge-
nético.
962 Sección 30-1. El código genético
El código genético "estándar" está muy extendido,
pero no es universal
Durante mucho tiempo se pensó que el código
genético "estándar" (el que se muestra en la Tabla
Algunos segmentos de DNA fágíco contienen
genes solapados en pautas de lectura diferentes
Dado que cualquier secuencia de nucleótidos puede
tener tres pautas de lectura posibles, puede ocurrir
que, al menos en teoría, un mismo polinucléotido
codifique para dos o incluso· para tres polípéptidos
diferentes. Sin embargo, esta idea no se había consi-
derado seriamente ya que se suponía que las restric-
ciones evolutivas de incluso dos genes en diferentes
pautas de lectura serían tan.grandes que ninguno de
los dos podría codificar para proteínas con funciones
importantes. Constituyó entonces una sorpresa el
anuncio de Frederick Sanger, en 1976, de que-el DNA
del bacteriófago <t>X174 contiene dos g.enes que están
completamente incluidos dentro de genes mayores de
pautas de lectura diferentes (Fíg. 30-9). Además, el
extremo de los- genes solapan tes D y E contiene la
secuencia de control de la Iniciación ribosomal del
gen J, por lo que este corto segmento de DNA posee
una triple función. Las bacterias también muestran
este tipo de economía codificadora; la secuencia ini-
ciadora ribosomal de un gen en un mRNA policistró-
nico se solapa con el extremo del gen precedente. No
obstante, no se han hallado genes completamente
solapados más que en fagos pequeños de DNA de
cadena sencilla. Probablemente esto es debido a que
estos fagos deben sacar el máximo provecho del esca-
so DNA que son capaces de empaquetar en el interior
de sus cápsides.
Muchas de las mutaciones que provocan las susti-
tuciones de aminoácidos en una proteína se reducen,
de acuerdo con el código genético, a mutaciones que
afectan a un solo punto de la secuencia. Por ejemplo,
todas las sustituciones de aminoácidos excepto una de
las que afectan a la cadena a de la triptófano sintasa,
representadas en la Fig. 30-5, resultan de cambios en
una sola base. Sin embargo, debido a que el código está
degenerado,· muchas mutaciones puntuales en la tercera
posición de un codón son fenotípicamente eilenciosas;
esto es, el codón mutado especifica el mismo aminoácido
que el codon salvaje. La degeneración puede explicar
hasta el 33 °/o de la variación en contenido G+C ob-
servada para el DNA de diferentes organismos (Sec-
ción 28-1 ), cuyo rango se encuentra entre el 25 y el
75 °/o. La presencia frecuente de Arg, Ala, Gly y Pro
tiende también a dar contenidos G+C elevados, míen-
tras qu.e ocurre lo contrario con los aminoácidos Asn,
lle, Lys, Met, Phe y Tyr.
hidrofóbioos, y los que contienen purinas en la
segunda posición codifican para aminoácidos ge-
neralmente polares.. Aparentemente, el, código ha
evolucionado de manera que se han minimizado los
efectos nocivos de las mutaciones.
Capítulo 30. Traducción 963
Figura 30-9
Mapa genético del bacteriófaqo <tiX1741 determmado por el
análisis de la secuencia de DNA. Los genes están
indicados A, B-, C, etc. Obsérvese que el gen B está .
totalmente incluido. en el gen A y que el E lo está en el D.
Estos pares de genes se leen con pautas de lectura
diferentes, y por tanto especifican proteínas no
relacionadas. Las regiones no marcadas correspond.en a
secuencias de control no traducidas.
A
--~\,
: ..
~ ,.,.
_,: ·, .".
ª AUG forma parte de la señal de iniciación y también codifica
los restos de Met internos.
Tercera
posición
(extremo 3')
G
u
e
A
G
u
e
A
G
u
e
A
G
u
e
A
G
e
GUµ ·· GCU ·.
GUC
GUA"Val
GUG
G
A
; . .t\UU ·
e
cuu
u
A u
. . ,
posicion
(extremo 5')
Segunda posición
Primera
Tabla 30-2
El código genético "estándar"
A. Estructuras primaria y secundaria
En 1965, tras un esfuerzo de si~te años, Robert
Holley reportó la primera secuencia de bases conoci-
da de un ácido nucleico de importancia biológica, la
secuencia del tRNA de la alanina (tRNAA1ª; Fig. 30-
11). Para poder hacerlo, Holley tuvo que solucionar
varios obstáculos importantes:
1. Todos los organismos contienen muchas clases de
tRNA (al menos una para cada uno de los 20
aminoácidos), que son de difícil separación ya que
poseen propiedades casi idénticas (véase más ade-
lante). Hubieron de desarrollarse técnicas prepara-
tivas que permitieran la obtención de un gramo
aproximadamente de tRNAAia puro de levadura,
que era lo que necesitaba Holley para su determi-
nación de secuencia.
2. Holley tuvo que inventar los métodos que fueron
utilizados inicialmente· para la secuenciación del
RNA (Sección 28-6).
3. Diez de las 76 bases del tRNAAla de levadura están
modificadas (véase más adelante). Sus fórmulas
te (Fig. 30-10). Crick sugirió que estos adaptadores
contienen RNA, ya que de esa forma el reconocimien-
to de codones podía realizarse por apareamiento de
bases. Aproximadamente en esa época Paul Zamec-
nik y Mahlon ·ttoagland descubrieron que, en el
transcurso de la síntesis proteica, los aminoácidos
marcados con 14C se unen transitoriamente a una
fracción de RNA de baja masa molecular. Investiga-
ciones posteriores indicaron que estos RNAs, denomi-
nados al principio "RNA soluble" o "sRNA" pero que
ahora se conocen como RNA de transferencia (tRNA)
son, de hecho, las moléculas adaptadoras que habían
sido postuladas por Crick .. ·
ª N representa cualquiera de los cuatro nucleótidos. ·
b También actúa formando parte de la señal de iniciación.
e AGA solamente; en el DNA mitocondrial de Drosophila no apare-
ce ningún codón AGG.
Fuente: Breitenberger, C. A. y QajBhandary, U. L., Trends Biochem.
Sci. 10,. 481 (.1985).
Leu lle
Trp
Arg Arg Código "estándar" Stop
Ser'
? •
? • Thr Trp
Trp
Trp
TrpTrp Stop Mamíferos
Levadura de
panadería
Neurospora crassa
Drosophila
Protozoos
Plantas
UGA AUA CUNª AGª CGG Mitocondria
Tabla 30-3
Desviaciones del código genético '' estándar'' en las
mitocondrias
La asignación de la función genética al DNA llevó a
deducir que las· células u traducían" de alguna manera
el lenguaje de la secuencia de bases al lenguaje de- los
polipéptídos. Sin embargo, ·los ácidos nucleicos no se
unen específicamente con los aminoácidos. En 1955, ·
Francis Crick postuló la que se conoció como la hipó-
tesis del adaptador. Proponía que la traducción tiene
lugar gracias a la mediación de moléculas "adaptado-
ras". Se propuso que cada adaptador llevaba un ami-
noácido añadido específicamente demanera enzimá- ·
tica, al tiempo que reconocía el codón correspondien-
2. RNA DE TRANSFERENCIA
30-2) era universal. Esta suposición estaba basada, en
parte, en observaciones de· que una clase de organis-
mo (por ej., E. coli) puede traducir de manera precisa
los· genes de organismos muy diferentes (por ejemplo
humanos). De hecho, este fenómeno constituye la
base de la ingeniería genética. Una vez que el código
genético "estándar" se hubo establecido, presumible-
mente durante la evolución prebiótica (Sección 1-4B),
cualquier mutación que alterara la forma como se
traducía el código producía numerosas modificacio-
nes en la secuencia de la proteína que eran en su
mayoría perjudiciales. Indudablemente, existe una
poderosa selección en contra de tales mutaciones. Los
estudios de secuencia de DNA realizados en 1981
revelaron que los códigos genéticos de ciertas mitocon-
drias (las mitocondrias contienen sus propios genes y
sistemas de síntesis proteica, que producen entre 10 y 20
proteínas mitocondriales) son variaciones del código ge-
nético "estándar" (Tabla 30-3) .. Por ejemplo, en la mito-
condria de los mamíferos, además del codón AUG el
AUA es también un codón Met/iniciador, el UGA
especifica Trp en lugar de ser un codón de paro, y
AGA y AGG son codones de terminación en lugar de
codificar para Arg. Obsérvese que todos los códigos
genéticos· de las mitocondrias, exceptuando las de las
plantas, simplifican el código "estándar" incrementan-
do su degeneración. Por ejemplo, en el código mito-
condrial de mamíferos, cada aminoácido está especifi-
cado porlo menos por dos codones que difieren en su
tercer. nucleótido, Aparentemente, las restricciones
que limitan las modificaciones del código genético se
hacen más suaves debido al menor tamaño de los
genomas mitocondriales. Sin embargo, estudios más
recientes realizados en protozoos ciliados revelan que
los codones UAA y UAG especifican Gin en lugar de
"stop". Quizás UAA y UAG fueron codones lo sufi-
cientemente poco frecuentes en un ciliado primordial
(grupo que los estudios filogenéticos moleculares in-
dican que se diversificaron muy pronto en la evolu-
ción de los eucariotas) que permitieron que el código
cambiara sin que se produjeran efectos nocivos into-
lerables·. En cualquier caso tenemos que el código
genético "estándar", pese a que es ampliamente utilizado,
no es universal.
964 · Sección· 30-2. RNA de transferencia
Anticodón
Figura 30-11 .
Secuencia de bases del tRNAA1a de levadura, representado
en su forma de hoja de trébol. Los símbolos de los
nucleósidos modificados (en color) se explican en la
Fig. 30-13.
3'
Los tRNAs contienen numerosas bases modificadas
Una de las características más sorprendentes de los
tRNAs es su elevada proporción de bases modificadas
6. Todos los tRNAs acaban en la secuencia CCA, con
un grupo 3~ -OH libre. El -CCA puede estar especi-
ficado genéticamente o ser añadido de manera en-
zimática a los tRNAs inmaduros (Sección 29-4C).
7. Existen 13 posiciones invariables (siempre la mis-
ma base) y 8 semiinvariables (siempre una purina
o siempre una pirimidina), que aparecen en su
mayoría en las regiones de los lazos. Estas regiones
contienen también invariables correlacionadas;
esto es, pares de nucleótídos de los lazos que se
encuentran apareados en todos los tRNAs. La puri-
na · del lado 3' del anticodón se encuentra siempre
modificada. La importancia estructural de estas ca-
racterísticas será examinada en la Sección 30-2B.
La región de mayor variabilidad entre los tRNAs
conocidos se encuentra en el también denominado
brazo variable. Posee entre 3 y 21 nucleótidos de
longitud, y puede tener un segmento de bases aparea-
das de hasta 7 bp. El lazo del brazo D también puede
variar su longitud de 5 a 7 nucleótidos.
Capítulo 30. Traducción 965
l. Un grupo fosfato 5' terminal.
2. Un brazo de 7 bp que incluye al nucleótido 5'
terminal y que contiene apareamientos de b.
que no son del tipo Watson-Crick,. como C
Esta estructura es conocida como el brazo acej
o brazo de aminoácido, debido a que el rest
aminoácido que carga el tRN A se añade a su g
3' -OH terminal (Sección 30-2C).
3. Una horquilla-de 3 o 4 bases apareadas, que a
en un lazo de cadena sencilla que contiene
cuentemente la base modificada dihidrouri
(D; véase más adelante). La estructura com:
recibe la denominación de brazo D.
4. Una horquilla de 5 bases apareadas con un
que contiene el anticodón, el triplete de bases que
es complementario al codón que especifica el
tRNA. Esta estructura recibe la denominación de
brazo anticodón.
5. Una horquilla de 5 bases apareadas acabada en un
lazo monocatenario que contiene por lo general la
secuencia T'tfC ( donde 'V es el símbolo para la
pseudouridina; véase más adelante). La estructura
se denomina brazo T o brazo T'tfC.
estructurales tuvieron que ser deducidas a pesar de
que nunca fueron disponibles en cantidades supe-
riores al miligramo.
Desde 1965, las técnicas de purificación de tRNA y
de secuenciación han sido mejoradas enormemente.
Un tRNA puede ser en la actualidad secuenciado en
pocos días, a partir de únicamente ,._ 1 µg de material.
Actualmente se conocen las secuencias de bases de
-- 300 tRNAs de una amplia variedad de organismos
(muchas de ellas a partir de las correspondientes se-
cuencias de DNA). Su longitud varia entre 60 y 95
nucleótidos (18-28 kD), aunque la mayoría tiene una
longitud de ,.._ 76 nucleótidos.
Casi todos los tRNAs conocidos, como reconociera
Holley por primera vez, pueden representarse esque-
máticamente con una estructura secundaria denomi-
nada también de hoja de trébol (Fig. 30-12). Comen-
zando por su extremo 5', comparten las siguientes ca-
racterísticas.
Figura 30-1 O
La hipótesis del adaptador postula que el código genético
es leído por moléculas que reconocen un codón particular
y que a su vez son pórtadoras del aminoácido
correspondiente.
:r. . .
· : ·~ ., ,.f 1.tl:'' :.r .~.~~ Adaptadores
Polipéptido
El mantenimiento de la compleja estructura
terciaria de los tRNAs se debe a puentes de
hidrógeno e interacciones de apilamiento de bases
La complejidad estructural del tRNAPhe recuerda la
de una proteína. A pesar de que sólo 42 de sus 76
bases están en regiones de doble hélice, 71 de ellas
participan en asociaciones de apilamiento (Fig. 30-15).
La estructura también contiene 9 interacciones entre
bases que acaban de entrecruzar su estructura tercia-
ria (Figs. 30-14a y 30-15). Notablemente, casi ningu-
na de estas interacciones terciarias es del tipo Wats·on
y Crick. · La única que lo es parece ser el soporte
principal de la estructura molecular. Además, la ma-
yoría de las. bases implicadas en estas interacciones
son o bien invariables o semiinvariables, lo cual su-
. . .
giere poderosamente que todos los tRNAs poseen
1
B. Estructura terciaria
Las primeras investigaciones. fisicoquímicas de la
estructura del tRNA indicaron que posee una confor-
mación bien definida. Pese a ello, a pesar de los
numerosos estudios hidrodinámicos, espectroscópicos
y de entrecruzamiento químico, su estructura tridi-
mensional fue un enigma hasta 1974. Ese año se
. consiguió la estructura cristalina0de rayos X del
tRNAPhe con una resolución de 2,5 A, independiente-
mente por Alexander Rich en colaboración con Sung
Hou Kim y por Aaron Klug en un cristal diferente. La
molécula adopta una conformación en forma de L, en la
que una de las patas de la L está formada por los brazos
aceptor y T, plegados en una doble hélice continua pare-
cida al A-RNA (Sección 28-28), y la otra pata está
formada por los brazos D y anticodón (Fig. 30-1~). Cada·
pata de la L tiene una longitud de unos 60 A, y los
sitios aceptor de aminoácidos y anticodón se encuen-
tran en extremos opuestos, a una distancia de unos
.. 76 Á. El tRNA nativo es muy estrecho, con un ancho
de unos 20 a 25 Á, y esto resulta esencial para su
actividad biológica: durante la síntesis· de proteínas,
dos moléculas de RNA deben unirse simultáneamen-
te a dos codones de mRNA, ocupando posiciones
muy cercanas una de otra (Sección '30-30).
Las bases modificadas del tRNAAsp inhiben que
éste se cargue incorrectamente
El tRNAAsp de levadura posee solamente ocho nu-
cleótidos modificados postraduccionalmente. Cuando
se expresa este tRNA in vitro, se produce sin estas
modificaciones. A pesar de que el tRNAAsp sin modifi-
car se carga con aspartato tan eficientemente como el
tRNA nativo modificado, se carga también incorrecta-
mente con arginina, de una manera mucho más efi-
ciente que el tRNA nativo. Evidentemente, algunas
de las modificaciones de este tRNA actúan impidien-
do la carga de aminoácidos incorrectos.
nocidas, a pesar de que las bacterias mutantes para la
formación· de ciertas bases modificadas compiten po-
bremente con las bacterias normales correspondientes.
o hipermodificadas postranscripcionalmente (pueden
. llegar a representar el 20 o/o de las bases). Algunas de
las más de 50 de tales bases modificadas, junto con
sus abreviaciones estándar, se indican en la Fig. 30·
13. Los nucleósidos hipermodificados, como la i6A, se
encuentran por lo general adyacentes al nucleótido de
3' · del anticodón, siempre que éste sea A o U. Sus
bajas polaridades probablemente refuerzan las aso-
ciaciones relativamente débiles de estas bases con las ·
del codón, incrementando de esta forma la fidelidad
de la traducción, Análogamente, ciertas metilaciones
bloquean el apareamiento entre bases y de esta forma
impiden la formación de estructuras no adecuadas.
Pesea todo, ninguna de estas modificaciones es esen-
cial para el mantenimiento de la integridad estructu-
ral de un tRNA (véase más adelante). Tampoco son
esenciales para la correcta unión del tRNA al riboso-
ma y, con una sola excepción conocida (Sección 30-
2C), tampoco lo son para ligar el enzima que une al
aminoácido correcto. Las funciones de la mayoría de
las bases modificadas, por tanto, siguen siendo deseo-
Figura 30-12
Estructura secundaria de hoja de trébol del tRNA. Los
círculos rellenos conectados por puntos representan pares
de bases de tipo Watson-Crick, y tos círculos abiertos en
las regiones bihelicoidales. indican bases que están
implicadas en apareamientos que no son de tipo
Watson-Crick. Se indican también las posiciones
invariables; Re Y representan, respectivamente, purinas o
pirimidinas invariables; 'V representa pseudouracilo. Los
nucleósidos marcados con un asterisco están a menudo
modificados. Las regiones punteadas en los brazos D y
variable contienen un número diferente de nucléotidos en
los diversos tR NAs.
Anticodón
I
Brazo variable Brazo
Brazo T\j/C
aminoácido
A - OH Brazo del
1
e
1
e
1 o
1 ••• 1
• • 1 . • • • 1 1 •. •· 1 1 ••• 1 1
. Brazo D ,,.u • • •
;. O ,1 1
,,....,._..A i • .• • a-o-A* o \ \ ~
I • , ' , o-•· .. o •-•-•-•-e .
G* • • • • • • • • 1
\. · o-e...6...o •-•-•-•-G ' G.... A/ W. , 'A,; , ... s •. ,, C o-- o-, • ,, .- ...... , . -'f~j
• • • º'o ', 1 1 .. , ... - • • • 1 1
anticodón T • T •••
,: 'o\
u
3'
966 Sección 30-2. RNA de transferencia
bioquímico-de la adenosina. Los nucleósidos pueden estar
también metilados en las posiciones 2' de la ribosa,
formando restos cuyos símbolos serían, por ejemplo,
Cm, Gm y Um.
Figura 30-13
Selección de nucleósidos modificados presentes en· los .
tRNAs, junto con sus abreviaciones convencionales.
Obsérvese que,. pese a que la inosina se parece
químicamente a la guanosina, se trata de un derivado
Ribosa
1
N>
.,.___ N
\
Ribosa
N
1
CJ~Ia
R = H Wiosina (Wyo)
o
11
R = CH2CH2CH:(COCH3)2 Y
N2,N2-Dimetilguanosina (mlG) N'7-Metilguanosina (m7G)
N HaC-(
N
1
N>
.,.___ N
\
Ribosa
H,
N
(CH ),N~ . 3 2 N
1
o
R
\
o CH . a / .
+ N>
----- N .
\
o
[nosina (1) .N6-Isopenteniladenosina (i6 A) 1-Métiladenosina (m1A).
fl"' . N ·.
1
N\\
~ .,.__· NI
.. N .· \
Ribosa
N>
N
\
Ribosa
N~ ..
~I
N
N>
---- N
\
Ribosa
()
CH3 / .
NH - ClI2 - Clf =--= C
\
C""I-I . '•') ,.)
NH2.
T.l _ -, .
r1. ;:;l, ..L
. "'-. 1
N~
~.
N
N4-Acetilcitidina (ac4C) 3-Metilcitidina (m3C)
N/" 1
HN~N
I r
( e n 9) .1. Ri bosa + ¡-·-··.t
I-I 3N - (;I-I - (;0{) --
Lisidina (L)
N :::,.,--
I t
OAN.
r .
· Ribosa ·
NH2
o
· 11
NH-C-CH-{ •- NH2·
H3C,+
. '/ N
~·
O · N
r
Ribosa
Pseudouridina (w)
H,
N I
0-Á_N
1
Ribosa
4-Tiouridina (s4U)
o
s o
H, ~·f1·
.N 1,,,-C .1
Á_ ..
O N
1
Ribosa
Ribotimidina (T)
o
H . H··
'N H
. 0-Á_N · · .. H
I H
Ribosa ·
Dihidrouridina (D)
Ribosa
~ti~idéi;::~aé.i··U:t:ii.;i.ío
o
H, A /I-{ N N
Capítulo 30. Traducción 967
C. AminoaciltRNA sintetasas
La traducción precisa requiere que tengan lugar dos
importantes etapas de reconocimiento: (1) la elección del
aminoácido correcto para la unión covalente al tRNA; y
(2) la selección del tRNA cargado con aminoácido que
corresponda a lo especificado en el mRNA. La primera
de estas etapas, que está catalizada por enzimas espe-
cíficos de aminoácido denominados aminoaciltRNA
nativas cte tKNA, todas ellas con resoluciones iguales
o superiores a 3 ,O A. · Las estructuras moleculares de
estos tRNAs se parecen mucho a las del tRN,A.Phe de
levadura. Las diferencias estructurales más importan-
tes entre ellos surgen como consecuencia de una flexi-
bilidad aparente en el lazo anticodón y en el extremo
-CCA, así como de una flexibilidad como de bisagra
a nivel de las dos patas de la L, que hace que, por
ejemplo, el tRNAAsp de la levadura adopte una forma
de búmerang. Ello está en consonancia con lo espera-
do para que todos los tRN As puedan acomodarse
dentro de las mismas cavidades en el ribosoma.
el brazo anticodón en verde pálido, el brazo variable en
naranja, el brazo TwC en azul claro y el extremo 3' en rojo.
(b) Dibujo de la estructura de rayos-X, que muestra la
organización de sus segmentos bicatenarios para acabar
generando la molécula en forma de L. El esqueleto de
azúcar-fosfato s.e representa mediante una cinta· siguiendo
el mismo esquema de colores que en la Parte a. [Cortesía
de Michael Carson, University of Alabama at Bírrnínchan.l
(b)
conformaciones semejantes (véase más adelante). La
estructura también está estabilizada por varios puen-
tes de hidrógeno poco habituales entre las bases y
grupos fosfato, o entre las bases y los grupos 2' -0H
de restos de ribosa.
La estructura compacta del tRNAPhe de levadura
deriva de su elevado número de asociaciones intra-
moleculares, las cuales hacen que la mayoría de sus
bases sean inaccesibles al solvente. Las excepciones
más notables a esto son las bases del anticodón, y
también las bases del extremo -CCA, que· se carga
con el aminoácido correspondiente al tRNA. Induda-
blemente, estos dos grupos deben ser accesibles para
que puedan desempeñar sus funciones biológicas.
La observación de que las estructuras moleculares .-
del tRNAPhe en dos formas cristalinas diferentes son
esencialmente idénticas dio-gran crédito a la suposi-
ción de que su estructura ~~talina es muy próxima a
. \
su estructura en solución. Desafortunadamente, hasido notablemente difícil cristalizar otros tRNAs dife-
rentes que el tRNAJ'he. Hasta ahora se han reportado
las estructuras cristalinas de solamente tres especies
Figura 30-14
Estructura del tRNAPhe de la levadura. (a) Secuencia de
bases representada en la forma de hoja de trébol. Las
interacciones de apareamiento entre bases se representan
con líneas rojas que conectan las bases participantes. Las
bases conservadas o semiconservadas. en todos los- tRNAs
están encerradas en círculos continuos o punteados,
respectivamente. El extremo 5' está coloreado en verde
brillante, el brazo aceptor en amarillo, el brazo D en blanco,
-- : : Purina o pirimidina
constante
Q Nucleótido constante
Lazo T\j/C
3'
,_OH
@15
5' © Brazo aceptor
'-~ C-G
G - C 10
G-U
5 A - U
A
A
(a)
968 Sección 30-2. RNA de transferencia
Aminoacil-adenilato
(aminoacil-AMP)
Aminoácido
JI O O
1 11 11
R - (; - (_~ - O - P - O- Ribosa-Adenina + J?Pi.
1 1 · .
NHri o-
HI o
//
R- (;-C + ATP
. 1 \ -
Ntit O
Aminoacil-AMP + tRNA , '
aminoacil-tRNA + AMP
el cual puede ser aislado, ·para la mayoría de las ·
aminoacil-tRNAs en ausencia de tRNA, a pesar de
que normalmente permanece. unido estrechamente
al enzima.
2. Este compuesto reacciona entonces con el tRNA
para formar el aminoacil-tRN A:
sintetasas, añade un aminoácido al resto de ribosa
3' terminal de su tRNA correspondiente, formando
un aminoacil-tRNA (Fig. 30-16). Este proceso, de
por sí no favorecido, tiene lugar gracias a la hidrólisis
de ATP en dos reacciones secuenciales que son catali-
zadas por un mismo enzima.
1. En primer lugar se "activa" el aminoácido, a través
de su reacción con el A TP para formar un aminoa-
cil-adenilato:
esquina de la L. (De Kim, S.H., en Schimmel, P.R., Soll, D.
y Abelson, J.N. (Eds.), Transfer RNA: Structure, Properties
and Recognition, p. 87, Cold Spring Harbor Laboratory
(1979). El esquema d~I tRNA tiene el copyright© de lrving
Geis.]
Figura 30-15
Las nueve interacciones terciarias de apareamiento entre
bases en el tRNAPhe de la levadura. Obsérvese que,
excepto uno de ellos, todos los apareamientos implican
interacciones que no son de tipo Watson-Crick, y que
todas las interacciones están localizadas cerca de la
Dimetilguanina 26 Ríbosa
, Ribosa
Adenina 44
Ribosa Ribosa Citosina 13
Citosina 25
'· Guanina 10
•
antlcodon
Anticodón Lazo·
Guanina 45 Ribosa 7-Metil-
guanína 46
· Ribosa
Ribosa
Citosina 48
Ribosa
Ribosa
Adenina 23
Ribosa
Guanina 15
Uracilo 12
Ríbosa ..
Ribosa
Adenina g
Guanina
19
Citosina 56
Ribosa Ríbosa
Ríbosa
Guanina 4
Ribosa
Uracilo 69 1-Metíladenina 58 Guanina 18 ·
Timina 54
Capítulo 30. Traducción 969
•
FigurJ 30-17
Estructura de rayos-X de los restos 1 a 320 de la
tirosil-tRNA sintetasa. La posición de los dobles ejes
moleculares de esta proteína dimérica está indicada en la
parte inferior izquierda. [De Blow, D.M. y Briek, P., en
Jurnak, F.A. y McPherson, A., Biological Macromolecules
and Assembly, Vol 2: Nucleic Acids and lnteractive
Proteins, p. 448, Wiley (1985).J
Las diferentes aminoacil-tRNA sintetasas no .
pasan de ser parientes lejanos
Las células deben poseer al menos una aminoacil-
tRNA sintetasa para cada uno de los 20 aminoácidos.
La similitud de las reacciones catalizadas por estos
enzimas y la semejanza estructural de todos los
tRNAs sugiere que todas las aminoacil-tRNA sinteta-
Algunas aminoacil-tRNA sintetasas añaden un ami-
noácido exclusivamente al grupo 2' -OH terminal de
su tRNA correspondiente, mientras que otras lo hacen
al grupo 3'-0H, y aún otras loañaden a cualquiera de
estas dos posiciones. Esta selectividad, o la ausencia
de ella, fue _e,stablecida utilizando tRNAs modificados
químicamente que carecían de los grupos 2' -OH o
3' -0H de sus restos de ribosa 3' terminales. La utiliza-
ción de estos derivados fue necesaria ya que en so-
lución el grupo aminoacil se equilibra rápidamente
entre las posiciones 2' y 3'.
La reacción global de aminoacilación es
Amínoáddo» tRNA + ATP , '
aminoacil-tRNA + AMP + PP;
Esta reacción; es fácilmente reversible, debido a que
las energías libres de la hidrólisis de los enlaces for-
mados. tanto en el aminoacil-adenilato como en el
aminoacil-tRNA son comparables a la de la hidrólisis
de ATP. La reacción global está dirigida hacia la
formación de aminoacil-tRNA gracias a la hidrólisis
total del PP; formado en la primera etapa de ·1a reac-
ción, catalizada por el enzima pirofosfatasa inorgáni-
ca. La activación del aminoácido, por tanto, se parece
a la activación de los ácidos grasos (Sección 23-2A); la
diferencia principal entre estos dos procesos, ambos
· elucidados por Paul Berg, es que el tRNA es el aceptor
acilo en la activación de aminoácidos, mientras que
esta misma función la desempeña el CoA en la activa-
ción de ácidos grasos.
La tirosil-tRNA sintetasa opera a través de la
unión a un estado de transición
La· estructura de· rayos-X de· la tirosil-tRNA sinteta-
sa de Bacillus stearothermophilus, determinada por
David Blow, está representada en la Fig. 30-17. La
subunidad de 419 restos de este dímero a2 contiene
una región de lámina P que recuerda al pliegue de
· unión a dinucleótidos (Sección 7-3 B). Esta región·
constituye el sitio de unión a tirosil adenilato. Su
estructura es muy parecida a la región de unión a
ATP de la metionil-tRNA sintetasa de E. coli, la otra
única aminoacil-tRNA sintetasa de estructura conoci-
da. Los 99 restos e-terminales de la tirosil-tRNA
sintetasa, así como otros tres cortos segmentos de su
Figura 30-16
En los aminoacn .. tRNAs, el resto de aminoácido se
encuentra esterificado con el nucleósido 3' terminal del
tRNA, a través de su grupo 3'-0H (mostrado aquí), o bien a
través de su grupo 2'-0H.
Aminoacil-tRNA
O C>lI
1
(;==O
1
J--f-(j- :R
1 +
NI-I3
3' 2'
sas evolucionaron a partir de un ancestro común, y
por tanto deben estar relacionadas estructuralmente.
Sin embargo, este no es el caso. De hecho, las aminoa-
cil-tRNA sintetasas constituyen un. grupo diverso de
enzimas. Los más de 100 enzimas de esta clase que
han sido caracterizados poseen una de cuatro tipos
diferentes de estructura de subunidades, a, a2, a4 y
a2p2, cuyos tamaños varían entre 334 y > 1000 res-
tos. Además, a pesar de que las sintetasas específicas
para un aminoácido dado tienen considerables homo-
logías de secuencia entre los diversos organismos,
entre las específicas para aminoácidos diferentes exis-
ten muy pocas homologías. Muy probablemente, las
aminoacil-tRNA sintetasas surgieron muy pronto du-
rante la evolución, antes del desarrollo del aparato de
síntesis proteica moderno (exceptuando los tRNAs).
Adenina
1
()
l
O ·r ·) C) c·~·I-I ::::::::: .• -; ' - . e . ·2 (")
1
..
. . ~
- . o n
970 Sección 30-2. RNA de transferencia
Asp 176
Figura 30-18
Formación de tirosil adenilato, catalizada por la tirosil-tRNA
sintetasa. (a) El grupo tirosil carboxilato ataca el fósforo a
del ATP nuctectüícarnente (arriba), en una reacción de
desplazamiento debida a la formación de un estado de
transición bipiramidal trigonal (centro) que da lugar a tirosil
adenilato y PP; (abajo). (b) Los estudios de modelos
basados en la estructura de rayos-X de la tirosil-tRNA
sintetasa acompleiada con el tirosil adenilato (estable en
ausencia de tRNA Yq indican que el fosfato y del hidrógeno
reactivo del ATP se une a la Thr 40 y a la His 45 (arriba)
sólo en el estado de transición de la reacción. El tirosil
adenilato establece también 12 puentes de> hidrógeno con
el enzima (algunos se indican con líneas de puntos) que, en
apariencia, no resultan perturbados en el estado de
transición. [De Leatherbarrow, R.J., Fersht, A.R. y Winter,
-~ G., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 7841 (1985).]
Asp78 w
o
'
~·-· 40
(b)
PP, Tirosil adenilato
o // o
Tyr-C 11 +
\ .,, p __
O' \ -o~
o
1
Ado
Estado de transición blplramldaltrigonal
i
1
Ado
o
//
Tyr-C
\o
ATP
Tirosina
(a)
Capítulo 30. Traducción 971
cadena polipeptídica, no son visibles en la estructura
cristalina, y por tanto se supone que deben tener una
conformación desordenada. Cada uno de estos seg-
mentos contiene varios restos de Lys y Arg, implica-
dos en la unión con la molécula polianiónica de
tRNA. De hecho, los 320 restos N-terminales, obteni-
dos por ingeniería de proteínas, catalizan la forma-
ción de adenilato de tirosina sin cambios en la kcat ni
en la KM, pero ni aminoacilan ni se unen al tRNA Tyr
La mayoría de las proteínas de estructura conocida
que se unen a ácidos nucleicos poseen, como veremos
más adelante, regiones conformacionalmente móviles
que interactúan con el ácido nucleico correspondien-
te. Se ha sugerido por tanto que estas regiones desor-
denadas actúan uniendo sus ácidos nucleicos a través
de interacciones flexibles. ·1
A pesar de que se desconoce la forma de interac-
ción entre la tirosil-tRNA sintetasa y el tRNATyr, la
elaboración de modelos acoplada a los estudios de
ingeniería de proteínas han revelado e1 mecanismo
por el cual este enzima adenila la tirosina. Los estu-
dios químicos han demostrado que esta reacción tiene
lugar a través de la inversión de la configuración a
nivel del fósforo a del A TP. Esta observación implica
que la reacción supone un único desplazamiento, en
el cual el grupo tirosil carboxilato actúa de nucleófilo,
y el PP; es el grupo que se elimina (Fig. 30-18a). La
elaboración de modelos realizada por Alan Fersht y
Greg · Winter, basada en esta premisa, junto con la
estructura de rayos-X del complejo tirosil adenilato
4~ .la tirosil:-tRNA sJr,itet9-ªª'. indican que el. enzima
opera uniéndose pref'7r~nttínen:t~; al estado ... de tran-
sición {Seccióri · 14,:·1F}:·,.'.,él.· fosfato t'/del. e:s~a1
do de transición pentacoordinado ·ae la reacción, pe-
ro' no· sus reactantes osus productos. se- une através
de puentes de 'hidrógeno a.Ias cadenas laterales cíe: la
Thr 40 y de la His 45. (Fig. 30~ 18b). Fersht. y_.:)Vinter
confirmaron esta conclusión a través de estudies de . - ~ . . . . .
ingeniería de .proteínas .en. los .. 'que· sus.tit~yerg;n la
.Thr 40 por A.la y/ o- la His 45:. (que· es un aminoécído
conservado por; la evolución en las.amínoacíl-tkblé,
sintetasas) por la.Gly. Todos estos enzimas. mutantes
tenían su capacidad catalítica: muy reducida (el doble
mutante presentaba una' reducción de·'3 'x·,·10~ .. veces
en su kcatt ª pesar de que -todos ellos se .únían tanto a
la tirosina como al ATP con afinidades .Pr~~t~camente
iguales al· enzima nativo. 'Obsérvese que. las interac-
cienes' que estabilizan el estado de transición s.e esta-
blecen a alguna distancia del sifio de .reacci9n con el
fósforo. ci. Además, el enzima no pGs~e.g~pos funcio-
nales 'catalíticámente .activos, 'del tipo .ácidos o bases,
en las proximidades del sitio de- re.~~c~ón.'. Ityig.erlte-
mente. las .reactividades inherentes ~1 'grupo ·nucl,eofí-
lito tirosil carboxilato y al PP; activado qu~. se elimi-
na del A TP son suficientes para dirigir la reacción
a una velocidad satisfactoriamente elevada (so-
bre las 109 veces superior a la reacción no catalizada),
y esto solamente basándose en la unión del estado de
transición combinada con la proximidad de los reac-
tantes y efectos de orientación (Sección 14-lE).
Figura 3.0-20
Modelo tridimensional del tRNAAla de E. coli, basado en la
estructura de rayos-X del tRNAPhe de levadura (Fig. 30-14).
En este modelo los nucleótidos que son diferentes en el
tRNAcys de E. coti están tesaltados en celeste, mientras
que el par de bases G8 · U70 se resalta- en color marfil.
[Cortesía de Ya-Ming Hou, MIT.]
Estos datos· sugieren que las características de un
tRNA reconocido por su aminoacil-tRNA sintetasa
correspondiente son propias de cada tRNA. Las mani-
pulaciones genéticas realizadas por Paul Schimmel
revelaron 'que estas características, al menos para una
clase de tRNA, son sorprendentemente sencillas. Nu-
merosas alteraciones de la secuencia del tRN A Ala de
E. colino afectan de forma apreciable su capacidad de
ser aminoacilado con alanina. Pese a ello, la mayoría
de las sustituciones de bases en el par de bases
G3 · U70, situado en el brazo aceptar del tRNA (Fig.
30-19a), disminuyen enormemente esta reacción.
Además, la introducción de un par de bases G · U en
la posición análoga del tRNA Cys y del tRNAPhe provo-
ca que sean aminoacilados con alanina, incluso a
pesar de que existen muy pocas similitudes de se-
cuencia adicionales entre .estos tRNAs mutantes y el
tRNAAlª (por ej., Fig. 30-20). De hecho; la alanil-tRNA
sintetasa de E. coli es capaz de aminoacilar eficiente-
mente incluso una "mícrohélice" de 24 nucleótidos,
derivada del brazo aceptar que contiene el par
G3 · U70 del tRNAAia de E. coli (véase más adelante).
Dado que los únicos tRNAs de- E. coli conocidos que
poseen un par de bases G3 · U70 son los tRNAAIª, y
que este par de bases está presente también en los
tRNAAIª de otros muchos organismos, incluyendo la
levadura (Fig. 30-11), todas -estas observaciones su-
gieren poderosamente que el par de bases G3 · U70 es
Las características estructurales reconocidas por
las aminoacil-tRNA sintetasas deben ser bastante
sencillas
Se han invertido considerables esfuerzos en la com-
prensión del mecanismo de reconocimiento entre las
aminoacil=tkf-lAs sintetasas y sus correspondientes
tRNAs. Los métodos utilizados incluyen la utilización
de fragmentos específicos de tRNA, tRNA·s mutageni-
zados y agentes de entrecruzamiento. Los' 'sltios de
contacto más frecuentes entre las tR'.NA sintetasas y el
tRNA tienen lugar en la cara interna (cóncava) de la
L. Aparte de esto, existen pocas regularidades en la
manera como· los diferentes tRNAs reconocen asus
correspondientes s1ntetasas. De hecho; las sintetasas
más pequeñas reconocen solamente la región acepta-
ra· de sus tR.NAs., mientras que los enzimas mayores
contactan gran parte de la superficie interior de sus
tRNAs (véase más adelante). Por tanto, el anticoáon
no participa necesariamente en el proceso de reconoci-
miento.
Figura 30-19
Elementos principales de identidad en cuatro tRNAs. Cada
base en e.l _tRNA se representa mediante un círculo. Los
círculos rojos indican posiciones demostradas de identidad
para el reconocimiento del tRNA por. su correspondiente
aminoacil-tRNA síntetasa, En todos los casos podrían_ aún
descubrirse otros elementos de identidad. [De Schulman,
L.H. y Abelson, J. Sctence 240, 1592 (1988).]
•
• o
• / G73
:- C72
• -C71
: - UA70
o
o o•
••••• o •
G1 -• G2 -•
AU3 -:
f>
C11:
111 • 1 •• • º"'º ...
(d) tRNA Ser
• •
• it •••
G34 / r 'A36
A35
·. . . ·- ... •• •
1 •
G20 • • • • •
•• • ••• • •
•
o
••• 4f, • • ••
•
Q;
• • • • • •• • •••• 3 •
~
• • • -A73 • • • •
(b) tRNAPhe (levadura)
~
&
"' o
~ • O,
• {!)
e• •
O •e~ e G
il!
• . '1> .,
~
• • o
!!,
o .. o t,
(!) t.' • o, ,to o ;¡,
e
01;\~lt~ 4;
• • S[> 4l
• e 0 • "• o
·~ •.• I} ~ •
,a •ec,
• o • • $ is,
o •
• e • • •
G35 / r 'U37
· A36
(e) tRNA~et
• • • • • • • •• •• • • • •• • •• • • • • • •• • • • • • • • • • • •••
• • • • • •
• - U70 • • • • • • • • • • • • •
• • G3 -• • • • • • • • • • •••• •
(a) tRNAAla
972 Sección 30-2. RNA de transferencia
La seril-tRNA síntetasa representa una segunda
clase estructural de sintetasas · ·
La estructura de rayos-X de la seril-tRNA sínteta-
sa (SerRS) ha sido determinada a una resolución de
2,5 Á. Este dímero de subunidades idénticas de 430
restos carga los cinco tRNASer isoaceptores que produ-
ce E. coli, así como su tRNAsecys. La subunidad de
la SerRS tiene dos dominios. Los 100 restos N termi-
nales forman un brazo expuesto al solvente muY.: cla-
ro, que es una hélice sobreenrollada de 60 A de
longitud de dos hélices a antiparalelas, unidas entre sí
por un corto segmento de cadena extendida.El resto
de la subunidad es un dominio globular que envuelve
un núcleo compuesto por una lámina ~ de 7 hebras
antiparalelas. Cuando se mira a lo largo de su doble
eje de simetría, el dímero posee una forma :que re-
cuerda la letra Z, con la parte superior y la inferior de
la letra formada . por las hélices sobreenrolladas, y la
barra diagonal generada por los dos dominios globu-
lares extensamente asociados entre sí a través del
doble eje de simetría. A pesar de que no existen
evidencias bioquímicas ni estructurales en relación a
la localización del sitio activo del enzima, se piensa
que éste ocupa una profunda depresión en la superfi-
cie del dominio globular. Esta depresión está rodeada
por lazos polipeptídicos y contiene varios restos bá-
sicos. Al contrario que la GlnRS, la SerRS carece
la apertura del primer par de bases del brazo aceptor
(Ul · A72). El extremo CCA del tRNA, por tanto, se
_ introduce profundamente en el interior de un bolsillo
de la proteína que también contiene los otros sustra-
tos de la sintetasa: el ATP y la glutamina. Existen tres
"dedos" de la proteína que se insertan en el surco
menor del brazo aceptor para realizar interacciones
específicas de secuencia. [Cabe recordar que el
· B-DNA, que presenta un amplio surco mayor pero
que tiene un surco menor muy estrecho (Sección
28-2A), interactúa principalmente con las proteínas a
través de su surco mayor (Figuras 29-20 a 29-23, por
ejemplo), mientras que el RNA bicatenario, que adop-
ta una estructura similar ~ la del A-DNA (Sección
. \
28-2B), posee un surco mayor que es demasiado es-
trecho para admitir proteínas, pero tiene un amplio
surco menor.] Estas observaciones estructurales apo-
yaron un número importante de datos genéticos y
bioquímicos que indicaban que las siete bases del
extremo del brazo aceptor (a excepción de su extremo
CCA), junto con la base central del anticodón, son los
principales elementos de identidad del tRNAGin.
El dominio de GlnRS que se une a la glutamina, al
ATP y al extremo CCA del tRNAGin adopta el pliegue
de unión a nucleótidos (pliegue de Rossmann) que
poseen, por ejemplo, muchas· proteínas de unión a
NAO+ y ATP (Sección 7-3B). Gran parte de este do-
minio puede superponerse prácticamente a los domi-
nios correspondientes de la tirosina-tRNA sintetasa
(TyrRS) y de la metionina-tRNA sintetasa (MetRS).
Estos tres dominios se encuentran claramente relacio-
nados desde el punto de vista evolutivo.
Capítulo 30. Traducción 973
Estructura de rayos-X de. un tRNA en complejo
con su aminoacil-tRNA sintetasa .,
Se ha determinado la estructura de rayos-X de la
glutaminil-tRNA sintetasa (GlnRS) en complejo
con el tRNAGln y el -·ATP, a una resolución de 2,8 A.
Esta es la primera aminoacil-tRNA_ sintetasa cristali-
zada en asociación con su tRNA. El tRNA adopta una
conf ormación en forma de L, bastante parecida a la de
otros tRNAs cuyas estructuras han sido determinadas
(Fig. 30-14b, por ejemplo). La GlnRS es una proteína
monomérica de ·553 restos, que posee cuatro domi-
nios organizados para formar una molécula alargada,
que es significativamente más larga que el tRNA._ La
proteína interactúa con el tRNA a lo largo de toda la
cara interna de la L, de forma que el anticodón queda
unido cerca de un extremo de la proteína, y el extre-
mo aceptor cerca del otro extremo.
El tRNA unido a la proteína difiere estructuralmen-
. te del tRNAPhe de la levadura en que el lazo anticodón
del tRNAGin adopta una _conformación que antes no
había sido observada, en la que las bases del antico-
dón no se encuentran .apiladas y se proyectan hacia
fuera para interactuar con grupos de la proteína de
manera que parece ser específica de secuencia. Una
segunda diferencia conformacional importante con el
tRNAPhe es que el extremo 3' -CCA del tRNA Gln gira
hacia el interior de la L, en lugar de continuar la
hélice en la dirección que llevaba. Este hecho provoca
la principal característica reconocida por las alanil-
tRNA sintetasas. Estos enzimas presumiblemente re-
conocen la forma distorsionada del par G · U (Fig.
30-15), una idea corroborada por la observación de
que los· cambios de bases en G3 · U70 que menos
afectan a la identidad del aceptor del tRNAAia son
aquellos que dan pares de bases de estructura pareci-
da a la del par G · U.
Los elementos reconocidos por las aminoacil-tRNA
sintetasas correspondientes a otros tres tRNAs se in-
dican en la Fig. 30-19. Al igual que con el tRNAA1ª,
estos identificadores comprenden solamente unas po-
cas bases. Obsérvese que el anticodón actúa de identi-
ficador en dos de estos tRNAs. En otro ejemplo de un
identificador en el anticodón, el tRNA11e de ·E. coli
específico para el codón ~UA posee el anticodón
LAU, en donde Les lisidina, una citosina modificada
cuyo grupo 2-ceto es sustituido por el aminoácido
lisina (Fíg, 30"." 13). En este contexto, la L se aparea con
la A en lugar de con la G, un caso único de modifica-
ción de bases que afecta a la especificidad de aparea-
miento entre bases. La sustitución de esta L con C no·
modificada, como era de esperar, genera un tRNA
que reconoce el codón de Met AUG (los codones se
unen a los anticodones de forma antiparalela). Sin
embargo, y sorprendentemente, este tRNA11e modifi-
cado pasa a ser un sustrato mucho mejor de la metio-
nil-tRNA sintetas·a que de la isoleucil-tRNA sintetasa.
Así, tanto el codón como la especificidad de aminoá-
cido de este tRNA se cambian en una sola modifica-
ción postranscripcional.
' Durante la síntesis proteica, el tRNA correcto es selec-
cionado solamente a través de interacciones entre codón
y anticodón; el grupo aminoacilo no participa en este
proceso. Este fenómeno fue demostrado de la manera
siguiente. El Cys-tRNAcys, cuyo.resto Cys estaba mar-
cado con 14C, fue desulfurado con níquel de Raney, de
forma que el resto de Cys pasaba a ser de Ala:
D. Interacciones codón-antícodén
. º' º' donde LióGº' = LiG1 - LiG2 es la diferencia entre las
energías libres de unión de las dos sustancias. Por
tanto, se calcula que la isoleucil-tRNA sintetasa po-
dría discriminar entre .la isoleucina y la valina en no
más de un factor ~ 100.
Berg resolvió esta aparente paradoja demostrando
que, en presencia del tRNA11e, la isoleucil-tRNA sinte-
tasa cataliza la hidrólisis cuantitativa de valina-
adenilato a valina + AMP, en lugar de formarVal-
tRNA11e. De esta forma, la isoleucil-tRNA sintetasa
somete a los aminoacil-adenilatos a una prueba de lec-
tura o etapa correctora, que tiene lugar en un sitio
separado del sitio catalítico. Este sitio probablemente
s~ une a los restos de Val, excluyendo a los restos
lle, de tamaño superior. La eelecttoidad global del en-
zima resulta, por. tanto, del producto de las selectivi-
dades de sus etapas de adenilación y de prueba de lectu-
ra, y esto es lo que explica su elevada fidelidad de
traducción. Muchas otras sintetasas discriminan con-
tra los aminoácidos que no les corresponden de forma
similar. Sin embargo, existen sintetasas que poseen
una selectividad adecuada por sus aminoácidos y ca-
recen de funciones correctoras (por ejemplo, la tirosil-
tRNA sintetasa, que discrimina entre tirosina y fenila-
lanina a través de la formación de puentes de
hidrógeno con el grupo OH de la tirosina). Obsérvese
que la corrección se lleva a cabo a expensas de la
hidrólisis de ATP, que es el precio termodinámico de la
fidelidad elevada (orden mayor).
[30.1]
cil-tRNA sintetasa transfiere r-: 50 000 isoleucinas al
tRNA11e por1 cada valina. Pese a ello, no existen sufi-
cientes diferencias estructurales entre estos dos aminoá-
cidos que justifiquen un grado de precisión tan elevado
en la generación directa de los aminoacil-tRNAs. Es
probable que la isoleucil-tRNA sintetasa posea un
sitio de unión cuyo tamaño sea suficiente para admitir
isoleucina, pero que excluya a otros aminoácidos más
grandes. Sin embargo, la valina, que difiere de laísoleucina solamente porque carece de un grupo meti-
leno presente -en el segundo aminoácido, cabe perfec-
tamente en el sitio de unión a isoleucina. La energía
libre de unión para un grupo metíleno se estima en
~ 12kJ · Il¡,lOI-1. La ecuación [30.1] indica que el cociente
f de las constantes de equilibrio K1 y · K2 con las que
dos sustancias se unen a un determinado sitio de
unión viene dado por
La prueba de lectura aumenta la fidelidad de la
unión de los aminoácidos a los tRN As
La carga de un tRNA con su aminoácido correspon-
diente es un proceso de una precisión remarcable. Los
datos experimentales indican, por ejemplo, que. a una
misma concentración de isoleucina y valina, la isoleu-
Existen dos clases de aminoacil-tRNA sintetasas
La comparación de las secuencias conocidas de las
aminoacil-tRNA sintetasas sugiere que estos enzimas
pueden ser divididos en dos familias no relacionadas,
denominadas sintetasas de Clase 1 . y sintetasas de
Clase 11. Los enzimas de Clase 1, entre los que se
encuentran GlnRS, MetRS, TyrRS y otras seis sinteta-
sas, a pesar de poseer secuencias muy diferentes entre
sí comparten dos segmentos homólogos que no están
· presentes en otras proteínas: (1) una "secuencia iden-
tifícatoría" de 1_1 restos, que contiene un tetrapéptido
más conservado His-X-Gly-His (HXGH), donde X es
un resto hídrofóbíco, a menudo lle; y (2) un tetra-
péptido de secuencia consenso Lys-Met-Ser-Lys
. (KMSK). Ambas secuencias ocupan posiciones· análo-
gas en los pliegues de unión a nucleótidos de GlnRS,
· MetRS y TyrRS, en las que ambos segmentos, HXGH
y KMSK, participan en la unión a A TP. Las sintetasas
de Clase 11, entre las que se encuentra SerRS y otras
nueve sintetasas, carecen de los motivos anteriores,
pero comparten algunos otros motivos de secuencia.
Muchos de los enzimas de Clase I requieren del
reconocimiento del anticodón para aminoacilar a sus
. .
correspondientes tRNAs. En contraste, varios enzi-
mas de Clase 11, incluyendo Ser~S, no interactúan
con el· anticodón de sus correspondientes tRNAs. De
hecho, tanto la AlaRS como la HisRS, ambos de la
Clase 11, son capaces de aminoacilar eficazmente "mi-
crohélíces" derivadas solamente de los brazos acepto-
res de sus tRNAs correspondientes. Otra diferencia
aparente entre las· sintetasas de Clase 1. y las de Clase
11 es que los enzimas de Clase I unen los aminoácidos
típicamente ·al grupo 2' -OH 3' terminal de los tRNAs,
mientras que los de Clase 11 lo hacen al grupo 3' -OH
(pese a ello, una . vez unido el grupo aminoacilo se
equilibra rápidamente entre estas dos posiciones). La
observación de que cuando dos aminoácidos son de
naturaleza química similar el mayor de ellos es carga-
do por un enzima de Clase 11, mientras que el más
pequeño es cargado por un enzima de Clase 1 ,(por
ejemplo, Lys vs. Arg y Asp vs. Glu), ha llevado a
postular la hipótesis de que la existencia de dos clases
diferentes de sintetasas ha permitido la evolución de
mecanismos de prueba de lectura eficientes.
del tamaño suficiente para unirse simultáneamente al
extremo CCA y· al anticodón de un tRNA. Se ha
sugerido, por tanto, que el brazo helicoidal de SerRS
funciona como un soporte· del brazo anticodón del
tRNAser. Obsérvese que SerRS no contiene un pliegue
de unión a nucleótidos como el de otras aminoacil- ·
tRNA sintetasas de estructura conocida (GlnRS,
MetRS y TyrRS).
974 Sección 30-2. RNA de transferencia
e G
A u
u AoG
G UoC
1 U, C o A
Base de 3' del· codón Base de 5' del anticodón
Tabla 30-4
Combinaciones de pares de bases permitidas por las
reglas del balanceo en la tercera posición del
codón-anticodón
La· hipótesis del balanceo explica
estructuralmente la degeneración de codones
Combinando indicios estructurales con deduccio-
nes lógicas, Crick propuso. la que él denominó hipó-
tesis del balanceo (Hwobble hypothesís"), que preten-
de explicar cómo un mismo tRNA puede reconocer
varios codones. El supuso que los dos primeros apa-
reamientos del codón-anticodón poseen geometrías
de Watson-Crick normales. Las limitaciones estructu-
rales que esto provoca sobre el apareamiento de la
tercera posición aseguran que su conformación no
será muy diferente a la de un par Watson-Crick.
Crick propuso entonces que· existiría cierta flexibili-
dad o "balanceo" en la tercera posición del codón, que
permitiría ajustes conformacionales limitados de su
geometría de apareamiento. Esto daría lugar a la for-
mación de algunos pares no Watson-Crick, como
U· G e I · A (Fig. 30-21a). Los apareamientos "balan-
. ceantes" permitidos se indican en la Fig. 30-21b. En-
tonces, analizando los patrones conocidos de aparea-
mientos codón-antícodón, Crick dedujo los conjuntos
más probables de combinaciones de apareamiento en
la tercera posición del codón-anticodón (Tabla 30-4).
Así, un anticodón con C o A en su tercera posición
sólo puede aparearse con su codón complementario
de tipo ''Vatson~Crick. Si la tercera posición está ocu-
pada por U, G o I, entonces se reconocen, respectiva-
mente, dos, dos o tres codones.
No se conocen tRNAs procarióticos o citopla~_m,áticos
eucarióticos que participen en una combinación de apa-
reamiento no balanceante. No existe ejemplo conocido
alguno de tRNA con una A en su tercera posición del
anticodón, lo cual sugiere que el par consecuente
· U · A no está permitido. Se conocen muy poco las
bases estructurales del apareamiento- balanceante, -a
pesar de que resulta claro que está influido por modi-
ficaciones de bases .
Por tanto, parece que en la tercera posición de la
interacción codón-anticodón pueden darse aparea-
mientos que·no son de tipo Watson-Crick (la primera
posición del anticodón está definida como su nucleó-
tido de 3')., Esta tercera posición (5') es la posición de
la mayoría de las degeneraciones de codones (Tabla
30-2). Obsérvese que esta posición contiene por lo
general una base modificada del tipo de Gm o l.
Capítulo 30. Traducción 975
5' • • • 3'
-G-C-1\- Codón:
• • •
• • •
3' 5'
Anticodón: - C - G - 1 -
5 • • • 3'
-G-C-(;-
5' • • • 3'
l T -G-C-J- Codón:
• • • • •• •
• • • • • •
3' 5' 3' 5'
Anticodón: -C-G- 1 -C-G_:. I-
y el tRNAAla de levadura, cuyo anticodón es IGC,
reconoce los codones GCU, GCC y GCA.
..
5' • • • 3' 5' • • • 3' -u-u-e- -u-u-u- Codón:
• • • • • •
• • • • • •
3' · 5' 3' 5'
Antícodon: ~A-A-Gro- -A-A-Gro-
La degeneración del código genético se basa
fundamentalmente en las interacciones variables
de la tercera posición del codén-antícodón
Uno podría pensar ingenuamente que cada uno de"
los 61 aminoácidos que especifican un aminoácido
podría ser leído por un tRNA diferente. En lugar de
ello, a pesar de que la mayoría de las células contie-
nen varios grupos de tRNAs isoaceptores (tRNAs
diferentes que son específicos para el mismo aminoá-
cido), muchos tRNAs se unen a dos o tres de los codones
que especifican para sus correspondientes aminoácidos.
Por ejemplo, el tRNAPhe de levadura, que posee el
anticodón GmAA, reconoce los codones UUC y UUU
(recordar que el anticodón se aparea con el codón de
manera antiparalela),
' . El híbrido resultante Ala-tRNAcys, marcado con 14C,
fue añadido a un sistema de síntesis proteica libre de
células extraído de reticulocitos de conejo. El único
péptido tríptico derivado de la cadena a de la hemo-
globina que contenía radiactividad era el que en con-
diciones normales contiene a la única Cys de la subu-
nidad. No se halló radiactividad en los péptidos que
contienen normalmente Ala y no Cys. Evidentemen-
te, solamente los anticodones de los aminoacil-tRNAs
están implicados en el reconocimiento de los codones.
H O
.. 1 11 .
H-CH2 -C-C-0-tRNACya
1 NH¿
Ala~tRNA Cys
Níquel de Raney ·s-tRNA Cys
H O
. 1 11
HS- ·CH2 -C-C-0- tRNACys + Ni(H)x
1
NHt
La selenocisteína es especificada por un tRNA
A pesar de que siempre se afirma, incluso en este
texto, que las proteínas son sintetizadasa partir de los
20 aminoácidos "estándar", es decir, los especificados
por el código genético "estándar", algunos organís-
mos, de hecho, utilizan 21 aminoácidos. Este aminoá-
cido número 21, denominado selenocísteína (SeCys),
presente en algunas de sus proteínas, posee la si-
guiente estructura:
Algunos tRNAs mitocondriales establecen
apareamientos balanceantes más permisivos que
otros tRNAs ..
El reconocimiento de codones por parte de los
tRNAs mitocondríales debe· reflejar el hecho de que
los códigos genéticos mitocondriales son variaciones
del código "estándar" (Tabla 30-3). Por ejemplo, el
Un examen de los diferentes apareamientos balan-
ceantes indica que al menos se necesitan 31 tRNAs
para traducir los 61 tripletes codificantes del código
genético (existen 32 tRNAs en el conjunto mínimo
debido a que la iniciación de la traducción requiere de
un tRNA independiente; Sección 30-3C). La mayoría
de las células contienen > 32 tRNAs, algunos de los
cuales poseen anticodones idénticos. No obstante,
todos los tRNAs isoaceptores de una célula son reconoci-
dos por la misma aminoacil-tRNA sintetasa.
Figura 30-21
Apareamiento balanceante. (a) Pares balanceantes U· G e
1 · A. (b) Geometría del apareamiento balanceante. Las
esferas y los enlaces que llevan unidos representan las
posiciones de los átomos C(1 ') de la ribosa con sus
enlaces glucosídicos. La X (izquierda) denota el nucleósido
del extremo 5' del anticodón (tRNA). Las posiciones de la
derecha son las del nucleósido de 3' del codón (mRNA)
correspondiente al apareamiento balanceante indicado. [De
Crick, F.H.Q., J. Mol. Biol. 19, 55 (1966).]
-U•••G
Los codones utilizados frecuentemente son
complementarios a los tRNAs más abundantes
El · análisis de las secuencias de bases de varios
genes estructurales de expresión abundante de la le-
vadura de panadería, Saccharomyces cerevisiae, ha re-
velado que existe una marcada desviaciónen su utili-
zación de codones. ·Normalmente se utilizan 'sólo 25
de los 61 tripletes codifican tes. Estos codones preferidos
son los que presentan mayor complementariedad, en el
sentido de Watson-Crick, con los anticodones de las
especies más abundantes de cada juego de tRNAs isoa-
ceptores. Además, se evitan los codones que se unen a
anticodones con dos pares G · C o tres A · U consecu-
tivos, de 'manera que los complejos codón-anticodón
preferidos poseen todos ellos las mismas energías
libres de unión aproximadas. En E. coli se da un
fenómeno similar; aunque algunos de sus 22 codones
preferidos son diferentes de los de levadura. El grado
de aparición de los codones preferidos en un gen
particular se encuentra estrictamente correlacionado,
en ambos organismos, con el nivel de expresión del
gen. Se ha formulado la hipótesis de que este hecho
permite que los m_RNAs de las proteínas requeridas
en mayor abundancia sean traducidos ránídamente y
sin interrupción.
Estándar:
U··· A
A••• U
C ••• G
G••• C
1 -v-c
Codón
tb)
Anticodón
N~
~ N
\
C(l')
H
I
O···H-N
N--
/
C(l')
I O····H-N \
C(l') . >=N C(l')
H2N
U•G
o (a)
genoma mitocondrial humano, de 16 569 bp, codifica
para 22 tRNAs (junto con qos RNAs.ribosómicos y 13
proteínas). -Catorce de estos tRNAs leen los pares de
codones sinónimos indicados en las Tablas 30-2 y
30-3 (MNX, donde X es o bien C o U o bien A o G)
. .
siguiendo las reglas de apareamiento . balanceante
G · U ya descritas: los tRNAs poseen o bien una G o
una U modificada en la tercera posición del anticodón
la cual permite su apareamiento con codones que
posean o bien X= C o U o bien X= A o G,·respectiva-
mente. Los 8 tRNAs restantes, que al contrario de las
reglas de balanceo reconocen los grupos de cuatro
codones sinónimos (MNY, donde Y = A, C, G o U),
poseen todos ellos anticodones con una U en su
tercera posición. O esta U es capaz de alguna manera
de interactuar con cualquiera de las cuatro bases, o
estos tRNAs leen únicamenté las dos primeras posi-
ciones del codón e ignoran la tercera. Así, no debe
sorprender en absoluto que muchos tRNAs mitocon-
driales posean estructuras en las que falta, por ejem-
plo, la secuencia GT'lfCRA (Fig. 30-12), o que, en el
caso más ext~~o, un tRNAser carezca por completo
del brazo D.·
-
I •••A~.
I •••U
G··· U
976 Sección 30-2. RNA de transferencia
Fuente: Kórner, A.M., Feinstein, 5.1. y Altman, S., en Altman, S.
(Ed.), Transfer RNA, p 109, MIT Press (1978).
Algunos supresores de falta de sentido en E. coli
1
Codón Aminoácido
Nombre suprimido insertado
su1 UAG Ser
su2 UAG Gln
su3 UAG Tyr
su4 UAA,UAG Tyr
sus UAA,UAG Lys
su6 UAA Leu
su7 UAA Gin
UGA-1 UGA Trp
UGA-2 UGA Trp
E. Supresión de falta de sentido
Las mutaciones de falta de sentido (ºnonsense mu-
tations") son por lo general letales cuando terminan
antes de tiempo la síntesis de una proteína esencial.
No obstante, un · organismo que haya sufrido. una
mutación de este tipo puede ser "rescatado" por una
segunda mutación que afecte a otra-parte del genoma.
Tabla 30-5
Los tRNAs supresores son formas mutantes de
tRNAs minoritarios ·
¿Cómo puede ser que las células toleren una muta-
ción que tanto elimina un tRNA normal como previe-
ne la terminación de la síntesis de polipéptidos? So-
breviven debido a que el tRNA mutado, por lo
El selenio, un elemento traza biológicamente esencial,
forma parte de varios enzimas tanto en procariotas
como en eucariotas. E. coli contiene dos selenoproteí-
nas, ambas formato deshidrogenasas. Cada una de
ellas contiene un resto de selenocisteína. Los restos de
selenocisteína se incorporan a estas proteínas en los
ribosomas, mediante un único tRNA que posee un
anticodón UCA. Este tRNA es reconocido por un
codón UGA (el codón de terminación ópalo normal)
particular (en el contexto del mRNA). La hipótesis de
que el contexto permite que el ribosoma diferencie el
codón UGA que especifica selenocisteína del codón
de terminación ópalo normal ha sido confirmada a
través de manipulaciones genéticas. En construccio-
nes que fusionan el segmento N-terminal del seleno-
péptido de la formato deshidrogenasa con la región 5'
del gen de la P-galactosidasa, se requiere selenio para
leer todo el mensaje y obtener síntesis de f3-galactosi-
dasa. Sin embargo, si se cambia el codón TGA en el
DNA por TGC, TGT (codones Cys), o TCA (Ser),
entonces .se suprime este requerimiento por selenio.
El -selenocisteinil-tRNA es sintetizado por la ami-
noacilación de su tRNA con L-serina por la misma
aminoacil-tRNA sintetasa que carga el tRNAser. Tras
la carga, el selenio se añade al resto de Ser mediante
una reacción enzimática. E. coii necesita los productos
de cuatro genes para Incorporar restos de SeCys a las
proteínas. El gen selC especifica el tRNAsecys que
funciona para incorporar SeCys a las proteínas. Los
genes selA y selD codifican para proteínas que trans-
forman el resto Ser en SeCys. El gen selB codifica
una proteína que se une a nucleótidos de guanina,
que se asocia específicamente al SeCys-tRNAsecys
pero no al Ser-tRNAsecys. La observación de que esta
proteína SELB y el factor de elongación EF-Tu po-
seen segmentos N-terminales homólogos (244 restos),
sugiere poderosamente que SELB es un factor de
elongación que. sustituye a EF-Tu, conduciendo al
SeCys-tRNAsecys al ribosoma. De hecho, EF-Tu posee
una afinidad de unión por. SeCys-tRNAsecys que es
inferior en 200 veces a la que presenta por cualquier
otro aminoacil-tRNA que participe en la elongación.
l
NH
1
CH - CH2--:-- Se - H
1
c=o
1 .
Durante mucho tiempo después de que se descubrie-
ran, la existencia de tales supresores intergénicos era
bastante intrigante. Sin embargo, ahora se sabe que
este tipo de supresión surge como consecuencia de
mutaciones en un gen de tRNA que provocan que
este tRNA reconozca a un codón sin sentido. Este
tRNA supresor de falta de sentido es capaz de unir
su aminoácido ( que es el mismo que transporta eltRNA salvaje correspondiente) a un polipéptido en
crecimiento en respuesta a la presencia del codón de
terminación reconocido. Esto impide la terminación
de la cadena. Por ejemplo, el supresor ámbar de E.
coli, conocido como su3, es un tRNATyr cuyo antico-
dón ha mutado de la forma salvaje GUA (que lee los
codones de Tyr UAU y UAC) a CUA (que reconoce
el codón de terminación ámbar UAG). Una E. coli su3+
que posea una mutación ámbar en un gen que codi-
fique para una proteína esencial podría ser viable si la
sustitución del aminoácido de la forma salvaje de esta
proteína por Tyr no inactiva su función.
Existen varios ejemplos bien caracterizados de su-
presores ámbar (UAG), ocre (UAA) y ópalo (UGA) en
E. coli (Tabla 30-5). Como era de esperar, la mayoría
de ellos poseen anticodones mutados. Sin embargo, el
tRNA UGA-1 difiere de la forma salvaje únicamente
por una mutación G • A en su brazo D, lo cual
transforma un par G · U en un par A· U, más fuerte.
Esta mutación, aparentemente, modifica la conforma-
ción del anticodón CCA del tRNA, por lo que no
puede formar el apareamiento balanceante normal
con UGA tan bien como el codón normal, UGG. En la
levadura también se presentan supresores de falta de
sentido.
El resto de
selenocisteína
Capítulo 30. Traducción . 977
Los RNA ribosomales poseen estructuras
secundarias conservadas evolutivamente
El rRNA de 165 de E. coli, secuenciado por Harry
Noller, tiene 1542 nucleótidos. Una búsqueda por
ordenador de segmentos bihelicoidales estables en
esta secuencia arrojó varias posibilidades, a menudo
excluyentes entre ellas, de estructuras secundarias.
Sin embargo, la comparación de las secuencias de los
rRNAs de 165 de varios procariotas, bajo la suposi-
ción de. que sus estructuras habrían sido conservadas
Los ríbosomas fueron. vistos por primera vez en
homogenados observados con microscopia de campo
oscuro por Albert _Claude; en la década de 1930. Este
investigador se refirió a ellos como "mícrosomas", Sin
embargo, no fue hasta mediados los 50 q_~e George
Palade los observó en el interior de las células, utili-
zando microscopia electrónica. Con ello eliminó los
argumentos de quienes creían que se trataban de
meros artefactos producidos por la rotura de las célu-
las. El nombre ribosoma deriva del hecho de que
estas partículas, en E. coli, están formadas por _.., 2/3
RNA y 1/3 proteína. (El nombre microsomas se re-
serva ahora para las vesículas artefactuales derivadas
del retículo endoplasmático que se forman después de
romper las células. Son de sencilla purificación por
centrifugación diferencial y so.n ricas en ribosomas.)
La correlación entre la cantidad de RNA en una célula
y la velocidad con la que sintetiza proteínas levantó
sospechas de que los ribosomas eran el sitio de sínte-
sis de las proteínas. Esta hipótesis fue confirmada en
1955 por Paul Zamecnik, quien demostró que los
aminoácidos marcados con 14C se . asocian de · forma
transitoria con los ribosomas antes de aparecer en las
proteínas libres. Investigaciones posteriores demos-
traron que la síntesis . de polipéptidos a nivel de los
A. Estructura del ribosoma
El ribosoma de E. coli, cuya masa de partícula es de
_.., 2,5 x 106 D y su coeficiente de s .. edímentacíón de
705, es una partícula esferoidal de "'-250 A de sección
en su dimensión más alargada. Como descubriera
James Watson, esta partícula puede ser disociada en
dos subunidades distintas (Tabla 30-6). La subunidad
pequeña (305) . está formada por una molécula de
rRNA de 165 y por 21 polipéptidos diferentes, mien-
tras que la subunidad grande (SOS) contiene un rRNA
de 55, uno de 235 y 32 polipéptidos diferentes. Los
cerca de 20 000 ríbosomas de una célula de E;. coli
contienen ,.._ el 80 ºlo del contenido celular de RNA y
el 1 O ºlo de su proteína total.
A pesar · de que el ribosoma ha sido cristalizado
recientemente. por Ada Yonath, es un elemento tan
complejo que pasarán muchos años antes de que su
estructura sea conocida hasta los detalles molecula-
res. Sin embargo, las estructuras de baja resolución
del ribosoma y de sus subunidades sí· que han sido
determinadas utilizando técnicas de reconstrucción de
imágenes en las que ha sido pionero Aaron Klug.
Estas técnicas se basan en la combinación de micro-
grafías electrónicas de una única partícula ·o de lámi-
nas ordenadas de partículas, tomadas desde distintos
ángulos, para generar una imagen tridimensional
(Fig. 30-22). La subunidad pequeña es una partícula
de· aspecto .de guante de boxeo arrugado, . mientras
que la subunidad grande es esferoidal con tres protu-
berancias sobre uno de sus lados (Fig. 30-23). La
subunidad grande contiene también un túnel, de diá-
metro hasta 25 A y de longitud de entre 100 y 120 A,
que se extiende a partir de una hendidura· que existe
entre las tres protuberancias de la subunidad.: Se ha
propuesto que este túnel proporciona la vía de salida
para el polipéptido naciente (Fig. 30-24).
3. RIBOSOMAS
ribosomas puede dividirse en tres fases: (1) iniciación
de cadenas, (2) elongación de cadenas, y (3) termina-
ción ·de cadenas.
En esta sección examinaremos la estructura del ri-
bosoma, o lo que se conoce de ella hasta el momento,
para describir después de forma general el mecanis-
mo ribosómico de síntesis de polipéptidos. Al realizar
esta descripción compararemos las propiedades de los
ribosomas de los procariotas (sobre todo E. coli) y de
los eucariotas (fundamentalmente los del citoplasma
de las células del hígado de rata).
general, es un miembro minoritario del conjunto de
tRNAs isoaceptores, y debido a que los tRNAs supre-
sores de falta de sentido deben competir por los codo-
nes de terminación con los factores· proteicos que
intervienen en la terminación de la síntesis proteica
(Sección 30-E3). En consecuencia, la tasa de síntesis
de proteínas activas que contengan una mutación sin
sentido UAG o UGA, mediada por supresores, rara-
mente sobrepasa el 50 o/o de la tasa de síntesis en las
formas salvajes, mientras que los mutantes con UAA,
el codón de terminación más frecuente, presentan
eficiencias de supresión inferiores al 5 ºlo. Además,
muchos mRNAs·poseen dos codones de terminación
en tándem de forma que, incluso si su primer codón
de terminación fuera suprimido, la terminación ten-
dría lugar en el segundo codón. No obstante, muchos
mutantes rescatados por supresores crecen de manera
relativamente más lenta, debido a que son incapaces
de producir tan eficientemente como las células salva-
jes las proteínas que de no ser ·por la supresión se
terminarían de forma prematura.
Se conocen otros tipos de tRNAs supresores. Los
supresores de sentido equivocado actúan de manera
similar a los supresores de. falta de sentido, pero
sustituyen un aminoácido por otro. Los supresores
de desplazamiento de pauta de lectura poseen ocho
nucleótidos en su lazo .anticodón en lugar de los siete
normales. Leen un codón de cuatro bases situado más
hacia 3' deuna inserción de base, por lo que recupe-
ran la pauta de lectura de la forma salvaje.
978 s~cción 30-3. Ribosomas
Fuente: Lewin, B., Genes (3.ª ed.), p. 145, Wiley (1987).
RNA
Mayor 165; 1542 nucleótidos 235, 2904 nucleótidos
Menor 55, 120 nucleótidos
Masa del RNA (kD) .1664 560 1104
Proporción de la masa 66 o/o 60 °/o 70 o/o
Proteínas 21 polipéptidos 32 polipéptidos
Masa de las proteínas (kD) 857 370 487
Proporción de la masa 34 o/o 40 °/o 30 o/o
705
2520
sos
1590
305
930
Coeficiente de sedimentación
Masa (kD)
Subunidad grande Subunidad pequeña Ribosoma
Tabla 30-6
Componentes de los ribosomas de E. coli
gestión con nucleasa y con los estudios de modifica-
ción química. Sus segmentos bihelicoidales tienden a
ser cortos (< 8 bp) y muchos de ellos son imperfec-
tos. Curiosamente, las micrografías electrónicas del
rRNA de 165 se parecen a las de la subunidad de30S
por la evolución, llevó a la propuesta de estructura
secundariaen forma de flor para el rRNA de 165 que
se muestra en la Fig. 30-25. Esta estructura de cuatro
dominios, cuyas bases están apareadas en un 46 °/o, es
razonablemente coherente con .Ios' resultados de di-
tomadas desde diferentes ángulos. De una manera similar
se elaboró el modelo de la .subunidad pequeña. [Cortesía
de James Lake, UCLA.]
Figura 30-22
Modelo tridimensional de la subunidad grande del
ribosoma, deducido matemáticamente combinando
imágenes bidimensionales de microscopia electrónica
./
. (a).
1
!
Capítulo 30. Traducción 979
Figura 30-23
(a) Modelo tridimensional del ribosoma de E. coli deducido
de la forma indicada en la Fig. 30 .. 22. La subunidad
pequeña (arriba) se combina con la grande (centro) para
formar el ribosoma completo (abajo). Las dos imágenes del
ribosoma así obtenidas concuerdan con las micrografías .
electrónicas de (b). [Cortesía de James Lake, UCLA.]
' Las proteínas ribosomales han sido parcialmente
caracterizadas
Las proteínas ribosomales son difíciles de separar
debido a que la mayoría de ellas son insolubles en los
tampones corrientes. Por convención, las proteínas
ribosomales de las subunidades pequeña y grande se
designan con los prefijos S (de "small", pequeña) y L
(de "large", grande), seguidos de un número que indi-
ca su posición, desde la parte superior izquierda hasta
la inferior derecha, en un electroforetograma bidi-
mensional (aproximadamente en orden decreciente
de masa molecular; Fig. 30-27). Existe una sola proteí-
na, S20/L26, común a las dos subunidades. Aparen-
temente está situada entre las dos subunidades. Una
de las proteínas de la subunidad grande está parcial-
mente acetilada en· su extremo amino, por lo que da
completa, lo cual sugiere que la forma global de esta
subunidad viene determinada principalmente por el ·
rRNA de 165.
Los rRNAs de SS y de 235 de la subunidad grande
del ribosoma están compuestos por 120 y por 2904
nucleótidos respectivamente, y también han sido se-
cuenciados. Al igual que con el rRNA de 165, parecen
poseer estructuras secundarias muy extensas. La es-
tructura propuesta para el rRNA de SS se muestra en
la Fig. 30-26. Por supuesto, como hemos visto para el
tRNA, la estructura secundaria de un RNA proporcio-
na poca información acerca de su estructura tridimen-
sional (aunque véase más adelante). (b)
Ribosoma
Figura 30-24
Imagen generada por ordenador de la subunidad grande
del ribosoma de Bacillus stearothermophilus, determinada
por reconstrucción de imágenes de microscopia electrónica
de organizaciones bidimensionales qrientadas de
partículas. Existe U'J túnel de - 25 A de diámetro que se
extiende unos 100 A a partir de la hendidura entre las tres
protuberancias (T) de la subunidad hasta el sitio probable
de salida del polipéptido naciente (E). La barra representa
20 Á. [Cortesía de Ada Yonath, Weizmann lnstitute of
Science.]
+ +
Hendidura
lataform
(a)
980 Sección 30-3. Ribos·omas
· Protuberancia-------ií
central
Figura 30-26
Secuencia del rRNA de SS de E. coli mostrando su
estructura secundaria propuesta. [De Noller, H.F., Annu.
Rev. Biochem. 53, 134 (1984).]
120 -u .J u
A/ C e / e
G / U
G / G
A ; G 10
Ce/ /CG¡C CGU 20 u e 30 cC e
G·G A I Ge I e A
U / GCGCGGUG CACCUGA U-40
11º - C l t • 1 1 1 " t ) 1 1 1 1 1 1 -G
~ C·GUGCCGC GUGGACUC C
G G G A / A A A AA \ A A G 9
G ._e- 70 60 50
._e
A.G
U._A
G
A ·u
100 - G G
A G
G U
C A
...... G
G
• U - 80 u.G
A-..., e u ....._G c ......
c ...... G
90 -C....., G . G
ºcu
3'(1542)
Figura 30-25
Estructur:a secundaria propuesta para los 1542 nucleqtidos
del rRNA de 168 de E. cgli, basada en la comparación de
secuencias de diferentes especies, suponiendo que esta
estructura secundaria está conservada por la evoluci9n. La
serie con aspecto de flor de horquillas y lazos forma cuatro
dominios (colores. diferentes), que se indican con números
romanos. La localización de ciertas características respecto
de proteínas ribosómicas específicas y la subunidad
ribosomal de 308 completa se indican mediante los
símbolos rojos. [De Gutell, A.R., Weiser, B., Woese, C.A. y
Noller, H.F., Prog., Nocteto Acid Res. Mol. Biol. 32, 183
(1,985).]
Subunldad ribosomal
de 305
Capítulo 30. Traducción 981
5'(1)
Dominio J
Doh1Jnlo IU
Figura 30-29
Mapa de ensamblado de la subunidad pequeña de E. coli.
Las flechas gruesas y delgadas entre los diferentes ·
componentes indican,· respectivamente, tendencia fuerte o
débil a la unión. Por ejemplo, la flecha gruesa que va del
rRNA de 168 a 84 indica que 84 se une directamente con
el rRNA de 1·68 en ausencia de otras proteínas, mientras
que las flechas delgadas que van del rRNA de 168 y de
84, se, S9, S19 y 820 a 87 indican que todos aquellos
componentes participan en la unión de S7. [De Held, W.A.,
Ballou, B., Mizushima, S. y Nomura, M., J. Biol. Chem. 249,
3109 (197 4).]
. . . : . :. ::. . ..
Figura 30-28
Estructuras de rayos-X de dos proteínas ribosomales:
(a) el fragmento e-terminal, de 7 4 restos, de la L7 /L 12
de E. coli. (b) La L30 de Bacillus stearothermophilus (61
restos). Las dos moléculas están orientadas de manera
que muestran sus conformaciones esqueléticas similares.
[De Leijonmarck, M., Appelt, K., Badger, J., Liljas, A.,
Wilson, K.8. y White, 8. W., Proteins 3, 244 (1988).]
. ,.
(b) (a)
Las subunidades del· ribosoma son capaces de
autoensamblarse
En las condiciones· apropiadas, las subunidades del
ribosoma se · forman espontáneamente a . partir de
mezclas de sus numerosos componentes macromole-
culares. Por tanto, las subunidades del ribosoma son
elementos autoorganizativos. Masayasu Nomura deter-
lugar a la aparición de dos manchas en la electrofore-
sis (L7 /L12). En la subunidad grande existen cuatro
copias. de esta proteína. Además, estas cuatro copias.
de L7 /L12. se agregan con LlO formando un complejo
estable, que en un principio se pensó que era una sola
proteína, denominada "L8n. Todas las otras proteínas
ribosomales están presentes una sola vez por subuni-
dad .
. Se han resuelto las secuencias de aminoácidos de • •
las. 52 proteínas ribosomales de E. coli, fundamental-
mente gracias a los trabajos de Heinz-Günter Witt-
mann y Brigitte Wittman-Liebold. Su tamaño varía
entre los 46.y los 557 restos de la L34 y de la Sl,
respectivamente. La mayoría de estas proteínas, que
presentan pocas similitudes de secuencia entre ellas,
son ricas en aminoácidos como. la Lys y la Arg, .Y
contienen pocos restos aromáticos, tal y como cabria
esperar de proteínas que están estrechamente asocia-·
das con moléculas polianiónicas como el RNA. Hasta
el momento se han reportado las estructuras de ra-
yos-X de dos proteínas· ribosomales: la de la L30 y la
de un .segmento C-tern1inal de L7 /112 (Fig. 30-28).
Estas proteínas poseen estructuras muy similares, a
pesar de que comparten únicamente un 14 °/o de ho-
mología de secuencia de aminoácidos.
Figura 30-27
Electroforetograma de un gel bidimensional de las
proteínas de la subunidad pequeña del ribosoma de E. coli.
Primera dim·ensión ( vertica~: 8 °/o acrilamida, P.H. 8,6;
segunda dimensión (horizonta~: · 18 °/o acrilamida, pH 4,6.
[De Kaltschmidt, E. y W·ittmann, H.G., Proc. Natl. Acad. Sci.
67, 1277 (1970).]
982 Sección 30-3. Ribosomas
(IgG); Sección 34-2A], elaborados contra una proteína
ribosomal específica, son capaces de unirse a esta
proteína en el sitio en el que queda expuesta hacia la
superficie de la subunidad que le corresponde. La
microscopia electrónica de los complejos subunidad
ribosómica · IgG indica el punto de unión de la IgG y
por tanto el sitio de la proteína ribosomal al que se
une (Figs. 30-30 y 30-31). Estos resultados han sido
confirmados y ampliados gracias a las medidas de
difracción de neutrones aplicada a subunidades de
305, conducidas por Donald Engleman y Peter Moore
(Fig. 30-32a), y estudios similares aplicados a la subu-
nidad de SOS realizadospor Knud Nierhaus. Las posi-
ciones de las proteínas indicadas en las Figs. 30-31 y
30-32a sort coherentes con el mapa de ensamblado de
las subunidades de la Fig. 30-29, en el sentido de que
los pares de proteínas que deben interactuar para un
correcto ensamblado (aunque no necesariamente de-
ben estabJecer contacto directo), se encuentran en
posiciones muy cercanas.
Muchos· de los elementos de estructura secundaria
del rRNA de 165 han sido situados dentro de la
subunidad pequeña (Figs. 30-25 y 30-32b.). Sus posi-
ciones fueron establecidas de forma indirecta a partir
de las posiciones conocidas de las proteínas que los
resultados de experimentos de entrecruzamiento
RNA-proteína y protección a nucleasa indicaban que
se unían a ·ellos. De esta forma, en la actualidad
poseemos un modelo- completo, aunque todavía sin
pulir, de la subunidad ribosomal de 305 de E. coli.
, Figura ·30-31
~apa!-~e.Ja,s.fsiJ~-\l':~~.ad~s- (a) peq~ñ,8- -t·(b~ .gr~nc;te d~I .
nl).osom-a,c,de E~ .. ,epl[,o1pd1cando ras tocaüzacíonesde algunas
. dé las protelnas ~que tas' componen,' determinadas por
inmunomicroscopia electrónica. Los sitios que están
señalados por líneas de puntos se encuentran al otro lado
de la subunidad. Los símbolos 16S 3' y 16S 5' en la
subunidad pequeña marcan los extremos del RNA de 16S.
En la subunidad grande, la P indica el centro peptidil
transferasa, la E marca el sitio donde el polipéptido
naciente emerge del ribosoma (el final del túnel en la Fig.
30-24), la M especiñca el sitio de anclaje a membrana del
ribosoma, y 5S 3' y 5S 5' indican los extremos del RNA de
5S. [De Lake, J.A., Annu. Rev. Biochem. 54, 512 (1985).]
•
'
(b) SuJ)urri'dad gr-a(lde
'
SS.3' 5Sf>' L7/l12
\ · . (4 ·moléc.ülas) , . ·':
( a) Suou.nídatJ peefUei'ía,
Capítulo 30. Traducción 983
Figura 30-30
La inmunomicroscropia electrónica revela las posiciones de
las proteínas ribosomales. Se mezcla inmunoglobulina G
(lgG) obtenida contra una proteína ribosomal particular (en
este caso S6) con ríbosornas. La lgG, que es una proteína
en forma de Y (Sección 34-28), se une a su antígeno
correspondiente en los extremos de las dos cortas ramas
de la Y, por lo que provoca la unión de dos ribosomas. La
posición de la proteína en la superficie del ribosoma queda
revelada por el punto de unión de la lgG. [Cortesía de
James Lake, UCLA.]
La arquitectura, del ribosoma ha sido deducida
utilizando estudios de inmunomicroscopía
electrónica y de difracción de neutrones
Las posiciones de la mayoría de los componentes
del ribosoma se han determinado gracias a la utiliza-
ción de diversas técnicas físicas y químicas. Muchas
proteínas han sido localizadas por James Lake y
Georg Stóffler utilizando inmunomicroscopia electró-
nica. Anticuerpos de conejo [inmunoglobulina G
minó cómo ocurría este proceso utilizando ensayos de
reconstitución parcial. Si se deja un componente ma-
cromolecular fuera · de una mezcla de . prqtéín;ás y
RNA que cuándo está completa se auto;ofganí.ia, _ los
componentes que fallan en unirse a la ,~úl>llni!1ad
ensamblada· parcialmente son los que de ~lg~I:ª ma-
nera interactúan con.el componente ausentes Ajravés
del análisis de una serie de tales experimentos de
reconstitución parcial, Nomura construyóun mápa de
ensamblado de la subunidad pequeña (Pig. 3Q-29).
Este mapa indica que las· primeras etapas en -el e:g.·-
samblado de la subunidad pequeña son las uniones
independientes de ciertas proteínas al rRN~·de 165.
Los intermediarios resultantes proporcionar(et.arma-.
zón molecular para la unión de las demás proteínas.
En un momento determinado del procesóideensam-
blado, una partícula intermedia debe sufrír'ún cambio
conformacional profundo para que el proceso de en-
samblado pueda continuar. La subunidad ín1iyor, se
autoorganiza de manera similar. La observación de
que tanto in vitro como in vivo aparecen los mismos
intermediarios sugiere que ambos procesos de ensam-
blado son muy parecidos.
l. El extremo 3' del rRNA de 165, que participa en la
unión al mR.NA (Sección 30-3C), está situado en la
"plataforma" de la subunidad pequeña. La localiza-
ción de las proteínas implicadas en la unión del
ribosoma al mRNA, junto con la observación de
que el ribosoma' protege de la digestión con RNasa
a un segmento de mRNA de ,.._, 40 nucleótidos,
indica que el mRNA se une a la subunidad peque-
ña a través de unaregión que conecta su "cabeza"
con su "basen.
unión al mRNA implica, aparentemente,. la participa-
ción de las proteínas 51, 53, 54, SS, 59, 512 y 518,
además del rRNA de 165. Por su parte, las proteínas
L2, Ll 1, Ll5,'Ll6, L18, L23 y L27, junto con el rRNA
de 235, estarían .implicadas en la función peptidil
transferasa. Para añadir más elementos de confusión
<"' .,,.
al tema, los estudios con mutantes que eran deficien-
tes para varias proteínas ribosomales revelaron que la
ausencia de cualquiera de al menos 15 de las 52
proteínas ribosomales de E. coli . no afecta en gran
medida la capacidad traductora del ribosoma. No
obstante, se han localizado las siguientes funciones
ribosoinales (Figs. 30-23 y 30-31 ):
normalmente (los deuterones. desvían neutrones de forma
bastante diferente a la de los protones). Estas medidas,
aplicadas a muchos pares diferentes de proteínas,
permitieron la elaboración de este mapa, en el cual el
volumen de cada esfera es proporcional a la masa de la
proteína correspondiente', y su posición marca el centro
másico de la proteína. Compárese este mapa con la Fig.
30-31 a. [Cortesía de Peter Moore, Vale University, y
Malcolm Capel, Brookhaven National Laboratory].
(b) Localización de los segmentos bicatenarios del rRNA de
16S (cilindros) en relación a las proteínas de la subunidad
de 30S (esferas) deducida a partir de estudios de
entrecruzamiento ANA-proteínas. La perspectiva es la
misma que en las Figs. 30-31 a y 30-32(a,,). [De Schüler, D.
y Brinacombe, R., EMBO J. 7, 1512 (1988).]
(b)
El marcaje por afinidad ha ayudado a identificar
los elementos funcionales del ribosoma
Se han invertido muchos esfuerzos en la identifica-
ción de los componentes funcionales del ribosoma,
tales .como el centro peptidil transferasa, que cataliza
la formación del enlace peptídíco (Sécción 30-30).
Muchas de estas investigaciones han aplicado la téc-
nica del marcaje por afinidad, una técnica en la cual
se une un grupo reactivo a un ligando natural" del
sistema de interés (por ejemplo un antibiótico que se
una al ribosoma, Sección 30-3G). El grupo reactivo,
que puede serlo espontáneamente o puede ser fotolá-
bil, de forma que sólo reacciona tras ser iluminado
con UV (marcaje por fotoafinidad), es transportado
al sitio de unión al ligando, en donde reacciona entre-
cruzando el ligando con los grupos de su alrededor.
La disociación de la partícula resultante permite la
identificación de los componentes con los que el mar-
cador por afinidad, por lo general radiactivo, ha reac-
cionado.
Los resultados del marcaje por afinidad del. riboso-
ma han sido a menudo de difícil interpretación, debi-
do a que sus diferentes funciones parecen implicar
varios componentes ribosomales. · Por ejemplo, la
(a)
Figura 30-32
Estructura de la subunidad de 30S del ribosoma.
(a) Diagrama de las posiciones relativas de las 21 proteínas
de la subunidad de 30S del ribosorna, superpuesta con un
perfil de' su superficie. Si a la Parte (i) se la denomina'
visión frontal, las Partes (ii) y (iií} corresponden a vistas
desde el lado izquierdo y desde abajo, respectivamente.
Las proteínas reciben su numeración estándar de la Parte
(i), en la cual S20 se encuentra directamente detrás de S3
(.los colores diferentes de las esferas sólo pretenden
facilitar la observación). Las distancias entre los pares de
estas proteínas fueron determinadas por la difracción de
neutrones de soluciones concentradas de subunidaoes de
30S reconstituidas, en las que las dos proteínas de interés
estaban muy déuteradas,mientras que los otros
componentes de la subunidad se -encontrabarvprctonadas
984 Sección 30-3. Ribosomas
La síntesis de polipéptidos avanza del extremo
amino· (N) al extremo carboxílo (C)
La dirección de la síntesis ribosomal de polipépti-
dos fue establecida por Howard Dintzis en 1961,
B. Síntesis de polipéptidos: una visión
general
Antes de comenzar nuestra discusión detallada de
la síntesis de, polipéptidos, será útil que hagamos un
breve repaso de sus características principales.
Los ribosomas eucarióticos son más grandes y
complejos que los procaríóticos
A pesar de que los ribosomas procarióticos y euca-
rióticos son parecidos entre sí tanto en estructura
como en función, difieren en prácticamente todos los
detalles. Los ribosomas eucarióticos poseen masas de
partícula que varían entre 3,9 y 4,5 x 106 O, y tienen
un coeficiente· de sedimentación nominal de 805. Se
disocian en dos subunidades distintas, que poseen
composiciones bastante diferentes de las de los proca-
'<,
5. El sitio que une los ribosomas a las membranas (M;
Sección 11-3F) · está sobre la subunidad grande,
adyacente al túnel de salida de polipéptidos E.
Por tanto, la subunidad grande estaría implicada en la
realización de tareas bioquímicas, como catalizar las
reacciones de la elongación de polipéptidos, mientras que
la subunidad pequeña es .el actor principal en cuanto al
proceso de reconocimiento del ribosoma, por ejemplo en
la unión de mRNA y tRNA (a pesar de que la subunidad
grande también estaría implicada en la unión al tRNA).
Obsérvese que el rRNA posee· probablemente un pa-
pel funcional fundamental en muchos, si no .en todos,
los procesos ribosomales (recordar que se ha demos-
trado que el RNA posee propiedades catalíticas; Sec-
ciones 29-4A y C).
3. Las cuatro subunidades L7 /L12, que constituyen
el prominente "tallo" de la subunidad grande, par-
ticipan en las diferentes reacciones de tipo GTPasa
que tienen lugar.
4. La función peptidil transferasa (P) ocupa el "valle"
entre las otras dos protuberancias de la subunidad
grande.
2. Los sitios de unión al anticodón se encuentran en
la región de la "hendidura" de la subunidad peque-
riotas (Tabla 30-7; compárese con la Tabla 30-6). La
subunidad pequeña (405) del ribosoma citoplasmáti-
co del hígado de rata, que es el ribosoma eucariótico
mejor caracterizado, contiene 33 polipéptidos únicos
y un rRNA de 185. Su subunidad grande¡ de 605,
contiene 49 polipéptidos diferentes y tres rRNAs, de
285, 5,85 y 55. La microscopia electrónica indica que
estas subunidades, así como el ribosoma intacto, po-
seen formas similares a las de los elementos equiva-
lentes de los procariotas. ·
Las comparaciones de . secuencias de los rRNAs
correspondientes de varias especies indica que duran-
te la evolución se han conservado sus estructuras
secundarias, más que sus secuencias de pares deba-
ses (Figs. 30-25 y 30-33). Por ejemplo, un G · C en un
segmento apareado del rRNA de 165 de E. coli ha
sido sustituido por un A · U en el segmento análogo
del rRNA de 185 de levadura. El rRNA de 5,85, que
está presente en la subunidad grande eucariótica for-
mando un complejo de bases apareadas con el rRNA
de 285, es homólogo en secuencia al extremo 5' del
rRNA de 235 procariótico. Aparentemente,· el rRNA
de 5,85 habría aparecido por mutaciones que modifi-
caron el procesamiento postranscripcional del rRNA,
lo cual habría generado la aparición de este cuarto
rRNA. ,
.... na.
Fuente: Lewin, B., Genes (3.ª ed.), p. 146, Wiley (1987).
.49 polipéptidos
1000
35 ºlo
33 polipéptidos
700 ·
50 ºlo .
1700
40 ºlo
Proteínas
' Masa de las proteínas (kD)
Proporción de la masa
65 ºlo 50 ºlo
700
185, 1874 nucleótidos 285, 4718 nucleótidos
5,85, 160 nucleótidos
55, 120 nucleótidos
1820 2520
60 ºlo
Masa del RNA (kD)
Proporción de la masa
605
2820
405
'1400
805 ·
. 4220
Coeficiente de sedimentación
Masa (kD)
RNA·
· Mayor
Menor
Subunidad grande Subunidad · pequeña Ribosoma
Tabla 30-7
Componentes de los ribosomas citoplasmáticos del hígado de rata
Capítulo 30. Traducción 985
La traducción activa tiene lugar en polirribosomas
Las micrografías electrónicas revelan que los ribo-
somas ocupados en la síntesis proteica se organizan
en tándem sobre los mRNAs, como las perlas de un
Número de péptido, cadena p
Figura 30-34
Distribución de [3H]Leu entre los péptidos trípticos de la
subunidad ~ de la hemoglobina soluble de conejo, tras la
incubación de los reticulocitos de conejo con [3H]Leu
durante. los tiempos indicados. [De Dintzis, H.M, Proc. Natl.
Acad. Sci. 47, 255· (1961).]
+
H3N-Lys-Lys-Lys- · · · -Lys-Lys -Asn -coo--
Esto, junto con el conocimiento de que AAA y AAC
codifican para Lys y para Asn, respectivamente, y a
que se conocía también la polaridad de la síntesis de
polipéptidos, indicó que el ribosoma lee el mRNA en la
dirección 5' :.a 3 '. Esto explica la observación de que,
en los procariotas, los ribosomas inician la traducción
sobre los mRNAs nacientes (Sección 29-3).
-4---------------.. Extremo C Extremo N 5' A-A-A-··· -A-A-A -C· 3'
En estas condiciones el sistema sintetiza una poli(Lys)
con una Asn e-terminal.
27 12 18 9 3 17 1 24 13
4 min'
Los ribosomas leen el mRNA en la
dirección 5' • 3'
La dirección de lectura de los mRNAs por parte del ·
ribosoma fue determinada utilizando un sistema de .
síntesis proteica libre de células, en el cual el mRNA
era un poli(A) con una C_ 3' -terminal.
7 min ·
,,,/"'
Tiempo de incubación ~-#"·
···<§'""·"".¡,,ef':'"'f~·:,r;: e-
~~ 60 mín --#~'{# . ~-· "'" •• ,.,,_.• ,:!.o ~-'· "-::.i:.. .. ~:..,.>.4"'-""••'''' .,., • .,,,, ••,,, ,.--.-·- ••••,,o,•_.L ....,.J!\: l~W,0•~.'-"-""• .·~--.;p.é'f~·t;(¡ • • - "' ,..,.,, .. ,....,,.,..,....,oor,, .'r: .,..,,..,._. •• .,.,...,,-.,z-;•ln·•.,.-..,,.,W: -,;...,. 11-':l"''-·•:.,,,.....~;,'l'or,,o:m'"'!, .... r :i- .. -.-- .. ""'"•"'""'"'...-""
mediante experimentos de marcaje radiactivo. Expuso
reticulocitos en fase de síntesis activa dehemoglobina
a leucina marcada con 3H, durante tiempos inferiores
a los necesarios para producir un polipéptido comple-
to. El grado de marcaje íncorperado a -los péptidos
trípticos derivados de las moléculas solubles de he-
moglobina (las completas) aumentaba conforme los
péptidos se hallaban más próximos al extremo C (Fig.
30-34). Los aminoácidos que se incorporaban al poli-
péptido debían, por · tanto, haberse añadido por el
extremo C en crecimiento; esto es, la síntesis de poli-
péptidos tiene lugar desde el extremo N al extremo C.
similitud que existe entre todos estos elementos; difieren
fundamentalmente en inserciones y defecciones de
estructuras de horquilla con lazo. Los rRNAs de tipo 238
de varias especies, igual que estos, poseen estructuras
secundarias parecidas. [De Gutell, R.R., Weiser, B., Woese,
e.a y Noller, H.F., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 32,
183 ,(1985).]
Figura 30-33
Estructuras secundarias predichas de formas parecidas
al rRNA de 16S evolutivamente distantes, de
(a) arqueobacterias (Halobacterium volcanii), (b) eucariotas
(levadura de panadería) y (e) mitocondrias de mamíferos
(bovinas). Compárense estas estructuras- con la del RNA de
168 de las. eubacterias (E. co/1). Obsérvese la estrecha , . .
<cJ (b)
986 Sección 30-3. Ribosomas
La fMet es el resto N-terminal de los polipéptidos
procarióticos
El primer indicio de que la iniciación de la traduc-
ción requiere un codón especial. identificado después
como AUG (y, en procariotas, ocasionalmente GUG),
fue la observación de que casi la mitad de las proteí-
nas de E. coli comienza con el aminoácido Met, un
aminoácido que, por otra parte, es muy poco frecuen-
C. Iniciación de cadenas
Si el .polipéptido en crecimiento es separado del
ribosoma por un tratamiento con elevadas concentra-
ciones salinas, su resto e-terminal está siempre esteri-
ficado con una molécula de tRNA, formando un pep-
tidil-tRNA.En consecuencia, el polipéptido naciente
debe crecer gracias a la transferencia del grupo peptidilo
del peptidil-tRNA al aminoacil-tRNA entrante, forman-
do un peptidil-tRNA con un resto de aminoácido más
(Fig. 30-36). Aparentemente, el ribosoma posee al me-
nos dos sitios de unión al tRNA: el denominado sitio
P, que se une al peptidil-tRNA, y el sitio A, que se
une con el aminoacil-tRNA entrante (Fig. 30-36).
Consecuentemente, tras la formación de un enlace
peptídico, el tRNA que ocupaba el sitio P, ahora
desacilado, debe ser. eliminado y sustituido por el
peptidil-tRNA recién formado, que viene del sitio A,
con lo cual se posibilita una nueva ronda de forma-
ción del enlace peptídico. El hallazgo, gracias a inves-
tigaciones recientes, de que cada ríbosoma es capaz
de unirse hasta a 3 tRNAs desacilados, pero sólo a
dos aminoacil-tRNAs, indica no obstante que el ribo-
soma posee un tercer sitio de unión a tRNA: el sitio
de salida o sitio E (de "Exit"), que se uniría al tRNA
saliente de manera transitoria.
Los detalles del proceso de· elongación de cadenas
se discutirán en la Sección 30-30. La iniciación y la
terminación de cadenas, que son procesos especiales,
serán examinados en las Secciones 30-3C y 30-3E,
respectivamente. En todas estas secciones considera-
remos el proceso de interés primero en E. coli, para
después compararlo con la actividad análoga en euca- . ' notas.
los polipéptidos de la ñbroína de la seda. La barra
representa O, 1 µm. [Cortesía de Osear L. Miller, Jr.,
University of Virginia.]
1 C=O
1
CH-R1
1
NH+ 3
Peptidil-tRNA
•
•
•
O OH.
1 C=O
1
CH-R
1 . J'l
NH
1 C=O
1
CH-Rl'l-l
1
NH
1 .
La elongación de cadenas tiene lugar por unión
del polipéptido en crecimiento al resto de
aminoácido del tRNA entrante
Durante la síntesis de polipéptidos, los restos de
aminoácido se añaden secuencialmente al extremo
carboxilo de la cadena polipeptídica en crecimiento,
que está unida al ribosoma.
collar (Figs. 30-35 y 29-16). Los ribosomas individua-
les de estos polírríbosomas (o polisomas) están se-
parados por espacios de 50 a 150 A, de manera 'que
ocupan una densidad máxima sobre el mRNA de ~ 1
ribosoma por cada 80 nucleótidos. Los polisomas ·
aparecen porque, una vez que un ríbosoma activo ha
dejado libre su sitio de iniciación, un segundo riboso-
ma puede venir e iniciar la síntesis en ese sitio.
Figura 30-35
Micrografías electrónicas de polisomas de glándulas de la
seda del gusano de seda Bombyx morí. El extremo 3' del
mRNA se encuentra a la derecha. Las flechas apuntan a
Capítulo 30. Traducción 987
Figura 30-37 ·
Secuencia de nucleótidos del tRNAret de E. coli,
representada en su forma de hoja de trébol. Los recuadros
sombreados indican las diferencias significativas entre este
tRNA iniciador y los tRNAs no iniciadores como el tRNAAla
de la levadura (Fig. 30-11)~ [De Woo, N.M., Roe, B.A. y
Rich, A., Nature 286, 346 (1980).]
El resto N-formilmetionina (fMet), que contiene un
enlace amida, sólo puede ser el resto N-terminal de
un polipéptido. De hecho, los. polipéptidos sintetiza-
dos en sistemas de síntesis proteica libres de células
derivados de E. coli poseen siempre un primer resto
fMet. Por tanto, fMet debe ser el resto iniciador en E.
coli.
El tRNA. que reconoce el codón de · iniciación,
tRNAt1et · (Fig. 30-37), · difiere del tRNA portador de
los restos de Met internos, tRNA~et, a pesar de que
ambos reconocen el mismo· codón. En E. coli, los
tRNAt'1et descargados se aminoacilan primero con
Met, mediante la misma aminoacil-tRNA sintetasa
que carga al tRN~et. El Met-tRNAttet resultante es
específicamente formílado para dar fMet-tRNAttet, en
una reacción enzimática que emplea N1º-formiltetra-
hidrofolato (Sección 24-40) como dador de formilo.
El enzima que cataliza la formilación no. reconoce .el
AoH
tRNAfet de E. coli C
e
A
Jlifl~I !J.f1~f G-C
C-G 70 o-e
G-C
G-C 60. uA
G-C CGGCC A
; i Ó5A 10 s~ u 1 1 1 1 1 A 57
,,,;¡;;;,,¡;,~·,1,i;,,!!ii:· e GAG G u e G G T e
:'.!.ff!tlllf/!ff!ff 1 1 1 1 e
0so · v · 18 G G C U C . A · 7.G
19 G D A G U-A Gm .
C-G 45
G-C
30 G-C 40
G-C
Cm A
33~ U A
u C A
Fora,llmetionina·tRNAptet
(fMet·tRNAJfe~ ·
te. Este hallazgo fue seguido por el descubrimiento de
una forma peculiar del Met-tRNAMet, en la cual el
resto Met está N-formilado.
S-CHa 1 f
CH2
l .
O CH~ O
II J.
2
ti
HC-NH-CH-C-O-.tRNAr1et
Figura 30-36
Reacción rlbosomal de la peptidil transferasa para formar un enlace
peptídico. El grupo amino del aminoacil-tRNA en el sitio A. desplaza
nucleofílicamente el tRNA del peptidil-tRNA en el sitio P, con lo que se
transfiere el polipéptido naciente al tRNA Que ocupa el sitio A.
'-,
tRNA descargado Peptidil-tRNA Aminoacil-tRNA
L\ :}: ::x ¡r; :ri ~t x i
.. :·.; . :. ·::·.:· ... . ..
,, " .
.. ;~ .. ·:.·:,.:~.:::.:: . . . . . .
.. . . . ··,.;;.,·· .. .. .. . '',·.::.':',.' .··::··:.:··:.'.: ·:.'., . ···············:·;.:·.: .. :·.:.;·.·:.·.:: .. :: .. ::
. . "
........................ !:i:lji:
Peptidil-tRNA
.. ·.•,, . , .
Sitio A Sitio P Sitio A Sirio P
988 Sección 30-3.· Ribosomas
iniciadora de la proteína A del fago R17. [De Steitz, J.A y
Jakes, K., Proc. Natl. Acad. Sci. 72, 4735 (1975).l
Figura 30-39
Interacciones de aparemiemto de bases entre el fragmento
de colicina E3 del rRNA de 168 de E. col) y la región
-AUUCCUAOGAOOUUUGACCUAUGCGAGCU-
1111111
3' HOAlTUCCUCCA CCAC;UAG- 5'
fMet-Arg-Ala-
a 1 O nucleótidos rico en purinas, o secuencia de
Shine-Dalgarno, que se encuentra centrado - 10
nucleótidos hacia el lado 5' del codón iniciador de
casi todos los mRNAs procarióticos conocidos (Fig.
30-38). Las interacciones de apareamiento de bases entre
una secuencia de Shine-Dolgarno en el mRNA y el rRNA
de 165 permiten, aparentemente, que el ribosoma selec-
cione el codón de iniciación correcto. De esta forma, los
ribosomas que poseen secuencias anti Shine-Dalgar-
no modificadas por mutación presentan con frecuen-
cia una gran reducción en su capacidad para recono-
cer a los mRNAs naturales, aunque traducen eficien-
temente aquellos mRNAs cuyas secuencias de Shine-
Dalgarno han sido modificadas para que sean com -
plementarias a las correspondientes en el ribosoma.
Además, el tratamiento de los ribosomas con la pro-
teína bactericida colicina E3 (producida por cepas de
E. coli portadoras del plásmido E3), que corta específi-
camente un fragmento de 49 nucleótidos del extremo
3' del mRNA, da lugar a ribosomas que son incapaces
de iniciar la síntesis de nuevos polipéptidos, pero ,sí
que pueden completar la síntesis de una cadena que
ya hubiera siclo iniciada -, De hecho: cuando se tratan
con colicina E3 ribosomas unidos. a un fragmento del
mRNA del fago Rl7, que contiene lá secuencia de
"" iniciación de su también llamada proteína A, y luego
se disocian en 1 °/o de SDS, este fragmento de mRNA
se libera formando un complejo con el fragmento de
rRNA de 49 nucleótidos (Fig. 30-39).
secuencias situadas hacia el extremo 3' del rRNA de 16S
(parte inferior de la figura). [De Steitz, J.A., en Chambliss,
G., Graven, G.R., Davies, J., Davis, K., Kahan, L. y Nomura,
M. (Eds.), Ribosomes. Structure, Function and Genetics. pp
481-482, University Park Press (197-9).]
;
Extremo q' del rRNA de 168
mRNA de la proteína A del fago Rl 7
El apareamiento de bases entre el mRN A y el
rRNA de 165 ayuda a seleccionar el sitio de
iniciación de la traducción
AUG codifica para restos Met internos, así como
para el resto Met iniciador de un polipéptido. Ade-
más, los mRNÁs contienen por lo general muchos
AUGs (y GUGs) situados sobre pautas de lectura
diferentes. Es evidente que un sitio de iniciación de la
traducción debe estar especificado por algo más que un
simple codón de iniciación.
En E. coli, el rRNA de 165 contiene una secuencia
rica en pirimidinas en su extremo 3 ', Esta secuencia,
como señalaran John Shine y Lynn Dalgarno en 1974,es parcialmente complementaria a un segmento de 3
Met-tRNA~et. Las estructuras de rayos-X del tRNA¡"1et
de E. coli y del tRNAPhe de levadura (Fig. 30-14) son
bastante parecidas, pero difieren en la conformación
de sus brazos aceptores ·y en la de sus lazos antico-
dón. Quizás estas diferencias estructurales permiten
que el tRNA¡"1et se diferencie del tRN~et en las reac-
ciones de iniciación y elongación (Sección 30-30).
Las proteínas de E. coli se modifican postraduccional-
mente por la desformila-ción de su resto fMet y, en
muchas proteinae, por la eliminación posterior de la Met
N-terminal resultante. El procesamiento necesario tie-
ne lugar, por lo general, sobre el polipéptído naciente,
lo cual explica el hecho de que ninguna proteína de
E. coli contiene fMet.
Figura 30-38
Algunas secuencias de iniciación de la traducción
reconocidas por los ribosomas de E. coli. Los mRNAs
están alineados de acuerdo con sus codones de iniciación
(sombreado azu~. Sus secuencias de Shine-Dalgarno son
complementarias (sombreado rojo), contando pares G · U, a
GCGAUU-
. AGAGUU-
.AAACCA-
·~aACCAUG-
UCUAAG-
GUUCGU-
GCUUCU-
. GCAACA-
'GCUUUA-
CAAACA-
.s AAAGCA-
- u u u a a A ut. G ~ a A A A e a
-AGCCUAA~OG~~Q~AAUU
- C AA UUC AG~GGI!JGG GA UU
-UUCACAC~~µ~jAACAGCU
-UAAC~A6:~~UGAAAUGC
-AAUCUUGGAGGCUUUUUU
-UCAACCBG~GÚUUGAAGC
-AAAACC~UG~GCUAUUUA
-CUACC~GO~GCAAAGCUA~
-CAAAAUllbP~~AAUAACA
- G u A A A t\.D G~ G¡U A u e G A e A
Codón de
iniciación
Capítulo 30. Traducción 989
Extremo 3' del rRNA de 168
araB
galE
lacl
lacZ
Replicasa del f ago Q~
Proteína A del fago <t>Xl 74
Proteína de la cubierta del fago Rl 7
Sl2 ribosomal
LlO ribosomal
trpE
Guía trp
2. En ese momento GTP, mRNA y un complejo de
IF-2 con fMet-tRNAt1et se unen a la subunidad de
305. El orden de unión es desconocido. Por tanto,
el reconocimiento del fMet-tRNAret no debe estar
mediado por interacciones codón-anticodón: es la
única interacción tRNA-ribosoma que no depende
de este. tipo de reconocimiento, No obstante, la·
interaceión codén-anticodón colabora en la unión
Figura 30-40
Vía' de iniciación en los ribosomas de E. coti
Complejo de Iniciación de 705
Sitio P
GDP+~
+ ÍFi1- +
3
Complejo de iniciación de 305
2
Secuencia de
Shine-Dalgarno
5' 1 j 1 1 tC " 1AUCí1 1 3' + .. ---- ..... . '
Met . IF-2 • fMet - tRNAr , ·
fMet - tRNA ret -.
¿y_, + JF-1-- .. ,
Ribosoma de 705 inactivo
L~ iniciación es un proceso de tres fases, que
requiere la participación de factores de iniciación
proteicos solubles
'Los ribosomas intactos no se unen directamente al
mRNA para poder iniciar la síntesis de polipéptidos.
En lugar de ello, la iniciación es un proceso muy com-
plejó, en el cual las dos subunidades del riboeoma y el
fMet-tRNAret se, asocian sobre un mRNA alineado de la
manera adecuada, para formar un complejo que es com-
petente para comenzar la elongación de la cadena. Este
proceso de ensamblado también requiere de ~a participa-
ción de, factores de iniciación proteicos, que no están
as.ociados al ribosoma de manera permanente. La inicia-
ción en E. coli implica a tres factores de iniciación
denominados IF-1, IF-2 e IF-3 (Tabla 30-8). Su exis-,
tencia fue descubierta cuando se halló que lavando la
subunidad pequeña del ribosoma con una solución de
cloruro de amonio lM, que elimina los factores de
iniciación pero no las proteínas ribosomales "perma-
rientes", se impedía la iniciación. ,
El proceso de iniciación en los ribosomas de E. coli
consta de tres etapas (Fig. 30-40):
1. Tras completar un ciclo de síntesis de polipéptidos,
las subunidades de 305 y de SOS permanecen aso-
ciadas en forma de ribosomas de 705 inactivos. El
IF-3 se une a· 1a subunidad de 305, de forma que
promueve la disociación de este complejo. IF-1
incrementa l~ tasa de disociación, quizás colabo-
rando en la unión de IF-3.
46 RF-3
38
Reconoce los codones
terminadores UAA y UAG
Reconoce los codones
terminadores UAA y UGA
Se une a GTP y estimula la unión
de RF-1 y RF-2
36 RF-1
Factores de liberación
74
77
EF-Ts
EF-G
Se une a aminoacil-tRNA y a
GTP
Desplaza GDP de EF-Tu
Promueve la translocación
uniendo GTP al ribosoma
Factores de elongación
EF-Tu 43
Colabora en la unión de IF--3
Se une al tRNA iniciador y a GTP
Libera la subunidad de 305
del ribosoma inactivo y ayuda
en la unión del mRNA
9
97
22
IF-1
IF-2
IF-3
Factores de iniciación
Función Masa (kD) Factor
Tabla 30-8
Factores solubles de la síntesis proteica en E. coli
990 Sección 30-3. Ribosomas
Transpeptidización
El enlace peptídico se forma en la segunda fase del
ciclo de elongación, con el desplazamiento nucleofílico
del tRNA del sitio P por el grupo amino de un aminoacil-
D. Elongación de cadenas
Los ribosomas elongan las cadenas polipeptídicas en
una reacción que sigue un· ciclo de tres fases, añadiendo
restos de aminoácidos al extremo carboxilo de un poli-
péptido en crecimiento (Fig. 30~41). Este proceso, que
tiene una velocidad de hasta 40 restos/s, implica la
participación de varias proteínas no ribosomales, co-
nocidas como factores de elongación (Tabla 30-8).
Unión de los aminoacil-tRNAs
Durante la fase de u unión" del ciclo de elongación ·
de E. coli, un complejo binario de GTP con el factor
de elongación EF-Tu se combina con un aminoacil-
tRNA. El complejo terciario resultante se une al ribo-
soma y, en una reacción que hidroliza el GTP ·a GOP
+ P¡, el aminoacil-tRNA se incorpora a un complejo
codón-anticodón localizado en el sitio A del riboso-
ma, mientras que se liberan el complejo EF-Tu · GDP
y el P¡. El resto de esta etapa consiste en la regenera-
ción del complejo EF-Tu · GTP, a través del desplaza-
miento del GOP de EF-Tu · GOP por el factor de
elongación EF~Ts, el cual, por su parte, resulta des-
plazado por el GTP.
Los aminoacil-tRNAs son capaces de unirse al sitio
A del ribosoma sin la mediación de EF-Tu, pero la
velocidad del proceso es demasiado lenta para que se
pueda· soportar el crecimiento celular. La importancia
de EF-Tu .queda reflejada en el hecho de que es la
proteína más abundante de E. coli; está presente en
~ 100 000 copias . por célula ( > 5 °/o de la proteína
celular), que es aproximadamente el número de molé-
culas de tRNA que hay en la bacteria. Por tanto,._ la
totalidad de los aminoacil-tRNAs celulares está esencial-
mente secuestrada por EF-Tu.
EF-Tu es incapaz de unirse ·al Met-.tRNAttet, formi-
lado o no, y esta es la razón por la cual el tRNA
iniciador no lee jamás codones internos AUG o GUG.
¿Cuál es la base estructural de esta discriminación? El
tRNAt1et de E. coli difiere de otros tRNAs de E. coli en
la ausencia de un par · de bases en el extremo del
segmento bicatenario de su brazo de aminoácido (Fig.
30-37). La conversión de su resto C 5' -terminal a una
U, por tratamiento con bisulfito, que restablece el
par de bases perdido al generar uh par U · A, permite
la unión de EF-Tu. Evidentemente, EF-Tu reconoce el
segmento apareado del brazo de aminoácido de los
tRNAs no iniciadores. Sin embargo, los tRNAs inicia-
dores de otros organismos poseen brazos de aminoá-
cido con segmentos completamente apareados.
hasta que encuentra el primer AUG. Esta hipótesis
explica · las tasas tan reducidas de iniciación de aque-
llos mRNAs que tienen incorrectamente añadida la
capucha.
Capítulo 30. Traducción 991
La iniciación eucariótica es parecida a la
procariótica
La iniciación en los eucariotas recuerda al proceso
global de los procariotas, aunque difiere en los deta-
lles. Los ribosomas poseen un "zoológico" más exten-
so de factores de iniciación (denominados eIF-n; la "e"
por eucariotas). En algunos sistemas eucarióticos se
han detectado unos 10, muchos de ellos con varias
subunidades, pese a que son más difíciles de distin-
. guir de las proteínas ribosomales que sus equivalentes
procarióticos.
· La diferencia más llamativa entre la iniciacióneuca-
riótica y la procariótica se da en la segunda fase del
proceso, en la unión del mRNA y de un complejo de
elF-2, GTP, y Met-tRNAt'et a la subunidad de 405
(aquí el subíndice ""i" distingue al tRNA iniciador
eucariótico, cuyo .. resto de Met no está jamás N-formi-
lado, del de los procariotas; no obstante, los dos
compuestos son fácilmente intercambiables in vi-
tro). Los mRNAs eucarióticos carecen de secuencias
complementarias que se unan al rRNA de 185 como
lo hacen los mRNAs procarióticos a la secuencia de
Shine-Oalgarno. En lugar de ello, la traducción de los
mRNAs eucarióticos, que son invariablemente monocis-
trónicos, comienza casi siempre en su primer AUG. Este
hecho, junto con las observaciones de que (1) los
ribosomas procariótícos pueden iniciar la síntesis de
polipéptidos sobre RNAs circulares, mientras que los
eucarióticos no y (2) una subunidad de eIF-4F es una
proteína que se une a la capucha (Hcap binding
protein"), sugieren que la subunidad de 405 se une a
un sitio próximo a la capucha de 5', si no a la capucha·
misma (Sección 29-4A), y que migra en dirección 3'
3. Finalmente, en un proceso precedido por la libera-
ción de IF-3, la subunidad de SOS se une al com-.
piejo de iniciación· de 305, hidrolizando el GTP
unido a este último para producir GOP + Pi. Esta
reacción, irreversible, reorganiza conformacional-
mente a la subunidad de 305 y libera IF-1 e IF-2,
permitiendo su participación en otras reacciones de . . . . , uuciacion.
La iniciación acaba con la formación de un complejo
fMet-tRNAret · mRNA · ribosoma, en el cual el sitio P
del ribosoma está ocupado por el fMet-tRNAret, mientras
que el sitio A e~tá a ·punto para aceptar un aminoacil-
tRNA entrante (esta organización es análoga a la que
se adopta al final de una ronda de elongación, Sec-
ción 30-30). Esta organización fue. deducida recu-
rriendo a la utilización del ·-antibiótico puromicina, ·
como se discutirá en la Sección·30-30. Obsérvese que
el tRNAt'1et es el único tRNA que entra en el ribosoma
directamente al sitio P. Todos los otros tRNAs lo
hacen pasando primero por el sitio A durante la elon-
gación de cadenas (Sección 30-30) .• ,.
de fMet-tRNA}"let con el ribosoma. IF-3 también
actúa en esta fase del proceso de iniciación: ayuda
en la unión de la subunidad de 305 a la secuencia
de Shine-Dalgarno presente en el mRNA.
,, .
Tirosil-tRNA Puromícína
OH 0-CH3
O OH
1 ·c=o
1
CH-CH2
1
.NH+
3
Hf OH
C=O
1 .
CH-CH2
1
NHt
o
11
···-O-P-0-CH
1 2
O H
,. NH2
t~NA situado en el sitio A (Fig. 30-36). La cadena
polipeptídica naciente aumenta su tamaño por su ex-
tremo carboxilo en un resto, y es transferida al tRNA
del sitio A en una reacción denominada de trans-
peptidizacíén. La reacción tiene lugar sin nece•
H3C, .,,,. CH3
N
sidad de cofactores activadores como el ATP, debido
a que el enlace éster entre el polipéptido naciente y el
tRNA del sitio P ~s un enlace de u alta energía". El
centro peptídil transferasa,. qu.e cataliza la formación
del enlace peptídíco, está situado íntegramente en la
Figura 30-42 ·
La puromicina (izquierda) se parece
al extremo 3' del tirosil-tRNA
(derecha).
. EF-Ts son sustítutdos por una única proteina multimérica,
eEF-1, y EF-G es sustituido por eEF-2.
Transpeptrdización
Aminoacil-
tRNA
Figura 30-41
Ciclo de elongación en los ribosomas de ,E. coli. i,.a
elongación eucanótíca sique un ciclo similar, pero EF-Tu y
GTP
3'
- descargado
tRNA,
tRNA
'
+ GDP+ Pi
Translocación
5' _..__..__._......,_ ......... 5' .......... ..,.._ .......... ...__._
mRNA
·Sitío P -
Unión
l.
Amínoacil-tRN A
• EF-Tu • GTP
Peptidil-tRNA
EF-Ts
EF-Tu .. GDP
Aminoacil-tRNA
Sitio P
EF - Tu • EF - Ts
_,....-_. GDP
EF-Tu • GTP
Polipéptido
naciente
EF-Ts GTP
992 Sección 30-3. Ribosomas
Peptidil-tRNA
Estados intermedios en el movimiento del tRNA
en el ribosoma
Los estudios de análisis de huellas químicas (Sec-
ción 33-3B) revelan que ciertas bases del rRNA de
La puromicina es un análogo de aminoacil-tRNA
El ciclo de elongación ribosomal fue caracterizado
originariamente gracias a la utilización del antibiótico
puromicina (Fig. 30-42). Esta sustancia, parecida al
extremo 3' del Tyr-tRNA, provoca la terminación prema-
tura de la síntesis de cadenas polipeptídicas. La puromi-
cina, en competencia con les aminoacil-tRNA especi-
ficados pero sin la necesidad de factores de elonga-
ción, se une al sitio A del ribosoma, el cual, a su vez,
cataliza la reacción de transpeptidización normal para
formar peptidil-puromicina. El ribosoma, en .estas
condiciones, es incapaz de catalizar la reacción de
transpeptidización en el próximo ciclo de elongación,
debido a que el "resto de aminoácido" de la puromici-
na está unido a su "tRNA" a través de un enlace
amida, en lugar de ser un enlace de tipo éster. Esto
provoca, en consecuencia, la interrupción de la sínte-
Un modelo alostérico de tres sitios para el ciclo
de elongación del ribosoma
En la actualidad se acepta que el ribosoma contiene
tres sitios de unión a tRNA: (1) el sitio A, que se une
al aminoacil-tRNA entrante al que será transferida la
cadena polipeptídica en crecimiento, (2) el sitio P, que
une peptidil-tRNA, y (3) el sitio E (de "Exit", salida en
inglés), que se une al tRNA desacilado. La unión del
tRNA a los sitios A y E presenta una cooperatividad
alostérica negativa. Al finalizar un ciclo de elonga-
ción, el sitio E se une con alta afinidad al tRNA recién
desacilado, mientras que et· ahora vacío sitio A pre-
senta baja afinidad por el aminoacil-tRNA (este esta-
do es el estado postranslocaeíonal), Tras unirse al
aminoacil-tRNA entrante, el ribosoma sufre un cam-
bio conformacional que convierte al sitio A en un sitio
de alta afinidad, y al sitio E en uno de baja afinidad,
con lo que se produce la liberación del tRNA desacila-
do (estado pretranslocacíonal).
Se hipotetiza que, en el estado postranslocacional,
el sitio A se une al aminoacil-tRNA entrante funda-
mentalmente a través de interacciones codón-antico-
dón, mientras que en el estado pretranslocacional, la
unión al aminoacil-tRNA se refuerza por interaccio-
nes ribosoma-tRNA, que afectan a todos los tRNAs
con una afinidad más o menos igual. De esta forma,
en · el estado postranslocacional, el sitio A discrimina
entre los aminoacil-tRNAs apropiados y los no apro-
piados de manera más precisa que en el estado pre-
translocacional. Este modelo, por tanto, proporciona-
ría una explicación para la precisión ribosomal sin la
necesidad de recurrir a mecanismos de prueba de
lectura (véase más adelante).
Translocacíón
En la etapa final del ciclo de elongación, se expulsa (o
quizás se transfiere al sitio E y se expulsa en la reacción
de unión siguiente) el tRNA del sitio P, ahora descargado
(primero un tRNAre1,. pero después de l·a iniciación un
tRNA no iniciador). Entonces, en un proceso que recibe
la denominación de translocación, el peptidil-tRNA en
el sitio A, unido al mRNA, se desplaza al sitio P. Esto
prepara al ribosoma para el próximo ciclo de elonga-
ción. El mantenimiento de la asociación codón-
anticodón del peptidil-tRNA deja de ser- necesario
para la específicación de aminoácidos. En lugar de
ello, probablemente actúa guardando el sitio que per-
mite que el ribosoma dé el salto preciso de· tres nu-
cleótidos a lo largo del mRNA, salto requerido para
conservar la pauta de lectura. De hecho, la observa-
ción de que los tRNAs supresores de pauta de lectura
inducen una translocación de cuatro nucleótidos (Sec-
ción 30-2E) indica que el movimiento del mRNA está
directamente acoplado al movimiento del tRNA.
El proceso de translocación requiere la participa-
ción de un factor de elongación, EF-G, que se une al
ribosoma junto con GTP y .que sólo es liberado tras la
hidrólisis del GTP a GDP + P;. La liberación de EF-G
es un requisito previo para el inicio del próximo ciclo
de .elongacíón,debido a que las uniones al ribosoma
de EF-G y de EF-Tu son mutuamente excluyentes. La
translocacióri es un proceso mecánico muy complejo
y, desafortunadamente, muy poco conocido.
sis polipeptídica, y la líberación de la· peptidil-
• • puronucma,
En ausencia de EF-G y GTP, un ribosoma activo no
puede unirse a puromicina debido a que el sitio A se
encuentra ocupado por un peptidil-tRNA. Sin embar-
go, un ribosoma recién formado escapa a esta norma;
cataliza la formación de fMet-puromicina. Estas obser-
vaciones demostraron la existencia funcional de los sitios
P y A, y establecieron que fMet-tRNAret se une directa-
mente al sitio P, mientras que otros aminoacil-tRNAs
deben ocupar primero el sitio A.
El ciclo de elongación de los eucarlotas se parece
al de los procariotas
· El ciclo de elongación eucariótico se parece mucho al
procariótico. En los eucariotas, las funciones de EF-Tu
y de EF-Ts las desempeñan dos subunidades diferen-
tes del factor de elongación eucariótico eEF-1. De la
misma forma, eEF-2 actúa como un análogo de EF-G.
Sin embargo, los factores de elongación eucarióticos y
procarióticos no son intercambiables.
subunidad grande, cosa que ha sido demostrada por
la observación de que, en presencia de concentracio-
nes elevadas de solventes orgánicos como el etanol, la
subunidad grande es capaz de catalizar la formación
de enlaces peptídicos por sí sola. Aparentemente, el
disolvente orgánico distorsiona la subunidad grande
de una forma que imita el· efecto de la unión con la
subunidad pequeña. La actividad peptidil transferasa
surgiría de la yuxtaposición de varias cadenas poli-
peptídicas en la subunidad grande, junto con el rRNA
de 235 (Sección 30-3A).
Capítulo 30. Traducción 993
Figura 30-43
Terminación en los rlbosornas de E. coli. RF-1 reconoce los
codones 'de terminación UA'A y UAG, mientras que RF-2
reconoce UAA y UGA. La terminación eucariótica sigue una
ruta -anáíoqa, pero requiere un solo factor de liberación,
eRF, que reconoce a los tres codones de terminación.
+ GDP + Pi
tRNA
descargado
coo
Polipépt1do
I
1 1 1 1 i 1 1 1 1
GTP
RF-3 -~
RF-3 • GTP
Polipéptido naciente
E. Terminación de cadenas
La síntesis de polipéptidos dirigida por mRNAs
sintéticos como poli(U) acaba con un peptidil-tRNA
asociado con el ribosoma. Sin embargo, la traduccion
de· los .mRNAs naturales, que. contienen los codones de
terminación UAA, UGA o UAG, resulta en la producción
de peüpéptidoe libres (Fig. 30-4-3). En E. coli, los codo-
nes de terminación, que son los únicos que -normal-
mente carecen de los correspondientes tRNAs, son
reconocidos por factores de liberación (RFs, de "re-
lease factors") proteicos (Tabla 30-8): RE-1 reconoce
UAA y UAG, mientras que Rf.-2. reconoc.e UAA y
UGA. Ninguno de estos factores de liberación puede
unirse al ribosoma simultáneamente· a EF-G. Existe
un tercer factor de. liberación, RF-3, que se-une a GTP·
y que estimula. la. unión al ribosoma de RF-1 y" de
RF-2. Estos factores de liberación actúan a -nivel del
sitio A del ribosoma, como lo indica el q;ue compitan
con los tRNAs supresores. por los codones de termina-
ción.
La unión de un factor de liberación al cedon de termi-
nación que le corresponde induce que la pepiidil transf e-
rasa ribosomal transfiera el grupo peptidilo a agua, en
lugar de hacerlo a un aminoaci.l-tRNA (Fig. 30-44). El
165 resultan protegidas por estar unidas a tRNAs en
los sitios A y P, y que ciertas bases del rRNA de 235
están protegidas gracias a su unión a tRNAs en los
sitios A, P y E. Casi todas estas bases· protegidas han
sido absolutamente conservadas por la evolución, y
muchas de ellas han sido implicadas en. la función
ribosomal en estudios genéticos o bioquímicos.
Las variaciones observadas en los patrones de hue-
lla química durante el ciclo de elongación indican que
la translocación del tRNA tiene lugar endos etapas
discretas. La primera, impulsada por la formación del
enlace peptídico, desplaza el extremo aceptor del
nuevo peptidil-tRNA desde el sitio A al sitio P de la
subunidad grande del ribosoma, dejando el extremo
anticodón asociado con el sitio A de la subunidad
pequeña ( este estado recibe también la denominación
de híbrido A/P). El extremo aceptor del tRNA recién
desacilado se desplaza simultáneamente desde el sitio
P al sitio E de la subunidad grande, mientras que su
anticodón permanece unido al sitio. P de lasubunidad
pequeña (estado híbrido P /E). En la segunda etapa de
la translocación, que es consecuencia de la unión al
ribosoma del factor de elongación EF-G; los extremos
anticodón de estos tRNAs, junto.con-el mRNA al que
están unidos, se desplazan en relación a la subunidad
pequeña de forma que el peptidil-tRNA ocupe ahora
el sitio. P de ambas subunidades ribosomales ( estado
P /P), y el tRNA desacilado ocupe el sitio E de· la
subunidad grande (como se indicaba antes, un t&NA
en el sitio E no protege al RNA de 165 de la modifica-
ción química, y por tanto su ocupación no- puede ser
determinada por este tipo de airálisis) .. Estas.observa-
ciones podrían explicar por qué todo.s los- .riboaomas
están compuestos por dos subunidades disociables.
994 Sección 30-3. Ribosomas
F. · Precisión traduccíonal
El código genético se traduce, por regla general, con
una fidelidad notable. Ya hemos visto que la trans-
cripción y la aminoacilación de los tRNAs son proce-
sos que también presentan una precisión elevada
(Sección 29-20 y 30-2C). La precisión de la descodifi-
cación ribosómica del mRNA fue estimada a partir de
la tasa de incorporación errónea de 355-Cys a la pro-
teína flagelina, de E. coli (Sección 34-3G), que nor-
malmente carece de este aminoácido. Estas medidas
indicaron · que la tasa de incorporación errónea es de
,.._ 10-4 errores por codón. Esta tasa aumenta notable-
mente en presencia de estreptomicina, un antibiótico
que incrementa la lectura equivocada por parte de los
ribosomas (Sección 30-3G). Del tipo de errores de
lectura que se conoce que son inducidos por la estrep-
tomicina, se dedujo que la traducción equivocada sur-
ge casi completamente de la confusión de los codones
de Arg CGU y CGC por los codones de Cys UGU.y
UGC. Por tanto, la tasa de error mencionada anterior-
mente resulta fundamentalmente de los errores en la
descodificación ribosomal del mensaje.
Los aminoacil-tRNAs son seleccionados por el ribo-
soma en función únicamente de su anticodón. Pese a
ello, la pérdida de energía de unión que supone un
apareamiento equivocado de una sola base en una
interacción codón-anticodón se ha estimado en ,.._ 12
kJ · mol:'. lo cual, de acuerdo con la Ec. [30.1 ), no
La hidrólisis de GTP acelera los procesos del
ribosoma
¿ Cuál es el papel de las diversas reacciones de
hidrólisis de GTP que son esenciales para el funciona-
miento normal del ribosoma? La traducción tiene lu-
gar en ausencia de GTP, aunque de manera extrema-
damente lenta. Esto implica que la energía libre de la
reacción de transpeptidización es suficiente para diri-
gir todo el proceso de traducción. Además, ninguna
de las · reacciones de hidrólisis de GTP da lugar a la
formación de intermediarios covalentes u de alta ener-
gía", como lo hace, por ejemplo, la hidrólisis de ATP
en numeros.as reacciones biosintéticas. Por tanto, se
piensa que la unión del GTP provoca un cambio
alostérico en la conformación de los componentes
ribosomales, de forma que se facilita un proceso, por
ejemplo la translocación. Este cambio conformacional
permite también que se catalice la hidrólisis de GTP,
lo cual, a su vez, permite que el ribosoma recupere su
conformación inicial, con ·1a liberación concominante
de productos como el GDP y el P¡. La e.levada veloci-
dad e irreversibilidad de la reacción de hidrólisis de GTP
asegura que los diversos y complejos procesos ribosoma-
les a los que va acoplada, la iniciación, la elongación y la
terminación, . sean también rápidos e irreversibles.La
hidrólisis de GTP facilita también la precisión en la
traducción (véase más adelante).
tRNA que queda descargado se disocia a continuación
del ribosoma, y los factores de liberación son expulsa-
dos con hidrólisis asociada de GTP a GDP + P;. El ·
ribosoma inactivo resultante libera el mRNA al que
estaba unido, preparándose para una nueva ronda de
síntesis de polipéptidos. ,
La terminación en los eucariotas se parece a la de
los procariotas, salvo que requiere únicamente de un
factor de liberación, eRF, que se une al · ribosoma
junto con GTP. Este GTP es hidrolizado a GDP + P;,
en una reacción que se piensa que es la que dispara la
disociación del ribosoma de eRF.
Figura 30-44
Hidrólisis del peptidil~!RNA catalízada por el ríbosoma, para formar un
polipéptido y tRNA libre.
Peptidil-tRNA .
Polipéptido
tRNA
H
/
:O
\
H
H
OH OH
o o-
~ / e
1
R-CH
n . 1
NH
1 C=O
1
Rn-1-CH
1
NH
!
•
•
•
+
Adenina
ismr;ffl
o
1
O=P-O-CH2 o
I_
O H
H
e:~
O=C~--
1
R-CH
n I
NH
1 C=O
1
Rn--1-yH
NH
1
•
•
•
Adenina • o
1
O=P-O-CH2
1 . -
O H
H
HO
Capítulo 30. Traducción 995
especificados) y los no correspondientes (no espe-
cificados), de acuerdo con las energías de unión de
las interacciones codón-anticodón.
2. Tras esto, el GTP unido se hidroliza irreversible-
mente, dando lugar a un intermediario activado,
indicado por una estrella en la figura. Este comple-
jo puede reaccionar ahora de dos maneras:
(a) El EF-Tu · GDP pttede disociarse del ribosoma
con una tasa constante k3, conduciendo así a la
formación de un enlace peptídico por parte del
ribosoma.
(b) Como alternativa, el aminoacil-tRNA puede
disociarse del ribosoma con una tasa constante
k4, interrumpiendo el proceso de elongación.
Después . de esto el complejo EF-Tu · GDP se
disociaría del ribosoma, permitiendo que éste
reiniciara el proceso de elongación.
Si el cociente k4/k3 es mayor para un tRNA incorrecto
que para uno correcto, · entonces se ha producido un
segundo tamizado. Se piensa que las bases físicas de
este segundo filtro son que k3 es independiente de la
identidad del tRNA, mientras que k4 es mayor para
los tRNAs incorrectos, que están unidos más débil-
Ricina/abrina
Toxina diftérica
Tetraciclina
Estreptomicina
Puromicina
Ácido fusídico
Eritromicina
Cicloheximida
· Inhibe la peptidil transferasa de la
subunidad grande procariótica
Inhibe la peptidil transferasa de la
subunidad grande eucariótica
Inhibe la translocación de la
subunidad grande procariótica
Inhibe la elongación en los
procariotas al impedir la
disociación de EF-G·GDP de la
subunidad grande
Un análogo de aminoacil-tRNA que
provoca la terminación prematura
de cadenas. tanto en procariotas
como en eucariotas
Provoca la lectura equivocada del ·
mRNA e inhibe la iniciación de
cadenas . en procariotas
Inhibe la unión de aminoacil-tRNAs
a la subunidad pequeña de los
procariotas
Inactiva catalíticamente eEF-2 por
ADP-ribosilación
Proteínas vegetales venenosas, que
inactivan catalíticamente la
subunidad grande eucariótica
Cloranfenicol
Acción lnhibidor
Tabla 30-9
Algunos Inhíbídores de los ribosomas
·Ribosoma (n)
Figura 30-45 ,
Mecanismo de prueba de lectura cinética para seleccionar
una interacción codón-anticodón correcta. La reacción de
reconocimiento inicial verifica el aminoacil-tRNA (aa-tRNA) ·
según que su interacción codón-anticodón sea la correcta.
El complejo resultante .~e convierte en un intermediario de
"alta energía"(*), en una reacción impulsada por GTP. Este
intermediario, por su parte, o bien libera EF-Tu ~ GDP como
preparación para la formación de un enlace peptídico, o
bien libera aminoacil-tRNA antes de que se libere
EF-Tu · GDP. Si k4/k3 es mayor para un apareamiento
incorrecto en· ,a interacción codón-anticodón que para un
apareamiento correcto, entonces estas últimas reacciones··
constituyen un mecanismo de prueba de lectura de la unión
de los tRNAs apropiados.
- ... EF~Tu • GDP
Ribosoma (n + 1) Ribosoma (n) • EF_:Tu ·• GDP
k5
ka
Prueba
de
lectura
Pi
[Ribosoma (n) • aa-tRNA • EF-Tu • GDP] *
Ribosoma (n) • aa-tRNA • EF-Tu • GTP
Ribosoma (n) + aa-tRNA • EF_;Tu • GTP
k_¡ k 1
Recono-
cimiento
inicial
La prueba de lectura cinética requiere una
reacción de ruta ramificada
Los modelos cinéticos de selección de tRNA requie-
ren un solo sitio de unión. John Hopfield teorizó que
un proceso de este tipo puede tener lugar a través de
una reacción ramificada, como la de la Fig. 30-45:
1. La reacción de unión inicial discrimina, como se ha
discutido ya, entre los tRNAs correspondientes (los
justifica que la precisión descodificadora del ribosoma
sea inferior a ~ 10-2 errores por codón. Es evidente
que el ribosoma posee algún tipo de mecanismo co-
rrector, de prueba de lectura, que aumenta su preci-
sión descodificadora global.
¿ Cómo podría ser la comprobación ribosomal de la
lectura de la interacción codón-anticodón? Pueden
intuirse dos tipos de mecanismos: (1) un mecanismo
de unión selectiva, como el de las aminoacil-tRNA
sintetasas (Sección 30-2C); y (2) un mecanismo cinéti-
co. El problema con un mecanismo ribosomal de
unión selectiva es que hay muy pocas evidencias que
indiquen la existencia de un segundo sitio de unión a
aminoacil-tRNA que actúe excluyendo las interaccio-
nes codón-anticodón que no son las apropiadas. Sin
embargo, hay muchas evidencias en favor de la exis-
tencia de un mecanismo cinético. de prueba de lec-
tura.
996 Sección 30-3. Ribosomas
(caracterizada por k_1). La hidrólisis de GTP, por tan-
to, proporciona el segundo contexto necesario para la
prueba de lectura. El modelo cinético de prueba de
lectura está apoyado por las siguientes observaciones:
1. Se hidroliza más GTP con la formación de enlaces
peptídicos correspondientes a tRNAs incorrectos
que a tRNAs correctos (esta observación es cohe-
rente también con los modelos de unión selectiva).
2. La tasa de disociación. del ribosoma del complejo
EF-Tu · GDP es independiente de la identidad del
aminoacil-tRNA unido.
mente. La tasa de disociación de EF-Tu'-· GDP, por
tanto, proporciona un valor de referencia contra el
cual el ribosoma mide la tasa de disociación del
tRNA: un tRNA que no corresponde al codón se
disocia por norma general del. ribosoma antes que
EF-Tu · GDP (un período promedio de varios milise-
gundos),_ mientras que un tRNA correcto permanece
unido más tiempo, permitiendo que primero se libere
EF-Tu · GDP. El intermediario activado es esencialen
este proceso, debido a que de otra forma su etapa de
disociación de tRNA (la caracterizada por k4) sería
idéntica a la de la etapa de reconocimiento inicial
Figura 30-46
Una selección de antibióticos que inhiben la traducción Estreptomicina
OH H
H
HO
Tetraciclina
H
o OH OH O o OH
H
/NH2 e
. 11
o
1
OH ·H ~(CH3)2
1
H OH
NH+ II 2 H
H2N-C-HN .1-----1...
H
HO
,
Acido fusídico NH+
11 2
NH-C-NH2
H
1
1
1
: H
1
CH8
,,'
IIO Eritromicina
H
\
\
C-OCHa
11 .
o CH8
1 ">------ 'H OH
HO .. .... HO
COOH
o O CHa
H CH3
H
CH3
OH
O N O
H
Cicloheximida
o
CHOH
1
CH2
OH CH20H O
1 1 11
-C-C-NH-C-CHCI2
1 1 H H
Cloranf enicol
Capítulo 30. Traducción 997
Toxina diftérica
La difteria es una enfermedad consecuencia de la
infección de bacterias Corynebacterium diphtheriae que
portan el bacteriófago corinefago p. La difteria fue
una de las principales causas de muerte infantil hasta
principios de este siglo, cuando la mayoría de las
personas fueron inmunizadas. A pesar de que la in-
fección bacteriana queda confinada, por lo general, a
la parte superior del tracto respiratorio, la bacteria
secreta una proteína codificada por el fago, conocida
como toxina diftérica, que es la responsable . de los
efectos letales de la enfermedad. La toxina diftérica
inactiva específicamente el factor de elongacióneucarió-
Tetracíclína
La tetraciclina y sus derivados son antibióticos de
amplio espectro que se unen a la subunidad pequeña
de los ribosomas procarióticos, en donde inhiben la
unión a los aminoacil-tRNAs. La tetraciclina bloquea
también la respuesta severa (Sección 29-3F) al inhibir
la síntesis de ppGpp. Esto indica que el tRNA desaci-
lado debe unirse al sitio A para poder activar el factor
de la respuesta severa. .
Las cepas resistentes a tetraciclina son ya bastante
comunes, lo cual plantea un problema clínico grave.
Sin embargo, la mayoría de las veces la resistencia
viene dada por una menor permeabilidad de la mem-
brana celular bacteriana a la tetraciclina, más que por
una modificación de los componentes del ribosoma.
Cloranfenicol
El cloranfenicol, el primer antibiótico de amplio
espectro, inhibe la actividad peptidil transferasa de la
subunidad grande de los ribosomas procarióticos. Sin
· embargo, su utilización clínica está limitada a las
infecciones graves, debido a que posee efectos latera-
les tóxicos debido, al menos en parte, a la sensibilidad
al cloranfenicol de los ribosomas mitocondriales. Los
experimentos de unión utilizando subunidades de
SOS reconstituidas en ausencia de diferentes compo-
nentes sugieren que la proteína 116 es necesaria para
la unión del cloranfenicol. Este dato es coherente con
el hecho de que los experimentos de marcaje de afini-
dad sugieren que la 116, así como otras proteínas de
la subunidad grande y el RNA de 235, se encuentran .
próximos al cloranfenicol unido. El RNA de 235 ~stá
también implicado en la resistencia al cloranfenicol,
ya que algunos de sus mutantes presentan esta resis-
tencia. El sitio de unión del cloranfenicol debe encon-
trarse cerca del sitio A de la subunídad grande, dado
que el cloranfenicol compite por la unión con la puro-
micina y con el extremo 3' de los aminoacil-tRNAs,
pero no lo hace con los peptidil-tRNAs. Esto sugiere
que el cloranfenicol inhibe la transferencia de _pépti-
dos interfiriendo con las interacciones de los nboso-
mas con los aminoacil-tRNAs unidos al sitio A.
minutos.. lo · cual permite que los ribosomas str~ se
unan también a los mRNAs recién sintetizados.
Estreptomicina
La estreptomicina, descubierta en 1944 por Sel-
man Waksman,.es-un miembro de importancia médi-
ca de la familia· de antibióticos de - los aminoglucósi-
dos. Estos antibióticos inhiben los ribosomas proca-
rióticos de varias maneras. A bajas concentraciones,
la estreptomicina induce que. el ribosoma lea equívo-
cadamente la secuencia del mRNA: una pirimidina
puede ser confundida por la otra en la primera o en la
segunda posición · del codón, y cualquier pirimidina
puede confundirse con la adenina en la primera posi-
ción. Esto inhibe el crecimiento de las células suscep-
tibles, pero no las mata. Sin embargo, a concentracio-
nes más elevadas la estreptomicina impide la inicia-
ción apropiada de las cadenas y provoca la muerte
celular. ,
Ciertos mutantes resistentes a la estreptomicina
(strR) poseen ribosomas con una proteína 512 alterada
respecto de las bacterias sensibles al antibiótico (str5).
Curiosamente, un cambio en la base C912 del rRNA
de 165 ( que está situada en el lazo central de la Fig.
30-25) también confiere resistencia a la estreptomici-
na. (Algunas bacterias mutantes no sólo son resisten-
tes a la estreptomicina; sino que llegan a depender de
ella; la necesitan para crecer.) En bacterias diploides
parciales que son heterozigotos para la resistencia a la
estreptomicina (strR /str5), la sensibilidad a la estrepto-
micina es el carácter dominante. Esta observación se
explica por el descubrimiento de que, en presencia de
estreptomicina, los ribosomas str5 permanecen liga-
dos a los sitios de iniciación, excluyendo así a los
ribosomas strR de estos sitios. Además, los mRNAs en
estos complejos bloqueados son degradados en pocos
G. - Inhibidores de la síntesis proteica:
antibióticos
Los antibióticos son sustancias producidas por bacte-
rias u hongos que inhiben el crecimiento de otros orga-
nismos. Se conocen antibióticos que inhiben diversos
procesos biológicos esenciales, incluyendo la replica-
ción del DNA (por ej., novobiocina; Sección 28-SC),
la transcripción (por ej., rifamicina B; Sección 29-2C)
y la síntesis de la pared celular bacteriana (po~ ej.,
penicilina; Sección 10-38). Sin embargo, la mauona de
los antibióticos conocidos, incluyendo una gran variedad
· de sustancias útiles en medicina, bloquean la traducción.
Esto se debe probablemente a la enorme complejidad
de la maquinaria de traducción, que la hace muy
vulnerable para la disrupción desde muchos ángulos.
Los antibióticos han sido muy útiles .. en el análisis de
los mecanismos ribosómicos debido a que, como ya
hemos visto para el caso de la puromicina (Sección
30-30), el bloqueo de una función específica permite
a menudo su disección bioquímica hasta las etapas
esenciales. La Tabla 30-9 y la Fig. 30-46 presentan
varios inhibidores de la traducción de Importancia
médica -y /o bioquímicamente útiles. Estudiaremos a
continuación los mecanismos de algunos de los mejor
caracterizados.
998 Sección 30-3. · Ribosomas
Figura 30-47
El producto elF-2 · GDP que se forma tras la iniciación
ribosomal se regenera gracias al intercambio GDP-GTP con
elF-28 · GTP.
eIF-2 • GDP -~____;;::::......__..-=:;.~-___._. eIF-2 • G'I,P
Grupo ADP-ribosilo
Diftamida ADP-ribosilada
La díftamida está presente solamente en eEF-2 (ni tan
sólo se. encuentra en el 'equivalente , procariótico,
EF-G). Esto explica la especificidad de la toxina difté-
eIF-2B • (}1"'P .eIF-2B • GDP
OH .. OH
~ N +
JI N(CH3)3
~~ 1 .
. CH2-CH2-CH
1 C=O
1
H NH 2
ADP-ribosilo-eEF-2 + Nicotinamida + H +
(inactivo)
inactivando este factor de· elongación. Dado que el
fragmento A actúa catalíticamente, una sola molécula
es suficiente para provocar la ADP-ribosilación de todos
los eEF-2s de una célula, _ lo cual detiene la síntesis de
proteínas y mata a la célula. Bastan unos poco.s micro-
gramos de toxina diftérica para matar a un individuo
no inmunizado.
La toxina diftérica ADP-ribosila específicamente un
residuo His modificado de eEF-2, que se conoce con
el nombre de diftamida:
Toxina diftérica
eEF-2 + NAO+
(activo)
La velocidad de iniciación ribosomal sobre mRNAs
procaríóticos varía dentro de un margen de 100 veces.
Por ejemplo, las proteínas especificadas por el operón
lac, de E. coli, que son la ~-galactosidasa, la galactosa
permeasa y la tiogalactósido transacetilasa, se sinteti-
zan con relaciones molares de 10:5:2. Esta variación
se debe probablemente a las diferencias que existen
entre sus secuencias de Shine-Dalgarno. Como alter-
nativa, los ribosomas podrían unirse al mRNA de lac
solamente por su gen de ~-galactosidasa, y ocasional-
mente separarse en respuesta a una señal de termina-
ción de cadenas (y esto· explicaría las menores tasas
de traducción conforme se avanza a lo largo del ope-
rón ). En cualquier caso, no existen evidencias de que
las velocidades de traducción en los procariotas res-
pondan a cambios ambientales. La expresión genética
en procariotas, por tanto, se encuentra casi exclusiva-
mente controlada a nivel de transcripción (Sección 29-3).
Por supuesto, dado que sus mRNAs poseen tiempos
de vida media de sólo unos pocos minutos, parecería
que los procariotas tienen poca necesidad de contro-
les traduccionales.
El control transcripcional en los eucariotas, pese a
ser mucho más complejo que el de los procariotas, se
reserva fundamentalmente para la regulación de la
diferenciación celular (Sección 33-3) .. Sin embargo,
existen indicios crecientes en favor de que las células
eucariotas responden a sus necesidades, al menos en
parte, a través de mecanismos de control traducciona-
les. Esto es posible gracias a que los tiempos de vida
de los mRNAs eucarióticos son generalmente de ho-
ras o días. En esta secciónexaminaremos los dos
·-
Residuo de His
o
11
-NH-CH-C-
1
CH2
4. CONTROL DE LA
TRADUCCIÓN EUCARIÓTICA
rica en la modificación exclusiva del eEF-2. La obser-
vación de que la diftamida está presente en todos los
eEF-2s eucarióticos sugiere que este resto es esencial
para la actividad de eEF-2. No obstante, algunos
cultivos mutantes de células animales, que poseen
una gran capacidad de síntesis de proteínas, carecen
de los enzimas que modifican postraduccionalmente
la His a diftamida. Se desconoce, por tanto, el papel
biológico normal de la diftamida.
tico eEF-2, inhibiendo por tanto la síntesis de proteínas
en los eucariotas.
Los efectos patogénicos de la difteria se previenen
mediante la inmunización con toxoide, toxina inacti-
vada con formaldehído que fue ·descubierta hacia
1880. Los individuos afectados por difteria son trata-
dos con suero antitoxina de caballo, que se une a la
toxina inactivándola, y con antibióticos para combatir
la infección bacteriana. · .
La toxina diftérica actúa de un modo particular-
mente interesante. Se trata de una proteína monomé-
rica de 58 kD, que es fácilmente digerible con tripsina
y con enzimas de tipo tripsina dando dos fragmentos,
A y B. El dominio B de la toxina intacta se une a un
receptor desconocido de la membrana plasmática de
las células susceptibles. En ese momento la toxina es
cortada proteolíticamente, a consecuencia de lo cual
el fragmento B puede facilitar la entrada al citoplasma
del fragmento A por endocitosis mediada por recep-
tor (el fragmento A libre carece de actividad tóxica).
Una vez en el citosol, el fragmento A cataliza la
ADP-ribosilación del eEF-2 por el NAO+,
Capítulo 30. Traducción 999
Figura 30-49
. En las células tratadas con interferón, la presencia de
dsRNA, que normalmente aparece tras una infección vírica, .
provoca (a) la inhibición de la iniciación traduccional y
(b) la degradación del mRNA, bloqueando en consecuencia
la traducción e impidiendo la replicación del virus.
Degradación del mRNA
· RNasa L _______ __.,.
"(actíva)
mRNA--~i __ ,.. Nucleótidos
(2',5')-Fosfo-:-
diesterasa
ATP----____.• ·. 2 5 A ------• ATP + AMP
~ '· .. ··
pp.
t
(b)
\',~;:'!\~'.¡~~:;\'.¡
,;1.~~¿tf.J?t~r-J~~t,~t·~~,;; .
dsRNA
Inhibición de la traducción
p.
i
eIF-2B
\. '.
'
dsRNA
ATP ADP
(a)
:;11~ª1~~ .. J~JJ~ .J)Q~ -, j~,~~~~;,.
:. ·:· .... ··. ·.. . . . . . . ... . . . .. . . . . ..
disocia espontáneamente de eIF-2 al acabar la inicia-
ción, a diferencia de lo que ocurre en el proceso
equivalente procariótíco, en el que el GDP sí que se
disocia de IF-2 de forma espontánea (Fig. 30-40). En
lugar de ello, el eIF-2 cambia su GDP por GTP en una
reacción mediada por otro factor de iniciación, eIF-28
(Fig. 30-47). Resulta que el eIF-2 fosforilado forma un
complejo mucho más fuerte con eIF-2B que cuando
no está fosforilado. Cuando eIF-2 está fosforilado
secuestra el elF-2B (Fig. 30-48), y provoca que este
factor esté disminuido en relación a eIF-2 no fosforila-
do, con lo cual se bloquea la regeneración del comple-
jo eIF-2 · GTP necesario para la iniciación de la tra-
ducción: La presencia de hemo revierte la inhibición
de la traducción al inhibir la activación de HCI. Las
moléculas fosforiladas de eIF-2 vuelven a su forma
activa gracias a la acción de una eIF-2 fosfatasa, que
es insensible a hemo. Además, los reticulocitos con-
A. ·. Control traduccional por el grupo hemo
Los reticulocitos sintetizan proteínas, fundamental-
mente hemoglobina, con una velocidad extremada-
mente elevada, y esto los transforma en el sistema
favorito para el estudio de la traducción eucariótica.
La síntesis de hemoglobina en lisados frescos de re-
ticulocitos tiene .lugar normalmente. durante varios
minutos, pero· entonces se detiene abruptamente de-
bido a la inhibición de la iniciación traduccional, con
la disgregación asociada de polisomas. La adición del
grupo hemo [un producto mitocondrial (Sección 24-
4A) que este sistema in vitro es incapaz de producir]
previene. este efecto de inhibición, lo cual indica que
la síntesis de globina está regulada por la disponibilidad
de hemo. La inhibición de la iniciación traduccional de
globina también puede ser revertida por la adición del
factor de iniciación eIF-2 y por elevados niveles de
GTP.
En ausencia de hemo, los lisados de reticulocitos
acumulan una proteína denominada inhibidor con-
trolado por hemo (HCI), que fosforila un resto Ser
específico de la subunidad a de eIF-2 (el eIF-2 es un
trímero apy que transporta GTP y Met-t~NAfviet a la
subunidad de 405 del ribosoma; Sección 30-3C) .. El
HCI se produce, en ausencia de hemo, a partir de un .
proinhibidor preexistente, en un proceso pococarac-
terizado que con toda probabilidad implica a otra pro-
teína.
El eIF-2 fosforilado puede participar en el proceso
de iniciación ribosomal de la misma manera que el
eIF-2 no fosforilado. Esto plantea una paradoja que
fue resuelta cuando se descubrió que el GDP no se
mecanismos de control traduccional eucariótico mejor
caracterizados: (1) la regulación de la síntesis de he-
moglobina por el grupo hemo, y (2) Ios efectos de
proteínas inducidas por virus conocidas. como inter-
ferones. También consideraremos el fenómeno del
enmascaramiento del mRNA (mRNA "masking"),
Figura 30-48
Modelo de la síntesis de proteínas controlada por hemo en
los reticulocitos.
p.
i
,}_; :-: : : : :: ;_:\::;: ! ,;
> ~, :-~~·<'·~<,.:~,:. ';
Inhibida
por hemo
-e ~ ~~~j'i
ATP ADP
1000 Sección 30-4. Control de la traducción eucariótica
Para transformarse en proteínas maduras, los poli-
péptidos deben plegarse para adoptar su conforma-
ción nativa, se deben formar sus puentes disulfuro (si
los tienen) y, en el caso de proteínas multiméricas, sus-
subunidades deben combinarse de forma adecuada.
Además, como hemos ido viendo a lo largo de todo el
texto, muchas proteínas ·son modificadas en reaccio-
nes enzimáticas que· cortan proteolíticamente ciertos
enlaces peptídicos y/ o derivan restos específicos. En
esta sección haremos un repaso de algunas de estas
modificaciones postraduccionales
2. Los interferones también inducen la síntesis· de
(2',5')-oligoadenilato sintetasa. En presencia de
dsRNA,-este·enzima cataliza la-síntesis a partir de
ATP de un oligonucleótido poco común, el
5. MODIFICACIÓN
POSTRADUCCIONAL 1. Los· interferones inducen la producción de una pro-
teína quinasa que, en presencia de dsRNA, fosfori-
la la subunidad a de eIF-2, de la misma manera
que HCI en los reticulocitos. Esto provocala inhi-
bición de la iniciación ribosomal. Esta observación
sugiere que la fosforilación de eIF-2 podría consti-
tuir un mecanismo general de control de la traduc-
ción en eucariotas.
C. Enmascaramiento del mRNA
Seconoce desde el siglo pasado que las fases inicia-
les del desarrollo embrionario de organismos como el
erizo de mar está regido casi por completo por infor-
mación presente en el óvulo antes de ser fecundado.
De hecho, los embriones de erizo de mar expuestos
durante tiempo suficiente a actinomicina D (Sección
29-2-0), para inhibir la síntesis de RNA sin bloquear
la de DNA, se desarrollan normalmente· durante las
fases · iniciales, sin cambiar su programa de síntesis
proteica. Esto se debe a que un óvulo no fecundado
contiene una gran cantidad de mRNAs "enmascarados"
por proteínas, de forma que se impide su asociación con·
los ribosomas que también están presentes. Tras la fecun-
dación, de alguna manera este mRNA es "desenmascara-
do" de forma controlada, - y comienza a dirigir la síntesis
proteica. El desarrollo del embrión puede, por tanto,
comenzar inmediantamente después· de la fecunda-
ción, 'sin tener que esperar a la producción de mRNAs
de origen paterno.
Los citoplasmas de muchas células eucariotas con-
tienen una gran cantidad de mRNAs acomplejados
con proteínas; que no se encuentran asociados a los
ribosomas. Queda pordescubrir, sin embargo, si et
enmascaramiento de los mRNAs es un mecanismo de
control también en tejidos no embrionarios.
..
• virus ..
· Existen tres familias de interferones: tipo a o inter-
ferón leucocítarío (los leucocitos son glóbulos blan-
cos de la sangre), el tipo Po interferón fibroblástico,
relacionado con el anterior (los fibroblastos son célu-
las del tejido conjuntivo), y el tipo y o interferón
linfocitario (los linfocitos son células del sistema in-
mune). La síntesis de interferón es inducida por RNA
bicatenario (dsRNA), que es generado probablemente
durante la infección por virus tanto de DNA como de
RNA. También son inducidos por el dsRNA sintético
poli(I) · poli(C). Los interferones son agentes antivíri-
cos efectivos incluso a concentraciones tan bajas
como 3 x 10-14M, que los· sitúa entre las sustancias
biológicas más potentes. Además, poseen un margen
de especificidad mucho más amplio que el de los
anticuerpos elaborados contra un virus particular. Es
lógico, entonces, que hayan despertado un gran inte-
rés médico, particularmente dado que existen algunos
cánceres que son inducidos por virus (Sección 33-4C).
De hecho, en la actualidad se utilizan clínicamente
para el tratamiento de ciertos tumores e infecciones
de origen vírico. Estos tratamientos pueden realizarse
gracias a la obtención de grandes cantidades de estas
proteínas, que en la naturaleza son muy escasas, utili-
zando técnicas de clonación molecular (Sección 28-8).
Los interf erones previenen la proliferación vírica fun-
damentalmente inhibiendo la síntesis proteica en células
infectadas (el interf erón linf ocitario también modula la
respuesta inmune). Su efecto se genera por dos vías
independientes (Fig. 30-49):
B. Interferón
Los interf erones son glucoproteínas secretadas por
células de vertebrados infectadas por virus. Tras unirse a
receptores de superficie de otras células, los interferones
las convierten a un estado .antivírico, que afecta a la
replicación de una amplia variedad de virus de RNA y
de DNA. De hecho, el descubrimiento del interferón
en la década de 1950 fue fruto de la observación de
que los individuos infectados· por ciertos virus son
resistentes a la infección por un segundo tipo de
pppA(2'p5' A)n, siendo n = 1 a 10. Este compuesto,
2,5-A, activa una endonucleasa preexistente, RNasa
L, para que degrade el mRNA, inhibiendo en conse-
cuencia la sintesis proteica. El propio 2,5-A es rápi-
damente degradado por un enzima denominado
(2',5')-fosfodiesterasa, de forma que debe ser con-
tinuamente sintetizado para que su-efecto se man-
tenga.
La independencia de estos dos sistemas, el del 2,5-A
y el de la proteína quinasa inducida por interferón,
queda demostrada por la observación de que el efecto
de 2,5-A sobre la síntesis proteica puede revertirse
por la adición de mRNA, pero no por la adición de
eIF-2.
tienenuna proteína de 67 kD cuyo descubrimiento es
reciente, que protege a eIF-2 de la fosforilación catali-
zada por HCI.
Capítulo 30. Traducción 1001
Figura 30·50
Micrografía electrónica. de agregados de procolágeno que
han sido secretados ~I medio extracelular. [Cortesía de
Jerome Gross, Harvard Medical School. l
Los péptidos señal son eliminados de las
proteínas nacientes por la acción de una
peptídasa de señal
Muchas proteínas transmembrana o proteínas cuyo
destino es. la secreción se sintetizan con un pépti- .
do señal N-terminal, que posee de 13 a 36 restos
predominantemente hidrofóbicos. De acuerdo con
la hipótesis de· la señal (Sección 11-3F), un pép-
tido señal es reconocido por una partícula de
reconocimiento de la señal (SRP). La SRP une los
r~bosomas que sintetizan ·péptido señal a un receptor.
situado en la membrana [el retículo endoplasmático
rugoso (RER) en los eucariotas y la membrana plas-
mática en las bacterias] y conduce al péptido señal y
al polipéptido naciente que lo sigue a través de ella.
Las proteínas que poseen un péptido señal se cono-
cen como preproteínas o bien, si contienen también
propéptidos, como preproproteinas. Una vez que el
péptido señal ha atravesado la membrana, es cortado
específicamente de forma que se separa del polipépti-
do naciente. El corte lo realiza una peptidasa señal.
Los propéptidos dirigen el ensamblado del
· colágeno
· La biosíntesis del colágeno ilustra muchos aspectos
de la modificación postraduccional. Cabe recordar
que el colágeno es uno de los principales componen-
tes extracelulares del tejido conjuntivo, y su estructu-
ra ~s !ª ~e una ~roteína fibrosa, de tres hélices, cuyos
polípéptídos estan formados por una secuencia repe-
tida de aminoácidos de la forma (Gly-X-Y)n, donde X
es ~on frecuencia Pro, Y es con frecuencia 4-hidroxi-
Rrolina (Hyp) y n ~ 340 (Sección 7-2C). Lospolípép-
tídos del procolágeno (Fig. 30-50) difieren de los de
la . proteína madura por la presencia de propéptidos
tanto N- como Cvtermínales de unos 100 restos, cuyas
secuencias, en su mayor parte, son diferentes de las
del colágeno maduro. Los polípéptidos del procoláge-
no · se asocian rápidamente, in vitro e in vivo, . para
formar una triple hélice de colágeno. En contraste, los
· polipéptidos extraídos del colágeno maduro sólo se
reasocian, cuando lo hacen, tras un período de varios
días. Los propéptidos son, . aparentemente, necesarios
para un plegamiento adecuado del colágeno.
Los pr~péptidos N- y ~-terminales d~l procolágeno
son eliminados por amino- y carboxílprocolágeno
peptídasastf'íg, 30-51) respectivamente, que también
serían específicas para. los diferentes tipos de coláge-
no. Un defecto congénito de la aminoprocolágeno
P:Ptidasa en vacas y ovejas provoca dermatospara-
xis, una enfermedad caracterizada por una piel extre-
madamente frágil. En el hombre existe una enferme-
da~ análoga, el sindrome-VII de Ehler-Danlos, que
e~ta provocada por una mutación en uno de los poli-
péptídos del procolágeno · que inhibe la eliminación
enzimática de este aminopropéptido. Las moléculas
de colágeno normalmente se agregan de. forma es-
pontánea para formar fibrillas de colágeno (Figs .. 7-33
y 7-34) .. Sin embargo, las micrografías electrónicas de
la piel dermatosparáxica muestran fibrillas de coláge-
no escasas y desorganizadas. La retención de los ami-
nopropéptidos del colágeno interfiere aparentemente con
la formación correcta de las fibrillas. (El gen de la
dermatosparaxis fue introducido en algunas varieda- .
des de ganado vacuno porque los heterozigotos pro-
ducen carne más tierna.)
A. Digestión proteolítica
La digestión proteolítica es una de las modificacio-
nes postraduccionales más comunes. Probablemente
todas las proteínas maduras han sido modificadas de
esta forma, aunque sólo sea por la eliminación endo-
proteolítica de su primer resto de Met (o fMet) muy
poco tiempo después de abandonar el ribosoma. Mu-
chas proteínas que están implicadas en una amplia
gama de procesos biológicos se sintetizan como pre-
cursores inactivos que son activados en las condicio-
nes apropiadas por un mecanismo de proteolisis limi-
tada. Algunos ejemplos ya descritos de este fenóme-
no son la conversión de tripsinógeno y quimotripsi-
nógeno a sus formas activas, por las digestiones
trípticas de enlaces peptídicos específicos (Sección 14-
3E), y la formación de insulina activa a partir de la
proinsulina, de 84 restos, gracias a la eliminación de
un polipéptido interno de 33 restos (Sección 8-lA).
Las proteínas inactivas que son activadas por la elimi-
nación de polipéptidos reciben la denominación de
proproteínas, mientras que los polipéptidos escindi-
dos se denominan propéptidos. . -; .
1002 Sección 30-5. Modificación postraduccional
El ensamblado del colágeno requiere
modificaciones químicas ·
La biosíntesis del colágeno (Fíg. 30-52) ilustra el
proceso de maduración de una proteína a través de la
Tanto la insulina como el colágeno son proteínas que
se secretan, y por tanto son sintetizadascon péptido
señal en sus extremos amino. En consecuencia, estas
dos proteínas se sintetizan, respectivamente, como
preproinsulina y preprocolágeno. Estas y otras mu-
chas proteínas son sometidas a tres cortes proteolíti-
cos secuenciales: (1) la deleción de su resto Met inicia-
dor, (2) la eliminación de sus péptidos señal y (3) la
escisión de sus propéptidos.
Las proteínas son sometidas a derivaciones quími-
cas específicas, tanto en los grupos funcionales de sus
cadenas laterales como en sus grupos amino y carbo-
xilo terminales. Se conocen más de 150 clases diferen- •
tes de modificaciones de cadenas laterales, que afec-
tan a las de todos los aminoácidos a excepción de Ala,
Gly, lle, Leu, Met y Val (Sección 4-3A). Entre estas
modificaciones se incluyen acetilaciones, glucosilacio-
nes, hidroxilaciones, metilaciones, nucleotidilaciones,
fosforilaciones y ADP-ribosilaciones, así como otras
muchas modificaciones "misceláneas".
· Algunas modificaciones de las proteínas, como la
fosforilación de la glucógeno fosforilasa (Sección 17-
lA) y la ADP-ribosilación de eEF-2 (Sección 30-3G), .
modulan su actividad. Muchas cadenas laterales mo-
e
dificadas se unen covalentemente a cofactores de en-
zimas, presumiblemente para aumentarsu eficiencia
catalítica. Entre los ejemplos de cofactores unidos
cabe mencionar la N6-lipoil-lisina, en la dihidrolipoil
transacetilasa (Sección 19-2A), y la 8a-histidilflavina
en la succinato deshidrogenasa (Sección 19-3F). La
unión de carbohidratos complejos, que tiene lugar
con una variedad casi infinita, modifica las propie-
dades estructurales de las proteínas y genera seña-
les diana o marcadores de reconocimiento en varios ti-
pos de interacciones célula a célula (Secciones 10-3C,
11-30 y 21-3B). Las modificaciones que entrecruzan
proteínas, como las que aparecen en el colágeno y en
la elastina (Secciones 7-2C y D), estabilizan los agre-
gados supramoleculares. De todas formas, todavía no
se han resuelto las funciones de la mayoría de las
modificaciones de cadenas laterales.
Poli proteínas
Algunas proteínas se sintetizan formando parte de
poliproteínas, que son polipéptidos que contienen
las secuencias de dos o más proteínas. Entre los ejem-
plos pueden mencionarse la mayoría de las hormonas
peptídicas (Sección 33-3C), las proteínas sintetizadas
por muchos virus, incluyendo el de la polio (Sección
32-2C) y el del SIDA, y la ubiquitina, una proteína
eucariótica muy conservada que está implicada en la
degradación de proteínas (Sección 30-6B). Existen
proteasas específicas que cortan las poliproteínas ge-
nerando las proteínas unitarias, presumiblemente a
través del reconocimiento de secuencias en el sitio de
corte. Algunas de estas proteasas han sido conserva-
das entre organismos situados a distancias evolutivas
notablemente altas. Por ejemplo, la ubiquitina se sin-
tetiza en forma de varias repeticiones en tándem (po-
liubiquitina) que E. coli corta correctamente,' pese a
que los procariotas carecen de ubiquitina.
B. Modificación covalente Figura 30-51 .
Representación esquemática de la molécula de
procolágeno. Gal, Glc, GlcNac y Man, respectivamente,
denotan restos de galactosa, glucosa, N-acetilglucosamina
y manosa. Obsérvese que el propéptido N-terminal posee
puentes disulfuro intracatenarios, mientras que el _
propéptido O-terminal posee puentes disulfuro tanto intra-
como intercatenarios. [De Prockop, D.J., Kivirikko, K.I.,
Tuderman, L. y Guzman, N.A., New Engl. J. Med. 301, 16
(1979).) -~
Dominio de triple hélice .
Dominio no
. de triple hélice
Domir.iio
globular
.. Propéptido . .....- ............. ..,
N-terminar ·
(150 A)
t
20Á
_J_
Sitio de corte de la
aminoprocolágeno
peptidasa
Sitio de corte de la
ca rboxi I procolágeno
peptidasa
t
Capítulo 30. Traducción 1003
[De Proe.kop, D.J., Kivlríkko, K.I., Tuderman, L. y Guzman,
N.A., New Engl. J.·Méd.<301, 18 (1979).]
'Retículo
endoplasmático rugoso
Figura 30-52
Re,pres:e11tación esquemática de la biosíntesis de colágeno.
E.1 diagrarrta;no indica la eliminación de los ,péptidos señal.
A. Especificidad de _la degradación
Las células degradao» seleciioamente la» proteínas
anormales. Por ejemplo/ la hemoglobina que ha sido
El trabajo pionero de Henry Borsook y Rudolf
Schoenheimer, alrededor de 1-940,- demostró que los
componentes de las células vivas están reno~ándose
permanentemente. Las proteínas tienen tiempos de
vida que van desde los pocos minutos hasta semanas
o más. En cualquier caso, las células sintetizan proteí-
nas y las degradan a sus componentes aminoácidos de
forma continua. Este proceso/ que en apariencia supo-
ne un gasto innecesario, tiene dos funciones: (1) eli-
minar las proteínas anormales cuya acumulación po-
dría ser peligrosa para la célula, y ·(2) permitir la
regulación del metabolismo celular al eliminar los
enzimas y las proteínas reguladoras superfluas. De
hecho, dado que el nivel de un enzima depende tanto
de su. velocidad de degradaciór\-como de su velocidad
de síntesis, ei control de la tasa-de degradación de una
proteína es tan importante' para la economia de la célula
como lo es el control de su tasa de síntesis. En esta
sección consideraremos los procesos de la degrada-
ción intracelular de proteínas y sus consecuencias.
6. DEGRADACIÓN DE
PROTEÍNAS
mente en fibrillas, lo cual sugiere que los propéptidos
poseen también un importante papel en la prevención
de la formación de fibrillas intracelulares. Finalmente,
tras la acción del enzima extracelular lisil oxidasa, las
moléculas de colágeno de las fibrillas se entrecruzan
espontáneamente (Fig. 7-35).
modificación química. A medida que los polipéptidos
del procolágeno atraviesan la membrana y se introdu-
cen en el RER de los fibroblastos que los están sinteti-
zando, los restos Pro y Lys son hidroxilados para dar
Hyp, 3-hidroxi-Pro y 5-hidroxi-Lys. Los enzimas que
catalizan estas reacciones son específicos de secuen-
cia: la prolil 4-hidroxilasa y la lisil hidroxilasa ac-
túan solamente sobre los restos Y de las secuencias
Gly-X-Y, mientras que la prolil 3-hidroxilasa actúa
sobre los restos X, pero sólo si la Y es Hyp. La
glucosilación, que también tiene lugar en el RER, une
restos de azúcar a los restos de 5-hidroxi-Lys (Sección
7-2C). El plegamiento de los tres polipéptidos para
f ermar la triple hélice del colágeno debe ser plií~terior
a la hidroxilación y ·a la glucosilaciórú-debido a que
las hidroxilasas y las glucosilasas son 'incapaces de
actuar sobre sustratos helicoidales. Además, la triple
hélice del colágeno se desnaturaliza por debajo de las
temperaturas fisiológicas, a no ser que se encuentre
estabilizada por interacciones- de puentes de hidró-
geno en las que participan testes de Hyp (Sección
7-2C). El plegamiento va precedido· también por la
formación de enlaces intracatenarios específicos de
tipo disulfuro, que afectan a los carboxilprcpéptidos.
Esta observación. a.poya la conclusión previamente
discutida de que los propéptidos del colágeno colabo-
ran en la selección y alineamiento de los tres polipép-
tidos del colágeno, para que estos se plieguen co.rrec-
tamente.
,,. Las moléculas de procolágeno pasan al aparato de
Colgj, en donde son empaquetadas en -gránulos. de
secreción (Secciones 1 l-3F y 2}.-3 B)'l y 'son secretadas
a los espacios intercelulares del tejido conjuntivo. Los
aminopropéptidos son separados justo antes de que el
procolágeno abandone la célula, y los carboxipropép-
tidos se eliminan algo más tarde. En estas condiciones
las moléculas del colágeno se asocian espontánea-
1004 Sección 30-6. Degradación de proteínas
Cloroquina
es una base débil que penetra libremente en el lisoso-
ma en forma no cargada, y se acumula· en su forma
cargada aumentando el ·pH e inhibiendo la función
lisosomal. El tratamiento de las células con cloroquina
reduce la velocidad de degradación de proteínas. Se
observan los mismos efectoscuando se tratan las
células con inhibidores dela catepsina como el anti-
biótico polipeptídico antipaína.
o o o o
11 11 11 11
-ooccHNH-C-NHCHC-NHCHC-NHCHC-H:
1 1 1 1
Phe Arg Val Arg
Los inhibidores lisosomales no afectan la rápida de-
gradación de proteínas anormales o de enzimas de
vida corta. Sin embargo, impiden la aceleración de la
destrucción de proteínas como consecuencia del ayuno.
Muchos procesos normales y patológicos están aso-
ciados con un aumento de la actividad lisosomal. La
Los lisosomas degradan proteínas de forma no
selectiva
Los lisosomas son orgánulos rodeados de membra-
na (Sección 1-2A) que contíenen r- 50 enzimas hidro-
líticos, entre las cuales se encuentran varias proteasas
conocidas como catepsinas. El lisosoma mantiene un
pH interno de ,.._ 5, y sus enzimas tienen óptimos de
actividad a pH ácido. Se supone que esta situación
protege a la célula de. la rotura accidental de algún
lisosoma, dado que los enzimas lisosomales son inac-
tivos a pH citosólico.
Los lisosomas reciclan los constituyentes intracelu-
lares fusionándose con porciones de citoplasma ro-.
deadas de membrana denominadas vacuolas autofá-
gicas, y destruyendo a continuación su contenido. De
la misma manera; los lisosomas degradan sustancias
que la célula capta por endocitosis (Sección 11-4B). La
existencia de estos procesos ha sido demostrada utili-
zando inhibidores lisosomales. Por ejemplo.Ta droga
antimalaria cloroquina
Cl
B. Mecanismos de degradación
Las células· eucarióticas poseen dos sistemas de degra-
dación proteica, un mecanismo que opera en los lisoso-
mas y un mecanismo de base citosólica que es dependien-
te de ATP. A continuación consideraremos cada uno
de· estos mecanismos.
Capítulo 30. Traducción 1005
igual que en E. coli, puede impedirse el incremento en
las velocidades de degradación utilizando antibióticos
que bloqueen la síntesis proteica.
posee una vida media en reticulocitos de ,..._ 10 min,
mientras que la hemoglobina normal dura los 120
días que vive un glóbulo rojo (y esto la transforma
probablemente en la proteína citoplasmática de ma-
yor vida media). De la misma forma, las hemoglobi-
nas mutantes inestables son degradadas muy poco
tiempo después de su síntesis, lo cual, por las razones
explicadas en la Sección 9-3A, provoca la anemia
hemolítica característica de estas ·enfermedades mole-
culares. Las bacterias también. degradan proteínas de
forma selectiva. Por ejemplo, las formas mutantes
ámbar u ocre de la P-galactosidasa poseen vidas .me-
dias de unos pocos minutos en E. coli, mientras que el
enzima salvaje es casi indefinidamente estable. Sin
embargo, la mayoría de las proteínas anormales apa-
recen por la modificación química y /o la desnaturali-
zación espontánea de estas frágiles moléculas dentro
del ambiente reactivo de la célula, más que surgir por
mutaciones o por errores infrecuentes durante la
transcripción·o la traducción. La capacidad de eliminar
las proteínas dañadas, por tanto, es un mecanismo de
reciclaje esencial que impide la acumulación de sustan-
cias que, de otra forma, interferirían con los procesos ce-
lulares. ·
Las proteínas intracelulares normales son elimina-
das con velocidades que dependen de cada proteína.
Una proteína cualquiera es eliminada con una cinética
de primer orden, lo· cual indica que· 1,:1 molécula que es
degradada es elegida al azar, más que de acuerdo a su
edad. Las vidas medias de diferentes enzimas en un
tejido dado varían sustancialmente, tal y como se.
indica para el hígado de rata en la Tabla 30-10. Es de
destacar que los enzimas que se .degradan más rápida-
mente ocupan puntos de control metabólico importantes,
mientras que los enzimas relativamente estables poseen
actividades catalíticas casi constantes en todas las condi-
ciones fisiológicas. La susceptibilidad de un enzima a · za
degradación ha evolucionado, evidentemente, junto con
sus propiedades catalíticas y alostéricas, de forma que las
células puedan responder eficientemente a los · cambios
ambientales y a .. las necesidades metabéíicas. Los crite-
rios de selección para la degradación de las proteínas
.natívas serán considerados en la Sección 30~6B.
La velocidad de degradación proteica- en una célula
varía también con su estado nutrícíonal Y. hormonal.
En condiciones de limitación de nutrientes, las células
aumentan su velocidad de degradación de proteínas,
proporcionando así los nutrientes necesarios para los
procesos metabólicos esenciales. El mecanismo que
aumenta las velocidades de degradación en E. coli es
la respuesta severa (Sección 2,9-3F). En los eucariotas
podría operar un mecanismo parecido dado que, al
H3C CHa
'/
CH
+ 1
H3N-CH-coo-
Valina
Cl, /CHa
CH
+ 1
H3N - CH - COO-
a-Amino-P-clorobutirato
sintetizada con el análogo de . valina a-amino-P-
clorobutirato
Figura '3ó-53
Estt.u .. ctura de rayos-X de la ubiquitina. La cinta blanca
representa el esqueleto poli_peptídico, y las curvas roja y
azul, respectivamente, indican las· direcciones de los
grupos carbonilo y" amida. [Cortesía de Michael Carson,
un·iversity of Alabama ar Birmingham. La-estructura de
rayos-X fue determinada por Charles Bugg.]
. ,
La ubiquitina señala las proteínas seleccionadas
para la degradación
Se supuso inicialmente que la degradación de pro-
teínas en las· células eucaríótícas era un proceso fun-
damentalmente lisosomal. Sin embargo, los retículo-
-citos, que carecen de lisosomas, degradan selectiva-
mente las ,proteínas anormales. La observación de que
la destrucción de proteínas resulta inhibida en condi-
ciones anaeróbicas llevó al descubrimiento de un sis-
tema proteolítice citosólico dependiente de ATP, in-
dependiente del sistema lisosomal. Esto resultó ines-
pérado 'desde el punto de vista termodinámico, dado
proteína de reconocimiento de péptido (prp 73), de
73 kD, que pertenece a la familia de las proteínas de
choque calórico (uheat shock") de 70 kD (Hsp70, Sec-
ción 11-3F). Otras proteínas que interactúan con
prp73 están restringidas a aquellas proteínas que se
degradan rápidamente como consecuencia de la pri-
vación de suero en el medio de cultivo. Evidentemen-
te, la prp73, que incrementa su concentración y se
redistribuye desde los orgánulos al citosol tras la eli-
minación del suero, funciona para dirigir las proteínas
KFERQ al lisosoma para que allí sean degradadas.
La macroautofagia se activa al principio del ayuno,
probablemente para suministrar al organismo los
aminoácidos que requiere. Sin embargo, una degrada-
ción no selectiva continuada de proteínas podría lle-
var a una carencia intolerable de enzimas y proteínas
reguladoras esenciales .. Dado que la captación de pro-
teínas KFERQ se activa sólo tras un ayuno prolonga-
do, se- piensa que las proteínas citosólicas que poseen
esta secuencia son relativamente dispensables.
Los lisosomas pueden degradar proteínas de
forma selectiva
Los lisosomas captan proteínas citosólicas de forma
no selectiva, tanto por fusión con vacuolasautofági-
cas (macroautofagia) como por invaginación ·de la.
membrana lisosomal (mícreautofagía). Sin embargo,
existe un tercer mecanismo de proteolísis .lisosomal,
de descubrimiento reciente, por el cual el Iisosoma
capta y degrada selectivamente proteínas que contie-
nen un motivo polipeptídieo-específico,
Las células de mamífero en cultivo crecen normal-
mente en medios que contienen suero . sanguíneo.
Se ha observado que cuando seelimina el suero, las
células responden a esta limitación nutricional au-
mentando la velocidad de degradación de ciertas pro-
teínas. Estas proteínas, que contienen el pentapéptido
Lys-Phe-Glu-Arg-Gln (KFERQ) o una secuencia muy
próxima, también se pierden selectivamente en ani-
·males en ayuno prolongado, pero sólo de aquellos
tejidos que responden al ayuno atrofiándose .(por
ejemplo, el hígado y el riñón). Los tejidos 'que no se
atrofian (por ejemplo, el cerebroo los testículos) no
presentan esta degradación se-lectiva. La región
KFERQ de la RNasa A se une específicamente a una
diabetes mellitus (Sección 25-3B) estimula la des-
trucción lisosomal de proteínas. Análogamente, el
desgaste muscular provocado por el· desuso, la des-
nerviación o la lesión traumática, es consecuencia de
un incremento en la actividad lisosomal. La regresión
del útero tras el alumbramiento, proceso por el cual
este órgano· muscular-reduce su masadesde 2·'kg a
SO gen 9 días, es un ejemplo extremo de este proceso.
Muchas enfermedades inflamatorias · crónicas, como
la artritis reumatoide, implican la liberación, extrace-
lular de enzimas lisosomales que destruyen losJepdos
próximos.
Fuente: Dice, J.F. y Goldberg, A.L., Arch. Biochem. Biophys. 170, 214
(1975).
118
130
130
130
150
Al do lasa
GAPDH
Citocromo b
LDH
Citocromo e
Enzimas de vida larga
Enzimas de vida corta
Ornitina descarboxilasa O ,2
RNA polimerasa 1 1,3
Tirosina aminotransferasa 2,0
Serina hidratasa 4,0
PEP carboxilasa 5 ,O
Enzima Vida media (h)
Tabla 30-10
Vidas medias de algunos enzimas de hígado de rata
1006 Sección 30-6. Degradación de proteínas
• ruco.
Los análisis · del sistema de reticulocitos de conejo
libre de célula han demostrado que la ubiquitina,
una proteína de la que se desconocía la función (Fig.
30-53), es .necesaría para la degradación proteica de-
pendiente de ATP. Esta proteína monomérica, de 76
restos, recibe esta denominacién debido a que es abun-
dante y está en todas partes (es ubicua) en los eucariotas.
Además, es la proteína conocida más conservada por la
evolución: es idéntica en organismos tan diversos
como el hombre, los sapos, la trucha y Drosophila, y
difiere en sólo tres restos. entre el hombrey la levadu-
ra. Evidentemente, la ubiquitina está destinada a ju-
gar un papel único en algún proceso celular esencial.
Las proteínas que se seleccionan para la degradación
son marcadas por la unión cotialente de ubiquitina. Este
proceso, que recuerda al de la activación de aminoá_ci-
dos (Sección 30-2C), tiene lugar en tres etapas (Fig.
30-54):
1. El grupo carboxilo . terminal de la ubiquitina es
conjugado a través de un enlace tioéster con un
enzima activador de ubiquitina (El), que es un
dímero de subunidades idénticas de 105 kD. Esta
reacción requiere A TP.
2. La ubiquitina es transferida entonces a un grupo
sulfhidrilo en una de varias proteínas pequeñas, de.
25 a 70 kD, denominadas proteínas transportado-
ras de ubiquitina (E2s). ·
3. Finalmente, una ligasa proteína-ubiquitina .(E3;
,.._ 180 kD) transfiere la ubiquitina activada desde
E2 a un grupo e-amino de una lisina de una proteí-
na previamente unida al enzima, formando un
enlace isopeptidico. E3 juega por tanto un papel
clave en la selección de la proteína que va a ser
degradada. Normalmente, la proteína condenada
es unida á varias moléculas de ubiquitina. Además,
una misma proteína diana puede ligarse a un tán-
dem . de hasta 20 moléculas de ubiquitina, que
forman una cadena multiubiquitina en la. que la
Lys 48 de cada ubiquitina forma un enlace isopep-
tídico con el grupo carboxilo C-terminal de la ubi-
quitina siguiente.
La proteína ubiquitinada es degradada proteolíticamente
en un proceso dependiente de ATP, mediado por un
complejo multiproteico grande (2!:: 1000 kD) y poco ca-
que la hidrólisis de péptidos es un proceso exergó-
Fuente: Bachmaír, A., Finley D., y Varshavsky, A., Science 234, 180
(1986). .
_.. 2 min
Muy desestabilizadores
Phe _.. 3 min
Leu
Asp
Lys
Arg
Figura 30-54
Reacciones implicadas en la unión de ubiquitina a una
proteína. En la primera parte del proceso se une, a través
de un enlace tioéster, et grupo carboxilo terminal de la
ubiquitina con E1 • en una reacción impulsada por la
hidrólisis de ATP. La ubiquitina activada· se transfiere
subsecuentemente a un grupo sulfhidrilo de E2 y después,
en una reacción catalizada por E3, a un grupo e-amino de ·.
una Lys sobre la proteína destinada a ser degradada,·
marcándola de esta forma para la proteolisis por UCDEN.
. Tyr _.. 10 min
Gin
o
---· 11 . Pr ., I Ubiquitinaj-C.;__NH-Lys- odtenadina.
- - _ \. con e a
Enlace
isopeptídico
o Estabilizadores
11 · I Ubiquitina j-c-:-S-El Met > 20 h
E2-SH Ser
2 Ala
El-SH Thr
o Val
. 11 Gly I Ubiquitina 1- C- S- E2
Desestabilizadores
• Proteína
condenada lle _.. 30 min
3
Glu
Vida media
Resto
N-terminal AMP + PPi
1
Tabla 30-11
Vidas·medias de enzimas citoplasmáticos en función de
sus restos N-terminales
o
11
jUbiquitina rcoo- + El-SH
.-ATP
Capítulo 30. Traducción 1007
Figura 30-57
Biosíntesrs de gramicidina S. (a) Transferencia inicial de
Phe a un resto Pro unido a E1, para formar un enlace
peptídico. (b) Reacciones de elongación (parte euoerion y
cierre del ciclo (pene, tntertor; sobre E1 (aquí las flechas
tndíean transferencia de -grupos, no transferencia de
electrones). [De Lipmann, F., science 173, 878 (1971 ).]
I
-s- Pro-Phe
-S - Va0-Pro-Phe
-S- ~Val-Pro-Phe
·-S- L~Orn-· Val-Pro-Phe
I i t , ,
Phe - Pro -Val-' Orn- Leu++ S-
(b)
+ E-SH
II
o ·o
11 11
E-S-C-H/Prn\-C-rH-NH2 I ~ D-Phe
o
ll
E- -S-C-CH-NH2 + V I rr D-Phe
o
11 ••
E-.S-C-HC-NH 1 ' .. 0)
(a)
Figura 30-56
Activación de aminoácidos por los enzimas que sintetizan
gramicidina S. En la primera etapa de la reacción se forma
un aminoacil-adenilato unido al enzima, de la misma
manera que en la reacción de la aminoacil-tRNA sintetasa
(Sección 30-2C). Sin embargo, en la segunda etapa de la
reacción, el resto de aminoácido es unido al enzima a
través de un enlace tioéster, en ,ugar de unirse a un tRNA.
O H
E- 11 1 + S'"'vC-f-NHa
R
t-AMP
O H
E- 11 1 + SH ···AMP'"'vC-f-NH3
R
l pp. t~ i
Aminoácido Enzima
O H
\\ 1 +
ATP + C-C-NH3
- / 1
O R
E-sH +
Figura 30-55
Secuencia de aminoácidos de la gramicidina S. Los
aminoácidos activados por E1 y E11 están coloreados en rojo
y en verde, respe·ctivamente. Las flechas discontinuas
indican los puntos de formación del ciclo. [De Lipmann, F.,
Ace:' Chem. Res. 11, 363 (1971).]
E:u
'
E n'
Se han caracterizado varios centenares de antibióti-
cos polipeptídicos, tales como la actinomincina D
7. SÍNTESIS NO' RIB~OSOMAL DE . .
POLIPÉPTIDOS
La vida media de una proteína está parcialmente
determinada por su resto N-terminal
Las características estructurales que E3 utiliza para
seleccionar al menos las proteínas nativas para su
destrucción podrían ser notablemente sencillas. La
vida media de una proteína citoplasmática varía según la
identidad del resto N-terminal (Tabla 30-11). De hecho,
el examen de 208 proteínas citoplasmáticas de vida
larga mostró que todas ellas poseían un resto "estabi-
lizador", Met, Ser, Ala .Thr, Val Gly o Cys en sus
extremos amino. Esto es válido tanto para eucariotas
como para procariotas, lo cual sugiere que el sistema
que selecciona proteínas para su degradación está
conservado en ambos grupos, a pesar de que los
procariotas carecen de ubiquitina. No obstante, exis-
ten indicios claros de que hay otras señales más com-
plejas que también son importantes para la selección
de proteínas para su degradación. Por ejemplo, pro-
teínas con segmentos ricos en Pro (P), Clu (E), Ser (S)
y Thr (T) son degradadas rápidamente, aunque el
mecanismo de reconocimiento de estas proteínas
PEST sigue siendo desconocido. Tampoco se conocen
los mecanismos de selección de las proteínas defec-
tuosas.
racterizado, denominado enzima degradador de conju-
gados de ubiquitina (UCDEN., de "ubiquitin-conjuga-
te degrading enzime"). Esta p.roteasa sólo degrada
proteínas ligadas a ubiquitina.
1008 Sección 30-7. Síntesis no ribosomal de polipéptidos
por dos pentapéptidos idénticos unidos cabeza a cola
(Fig. 30-55). Fritz Lipmann demostró que este antibió-
tico es sintetizado por dos enzimas, E1 (280 kD) y En
(100 kD) que activan los aminoácidos que se indicanen la Fíg. 30-'56. Cada uno de los aminoácidos de la
gramicidina S es activado por la unión dependiente
de ATP del aminoácido a su enzima correspondiente,
a través de un enlace tioéster. En se une sólo a un
resto de n-Phe, mientras que E1 se une simultánea-
mente a los otros cuatro restos de la gramicidina S.
El proceso de polimerización comienza cuando En
transfiere su resto de o-Phe al resto Pro ligado a E1,
formando un dipéptido (Fig. 30-57a). El oligopéptido
en crecimiento es transferido secuencialmente a los
otros restos de aminoácido del pentapéptido (Fig.
30-57b). La ausencia de' cualquiera de estos aminoáci-
dos de la mezcla de reacción in uiiro provoca la
enzima a través de enlaces tioéster con restos de cisteína.
Las reacctones de transp.eptidización y de transtiolización
se atternarr'para slntetizar el pentapéptido. [De Lipmanñ,
F., Acc. Chem. R'es.··6;"366 (1973).] ·
-c-e.-NB-2 . s-C \ eys- \\
O Val
(Sección 29-2D) y la gramicidína A (Sección 18-2C).
Estas moléculas, que a menudo son cíclicas, muy
ocasionalmente sobrepasan los 20 restos de aminoáci-
dos, que además pueden ser· a menudo aminoácidos
poco frecuentes. Muchos antibióticos polipeptídicos son
sintetizados por enzimas solubles, en lugar de por el
mecanismo descrito de síntesis rioosomat a partir de
moldes de mRNA. La síntesis de estas sustancias, por
tanto, no es sensible, a los inhibidores ribosomales
como el cloranfenicol (Sección 30-3G), que detienen
la síntesis proteica. En esta sección, consideraremos el
mecanismo de síntesis del ionóforo formador de ca-
nales gramicidina S, que constituye un buen ejemplo
de la síntesis de muchos otros antibióticos- polipeptí-
dicos.
La gramicidina S es producida por Bacillus brevis.
Se trata de un decapéptido cíclico que está compuesto
Figura 30,-58
Esquema propuesto para la participación del resto de
panteteína (azu~ en la biosíntesis de gramicidina S. Las
flechas circulares indican el movim(ento de la panteteína
recolectando los restos de aminoácido que se unen al
Capítulo 30. Traducción 1009
aminoácidos se unen a sus correspondientes tRNAs en una
reacción de dos etapas, catalízada por la aminoacil-tRNA
sintetasa pertinente. La gran precisión de la carga del tRNA
.con el aminoácido que corresponde surge de la corrección o
prueba de lectura que realiza la amínoacíl-tkblá sintetasa
del aminoácido que se ha incorporado. Esta reacción com-
porta hidrólisis de A TP. Los ribosomas seleccionan los ·
tRNAs únicamente en función de sus anticodones. Los gru-
pos de codones degenerados son leídos por un único tRNA
gracias al apareamiento balanceante de la tercera base. Las
mutaciones de falta de sentido pueden ser suprimidas si
aparecen tRNAs cuyos anticodones hayan mutado para
reconocer un codón de terminación.
El ribosoma está compuesto por una subunidad pequeña
y una grande, cuyas formas complejas han sido reveladas
por la' microscopia electrónica. Los tres RNAs y las 52
proteínas que contiene el ribosoma de E. coli son capaces de
autoensamblarse en las condiciones adecuadas. Las posícío-
nes de muchos componentes 'del ríbosoma, "en relación con
las superficies de las subunidades, han sido determinadas
principalmente mediante estudios de inmunomicroscopia
electrónica y de medidas de difracción de neutrones. Los
experimentos de marcaje de afinidad han identificado los
componentes ribosóm.icos que se encuentran en las cerca-
nías de varios sitios de unión y de centros catalíticos del
ribosoma. La síntesis ríbosomal de polipéptidos tiene lugar
por la adición de restos de aminoácidos al extremo e-termi-
nal del polipéptido naciente. Los mRNAs son leídos en la
dirección 5' ..... 3'. Por lo general, los mRNAs son traducidos
por varios ribosomas a . la vez, formando · estructuras deno-
minadas polisomas. El ribosoma posee por lo menos tres
sitios de 'unión al tRNA: el sitio P, que se une al peptidil-
tRNA, el sitio A, que se une al aminoacil-tRNA entrante, y
el sitio E, que se une transitoriamente al tRNA que. deja el
ribosoma. Durante la síntesis de polipéptidos, el polipépti-
do naciente se transfiere al aminoacil-tRNA, con lo que se
logra aumentar su longitud en un resto. En ese momento se
libera el tRNA descargado, y el nuevo peptidil-tRNA, junto
con su codón asociado, es translocado al sitio P. En los
procariotas, los sitios de iniciación sobre el mRNA son
reconocidos por la combinación de secuencias de Shine-
Dalgamo y codones de iniciación. Los codones iniciadores,
Las mutaciones puntuales pueden provocarse tanto por
análogos de bases, que se aparean incorrectamente durante
la replicación del DNA, como por sustancias q~e reaccionan
con las bases dar- ·1 r) productos que se aparean de manera
incorrecta. Las mutaciones por inserción/deleción (muta-
ciones de desplazamiento de pauta de lectura) surgen de la
asociación del DNA con agentes intercalantes que distorsio-
nan su estructura. El análisis de una serie de mutaciones de
desplazamiento de pauta de lectura que se suprimían unas a
otras estableció que el código genético es un código de
tripletes sin comas. El cartografiado genético de la estructu-
ra fina, junto con los análisis de secuencia de aminoácidos,
demostró que los genes son colíneales con los polipéptidos
para los que codifican. En un sistema de síntesis proteica
libre de células, el ·poli(U) dirige la síntesis de poli(Phe),
demostrando que UUU es el codón que especifica Phe. El
código genético se dedujo gracias a la utilización de varias
estrategias experimentales: el análisis de los productos de
traducción de polinucleótidos · de composición conocida,
pero de secuencia aleatoria, la capacidad de tripletes defini-
dos de promover la unión al ribosoma de tRNAs portadores
de aminoácidos concretos, y la utilización de mRNAs sinté-
ticos de secuencias alternativas conocidas. Estas últimas
investigaciones demostraron también que el extremo 5' del
mRNA corresponde al extremo amino del polipéptido para
el que codifica, y establecieron las secuencias de los codo-
nes de terminación de cadenas. Los codones degenerados
difieren fundamentalmente en la identidad de su tercera
base. Los fagos pequeños de DNA de cadena sencilla, como
</)Xl 7 4, contienen genes solapados en diferentes pautas de
lectura. El código genético que utilizan las mitocondrias
difiere en varios aspectos del código genético "estándar".
Los RNAs de transferencia están compuestos por entre 60
y 95 nucleótidos que pueden organizarse para generar la
estructura secundaria de hoja de trébol. Hasta el 1 O o/o de
las bases del tRNA pueden estar modificadas. El tRNAPhe
de levadura tiene una estructura tridimensional en forma de
L delgada, que se parece a la de otros tRNAs. La mayoría de
las bases están implicadas en asociaciones de apilamiento y
. de apareamiento de bases, incluyendo nueve interacciones
terciarias que aparentemente son esenciales para el mante-
nimiento de la conformación nativa de la molécula .. Los
. Resumen del capítulo
Se piensa que este resto de 20 A recoge secuencial-
mente los aminoácidos unidos al enzima para añadir-
los al oligopéptido en crecimiento, alternando reac-
ciones de transpeptidización . y de transtiolización
(Fig. 30-5&). Esta seria como la translocación en la
elongacíóncríbosomal de cadenas (Sección 30-30).·
f
C=O O 0-. OH 1 ~ / 1
HC- CH2 P CH2 CH NH CH2 NH CH2
1 '/"/'/'-.../"-/"../""'-/~
NH Ü Ü ,, .. e~ C CH2 C CH2 SFI
I HsC CH3- i i
....-------- 20,15 A ---~---~
terminación prematura de la reacción en ese punto.
Obsérvese que la elongación de la . cadena avanza·
hacia el extremo carboxilo, igual que en la síntesis
ribosomal de polipéptidos. El pentapéptido final, uni-
do al enzima, reacciona cabeza a cola con un segundo
pentapéptido equivalente, para formar el decapéptido
final (Fig. 30-55).
Las similitudes entre la secuencia de reacciones que
se han expuesto y las de la síntesis de ácidos grasos
ha llevado a Lipmann a proponerquela fosfopanteí-
na es un cofactor de la síntesis de polipéptidos igual
que lo es en la proteína transportadora de grupos
acilo (Sección 23-4A). De hecho, E1 contiene una fos-
fopanteína unida a un resto de Ser.
1010 Resumen
1
Garen, ~ Sense and nonsense in the genetic code, Science
160, 149~1-59 (1968). [Una discusión sobre los aspectos ge-
néticos de las mutaciones de falta de sentido.]
Judson, J. F., The Eighth Day of Creation, Part 11, Simon &
Schuster ( 1979). [Una narración histórica fascinante sobre la
deducción del código genétíco.]
Khorana, H. G., Nucleic acid synthesis in the study of the
genetic code, Nobel Lectures in Molecular Biology, 1933-1975,
pp. 303-331, Elsevier (1977).
Nirenberg, M. W. y Matthaei, J. H., The dependence of
cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally ocurring
Fox, T. D., Natural variation in the genetic code, Annu. Rev.
Genet. 21, 67-91 (1987).
Crick, F. H. C., The genetic code, Sci. Am. 207(4): 66-74
( 1962). [La estructura del código determinada · a partir de la
genética del fago.]
Crick, F~ H. C., The genetic code: 111, Sci. Am. 215( 4): 55-62
(1966). [Descripción de la naturaleza del código antes de
que se hubiera deducid~ completamente.] ·
El código genético
Attardi, G., Animal mitochondrial DNA: an extreme exam-
ple of -genetic economy, lnt. Rev. Cytol. 93, 93-145 (1985).
Benzer, S., The fine structure of the gene, Sci. Am. 206(1):
70-84 (1962). .
The Genetic Code, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 31
(1966). (Colección de artículos describiendo la deducción
del código genético. Ver especialmente los artículos de
Crick, Nirenberg y Khorana.]
Crick, F. H. C., Burnett, L., Brenner, S. y Watts-Tobin, R. J.,
General nature of the genetic code forproteins, Nature 192,
1227-1232 (1961).
General
Lewin, B., Genes (3.ª ed.), Capítulos 5-7 Wiley (1987).
Watson, J. D., Hopkins, N. H., Roberts, J. W., Steitz, J~ A. y
Weiner, A. M., Motecutar Biology of the Gene (4.ª ed.), Capí-
tulos 14 y 15, Benjamín /Cummíngs (1987).
nucleasa que degrada el mRNA. La traducción también
resulta . inhibida por el enmascaramiento del mRNA, al
menos en ciertos embriones.
Las proteínas pueden también ser modificadas postraduc-
cionalmente, por la acción de varios mecanismos. Los cortes
proteolíticos, catalizados por lo general por peptidasas es-
pecíficas, activan las proproteínas. Los péptidos señal de las
preproteínas son eliminados por peptidasas señal. Las mo-
dificaciones covalentes afectan a muchas clases de cadenas
laterales, y su variedad, enorme, colabora en la modulación
de las actividades catalíticas de los enzimas, proporciona
marcadores de reconocimiento y estabiliza las estructuras
de las proteínas.
Las proteínas de las células vivas sufren un recambio
permanente. Este recambio controla el nivel de enzimas
reguladores, y permite la eliminación de proteínas anorma-
les que de otra fo1111a interferirían con los procesos celula-
res. Las proteínas se degradan en los lisosomas, en un
proceso que puede ser no selectivo o selectivo. Este meca-
nismo de proteolisis lisosomal resulta activado en condicio-
nes de ayuno, así como en varios estados patológicos y
normales, Existe también un sistema de degradación cito-
plasmática, dependiente de ATP, que destruye tanto proteí-
nas normales como anormales, en un proceso en el que
estas proteínas son marcadas por la adición covalente de
ubiquitina.
La biosíntesis de gramicidina S, un antibiótico polipeptí-
dico cuya síntesis sirve de ejemplo a la de otros antibióticos
de esta clase, está mediada por enzimas solubles en lugar de
ribosomas. Los aminoácidos adecuados se unen como tioés-
. teres a E1 y E11, en reacciones que son impulsadas· por la
hidrólisis de A TP. La elongación de las cadenas tiene lugar
por la transferencia mediada por panteteína de los oligo-
péptidos en crecimiento a los restos de aminoácidos activa-
dos. La reacción final de dos pentapéptidos ligados a sendos
enzimas acaba generando el decapéptido cíclico.
Capítulo 30. Traducción 1011
Bibliografía
en los procariotas, especifican fMet-tRNA}"let. La iniciación
es un proceso complejo· que incluye la participación de tres
factores de iniciación que inducen la unión de las subunida-
des ribosomales con mRNA y fMet-tRNAt1et. El sitio de
iniciación en los eucariotas es, por lo general, el primer
AUG situado hacia 3' de la capucha 5' -terminal, Este AUG
especifica Met-tRNA~et, que no está formílado, Los poli-
péptidos se elongan en un ciclo de tres etapas, la unión al
aminoacil-tRNA, la transpeptidización y la translocación,
que· requieren la participación de factores de elongación y
que es impulsado vectorialmente por la hidrólisis de GTP.
Los codones de terminación unen factores de liberación,
que inducen que la peptidil transferasa hidrolice el enlace
peptidil-tRNA. La elevada precisión de la traducción indica
que el ribosoma comprueba la interacción codón-anticodón,
fundamentalmente mediante un mecanismo cinético. Los
inhibidores del ribosoma, muchos de los cuales son antibió-
" ticos, poseen importancia médica y son útiles bioquímica-
mente porque permiten el estudio de la función ribosomal.
La estreptomícina provoca la lectura equivocada del mRNA
e inhibe la iniciación de cadenas en los procariotas; el
cloranfenicol inhibe la peptidil transferasa procariótica; la
tetraciclina impide la unión a la subunidad pequeña proca-
riótica del aminoacil-tRNA, y la . toxina diftérica ADP-
ribosila a eEF-2.
En los eucariotas se han descrito varios mecanismos de
control traduccional. La síntesis de hemoglobina en los
reticulocitos es inhibida, en ausencia del grupo hemo, por el
inhibidor controlado por hemo. Este último enzima cataliza
la fosforilación de eIF-2, que en esas condiciones se une
fuertemente a eIF-28 bloqueando así la iniciación de la
traducción. En presencia de dsRNA, las células tratadas con
interferón detienen su traducción. Esto ocurre gracias a la
acción de dos mecanismos independientes: la inducción de
una proteína quinasa que fosforila elF-2, y la inducción
de 2,5-A sintetasa cuyo producto, 2,5-A, activa una endo-
Ladner, J. E., Finch, J. T., Rhodes, D., Brown, R. S., Clark, B.
F. C. y Klug, A., Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3
A resolution, Nature 250, 546-551 (1974). [Los artículos
punteros que describen la resolución de la estructura de un
tRNA.] .
Kline, L. K. y sen, D., Nucleotide modifications in RNA, en
Boyer, P. D. (Ed.), The Enzymes (3.ª ed.), Vol. 15, pp. 567-
582, Academic Press (1982).
Leatherbarrow, R. J., Fersht, A. R. y Winter, G., Transition-
state stabilization in the mechanism of tyrosyl-tRNA
synthetase revealed by protein engineering, Proc. Natl.
Acad. Sci. 82, 7840-7844 (1985).
Leinfelder, W., Zehelein, E., Mandrand-Berthelot, M.-A., y
Bock, A., Gene for a novel ·tRNA species that accepts L-
serine and cotranslatíonally inserts selenocysteine, Nature
331, 723-725 (1988).
Mirande, M., Aíninoacyl-tRNA synthetase family from pro-
karyotes and eukaryotes: Structural domains and their im-
plications, · Prog. Nucl. Acid · Res. Mol. Biol. 40, 95-142
(1991) .
Muramatsu, T., Nishakawa, K., Nemoto, F., Kuchino, Y.,
Nishamura, S., Miyazawa, T. y Yokoyama, S., Codon and
amíno-acíd specificities of a transfer RNA are both conver-
ted by a single post-transcriptional modification, N ature
336, 179-181 (1988).
Perret, V., Garcia, A., Grosjean, H., Ebel, J.-P., Florentz, C.
y Giegé, R., Relaxation of a transfer ·RNA specificity by
removal of modified nucleotides, Nature 344, 787-789
(1990).
Rich, A. y Kim, S. H., The three-dimensional structure of
transfer RNA, Sci. Am. 238(1): 52-62 (1978).
Rogers, M. J. y Sóll, D., Inaccuracy and the recognition of
tRNA, Prog. Nucl. Acids Mol. Biol. 39, .185-208 (1990).
Rould, M. A., Perona, J. J., sen. D. y Steitz, T. A., Structure
of E. coli glutamiriyl-tRNA synthetase complexed with
tRNA Gin and ATP at 2.8 A resolution, Science246, 1135-
1142 (1989).
Schimmel, P., Parameters for the molecular recognition of
tRNAs, Biochemistry 28, 2747-2759 (1989).
Schimmel, P. R., Aminoacyl tRNA synthetases: general
scheme of structure-function relationships in the polypepti-
des and recognition of transfer RNAs, Annu. Rev. Biochem.
56, 125-158 (1987).
Schimmel, P. R., sen. D. y Abelson, J. N. (Eds.), Transfer
RNA, Cold Spring Harbor Laboratory (1979). [Un tratado de
dos volúmenes sobre el tRNA. La Parte 1 trata de la estruc-
tura, propiedades y reconocimiento; la Parte 2 trata de
aspectos biológicos.]
Schimmel, P., Classes of aminoacyl-tRNA synthetases and
the establishment of the genetic code, Trends Biochem. Sci.
16, 1-3 (1991).
Schulman, L. H. y Abelson, J., Recent excitement in unders-
tanding transfer RNA identity, Science 240, 1951-1952
(1988).
Sprinzl, M., Moll, J., Meissner, F. y Hartmann, T., Compila-
tion of tRNA sequences, Nucleic Acids Res. 113, r1-r49
(1985).
,("'4º .
Altman, S. (Fd.), Transfer RNA, MIT Press (1978). [Serie de
revisiones generales sobre los tRNAs.]
Bennetzen, J. L~ y Hall, B. D., Codon selectio11 in yeast, /.
Biol. Chem. 257, 3026-3031 (1982).
Bjórk, G. R., Ericson, J. U., Gustafsson, C. E. D., Hagervall,
T. G., Jósson, Y. H. y Wikstróm, P. M., Transfer RNA
modification, Annu. Rev. Biochem. 56, 263-287 (1987).
Blow, D. M. y Bríck, P., Aminoacyl-tRNA synthetases, en
Jurnak, F. A. y McPherson, A. (Eds.), Biological Macromole-
culee and Assembly, Vol. 2: Nucleic Acids and Interactive
Proteins, pp. 441-469, Wiley (1985).
Críck, F. H. C., Codon-anticodon pairing: the wobble _
hypothesis, t: Mol. Biol .. 19, 548-555 (1966).
Cusack, S., Berthet-Colominas, C., Hártlein, M., Nassar, N.
y Leberman, R., A second class of synthetase structure
revealed by ·x-ray analysis of Eschericia coli seryl-tRNA
synthetase at 2.5 A, Nature 347, 249-255 (1990). - ·
Eriani, G., Delarue, M., Poch, O., Gangloff, J. y Moras, D.,
Partition of tRNA synthetases into two classes based on
mutually exclusive sets of sequence motifs, N ature 347,
203-206 (1990).
Forchhammer, K., Leinfelder, W. y Bóck, A., Identification
of a novel translation factor necessary for the incorporation
of selenocysteine into protein, Nature 342, 453-456 (1989).
Preist, W., Isoleucyl-tRNA synthetase: an enzyme with se-
vera! catalytic cycles displaying variation in specificíty and
energy consumption, Angreui. Chem~ 1 nt. Ed. Engl. 27, 773-
788 (1988).
Kersten, H., On the biological significance of modified nu-
cleosides in tRNA, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 31,
59-114 (1984).
Kim, S. H., Suddath, F. L., Quigley, G. J., McPherson, · A.,
Sussman, J. L., Wang, A. M. J., Seeman, N. C. y Rich, A.,
Toree-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine
transfer RNA, Science 185, 435-440 (1974); y Robertus, J. D.,
RNA de transferencia
.. ,
Yanofsky, C., Gene structure and protein structure, Sci. Am.
. 216(5): 80-94 (1967).
or synthetic polyribonucleotides, Proc. Natl. Acad. Sci. 47,
1588-1602 (1961). [El artículo en el que se da cuenta del
descubrimiento de que poli(U) estimula la síntesis de po-
li(Phe).]
Nirenberg, M. W., The genetic code: 11, Sci. Am. 208: 80-94
(1963). [Discute la. utilización de mRNAs sintéticos para
analizar el código genético.]
Nirenberg, M. y Leder, P., RNA code words and protein
synthesis, Science 145, 1399-1407 (1964). [Determinación
del código genético a través de la unión al ribosoma de
tRNAs utilizando trinucleótidos específicos.]
Nirenberg, M., The genetic code, No bel Lectures in Molecu-
lar Biology, 1933-1975, pp. 335-360, Elsevier (1977).-
Sínger.B, y Kusmierek, J. T., Chemical mutagenesis, Annu.
Rev. Biochem. 51, 655-693 (1982).
Yanofsky, C., Carlton, B. C., Guest, J. R., Helinski, D. R. y
· Henning, U., On the colinearity of gene structure and pro-
. tein structure, Proc. Natl. Acad. Sci. 51, 266-272 (1964).
1012 Bibliografía
Kurland, C. G. y Ehrenberg, M., Optimization of transla-
tion, Prog. Nucleid Acid Res. Mol. Biol. 31, 191-219 (1984).
Lake, J. A., Evolving ribosome structure: domains in archae-
bacteria, eubacteria, eocytes and eukaryotes, Annu. Rev.
Biochem. 54, 507-530 (1985).
Lake, J. A., -The ribosome, Sci. Am. 245(2): 84-97 (1981).
Liljas, _A., Structural studies of ribosomes, Prog. Biophys.
Mol. Biol. 40, 161-228 (1982).
Maitra, U., Stringer, E. A. y Chaudhuri, A., Initiation factors
in proteín biosynthesis, Annu. Rev. Biochem. 51, 869-900
(1982). .
Moldave, K., Eukaryotic protein synthesis, Annu. Rev. Bio-
chem. 54, 109-149 (1983).
Moore, P. B. y Capel, M. S., Structure-funchon correlations
in the small ribosomal subunit from Escherichia coli, Annu.
Rev. Biophys. Chem. 17, 349-367 (1988).
Moore, P. B., The ribosome retums, Nature 331, 223-227
(1988).
Nagano, K.·y Harel, M., Approaches to a three-dimensional
model of the E. coli ribosome, Prog. Biophys. Mol. Biol. 48,
67-101 (1986).
Nierhaus, K. H., Structure, function and assembly of riboso-
mes, Curr. Top. Microbiol. lmmunol. 97, 81-155 (1982). [Una
revisión profunda y clara.]
Nierhaus, K. H. y Wittman, H. G., Ribosomal function and
its inhibition by antibiotics in prokaryotes, N aturwissens-
chaften 67, 234-250 (1980).
Nierhaus, K. H., The allosteric three-site model for the
ribosomal elongation cycle: Features and future, Bioche-
mistry 29, 4997-5008 (1990).
Noller, H. F., Jr. y Moldave, K., (Eds.), Ribosomes, Methods
Enzymol. 164 (1988). [Contiene numerosos artículos sobre
metodología en el trabajo con ribosomas.]
Noller, H. F., Structure of ribosomal RNA, Annu. Rev. Bio-
chem. 53, 119-162 (1984).
Noller, H. F. y Moazed, D., Intermediate states in the
movement of transfer RNA in the ribosome, Nature 342,
142-148 (1989).
Noller, H. F., Architecture and function of ribosomal RNA,
. Harvey Lectures 84, 97-117 (1990).
Pappenheimer, A. M., Jr., Diphtheria toxin, Annu. Rev. Bio-
chem. 46, 69-94 (1977).
Prince, J. B., Gutell, R. R. y Garrett, R. A., A consensus
model of the E. coli ribosome, Trends Biochem. Sci. 8, 359-
363 (1983).
Rané, H. A., Klootwijk, J. y Musters, W., Evolutionary
conservation of structure and function of high molecular
weight ribosomal RNA, Prog. Biophys. Mol. Biol. 51, 77-129
(1988).
· Rhoads, R. E., Cap recognition and the entry of mRNA into
the protein initiation cycle, Trends Biochem. Sci. 13, 52-56
(1988).
Riis, B., Rattan, 5. l. S., Clark, B. F. C. y Merrick, W. C.,
Eukaryotic protein elongation factors, Trends Biochem. Sci.
15, 420-424 (1990).
Hunt, T., The initiation of protein synthesis, Trends Bio-
chem. Sci. 5, 178-181 ( 1980) .
•
Capítulo 30. Traducción 1013
'··' Ribosomas
Bielka, H. (Ed. ), The Eukaryotic Ribosome, 5pringer-Verlag
(1982). [Un texto detallado.]
Brinacombe, R., The emerging three-dimensional structure
and function of 165 ribosomal RNA, Biochemistry 27, 4207-
4214 (1988). ,
Capel, M. 5., Engelman, D.M., Freeborn, B. R., Kjeldgaard, .
M., Langer, J. A., Ramakrishnan, V., Schindler, ·o. G.,
5chneider, D. K., Schoenborn, B. P., Siller, 1.-Y., Yabuki, 5. ·
y Moore, P. B., A complete mapping of the proteins in the
small ribosomal subunit of Escherichia coli, Science 238, ·
1403-1406 (1987).
Caskey, C. Th., Peptide chain termination, Trends Biochem.
Sci. 5, 234-237 (1980).
Chambliss, G., Craven, G. R., Davies, J., Davis, K., Kahan,
L. y Nomura, M. (Eds.), Ribosomes. Structure, Function and
Genetics, University Park Press (1979). [Una serie de revi-
siones de gran valor informativo.]
Clark, B., The elongation step of protein biosynthesis,
Trends Biochem. Sci: 5, 207-210 (1980).
Dahlberg, A. E., The functional role of ribosomal RNA in
protein synthesis, Cell 57, 525-529 (1989).
Dintzis, H. M., Assembly of the peptide chains of hemoglo-
bin Proc. Natl. Acad. Sci. 47, 247-261 (1961). [La determina-
ción de la dirección de la biosíntesis de polipéptidos.]
Edelmann, P. y Gallant, J., Mistranslation in E. coli, Cell 10,
131-137 (1977). ·
Fersht,A., Enzyme Structure and Mechanism (2.ª ed.), Capí-
tulo 13, Freeman (1985). [Discusión de la especificidad enzi-
mática y de los mecanismos de corrección.]
Gale, E. F., Cundliffe, E., Reynolds, P. E., Richmond, M. H.,
y Waring, M. J., The Molecular Basis of Antibiotic Action,
Capítulo 6, Wiley (1981).
Gualerzi, C. O. y Pon, C. L., Initiation of mRNA translation
in prokaryotes, Biochemistry 29, 5881-5889 (1989).
Gutell, R. R., Weiser, B., Woese, C. R. y Noller, H. F.,
Comparative anatomy of 16-5-like .ribosomal RNA, Prog.
Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 32, 155-216 (1985).
Hardesty, B. y Kramer, G. (Eds. ), Structure, Function, and
Genetics of Ribosomes, Springer-Verlag (1985). [Serie de re-
visiones útiles sobre aspectos generales de ribosomología.]
Held, W. A., Ballou, B., Mizushima, S. y Nomura, M.,
Assembly mapping of 305 ribosomal proteins from Escheri-
chia coli, J. Biol. Chem. 249, 3103-3111 (197 4).
Hill, W. E., Dahlberg, A., Garrett, R. A., Moore, P. B.,
Schlessinger, D. y Warner, J. R. (Eds.), The Ribosome, Ameri-
can Society for Mícrobíolcgy (1990). [Compendio de avan-
ces recientes en enzimología.]
Stadtman, T. C., Selenium biochemistry, Ann. Rev. Biochem.
59, 111-.127 (1990).
5teege, D. A. y 5611, D.G. 5uppression, en Goldberger, R. F.
(Ed.), Biological Regulation and Development, Vol. 1, pp.
433-485, Plenum Press (1979).
von Ehrenstein, G., Weisblum, B. y Benzer, 5., The function
of sRNA as amino acid adapter in the synthesis of he~lo-
bin, Proc. Natl. Acad. Sci. 49, 669-675 (1963).
Degradación de proteínas
Bachmair, A., Finley, D. y Varshavsky, A., In vivo half-life
of a protein is a function of its amino terminal residue,
Science 234, 179-186 (1986).
Chau, V., Tobias, J. W., Bachmair, A., Maniott, D., Ecker, D.
J., Gonda, D. J. y Varshavsky, A., A multiubiquitin chain is
confined to a specific lysine in a targeted short-líved pro-
tein. Science 243, 1576-1583 (1989).
Dice, J. F.,. Peptide sequences that target cytosolic proteins
for lysosomal proteolysís, Trends Biochem. Sci. 15, 305-309
(1990).
Finley, D. y Varshavsky, A., The ubiquitin system: func-
tions and mechanisms, Trends Biochem. Sci. 10, 343-347
(1985).
Goldberg, A. L. y Dice, J. F., y Goldberg, A. L. y St. John, A.
. C., Intracellular protein degradation in mammalian and
bacterial cells: parts I and 11, Annu. Rev. Biochem. 42, 835-
869 (1974) y 45, 747-803 (1976).
Hershko, A., Ubiquitin-mediated protein degradation, J.
Biol. Chem. 262, 15237-15240 (1988).
Hershko, A. y Ciechanover, A., The ubiquitin pathway for
the degradation of intracellular proteins, Prog. Nucleic Acid
Res. Mol. Biol. 33, 19-56 (1986).
Rechsteiner, M., Ubiquitin, Plenum Press (1988). [Serie de
artículos sobre la estructura y la función de la ubiquitina.]
Rechsteiner, M., Rogers, S. y Rote, K., Protein structure and
intracellular stability, Trends Biochem .. Sci. 12, 390-394
(1987).
Rivett, A. J., Intracellular protein degradation, Essays Bio-
chem. 25, 39-81 (1990).
Stadtman, E. R., Covalent modifications are marking steps
in protein turnover, Biochemistry 29, 6323-6331 (1990).
..
Senahdi, V.-J., Bugg, C. E., Wilkinson, K. D. y Cools, W. J.,
Three-dimensional structure of ubiquitin at 2.8 A resolu-
tion, Prog. Natl. Acad. Sci. 82, 3582-3585 (1985).
Waxman, L., Fagan, J. M. y Goldberg, A. L., Demostration
of two distinct high molecular weight proteases in rabbit
retículocytes, one of which degrades ubiquitin conjugates, /.
Bi~l. Chem. 262, 2451-2457 (1987).
Modificación postraduccional
Fessler, J. H. y Fessler, L. l., Biosynthesis of procollagen,
Annu. Rev. Biochem. 47, 129-162 (1978).
Prockop, D. J., Kivirikko, K. l., Tuderma, L. y Guzman, N.
A., The biosynthesis of collagen and its disorders, New Engl.
.J. Med. 301, 13-23 (1979).
Wold, F., In vivo chemical modification of proteins, Annu.
Rev. Biochem. 50,1 783-814 (1981). .
Wold, · F. y Moldave, K (Eds.), Postranslational Modifica-
tions, Partes A y B, Methods Enzymol. 106 y 107 (1984).
[Extensas descripciones del "zoológico" de aminoácidos.]
· Williams, B. R. G. y Kerr, l. M .. , The 2-5A(pppA2'p5'A2'p5'A)
system in interferon-treated and control cells, Trends Bio-
chem. Sci. 5, 138-140 (1980).
Raff, R. A., Masked messenger RNA and the regulation of
protein synthesis in eggs and embryos, en Prescott, D. M. y
Goldstein, L. (Eds.), Cell Biol. Vol. 4, pp. 107-136, Academic
Press (1980).
Hershey, J. W. B., Protein phosphorylation controls transla-
tion rates, J. Biol. Chem. 264, 20823-20826, (1989).
Jackson, R. J. y Standart, N., Do the poly(A) taíl and 3'
untranslated region control mRNA translation? Cell 62, 15-
24 (1990).
Jagus, R., Anderson, W. F. y Safer, B., The regulation of
initiation of mammalian protein synthesis, Prog. Nucleic
Acid Res. MDl. Biol. 25, 127-183 (1981).
Kaempfer, R., Regulation of eukaryotic translation, en .
Praenkel-Conrat, H. y Wagner, R. R., (Eds.), Comprehensive
Virology, Vol. 19, pp. 99-175, Plenum Press (1984).
Lengyel, P., Biochemistry of interferons and their actions
Annu. Rev. Biochem. 51, 251-282 (1982).
Pestka, S., Langer, J. A .. , Zoon, K. C. y Samuel, C. E.,
Interferons ·and their actíons, Annu. Rev. Biochem. 56, 757-
777 (1987).
Proud, C. G., Guariine nucleotides, protein phosphoryla-
tion and control of translation, Trends Biochem. Sci. 11,
73-77 (1986).
Control de traducción
Schüler, D. y Brinacombe, R., The Escherichia coli 305 ribo-
some subunit; an optimized three-dimensional fit between
the ribosomal proteins and the 165 RNA, EMBO J. 7, 1509-
1513 (1988).
Shatkin, A. J., mRNA cap binding proteins: essential factors
for initiating translation, Cell 40, 223-224 (1985).
~ .
5hine, J. y Dalgarno, L., The ~, -terniinal sequence of Esche-
richia coli 165 ribosomal RNA: complementarity to nonsen-
se triplets and ribosome binding si tes, Prog. N atl. Acad. Sci. .
71, 1342-1346 (1974).
Spirin, A. 5., Ribosomal translocation: facts and models,
Prog. Nucleic. · Res. Mol. Biol. 32, 75-114 (1985).
Steitz, J. A. y Jakes, K., How ribosomes select initiator
regions in mRNA: base pair formation between the 3' ter-
minus of 165 RNA and the mRNA during initiation of
protein synthesis in Escherichia coli, Proc. Natl. Acad. Sci. 72,
4734-4738 (1975).
5tem, 5., Powers, T., Changchien, L.-1. y Noller, H. F.;'
RNA"'.'protein interactions in 305 ribosomal subunits: fol-
ding and function of 165 rRNA, Science 244, 783-790
(1989).
Stóffler, G. y Stóffler-Meilicke, M., Immunoelectron micros-
copy of ríbosomes, Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 13, 303-330.
(1984).
Thompson, R. C., EFTu provides an intemal kinetic stan-
dard for translational accuracy, Trends Biochem. Sci. 13,
91-93 (1988).
Yonath, A. y Wittmann, H. G., Challenging the three-
dimensional structure of ribosomes, Trends Biochem. Sci. 14,
329-335 (1989).
1014 Bibliografía
7. Explicar por qué se necesita un mínimo de 32 tRNAs
para traducir el código. genético u estándar".
8. Dibujar los apareamientos balanceantes que no figu-
ran en la Fig. 30-21a
19. Un antibiótico denominado fixmicina, purificado a
partir de un hongo que crece sobre los frutos de la
pasión maduros, es efectivo para curar muchas clases
de enfermedades venéreas. Caracterizando el mecanis-
mo de acción de este antibiótico usted se da cuenta de
que es un inhibidor de la traducción bacteriana que se
une exclusivamente a la subunidad grande de los ribo-
Especificar la mutación que provoca - la aparición de
hemoglobina "Constant Spríng" ..
"" -Ser-Lys-Tyr-Arg-Gln-Ala-Gly · · ·
En la hemoglobina "Constant Spríng", la secuencia de
·1a región correspondiente de la cadena a es
17. ¿Cuál es el coste energético, en términos de ATP, que
supone para E. coli la síntesis de una cadena polipeptí-
dica de 100 restos a partir de. atftinoácidos y de
mRNA? Suponer que no hay pérdidas debidas a la
prueba de lectura.
*18. Se ha sugerido que la Gly~tRNA sintetasa no requiere
mecanismo de corrección.¿Por qué?
- -Ser-Lys-Tyr-Arg
La secuencia del tetrapéptido Cvtermínel de la cadena
a normal es
5' -CUGAUAAGGAUUUAAAUUAUGUGUCAAUCA-
CGAAUGCUAAUCGAGGCUCCAUAAUAACACUU-
CGAC-3'
· · ·UCCAAAUACCGUUAAGCUGGA· · ·
16. Indicar los sitios de control de la traducción· y la se-
cuencia de aminoácidos especificada por el siguiente
mRNA procariótico.
4. Explicar por qué las diferentes clases de mutaciones
pueden revertir una mutación de la misma clase, pero
nunca de clase diferente.
5. ¿ Qué aminoácidos son especificados por codones que
pueden ser transformados en un codón ambar por una
única mutación puntual?
6. El mRNA qge especifica la cadena a de la hemoglobi-
na humana contiene la secuencia de bases
Indicar cómo puede haberse originado el mutante y
dar las secuencias de bases, tanto como sea posible, de
los mRNAs que especifican ambos polipéptidos. Co-
mentar la función del péptido en la proteína.
*3. La huella de una proteína de un mutante fenotípica-
mente revertiente del bacteriófago T4 indica la presen-
cia· de un péptido tríptico modificado respecto de la
variedad salvaje. Las secuencias de los dos péptidos
son las siguientes:
5' -TCTGACTATTGAGCTCTCTGGCACATAGCA-3'
9. Una colega sostiene que la exposición de E. coli a
HN02 le ha permitido mutar un tRNA Gly a un supresor
ámbar. ¿Es creíble esta afirmación? Explicarlo.
*10. Deducir las secuencias de los anticodones de todos los
supresores listados en la Tabla 30-5, excepto UGA-1, e
indicar las mutaciones que los han originado.
11. ¿ Cuántos tipos diferentes de macromoléculas debe
contener, como mínimo, un sistema de síntesis protei-
ca libre de células derivado de E. coli? Contar cada tipo
de componente ribosomal como una macromolécula
diferente.
12. ¿Por qué los oligonucleótidos que contienen secuen-.
cías de Shine-Dalgarno inhiben la traducción en los
procariotas? ¿Por qué no la inhiben en los eucariotas?
13. ¿Por qué el m7GTP inhibe la traducción en los eucario-
tas, y no en los procariotas?
14. ¿ Cuál debería ser la distribución de radiactividad en
las cadenas de hemoglobina completas tras una corta
exposición de los reticulocitos a. leucina marcada con
3H, seguida posteriormente por una caza con leucina
no marcada?
15. Diseñar un mRNA con los sitios de control necesarios
que codifique para el octapéptido Lys-Pro-Ala-Gly-
Thr-Glu-Asn-Ser.
Cys-Glu-Asp-His-Val-Pro-Gln-Tyr-Arg
Cys-Glu-Thr..:Met-Ser-His-Ser-Tyr-Arg
Salvaje:
Mutante:
1. ¿Cuál es el producto de la reacción de guanina con ácido
nitroso? ¿Esta reacción es mutagénica? Explicarlo.
2. ¿ Cuál es el polipéptido especificado por la siguiente
hebra antisentido de DNA? Suponer que la traducción
comienza tras el primer codón de iniciación.
Problemas
Kleinkauf, H. y Dóhren, H., Nonribosomal polypeptide
formation on multifunctional proteins, Trends Biochem. Sci.
8, 281-283 (1983).
Lipmann, F., Attempts to mapa process evolution of pepti-
de biosynthesis, Science 173, 875-884 (1971) .
Lipmann, F., Nonribosomal peptide synthesis on polyenzy-
me templates, Acc. Chem. Res. 11, 361-367 (1973).
Síntesis no ribosomal de polipéptidos
. . . .
Capítulo 30. Traducción 1015
I' .,
./
20. El grupo hemo inhibe la ·degradación de proteínas en·
los reticulocitos, regulando alostéricamente el enzima
activador de ubiquítina. ¿ Qué función fisiológica po-
dría esto tener?
21. Genbux Inc., una empresa dedicada a la ingeniería
genética, ha clonado e introducido en E. coli el gen que
codifica para un enzima industrialmente valioso, de
forma que son capaces de obtener grandes cantidades
del producto. Sin embargo, dado que la firma quiere
obtener toneladas del enzima, el gasto que supone·su
purificación se vería muy reducido si se pudiera hacer
que la bacteria lo secretara. Como consultor de presti-
gio que usted es, ¿qué consejo daría a la empresa para
solucionar este problema?
somas de E. coli. La iniciación de la síntesis de proteí-
nas en presencia de fixmicina tiene como resultado la
generación de dipéptidos que permanecen asociados al
ribosoma. Sugerir un mecanismo de acción para la fix-
• • micma.
1016 Problemas
El histórico artículo de Watson y Crick sobre la
estructura de la doble hélice de DNA acababa con
la siguiente frase: "Es evidente que el apareamiento
específico que postulamos para las bases del DNA
sugiere un posible mecanismo de reproducción del
5. Reparación del DNA
A. Reparación directa
B. Reparación por escisión
C. Reparación por recombinación
\,
D. La respuesta SOS
E. Identificación de carcinógenos
1. REPLICACIÓN DEL DNA:
INTRODUCCIÓN
4. 'Replicación de.1 DNA eucariótico
A. El ciclo celular
B. DNA polimerasas eucarióticas
C. Transcriptasa inversa
3. Mecanismos de replicación procariótica
A. Bacteriófago M13
B. Bacteriófago <t>X17 4
C. E. coli
D. Fidelidad de la replicación
En este capítulo, se tratará de la síntesis y el mante-
nimiento del DNA. La necesidad de la transmisión de
la información genética a las siguientes generaciones
suficientemente fidedigna, pero con capacidad para
admitir las mutaciones beneficiosas, ha llevado a la
· evolución de complejos mecanismos para la replica-
ción, reparación y recombinación del DNA. Los as-
pectos generales de estos procesos ya se conocen, si
bien los detalles quedan aún por dilucidar.
t
A non
Los seres vivos somos los instrumentos del DNA
para fabricar más DNA.
2. Enzimas de replicación
A. DNA polimerasa I
B. DNA polimerasa 111
C. Helicasas, proteínas de unión y DNA ligasas
7. Metilación del DNA
6. Recombinación y elementos genéticos móviles
A. Recombinación general
B. Transposición
1. Replicación del DNA: 1 ntroducción
A. Horquillas de replicación
B. Función de la DNA girasa
C. Replicación semidiscontinua
D. Cebadores de RNA
'
Capítulo 31
Figura 31-2
Autorradiografía y dibujo aclaratorio de un cromosoma de
E. coli replicándose. Las bacterias se cultivaron durante
algo más de una generación en un medio que contiene
· [3H]timina, marcándose así el DNA de nueva síntesis que
aparece como una línea de granos oscuros en la emulsión
fotográfica (líneas rojas en el dibujo aclaratorio}. El tamaño
del ojo de replicación indica que el cromosoma circular se
ha duplicado una sexta parte en la vuelta de replicación en
curso. [Por cortesía de John Cairns, Cold Spring Harbor
Laboratory.]
A. Horquillas de replicación
La replicación del DNA · se lleva a cabo mediante
enzimas conocidos con el nombre de DNA polimerasas
dirigi(jas por DNA o s.implemente como DNA poli-
merasas. Estos enzimas utilizan DNA monohebra
como molde sobre ·el que catalizan la síntesis de la
hebra complementaria, a partir delos desoxinucleósi-
dos trifosfato adecuados (Fig. 31-1). Los nuevos nu-
cleótidos se seleccionan por su capacidad para apa-
rearse, según la complementariedad demostrada por
Watson y Crick, con las bases de la molécula molde,
de modo. que la hebra recién sintetizada forma una
El DNA dúplex se replica
semiconservadoramente en las horquillas
de replicación
John Caims obtuvo las primeras pruebas sobre el
mecanismo de replicación de los cromosomas me-
diante autorradiografías de DNA en replicación. Estas
autorradiografías de cromosomas circulares creciendo
en un medio que contenía [3H]timidina mostraban
doble hélice con la hebra molde. Casi todas las DNA
polimerasas conocidas .. pueden añadir únicamente el nu-
cleótido aportado por un nucleósido trifosf ato, al grupo
3'-0H libre de un polinucleótido, que tiene sus bases
apareadas, de forma que la hebra de DNA se extiende
sólo en la dirección 5' • 3'. Las DNA polimerasas se
describen en secciones posteriores: 31-2A, 2B y 4B.
material genético." En un artículo posterior, estos au-
tores se extendieron en sus suposiciones señalando
que una hebra de DNA puede actuar como molde
para dirigir la síntesis de su hebra complementaria.
Aunque en 1958, Meselson y Stahl demostraron que
la replicacióndel DNA era semiconservadora (Sec-
ción 28-2A), no fue basta 20 años después cuando se
llegó a conocer con suficiente detalle el mecanismo de
la replicación del DNA en procariotas. Ello se debe,
como veremos más adelante en este capítulo, a que el
mecanismo de la replicación del DNA rivaliza con
el de la traducción en complejidad, pero está mediado
por ensamblajes de proteínas débilmente asociadas,
de las que sólo están presentes unas pocas copias por
célula. La sorprendente complejidad de la replicación del
DNA, en comparación con la transcripción, que usa
mecanismos químicos parecidos (Sección 29-3), proviene
de la necesidad de una fidelidad extrema en la replica-
ción del DNA, con el fin de mantener la integridad del
genoma generación tras generación.
Figura 31-1
Las DNA polimerasas ensamblan los desoxinucleósido trifosfatos entrantes sobre
moldes de DNA monohebra, con lo que la hebra creciente es extendida en dirección
5'-+ 3'.
.OH +
p
/ -OH
ppp p • • • p
-OH
p p p • • • p·
5' 3'
DNA replicado
B' B' B' B' 85 DNA polimerasa B' B' B' B' B' 1 2 3 4 1 2 3 4 5
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
81 82 83 84 B1 82 B3 84
p ••• p p p p ••• p pp.
t
p ••• p p p p • • • p
3' -. 5'
DNA molde
1018 Sección 31-1. Replicación del DNA: Introducción
Figura 31-4
Diferenciación, mediante autorradiografía, entre la
replicación unidireccional y la 0 bidireccional del DNA.
(a) Un organismo se hace crecer durante varias
generaciones en un medio ligeram~nte marcado con
[3H]timina par.a que todo su DNA sea visible en una
autorradiografía. Unos pocos segundos antes de aislar el
DNA (marcaje de pulso), se añad~ al cultivo una gran
cantidad de [3H]timina, con el fin de marcar únicamente las
bases próximas a la(s) horquilla(s) de replicación. En la
replicación unidireccional, sólo se observará intensamente
marcado uno de los puntos de ramificación (parte superior'),
mientras que la replicación bidireccional presentará dos de
estos puntos de ramificación (parte inferior).
(b) Autórradigrafía del DNA de E. coli, tratada de la
misma forma, que demuestra su repücacíón bidireccional.
[Cortesía de David M. Prescott, University of Colorado.]
(b)
(a)
rnarcade marcado
~,fi~~t.}-·;i-, ~-
r0-n' y ·V \,V)¡ •
"""' I'-"' ',(_;;-"(\ , , ,~ . . .. ~)<""\"' .. r
\/Y\ YX,<I~ R.ephcac16n . ' ,,,,~r'<A'Y), .. 0,
,vv(\, v\,~ unidireccional . ,~~""JJ
/"~~~fj~~""'
DNA densamente DNA ligeramente
dentro de los 3 µm de longitud· de una célula de E. coli
a - 100 revoluciones/s (recuérdese que el B-DNP~
tiene unas 10 bp por vuelta). Pero, incluso esto no
sería posible, ya que de hecho, el cromosoma de E.
coli es circular. Por el contrario, la molécula de DNA
acumularía +100 superenrollamientos/s (ver Sección
28-SA para una revisión del superenrollamiento ),
hasta que llegara a estar demasiado retorcida sobre sí
misma como para continuar desenrollándose. El su-
perenrollamiento negativo que tiene lugar en el DNA
natural promueve la desespiralización de únicamente
el - 5 o/o de sus vueltas dúplex (recuérdese que los
DNAs que se encuentran en la naturaleza no están
completamente superenrollados, les falta· una super-
hélice por cada - 20 vueltas dúplex; Sección 28-SB).
Sin embargo, en organismos procarióticos, los super-
enrollamientos negativos se pueden establecer -en -el
DNA por la acción de una topoisomerasa del Tipo 11
(DNA girasa; Sección 28-SC) a expensas de la hidróli-
sis de ATP. Este proceso es esencial en la replicación
B. Función de la DNA girasa
La necesidad de desenrollar la hebra paterna del
DNA en la horquilla de replicación (Fig. 31-3) produ-
ce grandes problemas a nivel topológico. Por ejem-
plo, el DNA de E. coli se replica a una velocidad
aproximada de ,....., 1000 nucleótidos/s. Si su cromoso-
ma de 1300 µm de longitud fuera lineal, debería girar
la existencia de "ojos" o "burbujas" de replicación
(Fig. 31-2)-. Estas estructuras, denominadas estructu-
ras 0 (por su parecido a esta letra griega) indican que
el DNA dúplex se replica por una progresiva separación
de las dos hebras pate.rnas, acompañado de una sínte-
sis de sus hebras complementarias, dando lugar, de forma
semiconservadora, a dos dobles hebras- hijas (Fig. 31-3).
El mecanismo de replicación del DNA basado en las
estructuras 0 es conocido como replicación 0.
El punto de separación de las dos hebras en el ojo
de replicación, donde la síntesis tiene lugar, se de-
nomina horquilla de replicación. Una burbuja de re-
plicación puede contener una o dos horquillas de
replicación (replicación unidireccional o bidireccio-
nal). Los estudios median-te autotradiografías han de-
mostrado que la replicación de tipo 0 es casi siempre
bidireccional (Fig.-31-4). Además, dichos experimen-
tos, junto con algunas evidencias genéticas, han esta-
blecido que el DNA procariótico y el de 1os bacterió-
fagos sólo poseen un único origen de replicación
(punto donde se inicia la síntesis d~l DNA).
Figura 31-3
Replicación del DNA.
DNAs replicados
DNA paterno
Capítulo 31. Replicación, reparación y recombinación del DNA 1019
Uno de los requerimientos casi universales para
todas las DNA polimerasas es el extender la hebra de
DNA a partir de un extremo 3'-0H libre. Como con-
secuencia de este hecho, resaltado por el estableci-
miento del modelo semidiscontinuo, se plantea la
siguiente pregunta: ¿cómo se inicia la síntesis de
DNA? Analizando cuidadosamente los fragmentos de
Okazaki, se observa que sus extremos 5' consisten en
segmentos de RNA de 1 a 60 nucleótidos (esta longitud
varía según. la especie), que son complementarios a la
hebra de DNA molde (Fig. 31-7). E. coli posee dos
enzimas que catalizan la formación de estos cebado-
res de RNA: la RNA polimerasa, el enzima que me-
dia la transcripción (Sección 29-2), y otro de menor
tamaño, la primasa (60 kD), que es el producto mo-
nomérico del gen denominado dnaG.
Esta primasa, contrariamente a la RNA polimerasa,
es resistente a la acción de la rif ampicina (Sección
· 29-2C). La observación de que la rifampicina inhibe
D. Cebadores de RNA
nuevo, la hebra retrasada, es también sintetizada en
dirección 5' • 3', pero de manera discontinua, formandg
los fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos se unen
covalentemente, después de su síntesis, en una reacción
catalizada por el enzima DNA ·Iigasa (Sección 31-2C).
Este modelo semidiscontinuo de replicación del
DNA se ve corroborado por micrografías de DNA
replicándose, donde se muestran regiones de DNA mo-
nohebra en una de las ramas de la horquilla de repli-
cación (Fig. 31-6). En el DNA que se replica bidirec-
cionalmente, aparecen además dos regiones de DNA
monohebra dispuestas, como era de esperar, en sitios
opuestos diagonalmente respecto a la burbuja de re-
plicación.
Figura 31-6
Micrografía electrónica de un ojo de replicación en el DNA
de Drosophila melanogaster. Obsérvese que las regiones
monohebra (flechas), cerca de las horquillas de replicación,
tienen una configuración trans, de acuerdo con el modelo
semidiscontinuo de replicación del DNA. [Tomado de
Kreigstein, H. J. y Hogness D. S., Proc. Natl. Acad .. Sci. 71,
173 (1974).]
5,--1.U.~--.U..u.J..J......U.J..1.u.i-~
Figura 31-5
En la replicación del DNA, ambas hebras hijas (rojo) se
sintetizan en la dirección 5' --. 3'. La hebra conductora se
sintetiza de forma continua, mientras que la hebra
retrasada lo hace de forma discontinua.
Hebras paternas 3 , ·T'iif r·r· r·:r j •• ·,. ·"··~~rT· "''l'ijllli:11¡ ....... 1 El'"il"ii''li''!f11iil 5, i11 ¡¡ ¡_¡' !I ·.!I :_:11 \ ; 1 ¡l ,·, 11 ¡-1 ~ 1ir :-¡' ;, :1 !,. '. · ·.:1 , · ': '•! .', :' il ·:'
Hebra retrasada (fragmentos de Okazaki)
3'
Avance de
--------------...,_ la horquilla
de replicación
C. Replicación semidiscontinua
Las imágenes de baja resolución obtenidas median-
te autorradiografías, como las de las Figs. 31-2 y
31-4b sugieren que las dos hebras antiparalelas del
DNAdúplex se replican. simultáneamente a medida
que avanza la horquilla de replicación. Pero, todas las
DNA polimerasas conocidas tan sólo pueden exten-
der las hebras en la dirección 5'-+ 3'. ¿Cómo, enton-
ces, la DNA polimerasa es capaz de copiar la hebra
paterna que sigue la dirección 5' · ... 3', más allá de la
horquilla de replicación? Esta pregunta fue contestada
en 1968 por Reiji Okazaki mediante los siguientes
experimentos. Si durante el crecimiento de.un cultivo
de E. coli se· realizan marcajes con pulsos de 30 s de
-[3H]timidina, la mayor parte: de la radiactividad y, por
ello el nuevo DNA sintetizado, tiene un coeficiente de
sedimentación en medio alcalino de 75 a 115. Estos
nuevos fragmentos sintetizados, llamados fragmen-
tos de Okazaki, son tan sólo fragmentos de 100_0 a
2000 nucleótidos .. Sin embargo, si después del pulso
de 30 s con [3H] timidina, se transfiere el cultivo de E.
coli a un medio no radiactivo (experimento de pulso
y caza), el DNA resultante, marcado radiactivamente,
sedimenta. a una velocidad que se incrementa con el
tiempo que las células han crecido en el medio no
radiactivo. De esta observación, se deduce que los
fragmentos de Okazaki deben haber sido incoporados
covalentemente a moléculas de DNA de mayor ta-
~ . . . . mano.
Okazaki interpretó sus resultados experimentales
en términos de un modelo de replicación semidis-
continua (Fig. 3_1-5). Las dos hebras paternas se repli- ·
can de modo diferente. La hebra de DNA sintetizada de
nuevo, que crece en dirección 5' ,. . 3', al igual que el
avance de la horouilla de replicación, es la denominada
hebra conductora y es esencialmente sintetizada de ma-
nera continua. La otra hebra de DNA sintetizada de
del DNA procariótico, como lo demuestra la deten-
ción de la replicación del DNA en presencia de inhibi-
dores de la DNA girasa, como la novobiocina o el
ácido oxolínico, a excepción de los mutantes en los
que la DNA girasa no se une a estos antibióticos.
1020 Sección 31-1. Replicación del DNA: Introducción
Figura 31.:a _
La actividad exonucleasa 3' _.. 5' de la DNA polimerasa I
, elimina nucleótídos no apareados desde el extremo 3' de la
hebra de· DNA naciente.
.. ·,,
3' Sitio de hidrólisis
de la exonucleasa
3' -. 5'
. ~ ...
e
T
.. 5'
•
• e
•
A G
G
•
•
Bases no
apareadas
extractos de E. coli, gracias a su capacidad de incor-
porar .marcaje radiactivo en el DNA a partir de (14C]ti-
midína trifosfate. Este enzima, - 'denomínado desde
entonces como DNA.polim~rasa I· o P-oJ· 1, es un
único polipéptido de ·928 restos.
Pol I coloca desoxinucleósido trifosf a tos en los moldes
de DNA ~(Fig. 31~1). La reaccion-ee produce por el ataque
nucleoiilico del grupo 3'-0H de la hebra de DNA que
está creciendo sobre el a-fosforilo del nucleóeido trifosfa-
to que. se va a incorporar eñ la siguiente posición. La
reacción es impulsada por la consiguiente etiminación de
un grupo PPi y su posterior hidrólisis por acción de la
pirof <Jsf átasa inorgánica .. La reacción global se parece a
la catalizada por la RNA polimerasa (Sección, 29-2),
pero difiere de ésta -err el requerimiento estricto de
que él nucléotido' entrante debe unirse 'al extremo
3' -OH libre de un polinucleótido que tenga sus bases
apareadas a la hebra molde (recuérdese que la RNA
polímerasa inicia la transcripción por la unión de dos
ribonucleótido trifosfatos sobre una hebra molde
de DNA)1 La cornplementaríedad entre el producto de
DNA·,y el molde fue inferida por vez primera median-
te estudios de la composición .: de bases y de hibrida-
ción, y, con el tiempo, fue establecida directamente
mediante la determinación de la secuencia de bases: ,. ' ,. ,.. . '
El nivel de error de la Poi 1, cuando copia el DNA
molde, es bastante bajo. Ello se demostró por la repli-
cación in vitro del DNA del bacteriófago </>X174, la
cual produjo DNA fágico con plena capacidad infec- . . . ClOSa. .
La especificidad de la P ol 1 · Pº!. la· base entrante,
más -q1ite.:;un mero reccnecímíentc, s~ cree debida a. la
ri~c~s1d~q de· que la nueva "base 'forme un par de bases
de Watson-erick .con el molde (recuérdese que los
"-":"'' :: \. J . lt.
c~at!o: pa~~s dé bases, A'· .T, T · A, G · C y C · e· po-
seen todos' formas casi idénticas; Sección .28-2A): Ello
explica que la Pol I pueda intercambiar la timina sólo
con el S-bromouracilo s- ;y la guanina sólo con la hipo-
xantina. Se dice que la Poi I es procesiva porque
cataliza una serie de p·a.SOS sucesivos de polimeriza-
ción, normalmente unos.Zü o más, sin liberar el mol- . ,. .
de. Por supuesto, la Poi I puede actuar también en
Figura 31-7
La síntesis de DN·A se inicia en s'egmentos cortos de RNA.
5' .
'•
-~5'
'· Fragmento de Okazaki
'\
·'
' '
RNA cebador
\ ... •r11¡·
¡ f
3' .'•• .. . . . . . \ .
l ; • ~ ' . .
5 • j 1111 l j j J j l~ ~: ! i //.
Capítulo 31. Repticación, reparacion y recombinación del "f?NA 1021
(bj
1. 'Puede actuar como exonucleasa 3' -... 5'.
2. ~Puede actuar como exonucleasa 5'--... 3'.
La reacción exonucleasa 3' · • 5' difiere-químicamente
de la reacción de pirofosforolisís 'sólo en que el acep-
tor dce nucleótidos es él H20 en -Iugar 'del PP¡. Sin·
embargo.estudios cinéticos y cristalográficos (ver más
adelante) indican que estas dos actividades catalíticas
ocurren en sitios activos diferentes, La función exonu- ,
cleasa 3' -+ 5' es activada por un nucleótido terminal
en 3', desapareado, eon -un grupeOfí libre. Cuando
la. Poi I incorpora, por.error, un.nucleótido equivoca-
do (desapareadc) en el extremo de la· hebra de DNA
que está creciendo, la- actividad polimerasa se inhibe
y la actividad exonucleasa 3' -... 5' elimina el nucleóti-
do erróneo (Fig. 31-8). A continuación, la actividad
polimerasa reanuda la replícación.del DNA. La, Pol 1,
de este modo, tiene la capacidad de releer la hebra de
DNA que está sint.etiz.ando y corregir.su« -propioe errores.
Ello permite explicar la gran fidelidad de la replica-
ción del DNA, a pesar de la relativamente poca ener-
'
Figura 31 .. 10
Estructura de rayos-X del. fragmento Klenow de la P·ol 1.
(a) Dibujo ge cintas, én el que la discontínuídad entre las
hélices H. e 1 (izquierda) indica la poslelón -de .~ñ .seqmento
desordenado de 50 restos. La d:ivisión enfre,,lós domtníos
pequeño ( verde,} y grande (púrpura) oe la ,,~J)tej"' S0¿~ ·.
encuentra en el lazo entre tasnéuces F l."?: [Se-9ün Ollfs,
L., Brlek, _P., Hamhn, R., XiJOrt.g, N. G. y.,$teitz, T. A., ~ature
313, 762 (1985).] (b) Dibt:Jló. ·de· espaclo-ñeno, basado _en , . ..· ' . . . ,},
parte en fa construcción de moderes; del fragmento ~lflno·w
.. de la Poi I con el - 8-DNA de doble hebra colocado en la
· hendidura propuesta de fijación def DNA (el cristal de Poi I
no ecntíene DNA). La hebra cebadora (verde) acaba en la
región d-el probable sítío actívo d.e la poumerasa, mientras
que la. hebra molde (~marillo) atraviesa el, enzima. ~-Útfa
molécula de d'fM P (púrpura) se muestra urwda,,:en la ·
posición obse.rvada, at. $ttio ~~tivo de ·l~ e.xdnuc1:easa, · · -,
3'-+ 5'. [Por cortesía de Thomas St&ítz, Yá1e~u,h-iversity.]
(a) .
·'
.. _ . ... ·'
•,;,
'
desordenado
de 50 restos
~ . .
Posición del
segmento ,,
" ..,. . .
Poi I puede corregir sus errores
--~ Además de su actividad polímerasa, la :1Jol I tiene
dos actividades hidrolíticas índependíentes: · ,._
. ·~. -
' . .
sentido inverso, degrandando.el DNA mediante piro-
fosforolisis: Esta reacción inversa probablemente no
tiene ningún significado biológico, }'ªª que la concen-
tración i71: - vivo .de PP;, procedente de Ia acción de
pírofosfatasa inorgánica, ·e·s.· muy baja.
~
Fi·gura 31 .. 9 ·
La actívic;lad exonucteasa 5' -+ 3' de la D·NA poíimerasa I
elímlna hasta 1 O nucíeóndos a partir del extremo .5·' de un
corte que .se ha producído en una sola, hebra. El nucíeóüdo.
que $e encuentra inmeclatamente después-del corte puede
estar apareado o no. . -Ó,' ·, Corte en una sola hebra
e
• •
• •
• •
3'
- ; e··.
, , T ' .. --.....,- G
Sitio de hidrólisis
de la exonucleasa 5' ..,.. 3'
1022 Sección 31-2. Enzimas de replicación
La función fisiológica de la Poi I
es la. reparación del DNA
Durante los 13 años que siguieron al descubrimien-
to de la Poi 1, fue comúnmente aceptado que este
enzima era la DNA replicasa de E. coli, ya que no se
había detectado ninguna otra actividad polímerasa.
En el año 1969, esta presunciónfue cuestionada por
Caims y Paula DeLucia, al aislar un mutante de E. coli
en el cual sólo se detectaba < 1 °/o de la actividad Poi
Lnormal (aunque tenía niveles casi normales de acti-
vidad exonucleasa 5' • 3') y que, a pesar de ello, su
velocidad de reproducción era normal. Sin embargo,
esta cepa . mutante era muy sensible a los efectos
dañinos de la radiación UV y a los mutágenos quími-
cos. Era evidente que la polimerasa Poi I desempeñaba
un papel fundamental en la reparación del DNA dañado ·
(modificado químicamente).
El DNA alterado, tal como se describe en la Sección
· 31-5, es detectado por diferentes sistemas de repara-
ción· del· DNA. La mayoría .de ellos cortan, mediante
endonucleasas, el DNA dañado en el lado 5' de la
lesión, activándose la exonucleasa 5' • 3' de la Poi l.
Mientras por un lado se elimina el DNA dañado, por
el otro, la misma Pol I va rellenando el hueco que
resulta en una de las hebras, mediante la actividad
polimerasa. Así, la actividad exonucleasa 5' -+ 3'
se incrementa diez veces cuando la función polimera-
sa está activada. Es posible que la simultaneidad de
las dos actividades de la Poi I, escisión y polimeriza-
do .indican, además, que las hélices J y K se extienden
hacia el interior del surco mayor del DNA. De esta·
forma, queda fijada la orientación helicoidal del DNA
en . el sitio activo de la Poi 1, de una forma muy
semejante a la rosca de una tuerca. Si estas dos carac-
terísticas estructurales son realmente ciertas, el DNA
debería atornillarse, avanzando hacia un nuevo extre-
mo 3', entre las etapas de polimerización.
Con la intención de caracterizar mejor la función
polimerasa de la Poi 1, se cristalizó el fragmento
Klenow unido a un fragmento de DNA, diseñado
para imitar el complejo molde-cebador: un DNA de
8 bp, en el que la hebra molde presenta un segmento
monohebra de 3 nucleótidos que sobresale en el ex-
tremo 5'. La estructura de rayos-X de este cristal
reveló que el DNA, contrariamente a lo esperado, se
une al sitio de la exonucleasa 3' • 5', dejando sola-
mente un segmento visible de 4 nucleótidos (el resto
está probablemente desordenado) que se extiende h~-
cia el sitio de la polimerasa, que se encuentra a "' 30 A.
Ello sugiere que el sitio de la exonucleasa 3' ,. 5'
compite con el sitio de la polímerasa por el extremo 3'
del DNA. recién sintetizado (Fig. 31-11). Como sea.
que el sitio de la exonucleasa puede fijar únicamente .
DNA monohebra, cuando el extremo 3' está desapa-.
reado y provoca por tanto la fusión del DNA,.favore-
ce claramente la unión de la hebra de nueva síntesis
al sitio de la exonucleasa. De esta forma, los errores
de apareamiento son eliminados durante el proceso
preferentemente ..
La actividad polimerasa y las dos actividades
exonucleasa de la Poi I tienen lugar en sitios
activos distintos
La actividad exonucleasa 5' • 3' de la Poi I es
independiente de las otras dos, exonucleasa 3' ,. 5'
y polimerasa. De hecho, como hemos. visto en la
Sección 28-6C, algunas proteasas como la subtilisina
o la tripsina digieren la Poi I en dos fragmentos: el
fragmento grande o fragmento "Klenow" (posiciones
324-928), en el cual se encuentran las actividades
polimerasa y exonucleasa 3' • 5', y un pequeño
fragmento {posiciones 1-323), que contiene la activi-
dad exonucleasa 5' ,. 3'. Así, la Poi I contiene tres
sitios activos en una sola cadena polipeptídica. \
La estructura de rayos-X del complejo formado por el
fragmento· Klenow y el dTMP, determinada por Tho-
mas Steitz, indica que esta proteína está formada por
dos dominios (Fig. 31-lOa). El dominio pequeño fija
dTMP, cuyo fosfato 5' interacciona con dos iones
metálicos divalentes. El sitio de fijación de dTMP
forma parte de la exonucleasa 3' • 5'. Ello se demos-
tró por la ausencia de esta actividad, y no de la
actividad polimerasa, en un fragmento Klenow mu-
tante, modificado por ingeniería genética, que carecía
de los sitios quelantes de iones pero que, por lo
demás, poseía una estructura normal. El dominio.
grande (a partir de la hélice G, en la Fig. 31-lOa)
.posee una hendidura prominente, el sitio activo de la
polimerasa. La construcción de modelos indica que
éste tiene el tamaño y la forma apropiados para unir
una molécula de B-DNA, en una forma que recuerda
. a una mano derecha agarrándose a una barra (Fig. 31-
10b ). Un segmento de la proteína, constituido por 50
restos, que saldría del pulgar de la mano imaginaria
(hélices H e I en la Fig. ·31-tOa), no es visible en la
estructura de rayos-X y, por ello, se cree que posee
una conformación desordenada. Steitz ha sugerido
que este fragmento está unido de una forma flexible a
la proteína, cerrando el cuarto lado de la hendidura
cuando ésta contiene DNA. Este mecanismo podría
reducir enormemente la velocidad de disociación del
DNA de la polimerasa, explicando así el carácter pro-
cesivo observado en la Pol l. Los estudios de modela-
gía libre que posee una única interacción por aparea-
miento de bases (los aspectos energéticos de la.
fidelidad en la unión se discuten en la Sección 30-
2C). El coste de esta elevada fidelidad es que "' 10 °/o
de los nucleótidos incorporados correctamente son
también eliminados.
Cuando actúa como exonucleasa 5' • 3', la Poi I se
une a los puntos del DNA dúplex que presentan
muescas en una sola hebra, independientemente de
las caracteristícas del nucleótido en 5' (5' -OH o grupo
fosfato, apareado o no). La Poi I corta el DNA en una
región apareada próxima a la muesca, degradándolo a
mononucleótidos u oligonucleótidos de hasta 10 res-
tos (Fig .. 31-9). En cambio, la actividad exonucleasa
3' .- 5' elimina únicamente los mononucleótidos des-
apareados con grupos 3' -OH libres.
Capítulo 31. Replicación, reparación y recombinación del DNA 1023
Figura 31-12·
Traslación de muesca catahzada por la Poi 1.
:: . ~ u 1· 1 l li ll) LLH. IJlJlltil Ull{ll 11 rf UH 11 U n:· ::
' " ,y '
Monon ucleótidos <: ;, - ;:...¡· 1 .
¡/-,~
. ·" ' DNA polimerasa I
··, Muesca dNTPs. ·-.-. ,.
La "p~i (11. -e~·· la .:,pNA replicasa de É. coli · . ,
Lainterrupción de la ,replicación.del ·oNA en mu-
tantes dé .frolC, sensibles a latémperatura, por encima
de la temperatura restrictivaIalta) demuestra que ·1a
Pol III es la DNA replicsea 'de E. coii. Este enzima tiene . , .
. .,,: ·,
v-
' '
,, El descubrimiento de mutantes de ,E. coli, ,c~p.aces
de crecer normalmente, con-una escasa actividad· Pol
1;·_estímilQ la búsqueda de otras-actividades.polimeri-
zantes del- ~DNA .. Este esfuerzo :S~,· vio recompensado
cuando, s~ encontraron dos .enzimas más, designados
según .,.,~J orden de su descubrimiento, DN,A .. políme-
rasa 1.1· (P~,-·11). y DN~--,~p~Iim-érása. m (Poi 111). Las
propiedades q.e estos enzimas s~· comparan con las de
já" jft!}f_~f;«fn _la Ta};rlfl, 3.~ -.1 .. La, Pol 11 _ y la Pol III no 5-e
h~í~p ·-4~¡~t~d~0 'Con: anterioridad debido a qu·~- sus
actividades conjuntas, -éñ las- condiciones utilizadas,
son normalmente < 5 9/o de la actividad· PÓl 1:
Los mutantes que carecen, de actividad .. Poi II no
presentan ningún def ecto. a parente. 'Se .desconoce, por
tanto, la función fisiológica <l~, la, ~ól II, si la· tiene.
~ , /
B·. DNA .polímerasa 111
"· ..
ción cromosómica), Así, la Poi I es indispensable en la
replicación del DNA de E. coli, aunque, de una manera
;,
diferente a 'la que se suponía en un ¡#incipio.
,
ªNucl~ótidos polimerizados · mip-1 · molécula"! a 37 ºC.Fuente: Kornberg A.,. DNA Replicaiion, p. 169, Freeman (1980).
,.
,
Exonucleasa: 5' --. 3,.
109 120 140
400 ? 10-20 •
600 30 9000
. polA polB ' polC .,
+ ' - +
+ + +
.+/ +· , +
+ ' +
Masa (kD)
Moléculas/ célula
Número de recambio-
Gen estructural
Mutante leta1 condicional·
Polimerización: 3' --. S.'
Exonucleasa: 3'·--. 5'
Poi 11 Poi 111 Poi I Propiedad
, . ' .
. La función físíológíca de la exonucleasa 5' -+ 3'
de la Poi I es la eliminación de los cebadores·
;¡, .- ' ,!
de RNA
La exonucleasa 5'-. 3' también eiimina los cebadores ,
de RNA ,de los extremos 5' y rellena los huecos resuitan-
tes con DNA sintetizado de nueoo., La- importancia
de, esta función fue demostrada por el aislamiento de
mutantes de E.. coli .sensibles a la temperatura, los
cuales no son viables ni muestran, actividad exonu- .. ' ,(
cleasa 5' • 3' a la temperatura restrictiva de =: 43 .?C
(el bajo nivel de actividad polímerasa de la cepa
mutante en Pol I aislada por Cairns y Del.ucia es, al
parecer, suficiente para llevar a .. cabo este proceso
fundamental de rellenar los huecos durante la replica-
.. . .
La Poi I cataliza la traslacíén de muesca-. : _-< ;, ·
Las 'actividades exonucleasa 5' ,·,r ~q; i~~~asá'":
de la P0.l I pueden, conjuntamente. sacar :.y· colocar ·
nuevamente los nucleótidos .. en el lado 5' de un corte,'
que ·se, haya producido en una de las hebras de un
PNA que,, por lo demás; aparece intacto. ,.Estas reac-
ciones,. de hecho, trasladan (mueven) la mues-ca hacia
el extremo· 3' de _la hebra de DNA .sín alterar, :por lo
demás, la molécula (Fig. 3.1 .. 14). Este p(oc.e.so de tras-
lación de muesca (''n'ick. translatíon"), en. presencia
de desoxinucleósido trifosfatos marcados, es utilizado . -
enla síntesis de DNA altamente radiactivo (las mues-
cas pueden ser, generadas por tratamiento del DNA
con pequeñas cantidades de DNasa I <pancreática) ...
-~ ~
ción, proteja al DNA de la acción de las nucleasas
celulares, que podrían dañar aún más al D,NA abierto. · . .
. . . .,
'
Figura 31-11
Modero esquemático del. fragmento Klen-ow con· el DNA ,
unido a (a) et sltío- activo de la polimerasa; .. y (b) el sitio .
activo de la exonucleasa 3' -+ 5'. Para desplaaarse del· ·
sltío activo de · 1~ .poümerasa al de la exonucleasa, el ·
extremo 3' de ía l;lebra, .hija (rÓjo) debe recorrer ta' loógitud
9.e cuatro nucleótldosde DNA dé doble h~pra ·y cuatro.de
DNA' mononebra, l..~ hebra molde está dibuJa~a en
azul. '[Según Freernont, P. S., Friedman, J. M.,' Béese, ·L. s.,
ª'-~Qae-rsa1:1-,. M . ·R. y Steitz, T. A. Proc Na-tJ: Aoea. s« 85,
8927 {0198.8)~] . . . · /
·, ,, .:
Sitio activa· ,
de la exonucleasa
,
,· l •1,
de la poltmerasa Propiedades de las DNA polimerasas de E. coli
Tabla 31-1 Sitio activo (a)
1024 Sección 31-2. Enzimas de replicación
Fu-ente: Kornberg, A.~ DNA Replicaiion, 1982 Supplement, p. 583,
Freeman (1982) y DNA Replication p. 2,83,, Freeman (1980). ·
Proteína Rep ' Monómero 65 50
Helicasa 11 Monómero 75 6000
SSB Tetrámero 19 80·0
' .
Figura 31-13 · ., .
DesenroUamiento del DNA por la acción combinada de.la
proteína Rep., la helicasa II y la proteína SSB. L~ proteína
Rep se mueve a lo largo del ~olde de la he~ra cond~ctora
en dirección 3' .... 5', acampanada por la hehcasa II en el
molde de la hebra retrasada, moviéndose en'. dirección
5'-+ 3' ~ La unión de la proteína SSB impide la nueva ·
hibridación de tas hebras del o·NA previamente separadas.
Proteína Rep
Proteína
Tabla 31-3
_Proteínas desenrolladpras y de unión al ·DNA en E., coli.
Estructura Masa en Moléculas
subunidades subunidades (kD) célula
Hebra retrasada
•"- • Movimiento de la horquilla
Hebra conductora
5'
SSB
/ Helicasa
3'
una composición de subunidades del tipo a·E0, donde
a, el producto del gen polC (Tabla 31-2), contiene la
función polimerasa. Las propiedad~_s c~taiític~~ de la
Poi III se asemejan a , las¿ de, la Pol 1 (Tabla' 31-1 ),
excepto por ·la imposibilidad de ,,~a primera de replicar
DNA monohebra unido a un cebador o DNA dúplex
cortado en una de sus hebras. De esta manera.. la
Poi 111 actúa in vitro sobre huecos de < ÍOO~nÚ{:lei>.t!-
dos en una sola .hebra, situación que recuerda el
estado del PNA dentro de la.horquilla de replicación.
La función exonucleasa 3' -+ 5' de la· ·Pql III, qu·e
reside en la subunidad s gel .. enzima, es la. principal
correctora del DNÁ durante la replicación; esta fun-
ción aumenta hasta 200 : veces la fidelidad . del
enzima en la replicación. Sin embargo, la actividad
exonucleasa 5' ,. 3' de la Pol III actúa.únicamente
sobre DNA monohebra, razón por la cual no puede
catalizar la traslación de muesca.
La Poi 111 actúa in vivo como un complejo enzimático
lábil, el holoenzima de la Poi 111, formado como míni-
,,
C. Helicasas, proteínas de unión y DNA
ligasas
El holoenzima de la Poi III, a diferencia de la Pol-,I,
no puede desenrollar el DNA dúplex. Así pues, es
necesario el trabajó coordinado de tres proteínas, la pro-
teína Rep, la helicasa 11 ··y la proteina de unión al
DNA monohebra '(SSB) (Tabla 31-3); para desenrollar
el DNA antes del avance de la horquilla de· replicación
(Fig. 31-13), en un proceso que es impuieado por la
hidroíieis de ATP. La proteína Rep, producto del gen
rep de .E. coli, separa Ias hebras del DNA dúplex.
avanzando a lo largo de la hebra conductora del DNA
mold·e en dirección 3'-+ 5' y consumiendo, al mismo
tiempo, dos ATPs por cada par de bases separado. De-
modo parecido, la helicasa II se desplaza a lo largo
de la· hebra retrasada del DNA molde en dirección
5' .. , 3'. La observación ·de que, en los mutantes rep ,
únicamente se reduce la velocidad de la replicación
sugiere que la proteína· Rep y la helicasa II trabajan
juntas en la horquilla de replicación desenrollando el.
DNA. La unión de la proteína SSB impide hibridar de
nuevo a las hebras de DNA·u.na vez separadas, detrás
del pa.so de ta helicasa. Un .gran número de copias de
esta proteína tetramérica recubren cooperativamente
el DNA monohebra, manteniéndolo así desapareado.
Obsérvese, sin embargo, ·que el DNA debe ser despo-
jado de proteínas SSB antes de que pueda ser replica-
do por .el holoenzima de la Poi 111 ..
' ªComponentes del la Poi III. <, •
bLas subunidades y y 't son codificadas por la misma .s~cuenc1a
génica; la subunidad y comprende el extremo N-terminal de la
subunidad 't.
Fuente: McHenry, C. S., Annu. R:-ev. Biochem. 57, 538 (1988).
Tabla 31-2
Componentes del holoenzima de la
DNA polimerasa 111
mo por .sieie tipos de subunidades .(Tabla 31-2). Las
últimas .cuatro subunidades de la Tabla 31-2 actúan
como moduladoras de la actividad de. la Pol III. Por
ejemplo, Ja fijación del holoenzima de la Pol III a un
DNA molde, con un cebadorunido, requiere la hidró-
lisis .de ATP en -una reacción catalizada por la subuni-
dad ~· Mediante esta reacción, el holoenzima queda
sujeto al molde de DNA, formando un complejo que
puede progresar _por la doble hélice de una- manera
casi .indefinida (> 5000 restos). En cambio, la Pol 111
por sí sola, que no hidroliza ATP, tan sól~ es capaz ~e
avanzar de 1·0 a 15 restos. Parece como si las subuni-
dades del holoenzima, distintas de la Pol 111, propor-
cionaran algunos, de los sitios de interacción con otras
proteínas participantes en la replicación del DNA
(Sección 31-3).
Masa (kD) Gen estructural
130 polC (dnaE)
27,5 dnaQ
10 Desconocido
71 dnazxb
52 . dnazb
32 Desconocido
40,6 dnaN
Subunidad
Capítulo 31. Replicación, reparación y recomoinación del. DNA 1025
o
.......... -, 11
0-P-0
1 o-
Figura 31-14
Reacciones catalizadas por la ligasa de E. · colí. En las DNA
ligasas de eucariotas y del fago T4, el NAO+ es sustituido
por ATP, con lo que, en el ·primer paso de la reacción. se ·
elimina PP; en lugar de NMN+.
-•AMP
3
E~Lys-NH2
A. Bacteriófago M13
El bacteriófago M13 posee un DNA circular mono-
hebra de 6408 nucleótidos, conocidocomo la hebra
vírica o(+). Tras la infección de una célula de E. coli,
esta hebra dirige la síntesis de su hebra complementa-
ria o(-), formándose el DNA dúplex circular, llamado
forma replicativa (RF), pudiendo estar en la forma
superenrollada (RFI) o relajada (RFII). Este proceso
de replicación (Fig. 31-15) puede ser tomado como
· ejemplo de síntesis de la hebra conductora en el DNA
dúplex.
Cuando la hebra(+) de M13 entra en las células de
E. coli, es recubierta por la proteína SSB, a excepción
de un segmento palindrómico de 5 7 nucleótidos que
forma una estructura de horquilla. La RNA polimera-
sa, en un proceso que requiere la subunidad CJ para el
reconocimiento del sitio de iniciación (Sección 29-28),
comienza la síntesis del cebador seis nucleótidos an-
tes de la estructura de horquilla y extiende el RNA de
20 a 30 restos, formando un segmento . de dúplex
híbrido RNA-DNA. El DNA, que resulta desplazado
+ E-Lys-NH2
o
+ 11
E-Lys-NH2-P-O-R-l\.
1 . o-
Los bacteriófagos se encuentran entre las formas de
vida más simples y los mecanismos de replicación
de su DNA reflejan claramente este hecho. Gran par-
te de los conocimientos sobre el mecanismo de repli-
cación del DNA procede del estudio de este proceso
en diferentes fagos. En esta sección, examinamos la
replicación del DNA en los colifagos M13 y ct,X174 y,
después, consideramos la replicación del DNA en la
misma E. coli. La replicación del DNA eucariótico se
tratará en la Sección 31-4. 2
3. MECANISMOS DE
REPLICACIÓN PROCARIÓTICA
o o
· 1r 11
+ N-Ii~o-:p-Q~P:-O-R-A
. 1 1 -o o-
1 NAD+
-• NMN+
• •
E-Lys-NH2
un aducto fosfoamida poco común que es, sin em-
bargo, fácilmente aislado.
2. El grupo adenilo del enzima activado es transferi-
do al extremo 5' -fosforilo de la muesca, formándo-
se DNA adenilado. En este caso, el AMP se en-
cuentra ligado al nucleótido en 5' a través de un
enlace pirofosfato, en lugar del habitual enlace fos-
fodiéster .
3. La DNA ligasa cataliza la formación .de un enlace
fosfodiéster, por ataque del grupo 3' -OH sobre el
grupo 5' -fosforílo, cerrando así la muesca y libe-
rando AMP~
Las DNA ligasas que requieren ATP, como las eu-
carióticas y la del fago T4, producen PP¡ en la primera
etapa de la reacción, en lugar de NMN+. la ligasa de
T4 tiene, además, la peculiaridad de que, a elevadas
concentraciones de DNA, es capaz de enlazar dos
DNAs dúplex (ligación de extremos romos), reacción
sumamente importante en ingeniería genética (Sec-
ción 28-SB).
La DNA ligasa cierra los cortes producidos
en una de las hebras del DNA
La Poi I, como se ha visto en la Sección 31-10,
sustituye los cebadores de RNA de los fragmentos de
Okazaki por DNA, mediante la traslación de muesca.
Los cortes resultantes en una de las hebras, entre doe
fragmentos de Okazaki adyacentes, así como en el DNA
circular después de la síntesis de la hebra conductora,
. son cerrados en una reacción catalizada por la DNA
ligasa. La energía libre requerida para esta reacción
es obtenida, dependiendo de la especie, a través de la
hidrólisis acoplada de o bien NAO+ a NMN+ + .AMP,
o bien ATP a PP; + AMP. El enzima de E. coli, un
monómero de 77 kO que utiliza NAO+, cataliza la
reacción en tres etapas (Fig. 31-14 ):
1. El grupo adenilo del NAO+ es transferido al grupo
s-amíno de un resto de Lys del enzima, formando
1026 Sección 31-3. Mecanismos de replicación procariótica
6. LaPol Lelimina-Ios cebadores y Íos reemplaza por
DNA. A continuación, la DN,A ligasa conecta 'los
.
2. Las proteínas i, DnaB y DnaC se añaden a este
complejo, proceso que requiere ATP, formando el
preprimosoma. El preprimosoma, a su vez, une la
primasa, convirtiéndose en primosoma. ',
3. El primosoma es empujado en.la dirección S' --. 3',
a lo largo de la hebra (+), gracias a la hidrólisis de
ATP catalizada por n'. Este movimiento, que des-
plaza a la SSB de su camino, lleva una dirección
opue~ta a la de lectura de la hebra molde durante
la elongación de la cadena de DNA .
4. En sitios seleccionados al azar, el primosoma in-
.. vierte Ia dirección de su migración, mientras que la
primasa sintetiza un cebador de RNA. La ini-
ciación de la síntesis del cebador requiere la parti-
cipación de la proteína DnaB que, mediante la
hidrólisis concomitante de ATP, se cree q\le modi-
fica la conformación del DNA molde, favoreciendo
la acción de la primasa.
5. El holoenzima de la Pol 111 extiende los cebadore-s,
formando fragmentos de Okazaki.
. ~ "'
La replicación de la hebra (-) de <J,X174 es
un ejemplo de síntesis de la hebra retrasada
La síntesis de la hebra (-) de ·<J,Xl 7 4 tiene lugar
mediante un proceso de seis etapas (Fig. 31-16 ):
l. La secuencia de reacciones se inicia de la misma
.>
manera que en el caso de Ml3-: la hebra (+) es
recubierta con la proteína SSB, exceptuando una
estructura de horquilla de 44 nucleótidos <;erca_ de
. la ,posición 2300. A continuación, una secuencia de
55 nucleótidos que incluye la horquilla es recono-
cida por las proteínas n, . n'y n", que se unen a
ella.
() complejo. proteico de casi 600 kD, conocido como
prímosoma (Tabla 31-4).
r
,
• • pr1:rpasa, se conoce como prepnmosoma.
Fuente: Kornberg, A.~ DNA Replication, 1982 Supplement p. 5123,
Freeman (19-82). · ._
• ªEl complejo .de todas las proteínas del primosoma, excluyendo la
· 50
20
100
50
80
70
n Dímero 14
• .
' .
n' Monómero ,( . , 76 . '
n'' Monómero 17
..
• Trímero 22 l
DnaB Hexámero 50
DnaC Monómero :,;., 29 , ., •
Primasa Monómero 60
Estructura , Masa "en Molécuías
·,..·.:
subunidades subunidades (kD) célula: ,, Proteína
., ·; .. ,.
'
'·}j
·,.
Proteínas del -primosomaª
Tabla 31-4
Figura 31-15
Síntesis de la hebra(-) del DNA de M13 sobre un molde de
h·etrra ( +}:, ·!2r"!á·qd0:.seí é1;~Ñ& ?.~e:;.l~'~R_F~- dé,. \M13: · ~ . r ·~
• )' . ~.1 ·~·. (j, .. ';';- .... . " / .~ ,., ~ •. ~· ~·
~ • sr; Ó, ·~¿. ·.,. _e;." . '. :.,• l. .,
' j 7" •: ', .: ;~ ::-, '.º:•';?~ :·_.;• ~-~:;:;, '?,t:':;~F;:, :·~~~/Ó·,:;.·:· ': '; .,,;;,:• ~);>:~:.f: "'/ , ' :
de l_á rrorq1}i!f~Íi·f,{§~::t~~q~~~~t.ó~1P.,9-tJ-á;p~°*~\rt~ Ss~B., dé
forma q~e. fÚ~~d€ftia·~~1~1~tp~li~~f~2fr)l~$~ ?'ª -laposi-
ción .de S~Bf:t-e1'.illfil."\a:';I~t¡·ysíntesis_;d~l~ cf~tta4Q.r~J~A contí-
nuaeión, eff~~Ó:~~~~~ide-fla~P<:':J:)11 ~~ttfettdi(el ééll~;
. dor óe .: RN,A:~·ª:Tt:ede(fót:~ ~del : .. _círé'tifó-, f0itna-nd-i1t:::la/ ·ii;e-
. ·,-~ "". :iy- ""..,; .. . ' ""· -.,.~'. . . . . . •···¿, .· ;.: , _-;
bra" (~)~ El t,é'~láaa9;r;(e~ ;~~:íminJd01>:F:ór.:ttiasf~i9~:,,-~de
muesca, cátaliiáda:;ptlr;la .Pól(:-:é" :¡~r:11):ál)do~é"_:.á,si·.:RfII~
que-es, ffpnyertíd·a_,,a · E:f~·,po;r k~l~cct~fl,"sg~uéncíal de la
ON A ligas:a~:y 'de, la, ,.DNA 'giiasa.\ ~ : · .. .. r" . · ·..' ·.. "', e, :-/_-. . ,: ,; ~ ·, ,
•• ..« : : • , • ·-. ··:: f-. '>· i : · · :: : ;_ .: ,,_ ' ~ .f:: ;i;;;::·i~F~- '. ..
B~ .· ·Bacteriófago cpX174r: <"' ·~ -: -: ·. ,· .:. ,.r. •• • ,," .. •· ·:. :: •••
El bacteriófago </>X174, al igual que M13, contiene
un pequeño_bNA circular monohebra (S38:6 nucleóti-
dos). Curiosamente, Ia conversión ··in "oino _del DNA
vírico de. </>X 17 4 a su forma replicativa es un pro.ceso
mucho más complejo que en el ca-so de M13. La
replicación de </>X174 requiere la participación ele un
' •.
'
.. .... ,< . .
. .
»e: DN·A . ~
de la RFL
de M13
1. Repticacíón del DN·A por la Pol. III.. .,
·2. Eliminación del R·NA Y, llenado del hueco
resultante por la Pol l.
3. Sellado de la unión por la DNA ligasa
4. Superenrollamiento por la DNA girasa
•. .... ... .,.
. ... ..
/ '
,·
RNA polimerasa
5'
/
3'
: Hebra ( + )- · ' ·
del DNA de M 13
SSB
/
Capítulo 11. Replicacion, reparación y recombinacién del DNA :}027
Fig,ura 31-1,7~, ., - ~.· --"'·· ':>, ·, · ,· •• ·.;·\,. __ , · ·•
Micografi~ eJectrónic~ de un prímoaorna unido al DNA
de ta RFI del fago <J;X'17 4. ~stps complejos slernpre
contienen un único prímosornaasociado a uno o dos
pequeños lazós de ·DNA. '[Por 'cortesía de Jack Griffith,
Líneberqer Canc.er Research Ce,nter; University of North
Caroljna.]
,,,. .. ..
2. Seguidamente, la proteína Rep (Sección 31-2C) se
une a la hebra(-), a la altura de la proteína del gen
A y, con la ayuda del primosoma que continúa
asociado a la hebra ( + ), empieza a desenrollar el
DNA dúplex a partir del extremo §r de la hebra ( + ).
La.hebra.f+) desplazada es recubierta con SSB, lo
cual .irnpíde su reasociación con la hebra (- ). La
proteína Rep resulta esencial en la replicación del
DNA de <t>Xl 7 4, a diferencia de lo que ocurre en el
cromosoma de E. coli, tal como se demuestra por la
incapacidad de <t>Xl 7 4 para replicarse en células de
La replicación de la hebra(+) de <t>X174 sirve
como modelo para la síntesis de la hebra retrasada
Una de las hebras de un DNA dúplex circular se
puede sintetizar siguiendo el modelo del círculo ro-
dante o replícacíón o (llamada. a-sí por el parecido
de la estructura replicativa con la letra griega sigma;
Fig. 31-18). La hebra (+) del fago <t>X'174 se sintetiza
sobre un molde de RFI, mediante una variación de este
proceso, el modelo del circulo rodante con lazo
(Fig. 31-19): .
1. La síntesis de la hebra ( +) comienza con la unión,
asistida por el primosoma, del enzima codificado
por el fago, proteína del gen A (60 kD), a su sitio
de reconocimiento de ,.._ 3-0··~p. Una vez allí, la
proteína del gen A corta específicamente el enlace
fosfodiéster 'que precede el nucleótido 4306 de la
hebra, ( + ), formando un enlace covalente con su
grupo 5' -fosforilo,. lo que conserva la energía del
enlace roto. · · , --
~
fragmentos y la DNA girasa les confiere su estruc-
tura superenrollada, formando la RFI de <t>Xl 7 4 .
El primosoma permanece formando un complejo con
el DNA (Fig. 31-17), situación en la que participa en
la síntesis de la hebra (+),(ver más adelante)"
Figu:ra 31-16
Síntesls de la. hebra (-) del fagq .l/>X174 sobre un molde de,
hebra ( + ), formándose el DNA de la RFÍ de <t>X17 4. [Según
Arai, K .. , Low, R. Kooort, J .. Schlomar, J .. y Kornberq, A.,
J .. Biol~ Chem. 25~., 5280 (1981 ).]
. ": ,.
,.
I k
'
RFI
'
6. Escisión
llenado del hueco,
ligación,
superenrollamiento
/
..
F?ol I, ligasa,
girasa
4d NTPs, NAO+ . .
'
' ..... ·· RFII 5 .. Elongación
Holoenzíma de la DNA
polimerasa III, 4d NTPs
,
¿.
/. > ... .•• ' J :. l ",,- " •
/• ·. \ ,;. - ., ' ' . r e ... i ' .
v •·.
'
ADP +'Pi._. ,·_-
•
,, 4. Inicio
ATP
•
3. M lgraclón
•••• •••
., Pr: mosoma
"
2. Ensamblaje .~.
• • •• /'
.---· Pri masa
i, DnaB, DnaC, Proteína I!• -- de unión a
monohebra
(SSB)
n, n', n"
,.
l. Reconocimiento
•
1028 Sección 31-3. Mecanismos de replicación procariótica
•
. . . . ; .. ' ,.
ó •
. . ...
' . .
' .
'
', ( +)
·~
5'' g .. ~
~
.. . ,
, -; , .. '
v
(+)
El cromosoma de E. coli se replica desde un único
origen de replicación, siguiendo el modelo. e bidireccio-
nal (Sección 31-lA). El modelo más plausible para los
sucesos que tienen lugar en la horquilla de replicación
de E. coli (Fig. 31 ... 20) proviene, en gran parte, de
estudios sobre los mecanismos de replicación del
DNA de colifagos, tales como M·13 y <t>Xl74, mucho
más sencillos y más abordables experimentalmente.
El DNA .. dúplex es desenrollado por la proteína Rep,
en la hebra conductora del molde, en colaboración
con la .. helicasa II y el primosoma, en la hebra retrasa-
da. Una vez separadas, las dos hebras sencillas son
recubiertas inmediatamente por SSB. La síntesis de la
hebra conductora está catalizada por el holoenzima
de la P-01 III, así como la síntesis de la hebra retrasada
después del cebado por la primasa asociada al primo-
soma. Parece ser ·que tanto la síntesis de la hebra
conductora como de la hebra retrasada tienen lugar
en una única partícula multiproteica, el replísoma,
De esta forma, la hebra retrasada adquiere una estruc- ·
tura de lazo (Fig. 31-20). Después de completar la
síntesis de vn fragmento de Okazaki, el holoenzima
situado en la hebra. retrasada se traslada a un nuevo
cebador cerca de la horquilla de replicación. El ceba-
'
Figura 31-18 , · · .
Modelo del círculo rodante de. repucacíón del D·NA. La .
hebra (+), que está siendo slntetlzada, es extendida .·
desde .un corte específico realizado en el origen de ,
replicación (1 ), desplazahdo la antiqua hebra ( +) (2 y 3).
La síntesis continua de ta hebra ( +) sobre un molde de
hebra (-) circular produce una serie de hebras ( +) uni-das
en tándem (4); las cuales pueden ser separadas más
e,
tarde mediante u·na endonucleasa específica .
5' ~
4
• , .
:.:.
C. E. coli
(+)
- Origen
1
(+) {"-1
. R
\ #
~
.,
,.
(+)
5'
..
4. Una vez que la proteína del gen A ha dado toda la
vuelta al círculo siguiendo la hebra(-), realiza un
nuevo corte específico en el origen de replicación,
con el fin deunirse covalentemente al extremo 5'
de la nueva hebra ( + ). Simultáneamente, el grupo
3' -OH terminal recién formado de la antigua hebra
(+),·la cual forma parte del lazo, ataca nucleofílica-
mente el enlace 5-fosforilo .con la proteína del gen
A, liberando así la hebra(+) cerrada covalentemen-
te. Resulta evidente que la proteína del gen A debe
tener dos sitios activos que se alternan en su unión
a los extremos 5' de las sucesivas hebras ( +) sinteti-
zadas. La horquilla de replicación progresa alre-
dedor del círculo dúplex, produciendo nuevas he-
bras (+).
p
En las etapas intermedias de una infección por el fago
<t>Xl 7 4, cada hebra ( +) recién sintetizada dirige la
síntesis de la hebra (-)1 formando la ·RFI como se ha
descrito anteriormente. Sin embargo, en los últimas
etapas de la infección, las nuevas hebras(+) se empa-
quetan dentro de las partículas víricas ..
'
(+)
E. coli rep=. El holoenzima de la Poi 111 extiende la
hebra ( +) a partir de su grupo 3' -OH libre.
3. El proceso de extensión genera un. círculo rodante
con lazo, en el cual el extremo 5' de la antigua
hebra(+) permanece unido a la proteína del gen A
en la horquilla de replicación. Se cree que, a medi-
da que la antigua hebra ( +) se separa de la RF, el
primosoma sintetiza los cebadores que se necesita-
rán para la generación posterior de una nueva
hebra (-).
' '· ' .• •.
3' 5'
~~. i
1
Capítulo 31. Replicación, reperacién M ricombinación del DNA 1029
. .
. ..
• < -
'·
' . .
,·
~ SSB
. .
(+).
2. A·. continuación, las subunidades de la proteína
DnaA abren sucesivamente las hebras de tres seg-
. mentos ricos en AT, repetidos en tándem, de 13 bp
.,(i·a . secuencia consenso es 5 '-GA TCTn TTn TTTT -3 ',
donde n indica 'posiciones no específicas} y locali-
zados cerca del límite "izquierdo" de oriC. La exis-
tencia del complejo abierto resultante, de ;-o..; 45 bp,
se estableció a partir de la sensibilidad a la nuclea-
sa Pl, una endonucleasa específica para hebras
sencillas. La formación de este complejo abierto
requiere la presencia de la proteína DnaA y de
A TP (el cual es fuertemente unido p,or la proteína
Dna.A, · hidrolizártdolc enuna 'reacción dependien-
te de DNA)º y·i tiene lugar únicamente por encima
- de 22'°C (~1 menos, in oitro }~ No.cabe duda que la
riqueza en. A 'f de.Ias repeticiones de 13 bp -; facilita
el proceso de. .separación de _las hebras del DNA.
3. Después.ila proteína DnaA'guía un complejo for-
,. mado , por las- proteínas Dnall y D.naC 'hacia la
región :_con ~el ·o·NAv.abiertp-,·'_formando el 'denomi-
nado complejo pre-inicíador. e • • •
.... ~-
:-..>,, .;,,
4 .: En presencia de SS.B y dé girase, la proteína Dnaü,
- .que posee actividad helicasa, desenrolla aún más
,, el DNA .en el €otnplej.o pre-iniciador- en .ambas
direcciones, permitiendo así la entra-da de la pri-
masa y de la R~NA polímerasa .. ,;·~Ea(pa~ticip.a.ción de
ambos .enzimas en la síntesis-de los cebadores .. de lahebra conductor-a (Sección 31-,.1 D}, junto con la - li-
mitación de .este. procese, al sitio ori'C, sugiere· que
la RNA .polirnerasa 'debe activar .. a la prirrrasa-para
que ésta sintetice al cebador. Ello podría explicar· la
' ..
Figura 31~19 · r •• '"
Síntesi-s d·e la hebra (+) del fago <t>X174 medtante el '
rnodetooel 'Círculo rodante con lazo.
'
Rep, SSB,
. . . P.ol III, etc. ' 2·
'
.,
•'
Origen
. . Proteína del gen A
. /5, ~
3'
,
La replicación del DNA de E. coli se inicia
en oriC por un proceso. mediado por la proteína
DnaA ·.
El origen de replicación 'del cromosoma de E. coli
consiste en un único. segmento de 245 bp, conocido
como el locus oriC. Esta secuericfa, cuyos segmentos
están muy conservados entre . las bacterias gram-
negativas, sostiene la replicación. bidireccional en los
diversos plásmidos. en que ha sido insertado. Basán-
dose en experimentos con estos plásmidos, Kornberg
'propone que el inicio de replicación en E. coli ocurre
siguiendo el siguiente proceso que consta de varias
etapas (Fig. 31-21):
l. La proteína DnaA (52 kD) reconoce y se une hasta
a cuatro repeticiones de 9 bp en oríC, formando,
como indican los experimentos de protección fren-
te a DNasal y microscopia electrónica, un complejo
con el ~DNA de oriC superenrollado negativamen-
te, que envuelve un núcleo central de 20 a 40
monómetros de la proteína Dna.A.: Este proceso
viene facilitado por la proteína HU, semejante a
las histonas. ,, -: •. ·' . '
)
(~-":P
'
1
dor que encabezaba el fragmento de Okazaki previa-
mente sintetizado es eliminado mediante traslación
de .muesca. catalizada por la Pol I, y la muesca se
cierra por acción de la DNA ligasa. RF I con pri rnosoma asociado
1~30 Sección 31-3~ Mecanismos de· replicación procariótica
\
Helícasas de E. coli · · - -~ · 2. ·" r
Se conocen· diez enzimas -: de E·: coli que poseen
actividad helicasa, Cada uno de ellos parece tener en
la célula una función específica dirigida a facilitar
pro~esos como la replicación, reparación y recom-
binación del DNA, así como también la transcrip-
'
Todo está.~ punto p~r~ la ~~-ftlic~ci99 bídíreccíonal
del DNA mediante el holoenzima de la Bol, III, tal
como se ha descrito anteriormente. e "~
. ,~ ~·
ción del RNA. Estos enzimas, los cuales son todos
ATPasas dependientes de DNA monohebra, incluyen
_la proteína UvrAffC, que participa en la reparación
por escisión del ,DNA (Sección 31-SB), la proteína
RecBCD, que interviene en la recombinación general
(Sección 31-6A), el factor rho, el cual finaliza la trans-
cripción desenrollando la hélice de DNA · RNA en la
burbuja de transcripción (Sección 29-2E) y varias pro-
teínas más que 'serán discutidas con detalle más ade-
lante.
Diversas pruebas circunstanciales han sugerido que
la- helicasa II (producto del gen uvrD), junto con la
proteína Rep (producto del gen rep) participan en la
propagación de la horquilla de replicación en E. coli
similitud deIos-l S'nucleótidos neos eh AT del- oriC
con los 'promotores transcripcionales de Ia RNA
polimerasa (Sección 29-'-2.B). : . .; . .: · - -- ..
'
;.· ..
'
. ,,·.
se encuentra con el fragmento de Okazaki previamente
sintetizado. ·Ello probablemente sirve de señal para que
el prímosorriá i·nlé;ie ~·a·- síntesls del ANA cebador de la
hebra retrasfia:a~~-, {e} El -holoenzñna se une de nuevo al
molde de la hebta retrasada ·y extiende el R NA cebador,
formando un nuevo fragmento de Okazaki. Obsérvese
· que, en este modero, la síntesis de la hebra conductora
está siempre más avanzada que la de la hebra retrasada.
~ - ... - Figura· 31:-20· , ·· .
R·eplioaeiórí det DNA 'de E. colt. ·(a) Et repüsorna de'.r 0NA·
de E. con, que se cree contiene dos 'holoertzim.a~s, de 1.a
Poi U-1, síntetíza tanto Ja hebra cond.ucto(a<cornQ· .. ra. hebra
retrasada .. EJ moteje de la hebra. retrasada debe tormar.'. un lazo para permitir. que .el notoenzima extien.d·a, la .
hebra retrasada, ini'ciaoá por etprlmosorna. (o) ·E.I , , ·
holoenzíma libera ef molde de 1:a hebra. retrasada cuando
,. ~ . .
.,,.
. ,:
. ,. .. ~ , '
I'
~~i .. l JJ ·. ~ ::
Antiguo tra¡mento
.~
de Okazaki
Frasrnento .
de Okazaki recfén
iniciado . . . »
- • . ' . '
. 5'
3'
(e)
. '
R'NA cebador a sustituir - .
por DNA mediante la Poi I;
muesca sellada
por la DNA ligasa
-Fragmento de Okazaki completo
... 'rx\¡ 31
. V\JL5· i l t f !· . l ¡
¡'
' '
(b)
Fragmento de Okazaki
creciente
Hebra retrasada
Helicasa II ,
Pritnosorna
RNA cebador
' ' ..
Proteína Rep
Holoenzí ma de la
DNA~ polimerasa III
SSB _,
(a)
Capítulo 31. Replicación, reparación y recombinación del DNA 1.031
La i-nic~éi·ón de la 'repltcación del,.DNA de E. coli
está finamente regulada ., ·
La replicación del· cromosoma. en 'E. coli · tiene lugar
una sola vez en cada división celular, por lo que este
proceso· debe estarjuertemente controlado: El tiempo.de
división de E. coli a .3 7 C?C varía según las condiciones
de crecimiento desde :< ,.2-0 min hasta ,._, -: 10 h. Sin
embargo, la velocidad del movimiento de cada hor-
quilla de replicaciónes constante e igual a ---~ 850 nu-
cleótidosys, .lo- que,fiia el tiempo de replicación ero-
.. . ~ ~·
,
V
FigLtra 31-21
Modelo del inicio de la replicación del DNA en oriC.
(1) Las proteínas DnaA se unen a los cuatro 9-meros,
de manera que oriC, convenientemente superenrollado,
envuelva un núcleo proteico de 20 a 40 subunidades.
(2) A conunueeíén. las tres repeticiones de 13 bp, ricas
en AJ', se abren en una reacción impulsada por ATP,
tormanqo -UJJ complejo abierto, .al cual (3) se une el
complejo DnaB-nnaC. (4) El complejo abierto es
· desenroüado aún más rnedlante la actividad helicasa de
la proteína DnaB, prepa:rando de esta manera el
complejo para el inicio y la replicación bídíreoc'onat,
[Seg.ún Bramhitl, D. y Kornberg, A., Ce// 52, 752 ·(1988).]
\.
Iniciación
y replicación
4 Sensibles a Pl
•
i !
Complejo
pre-iniciador
,.
'
~ !" .,· ,.
•;
• ! ,
' ,
3
'
,J,
38º
' . Sensibles a Pl
, Complejo
abierto
38º 5 mM ATP t
Insensibles a Pl t
2 20°
Complejo
inicial
HU
. ATP•DnaA 1
orí e
' ' ' ' ' ' <,
' ' ' ' ' ' -,
' <,
-,
-,
<,
-,
<,
<,
'
Molde
superen rol lado a
-
(Sección 31-2C). Por ejemplo, la helicasa II estimula
la replicación del DNA in vitro, en un proceso que
., 'está activado por la proteína Rep y en el que los
· .rnut .. antes dobles_,.rtP¿,uvrD parecen ser inviables. Sin
embargo, muchos- dé-los- fenotipos correspondientes a
los mutantes uvrD, como pueda ser el aumento de
sensibilidad hacia la radiación. UV y otros agentes que
dañan el DNA, implican a la.helicasa II en los proce-
sos de reparación y /o recombínacíón. Las células de
E. coli portadoras de genes rep mutantes son viables,
si bien sus horquillas de replicación parecen propa-
garse más lentamente de lo que es :habitual en las
células de la estirpe salvaje. De· ahí que el papel
fisiológico de la proteína Rep en E. coli siga siendo
descónocido (aunque se sabe seguro que participa en
la replicación del tipo círculo rodante del DNA de la
RFI del fago ·(/)Xl.74 [Fig. 31-1-9]).
o/~1zt -~it: Recientemente, se ha demostrado que_ las proteínas
" ,.;.·- ,.·-~ -ef4;·· .. de E .. coli responsables. de la desenrollamiento del
'~.·.DNA en la horquilla de replicación son la proteína n'
( también conocida como proteína PriA, ya que es el
producto del g~ priA); que es una helicasa 3' .,. 5',
y la proteína Dnab, que es una helicasa 5' ~ 3'.
Ambas proteínas son componentes del primosoma, el
cual se cree que se une al molde .de la hebra retrasada
en la horquilla de, replicación y, p9:r ello, ~s tá obliga -
do a avanzar en la dirección 5' ~ 3'.(E'ig. 31-20). Así
pues, el desenrollamíento del DNA, por delante del
avance de' l~ _:n,'laqui~_ar~a de, replicacíón (el .·repliso-
ma), requeriría 1~ acción de una helicasa 5'' ,. 3 ',
como laproteínaDnañ .. Por -tánto, sé ha sugerido, que·
la proteína n' funcionaria como una translocasa, ha-
ciendo pasar el lazo que forma el molde de la hebra
retrasada-a través del replisorna e11:, ·ia .direccíón 3! ,. 5',
manteniendo así ,~l tamaño del. lazo a medida que el
replosoma avanza en la dírección.S' .,. 3'.
1032 Sección 31-3. Mecanismos de replicación procariotica ·
Terminación de la replicación
El punto final de la replicación en E. coli es una
amplia región (350 kb) flanqueada por cuatro sitios de
terminación de 23 bp, casi idénticos, TerD y Ter A a la
izq'uierda y TerB y TerC a la derecha, si el cromoso-
ma circular de E. coli se dibuja con su punto final de
replicación en la parte superior (lo que deja el origen
de replicación, oriC, en la parte inferior). La horqui-
lla de replicación que avanza en el sentido contrario a
las agujas del reloj se detiene cuando encuentra TerA o
TerD (TerD es probablemente un sitio de emergencia
para el caso de que falle TerA), mientras que el movi-
miento de la horquilla de replicación según las agujas
del reloj es interrumpido por TerC o, si falla éste, por
TerB. Así pues, estos sitios de terminación son pola-
res; sólo interrumpen el avance de la horquilla de
replicación en una dirección a lo largo del cromoso-
ma. Este hecho garantiza que las dos horquillas de
replicación, generadas por la iniciación bidireccional
en oriC, se encuentren al final de la replicación, inclu-
so si una de ellas llega antes que la otra.
La terminación de la replicación requiere la presen-
cia de la proteína Tus, una proteína monomérica de
36 kD que es el producto del gen tus (de "rerminator
utilization substance" o sustancia para la utilización
del terminador). Esta proteína se une específicamente
al sitio Ter, donde impide el desplazamiento de las
hebras por parte de la helicasa DnaB, con lo cual se
detiene el movimiento de la horquilla de replicación.
La proteína Tus contiene una gran proporción de
restos básicos, al igual que otras proteínas de unión al
DNA, pero no posee ninguna secuencia que se ase-
meje a los motivos de unión al DNA más comunes,
ción de cromosomas con múltiples horquillas, como
se muestra en la Fig. 31-22 correspondiente a un
tiempo de división celular de 35 min.
Las consideraciones mencionadas anteriormente indi-
can que debe existir una señal que desencadena el inicio
de cada ciclo de replicación cromosómica. La naturaleza
de esta señal es hasta ahora deconocida. Sin embargo,
algunas observaciones sugieren que el disparador del
inicio de la replicación del DNA en E. coli responde al
grado de metilación de oriC. Estas observaciones son:
(1) todas las repeticiones de 13 bp de oriC empiezan
con la secuencia GATC (véase anteriormente), que
corresponde a la secuencia más comúnmente metila-
da en E. coli (Sección 31-7), y (2) las células de E. coli
que carecen del enzima responsable de la metilación
de GATC se transforman con un rendimiento muy
bajo por plásmidos que contienen oriC.
Existen numerosas evidencias morfológicas, tales
como la mostrada en la Fig. 31-23, de que el cromoso-
ma de E. coli está asociado a la membrana celular.
Esta asociación permite probablemente la segregación
de los cromosomas replicados en células diferentes
durante la división celular. No hay ninguna prueba
directa, sin embargo, de que ningún componente de
la membrana sea necesario en la replicación del
· DNA.
Capítulo 31. Replicación, reparación y recombinación del DNA 1033
Figura 31-23
Micrografía electrónica de un cromosoma de E. coli
intacto y superenrollado, unido a dos fragmentos de la
membrana celular. [Tomado de Delius H. y Worcel, A.,
J. Mol. Biol. 82, 108 (1974).]
mosómica, C, en ,.._, 40 min ( el cromosoma de E. coli
consta de -- 4 x 106 bp). Además, la segregación de
los componentes celulares y la formación de un tabi-
que entre ellos, proceso que debe preceder a la divi-
sión celular, requiere un tiempo constante, D = 20 min,
después de completarse el correspondiente ciclo de
replicación cromosómica. Las células con tiempos de
división < C + D = 60 min deben, por lo tanto, iniciar la
replicación cromosómica antes de la finalización del ciclo
de división celular precedente. Ello conlleva la forma-
Figura 31-22
En células que se están dividiendo cada 35 min, el
intervalo fijo de 60 min entre la iniciación de la
replicación y la división celular conlleva la formación de
cromosomas con múltiples horquillas. (Según Lewin, B.,
Genes (3.8 ed.), p. 299, Wiley (1987).]
.. }.:·:·.:-: :::)--- :)--
: : ; -W,, ¿, :::)--- - :)----
----
-, ....
' \
\
1
1
Iniciación )
I
I
I
/
/
/ ., ....
~/,,,,,,,.~
/ ,,,,.---- .....
I ,,-
/ 1/
I I
I t
1 1
1 ,.
1 1
1 \
1 '
\ ' I ', , ...... ...... /
' .... ...,
División
·_·; Origen,,....-:=}-Fin
~éf . / ~
.- .. --~ .-.---.·-___,.-
'..O min
Figura 3'1 ~2$: . · { · - ./ .
El ciclo· de la -célula eucartótlca .. Las· célutas en G1
pueden entrar en la fase de qulescencla (G-0), en lugar de
seguir el ciclo.
Quíescencia
· · ·(variable} ·
r
..
·' .
. . '
~, ·•
está formando, ,s9n los que más frecuentemente pue-
den estar desapareados, d.ebjg.Q a la naturaleza coope-
rativa de las .ínteraccíones ~9"el. .apareamíento de las
bases (Sección 2s ... 3 ). Igualmente, la corrección de un
oligonucleótido 'dúplex corto, es un proceso sujeto a
errores, El uso de cebadores de RNA elimina esta
· fuente· de error, ya que el RNA. es sustituido al final
por DNA! éri unascondíclones que permiten un apa-
reamieñto 'debases preciso. ' .~
· '!'Jós 'podemospreguntar por_qu~ lascélulas en su
. evolución han mantenido un 'sistema· complejo de
~ sínfésis discontínua mediante hebras retrasadas, en
. lugar de . Ji~ñaª ·o~A· polimerása que_, 'pudiera simple-
mente extender las. cadenas. de DNA. en la· dirección
3' , 5 ', Si consideramos ,la_ química de la extensión
de la cadena dé 'D~A, podernos' observar que este . .
•
lmpursaoo por la hidrólis:is d·el nucíeósído trifosfato unido
previamente. (b) La eUminación de un nucleósldo
trífostato 5 -terrnlnal incorrecto haría imposible continuar
. la elongació·n de la cadena de DNA.
p p
·OH. + •••
p
p p
•••
•.:t.
•
pp.
l ,,
Si un único.polipéptido.itan pequeño como el frag-
mento Klenow de· Ia Pol J_ puede.replicar el DNA p.or
sí solo, ¿por qué E. coli mantiene una serie de > 20 .. prp.-
teínas coordinadas entre sí para replicar su Fromoso-
ma? Al parecer, la respuesta ~s., pare, asegurar :l·fl, casi
perfecta fidelidad de la repíicecion -del DNA, .requerida
para .con2_ervar laj integridad del mensaje genético de
generacion e·n generación. Y,..- . . , :.
Las velocidades de reversión de los mutantes d-e E.
coli o del fago T 4 a la estirpe salvaje .ind_i~an1-~que sólo
ocurre un error de apareamiento por cada 10-8 a .1010
p-ares de bases replicados, Ello corresponde a "" 1
error po·r cada 1 Q.QO bacterias y p9r generación, .Esta
gran precisión en la replicación ~s debida, en -parte, a
las· funciones exonucleasa 3-' • 5' dé la Poi I: y de la
Pol III, que .detectan y eliminan los errores ocasiona-
les producidos por su. función polimerasa. De hecho, .
las mutaciones. que aumentan la.actividad exonuclea-
sa correctora de las DNA polimerasas disminuyen las
tasas, de mutación de otros genes.
La incapacidad. de una DNA polimerasa para iniciar la
eumgacion de una cadena sin un cebador parece ser un
factor que aumenta la [uieluiad de la replicación del
DNA. Los primeros nucleótidos de una cadena,_que se
n, Fjd~li.!1a~, de la replicación
, . . .
..
\ '
tales corno el motivo hélice-giro-hélice __ (Sección ,29~
3C) o· el dedo de zinc (Sección .33-~B,). .La observación
de que cuando la proteína ·Tus se fusiona a· una se-
gunda proteína de unión al DNA, · la replicación. es
inhibida en el sitio de unión de la segunda· proteína,
sugiere que la proteína Tus no actúa como una- simple
grapa, sino - queinteracciona con, la proteína Dnaf
inhibiendo su acción helícasa. Curiosamente, e~lJ-gen
tus empieza .sólo 10 ~p: corríente.abaío del sitio Terñ,
lo cual sugiere que la tt-anscrip-J:i·pn ide"tus: e-~t~~i.auto-
1 d . ' ' • . ¡I'• .~· .. ,. regu a .a. ; .. '•; ·, ·; . .,c.' • .: ;· ., '" . ·t . .., ·•.'.-,.. . .'· ~ ~ ,. ·"·' , . . ,. • =:», ... .. •· . .._ ,, •: _.,,· ,: ,( ~.
~
. . .,,:: "" . ' .
,,
I •
Fi,gura 31.:.24. -.
.Si. una DNA.polim·e-rasa pudiere slntetízar DNA en ,
díreccíón 3' -+ 5': (a) El acopíamlento de cada
nucleósido ~rifosfato a la cadena creciente estarla . ,
/
p p
• • • •
' .
p ppp
' ' 3' 5' (b)
p ppp
+
,
• • •
p PPP
5 '. 3' (a)
1034 Sección 31-3. Mecanismos de replicación procariótica
,! .. ª Reacciona con las císteínas (Tabla 6-3).
Fuente: Principalmente Kornberg, A., DNA Replication, p. 204, Freeman (1980).
Tabla 31-5
Propiedades de las DNA polimerasas de animales
a ~I ·Y
Localización · Núcleo Núcleo Mitocondria Núcleo
Masa (kD) 120-220 30-50 150-300 140-160
Inhibid ores: •
Afidicolina Sí No - No Sí
Didesoxi NTPs Débil Fuerte Fuerte · Débil
Arabinosil NTPs Fuerte Débil Débil Fuerte
N -E tilmaleimida (NEM)ª Fuerte Débil Fuerte Fuerte
A. El ciclo celular
Cada vez parece más evidente la existencia de un
elevado grado de similitud entre los mecanismos de re-
plicación del DNA en procariotas y eucariotas. Existen,
sin embargo, diferencias. significativas entre estos dos
sistemas de replicación, como consecuencia de la mu-
cho mayor complejidad de los eucariotas en compara-
ción con los procariotas. En esta sección considerare-
mos estas diferencias.
4. REPLICACIÓN DEL. DNA
EUCARIÓTICO
1. La mitosis y la división celular ocurren durante la
fase M (de mitosis), que es relativamente corta.
2. Esta fase es seguida por la fase G1 (de "gap",
intervalo), la cual representa la parte más larga del
ciclo celular.
3. La fase G1 da paso a la fase S (de síntesis). Esta
fase, a diferencia a lo que ocurre ·-en procariotas, es
el único periodo durante el ciclo celular en que se
sintetiza DNA.
4. Durante la fase G2, relativamente corta, la ahora
célula tetraploide se prepara para la mitosis. A
continuación, se entra de nuevo en la fase M y así
empieza una nueva vuelta del ciclo celular.
El ciclo de las células en cultivo ocupa normalmen-
te un periodo de 16 a 24 h. En cambio, la duración del
ciclo celular de los diferentes tipos celulares de un
organismo pluricelular puede variar entre .sólo 8 h y
> 100 días. Esta variación se debe, en su mayor
parte, a la fase G1• Además, la mayoría de células
diferenciadas terminalmente, como las neuronas o las
células musculares, nunca se dividen; adquieren un
estado quiescente o de reposo; que se conoce como la
fase G0•
La º decisión" irreversible de proliferar, por parte de
la célula, se realiza durante G1• La quiescencia se
mantiene si, ¡por ejemplo, los nutrientes se agotan o si
la célula entra en contapto con otras células (inhibi-
ción por contacto). Pór el contrario, la síntesis de
DNA puede inducirse por diversos agentes, tales
como -carcinógenos .o virus tumorigenos, los cuales
desencadenan la proliferación celular incontrolada
(cáncer; Sección 33-4C); la extirpación quirúrgica de
un tejido, que puede resultar en una rápida regenera-
ción; o por proteínas conocidas como mítógenos, que
·se unen a los receptores de _ superficie celulares e
inducen de algún modo la división celular. Las células
en crecimiento contienen factores citoplasmáticos que
estimulan la replicación del DNA. Por ejemplo, los
extractos de huevos de rana inducen la síntesis de
DNA en células del bazo de rana. No. obstante, el
modo de acción de estos factores es hasta ahora des-
conocido (sin embargo, véase más adelante).
El ciclo celular, la secuencia general de sucesos
que ocurren durante la vida de una célula eucariótica,
se divide en cuatro fases distintas (Fig. 31-25):
-
proceso también conduce a una elevada fidelidad en
la replicación. La unión de 5' -desoxinucleótido trifos-
fatos en dirección 3' :. 5' requeriría la conservación
del grupotrifosfato 5'-terminal de la cadena creciente
para facilitar ~¡ - siguiente paso de acoplamiento (Fig.
31-24a). Después de corregir un nucleótido 5' -termi-
nal desapareado (Fig. 31-24b), esta supuesta polime-
rasa podría, análogamente a la Poi 1, por ejemplo,
eliminar el nucleótido erróneo, dejando un grupo
5' -OH o bien un grupo 5' -fosfato. Ninguno de es-
. tos grupos terminales puede proporcionar la energía
necesaria para continuar la extensión de la cadena.
Por la misma razón, una DNA polimerasa 3' • S'
correctora tendría que ser capaz de reactivar su pro-
ducto _ corregido. La complejidad inherente de este
sistema, probablemente, ha sido un factor decisivo
para que no fuera escogido durante la evolución.
Cualquier error que permanezca en un DNA dú-
plex después de su replicación o que aparezca poste-
riormente, debido a ataques químicos y /o físicos,
puede ser corregido mediante diversos procesos de
reparación del DNA (Sección 31-5). Estos capacitan a
la célula para mantener su herencia genética durante
su ciclo vital.
Capítulo 31. Replicación, reparación y recombinación del DNA 1035
Replicación del DNA de SV40
El virus símico 40 (SV 40) es un virus pequeño y
relativamente simple (Fig. 32- lg) que contiene un
DNA dúplex circular de 5243 bp (Fig. 33-34). Se
replica en células de primate y, por tanto, proporciona
un modelo de replicación del DNA eucariótíco, La
replicación del DNA de SV40 es precedida por la
unión de múltiples copias de la proteína de 708 res-
tos, codificada por el virus, denominada antígeno
tumoral mayor (antígeno T, SV 40 es un virus tumo-
rígeno) al origen de replicación de SV40, de 64 bp (orí
de SV40). El antígeno T, la única proteína requerida ·
para la replicación del DNA de SV 40 que- no es
suministrada. por la célula huésped, posee una activí-
dad helicasa, impulsada por A TP, que desenrolla lo-
calmente las dos hebras del orí de SV40, permitiendo
la unión de la SSB eucariótica (también conocida
como factor de replicación A (RF-A.]) y de una to- ·
poisomerasa que continúa desenrollando el dúplex de
SV 40, de manera que la horquilla de replicación pue-
de ir avanzando. La SSB eucariótica es un heterotrí-
mero que puede sustituir a. la SSB de E. coli, aunque
no al revés, sugiriendo por tanto que la SSB eucarióti-
y por la observación de. que la actividad de la DNA
polimerasa a varía con la velocidad de proliferación
celular, Esta proteína compuesta de varias subunida-
des (cuatro tipos de subunidades en Drosophila; cinco
en hígado de rata), como todas las demás polimera-
sas, replica el DNA extendiendo un cebador en la
dirección 5' , 3' bajo la dirección de un molde de
DNA monohebra. La DNA polimerasa a posee una
actividad primasa fuertemente asociada. Sin embar-
go, carece de actividad exonucleasa y, por tanto, el
DNA que ella replica debe ser corregido por otros me-
dios,
La DNA polimerasa o, un enzima nuclear sensible a
los mismos inhibidores que la DNA polimerasa a
(Tabla 31-5), difiere de esta última en que la DNA
polimerasa o carece de la actividad primasa asociada,
pero muestra una actividad exonucleasa correctora
3' -+ 5'. Otra diferencia es que, al parecer, la ·oNA
polimerasa o posee una procesividad ilimitada ( es
capaz de replicar un molde en toda· su longitud),
mientras que la procesividad de la DNA polimerasa a
es sólo moderada ( ~ 100 nucleótidos). Por- todo ello,
se ha sugerido que la DNA polimerasa o es la re-
plicasa de la hebra conductora (que requiere una
elevada procesividad, pero que sólo necesita un ceba-
dor ocasionalmente), mientras que la DNA polimera-
sa a es la replicasa de la hebra retrasada ( que requiere
un cebador frecuentemente, pero que sólo precisa .. de
una procesividad de 100-200 nucleótidos).
Recientemente, se ha observado que la DNA poli-
merasa o sólo muestra unaelevada procesividad
cuando está formando complejo con una proteína de
36 kD, llamada antígeno nuclear de células en pro-
HO' ,' H
HOH2C H
. Afidicolina ·
Iíferación (PCNA; denominada así porque sólo se
encuentra en los núcleos de las células en prolifera-
ción y reacciona· con los sueros de un tipo de pacien-
tes con la enfermedad autoinmune lupus erythremato-
sus sistémico}: Por ello, se cree que, en los eucariotas,
la replicasa de la. hebra conductora está constituida
por un complejo entre la DNA polimerasa 6 y el
PCNA.
Recientemente, se ha descubierto una quinta DNA
polimerasa eucariótica, la DNA polimerasa E. Aun-
que laDNA polimerasa E era anteriormente llamada
DNA polimerasa -021 debido a su parecido superficial
con la DNA polimerasaS, los dos enzimas difieren en
que la DNA polimerasa E es altamente procesiva en
ausencia de PCNA. Además, la DNA polimerasa E
muestra una actividad exonucleasa 3' , 5' que sólo
degrada DNA monohebra a. oligonucleótidos de 6 a
7 restos, y no a mononucleótidos como hace la DNA
polimerasa o .. El hecho de que la DNA polimerasa E es
necesaria para la reparación de las lesiones inducidas
por UV en las células HeLa (una línea de células
cultivadas de cáncer humano) prueba de forma con-
vincente que este enzima participa en la reparación
del DNA. No obstante, dado que la DNA polimerasa E
es necesaria para la viabilidad de la levadura, este
enzima también podría ser necesario para la replica-
ción del DNA in vivo.
La DNA polimerasa ~ destaca por su pequeño ta-
maño. Se desconoce la función biológica de este enzi-
ma nuclear, aunque la observación de que su nivel de.
actividad no· varía con la velocidad de crecimiento
celular sugiere que participa en los procesos de repa-
ración del DNA. La DNA polimerasa y se encuentra
exclusivamente en la mitocondria, donde probable-
mente replica el DNA mitocondrial. Los cloroplastos
contienen un enzima similar.
B. DNA polimerasas eucarióticas
Las células animales contienen, como mínimo, cin-
co tipos diferentes de DNA polimerasas, denomina-
das según el orden en que fueron descubiertas, DNA
polimerasas·a, ~' y, o y e (Tabla 31-5; la DNA poli-
merasa E ha sido descubierta muy recientemente). Sus
funciones se fueron elucidando, en gran parte, por sus
diferentes respuestas a compuestos inhibidores (Tabla
31-5), ya que sólo recientemente se han conseguido
formas mutantes de estos enzimas.
La DNA polimerasa a, que ·se encuentra únicamente
en el núcleo celular, interviene en la replicación del
DNA cromosómico. Esta función fue descrita con deta-
lle a partir de los trabajos con el inhibidor específico
afidicolina
1036 Sección 31-4. Replicación del DNA eucariótico
Telómeros y telomerasa
Los extremos de los cromosomas lineales no pue-
den ser replicados por ninguno de los mecanismos
vistos hasta ahora. Ello es debido a que el RNA
cebador situado en el extremo 5' de la hebra retrasa-
da, cuando ya ha sido completada su síntesis, no
puede ser reemplazado por DNA, ya que no existe el
cebador necesario para ello. Entonces, ¿cómo se repli-
can las secuencias de DNA de los extremos de los
cromosomas eucarióticos, es decir, los telómeros? El
DNA telomérico posee una secuencia poco corriente,
que consta de hasta mil o más repeticiones en tándem .
. de una sencilla secuencia rica en G, dependiente de
· especie, situada en la hebra del extremo 3', al final del
cromosoma. Así, por ejemplo, el protozoo ciliado Te-
trahymena, tiene la, secuencia telomérica repetida
TTGGGG, mientras que en el hombre es TTAGGG.
posee múltiples orígenes de replicación, a diferencia del
cromosoma procariótico, que tiene un único origen de
replicación. La DNA polímerasa a sintetiza DNA a
una . velocidad de /1-.J 50 nucleótidos/s ( ~ 20 veces
más lenta que las polimerasas procarióticas). Dicha
velocidad ha sido determinada autorradiográficamen-
te, midiendo las diferentes longitudes de las secciones
de cromosoma marcadas mediante un pulso. Consi-
derando que un· cromosoma eucaríótíco típico contie-
ne 60 veces más DNA que los cromosomas procarió-
. ticos, si utilizara el sistema de replicación bidireccio-
nal, con un solo origen de replicación, se requeriría
/1-.J 1 mes para finalizarla. Micrografías electrónicas,
tales como las mostradas en la Fig. 31-26, sin embar-
go, muestran que el cromosoma eucariótico posee
múltiples orígenes de replicación, uno cada 3 a 300
kb (kilopares de bases), dependiendo de la especie y
del tejido, con lo que la fase S dura normalmente
unas pocas horas.
Las observaciones citológicas indican que no todas
las diferentes regiones cromosómicas son replicadas
simultáneamente, sino que son activados al mismo
tiempo grupos de 20 a 80 replicones (unidades de
replicación; segmentos de DNA cada uno de los cua-
les está servido por un origen de replicación) adya-
centes. Durante la fase S, son activados nuevos repli-
cones, hasta que el cromosoma entero ha sido replica-
do. Durante este proceso, los replicones que ya han
sido replicados, de algún modo, son distinguidos de
aquéllos que todavía no lo han sido. Experimentos
sobre la síntesis del DNA en virus eucarióticos sugie-
ren que la replicación de los replicones puede ser
desencadenada por la transcripción de cebadores,
bajo el control de elementos activadores asociados a
los orígenes de replicación (los elementos activadores
son aquellas secuencias de DNA que regulan el inicio
de la transcripción, mediante la unión de proteínas
estimuladoras de la RNA polimerasa llamadas facto-
. res de transcripción; Sección 29-2F). En este caso,
algunos factores de transcripción específicos de tejido
y de ciclo celular podrían activar determinados repli-
cones ..
Los cromosomas eucaríétícos contienen
numerosos replicones
Los sistemas de replicación eucarióticos y procarióti-
cos difieren obviamente en que el cromosoma _eucariótico
ca tiene alguna otra función además de impedir la
rehibridación de las hebras del DNA.
Llegado este punto, la replicación del DNA es ini-
ciada bidireccionalmente por el complejo DNA poli-
merasa a-primasa, el cual sintetiza un corto fragmen-
to de DNA, cebado por RNA. (fragmento de Okazaki),
en cada hebra (recuérdese que la DNA polimerasa a
tiene una actividad primasa estrechamente asociada y
no tiene más que una procesividad limitada). A conti-
nuación, el PCNA, formando complejo con una pro-
teína de múltiples subunidades llamada RF·C (alter-
nativamente, Al),· se une al extremo 3' de la hebra de
DNA naciente, impidiendo la extensión de la hebra
por parte de la DNA · polimerasa a. Sin embargo,
la DNA polimerasa 6 sustituye a la DNA polimera- ·
sa a, uniéndose así específicamente al complejo
PCNA-RF-C en un proceso llamado cambio de poli-
merasas, y empieza la síntesis de la hebra conductora,
extendiéndose progresivamente el fragmento de Oka-
zaki (recuérdese que la DNA polimerasa o no tiene
asociada la actividad primasa pero, formando com-
plejo con PCNA, posee una procesividad ilimitada;
RF-C es una proteína accesoria que activa la DNA
polimerasa 6). La DNA polimerasa a que ha sido pues
liberada se une al lado 5' de la hebra conductora
naciente, donde inicia la síntesis discontinua de la
hebra retrasada. Los RNAs cebadores son finalmente
eliminados por una RNasa H, los huecos son rellena-
dos por una polimerasa, los cortes son sellados por
una DNA ligasa y los dos DNAs dúplex- circulares
hijos son desenredados y separados por la acción de
una topoisomerasa 11 (Sección 28-SC). Así pues, el
único componente celular que todavía no ha sido
identificado, como parte del aparato mínimo de repli-
cación del DNA eucariótico, es el equivalente al antí-
geno T, es decir, una proteína de unión al origen de
replicación que reconozca los sitios de iniciación y
que tenga actividad helicasa para crear la horquilla de
replicación.
Figura 31-26
Micrografía electrónica que muestra múltiples ojos de
replicación (flechas)en un fragmento del DNA de
Drosophila que se está replicando. [Tomado de
Kreigstein, H. J. y Hogness, D. S., Proc. Natl. Acad. Sci. · ·
71, 136 (1974).]
Capítulo 31. Replicación, reparación y recombinación del DNA 1037
..
Además,. en .-el extremo de esta,. hebra s9presale. una
secuencia de 12 a. 16 bp. ,_ .. , . - , ,~ ... , ..
- .: .. El,s.Qlt;A :Jelomérico.;se ·sintetiza~ a tr-avés :de uri me-
~~iJi~P···Yll:iP'P.-: a enzima qu~ sintetiza la ,h~-hra rica
,ett.t(3::1Qe{/. ]i}NA.{t'elomérico s·e llama. telo·merasa. ,La
. ,.~ •
. '•· ' .,. .<
Fi·g,ura 31-27 , . . . ' .
MocteJo-,del .lazo D de replicación det O.NI,\.
' 7 ·,. :•. :-. , •, /""'<· - ' • ,. "4' •.
l ~ f ~ i
., ' . . . ,.
' .
., \. ~ ' ..
'
.. ·•. - ~ . '·
" . .. ~:
" • ...., • . •. •<
'
••
·"' •:
1,.
( . ·~ ':
. ' ·'-(::
'
' - ..~ .. t . ·' • ·:, , :, .. . ..
.. . , .. -:. ....
•;,. •·'
,,
' '· .. ... ,.
. . . ., / . ' ~ .•. ,,, .•• ¡. lt,
• .. "' ... • ~..l.
' ,
: ;!
... Origen de la ,. . ...
heb'rá retrasada
,. ,
.: • • ·.<: ,.. .
. ,.
, ·'' •. "! . ' ,"
' .. ,. . ": .. . .... . ,. ... .. ...
,• ' .
' ., .. .,
'!..
"~ . ~· . ' - ; ~ . ~ ~
' 'f ,. , ••
/ .
·: ... .. ~· .. I
•·
.,,; ,; . ·•. ! ,.
',
' . ,. -· :, ¡; .,, '·
,· ;• .,
Origen· de· la
hebra retrasada · ·
.... .· ·"
"· ,,: . . '
' .
109.8 Sección 31-4. Replicación del DNA - eueariotico
telomerasa- de- Teirahsmeno, · por ,e,j emp Jo; añade repe-
tíeiones. ·eii:,~~hd-~.,.\."-dé>~ta - .secuencia telomérica
T'!r:P~·G' G '].',; -; .,., ., ' / ,,,· '°Q,f'· ,:.J~ ... ;:, ·, " -. ,u, ,,•· l .,~ --~ l !~!_.~\i ~ ... t: é\}it~~trem9:rir-;··¿:~:<~µ~1qt11~~ ·-Q1ig9nu_e e0tíuo
tel.Qó;férlccp .--~00:.,j·en~r:~,-t i-tjij,p~l).rl,iéfit~erite ,, de -cual-
·q~~é~5m~lq~f:emg~n~;-,,~~iído:~{i~~-;ü.edufo,.~1;pa~tir .
. d~,·~5f~s~tip¡!W1eO:fRiJs~:~~¡{~S~:~~~~as,~-:_:s~Ij: .. , ribo-
n.11~le,!)p~qt~fü~s,/ ... cµ}'QS-.,~~4s:~limf(Qne;nt~~ceJ1·t!enen
U\l.· /é~~~,~~a,'é~~!s:~~f:~iplf~f~1f~Pi6-; de · .. ~---,ffe,~¿úen-cia
-t·é}Qméifé~j~}t~ai!AI;jiaieéér;,'1~ta~t:~dctfencia actúa
como molde en tina reacción del tipo transcriptasa
inversa que sintetiza: la secuencia telomérica, se trans-
loca hacia el nuevo extremo, 3' del DNA y repite el
proceso. Est~- hipótesis se ha.confirmado. con la obser-
vación .de que cuando se" introelueen mutaciones en el
segmento del gen del RNAde la telomerasa, comple-
mentario del DNA telomérico, se produce un DNA
.teloméríce ·que,,tI!OS'e·e lay secuencia. mutada corres-
pondiente. La r h~bra, del, ~:GNJ\ .cemplementaria d~ .
la hebra teloméríca.riea en.G, al parecer, es sintetiza-
da a través, de, los .mecanísmos-celulares normales de
síntesis- .de la .hebra · retrasada, explicándose así el
3,' .saliente de.la hebra· rica en .·G. , · ·
-. -Sin la acción, de la .teloraerasa, el cromosoma se
vería acertado en sus -extremos en una longitud co-
rrespondiente a la del RNA cebador, con cada ciclo de
replicación del Dl)Itlt -y de -divisién celular, Los.genes
esenciales .Iocalizades ,Ce.rea .de.Jos .extremos de los
cromosomas serían- delecionados inevitablemente por
este proceso/ -haeiende de .este modo, imposible la
· vida de Ios descendientesde la célula afectada-origi-
nalmente. Á De' hechor r-Jo-s:; -cultives- -de Tetra-hymena,
· ,, ;·:. ~ ~ , ~ .: / ·:. ":<~,, · V , : :::.~ ;. ,~ -s, _: t » _ normalmente inmortales.sa les q,ue se les.ha dañado
-.~ ... • ,. : . f' sustelomerasas po:1: mutación, muestran. característi-
cas que-recuerdan a.las células-de mamíferosenescen-
tes justo tlftJes de.morir- Esta observación sugiere una
posible base del envejecimiento en organismos multi-
celulares, Los-cultivos de.células.humanas, por ejem-
plo,,só~ son viables.durante ,:µn -número limitado de
generaciones *(-20-6-0) que -disminuye .con la edad del
individuo del cual se-obtuvieron las células. La obser-
vación.de que.Ia Iongiíud .deltelómero se reduce con
el tiempo de vida de -la línea celular y que los telóme-
ros ge e~perma humanoson más.largosque.los teló-
meros somáticos -sugiere que· las. telomerasas podrían
ser sólo.activas encélulasgerraínales, Que esto sea
cierto -Y- _que los telómeros acortados sean los respon-
.. sables de. los -sintemasdeenvejecimiento aún está p.or
demostrar. "No obstante, una posibilidad interesante
es que .la senescencia celular sea un.mecanismo que
proteja a los erganismos multicelulares contra el cán-
cer. Las características ,que <le-finen __ a las células canee-
rosas son ,que son inmortales y, -crecen sin con trol
(Sección 3;3-4C).. Si- las células. de mamífero fueran
normalmente inmortales, la incidencia- de cáncer sería
probablemente mucho más elevada de lo que es, ya
que la inmortalización (en este caso, se supone la
activación de, Ia-rtelomerasa). es -una de las· etapas
principales para la transformación maligna. En.reali-
dad, -los animales pequeñosde vida.corta tienen una
incidencia mucho mayor de cáncer por. célula que los
A. Reparación directa
Los dímeros de pirimidina son destruidos
por la fotoliasa
La radiación UV (200-300 nm) induce la formación
de un anillo de ciclobutilo entre restos de timina
adyacentes en la misma hebra de DNA, formándose
un dímero de timina intracatenario (Fig. 31-28).
Igualmente, se forman dímeros de citosina y de timi-
na-citosina, parecidos a los anteriores, aunque con
una menor frecuencia. Dichos dímeros de pirimidi-
na distorsionan localmente la estructura de bases apa-
El DNA no se puede considerar en ningún caso una
sustancia inerte, como se podría suponer por la esta-
bilidad del genoma. Por el contrario, la propia reacti-
vidad del medio celular, la presencia de una gran·
variedad· de sustancias tóxicas y la exposición a la
radiación UV o a las radiaciones ionizantes someten
al DNA a numerosos ataques químicos que eliminan
o modifican bases y alteran los grupos de azúcar-
fosfato. De hecho, algunas de estas reacciones ocu-
rren con una frecuencia sorprendentemente elevada.
Por ejemplo; todos los días, en condiciones fisiológi-
cas normales, el enlace glucosídico de unos 10 000
nucleótidos purinicos · se hidroliza espontáneamente
en el. genoma de una célula humana.
· Cualquier daño en el DNA debe ser reparado si se
quiere mantener la integridad del mensaje genético. La
reparación del DNA es posible gracias a la información
redundante inherente al DNA dúplex. La importancia
biológica de la reparación del DNA se manifiesta por
la gran variedad de mecanismos de este tipo que
pose~n incluso organismos relativamente simples, ta-
les como E. coli. De hecho, los principales procesos de
reparación del DNA en E. coli y en las células de mamí-
feros son muy parecidos químicamente. Dichos procesos
se describen en esta sección.
5. REPARACIÓN DEL DNA
complementario, formándose un híbrido RNA-DNA. A
continuación, el enzima degrada la hebra de RNA y
replica el DNA monohebra, formando el DNA dúplex
que gobierna ·el resto de la infección vírica.
La transcriptasa inversa ha sido una herramienta
especialmente útil en ingeniería genética debido a su
capacidad p~ra transcribir mRNAs en hebras comple-
mentarias de DNA (cDNA). En la transcripción de
mRNAs eucariótícos.. que poseen colas de poli(A)
(Sección 29-4A), el cebador puede ser oligo(dT). Así,
los cDNAs se han utilizado, por ejemplo, como son-
das en los análisis mediante transferencia Southern
(Sección 28-4C) para identificar a los genes que codi-
fican sus correspondientes mRNAs. La secuencia de
bases de cualquier RNA puede ser determinada fácil-
mente mediante la secuenciación de su cDNA (Sec-
ción 28-60).
C. Transcriptasa Inversa
Los retrovirus, virus eucarióticos . que contienen
RNA, tales como ciertos virus tumorigenos y el virus
de la inmunodeficiencia en humanos (HIV, .causan-
te del SIDA), contienen una DNA polimerasa de-
pendiente de RNA (transcripta~a inversa). Este en-
zima, descubierto independientemente en 1970 por
HowardTemin y David Baltimore, actúa del mismo
modo que la ·Poi 1, en el sentido de que es capaz de .
sintetizar el DNA en dirección 5' .... 3' a partir de un
cebador unido a un molde. En el caso de la transcrip-
tasa inversa, sin embargo, este molde es RNA en
lugar de DNA.
El descubrimiento de la transcriptasa inversa
·"· tuvo, en un principio, una fría acogida en el
seno de la comunidad bioquímica, ya que para
algunos constituía una herejía contra uno de
los dogmas centrales .de la biología molecular
(Sección 29-1). Pero la reacción de la transcrip-
tasa inversa no está ·prohibida termodinámica- .
mente; de hecho, bajo ciertas condiciones, la
Poi I también puede copiar moldes de RNA.
. ' . .
Las transcriptasas · inversas procedentes del virus
del mieloblastoma de ave y del virus del sarcoma
de Rous son dímeros formados por las subunidades a
y ~ de 65 y 95 kD, respectivamente. La transcríptasa
inversa tiene dos actividades enzimáticas adicionales:
l. Es una exorribonucleasa que degrada específica-
mente el RNA de un híbrido RNA-DNA (actividad
RNasa H; H, de híbrido). -~
2. Es una DNA polimerasa dependiente de DNA.
Durante la infección por retrovirus, la transcriptasa in-
versa transcribe el RNA vírico en una hebra de ·DNA
El DNA mitocondrial es replicado en ·forma
de lazos D
· El DNA mitocondrial es replicado mediante un pro-
ceso, en el cual la síntesis de la hebra conductora
precede la síntesis de la hebra retrasada (Fig. 31-27).
Así, la hebra conductora de la mitocondria desplaza
el molde de la hebra retrasada, formando un despla-
zamiento o lazo D. El cromosoma mitocondrial de
los mamíferos, circular y de 15 kb, normalmente con-
tiene un único lazo D de 500 a 600 nucleótidos, que
es· sometido a frecuentes ciclos de degradación y nue-
va síntesis. Durante- la replicación, se .extíende el la-
zo D. Cuando éste alcanza un determinado puntor+]
del cromosoma, se expone el origen de la hebra retra-
sada y se inicia su síntesis en sentido opuesto al
anterior. Así pues, cuando termina la síntesis de la
hebra conductora, sólo se ha completado ""-:' }- de
la síntesis de la hebra retrasada.
. ' mera.
animales más longevos, probablemente porque el .me-
tabolismo del DNA está controlado más estrechamen-
te en los animales longevos que en los .·de vida efí-
Capítulo 31. Replícacién, reparación y recombinación del DNA 1039
'
Figura 31-29 ,
Mecanísmc de reparacíón por .escísíón 'de fotodímeros
de pirimidtna:··[Según Haseltme, W. A. Ce// 33, 1-5 (1983).]
• • • '> ... ... . .. ,. '
Poi I, DNA:ligasa ·
, <
+ ..
,.
, .. .. ' .·\ -''
":
;,.,,,. '1 .., ~~ L '' "
I ,, .: .... • • ,;,
••• •• · ....... ') •' .
-,
,,
\
Endonucleasa UvrABC
3'
v- " ,.
,. ,.
•, .. ...; .,
. . '·"' . . .. . . .. \ '
B·~ ... Reparación por · escisión . , , , .
~ - ·~ ..... -·.. .... '( ' .,;. "-! • .. ,..1. .•· ~
Los _ dímeros - dé pirimidinas también pueden ser
reparados.vpor un proces.-o denominado reparación
.por escisión .. En-este meeanismo -de reparación, -el oligo-
nucíeoiide que contiene-la l·es:ión es.escindido del DblA y
el hueco uue. resulta en- una de las hebras es rellenado.
En E. coli, los dímeros.de. pirimidina son reconocidos
por un enzima con múltiples, subunidades, producto
de los genes uvrA, uv.rB y uvrC. Esta endonucleasa
UvrABC, en una reacción dependiente de ATP, corta
el octavo enlace fosfodiéster .en.el lado S' del. dímero y
el cuarto en su lado S' (Fig. 31-29). El oligonucleótido
escindido- es .sustituido- por la "acción- de una DNA
polimerasa, probablemente la Pol I, seguido por la
acción, deuna 9N~ Iigasá. · · < -·: ·~
·."La ertdenueleasa- UvrABC escinde otros· tipos de
lesiones en,el·:DNA', además de losdímeros de pirimi-
dina. Estas lesiones -se caracterizan por el. desplaza-
" . ·~ ·' < ·~· ·,, . .• I '; 1
Las lesiones debidas a 06-metilguanina· y 06-etil-
guanina en el DNA de E.· celi y de las· células <Je
mamíferos -son reparadas por la 06-me·tilguanina-
DN A metiltransferása, la cual transfiere directamen-
te el grupo alquilo a uno de sus propios restos de Cys.
Dicha reacción Inactiva esta -proteína, por lo cual no
puede ser considerada estrictamente como un enzi-
ma. La reacción deIa alquiltransferasa es estudiada
con considerable" atención 'debido -a que la .carcinogé-
nesis inducida -por agentes· metilantes - y etilantes se
correlaciona 'con deficiencias en la reparación - de las
lesiones p-or 06-.a1quilguaniná. .. ·
produce, entre· otros productos, restos de O~-al-quil-
guanina. La formación de estos derivados resulta al- ·
tamente mutagénica, ya .que durante· la replicación
inducen con frecuencia la incorporación de timina en
lugar de citosina,
.• . ,
,, . ,;
.Resto de 06-metilguanina N;..Metil-N., -nitro-N- ·
nitrosoguanidina (MNNG)
. ·H N ~
2 N »
, N~
.HC NH H
;; 3 \ 11 /
N.-C-N
/ \
O=N .. r • 'N02
CH / 3 o
.. '
'
.. Q
'
Las alquiltransferasas desalquilan .. las bases
alquiladas ·~ _ ,. e ,
La exposición del DNA a agentes alquilantes, como
el N-met.il-N'-nitro-N-nit~osaguanidina (MNNG),
' ·'
readas del DNA, con lo qu~ éste no puede ser un
buen molde para la transcripción ni para la replica- . , ' c1on. , ,. , . ,
.. Los dímeros· de pirirnidina pueden volver a su- for-
ma monomérioa, mediante la acción de un enzima
q,ue tiene capacidad para absorber luz y que s.e halla
en todas- las formas- de, vida. .g.~yof.Ain~g..o.: ,,e»zima
fotorreactivante o fotolíasa. ~J;:J '!,e-Jt!.zi.ffl_a,. de.E, eoti
(54 kD) se une a los .. dímeros de pirimidina en un
proceso que puede ocurrir en la oscuridad y, poste-
riormente, tras la absorción de luz de 300 a 500 nm
por medio de dos cofactores unidos mediante. enlaces
no covalentes, una pterina y un ;FADH2, la, fotoliasa
corta ·e.l dímero. ,
·, ~.
' ,
. .... .
.,
Figura 31-28
Dímero de ciclobutiltimina, que se forma tras la
irradiación con UV, entre dos restos de timina
adyacentes en una misma hebra de DNA. Los enlaces
entre los aníjíos de -timina (rojo_~\s.on mtJcJ:101::t,nás-cort~s
que la distancia. normal de 3,4 A en~tre tos anil.los .
apil·ados del E;l-DNA, con lo que se produce una
distorsión looal en el DNA.. ..~'.· ..
Anillo de,
cíclobutílo
•• •
O H
~ 1 ' ./ •• e--
/ ~
">---N C=O ., /
. le <\
H· CH3
o
• •
..
• ..... 1f140 Seccum 31-5. Reparación del DNA
Las glucosilasas eliminan las bases alteradas
Las bases del DNA son modificadas por reacciones que
suceden en condiciones fisiológicas normales, así como
por la accum de agentes ambientales. Por ejemplo, la
adenina y la. citosina -se desaminan de forma espontá-
nea a velocidades finitas, formándose restos de hipo-
xantina y uracilo, respectivamente. La S~adenosilme-
tionina, un agente metílante común en .el metabolis-
mo, a veces metila ·una base de, forma no enzimática,
formándose derivados-como los restosde 3-metilade-
nina y 7 -metilguanina. 'Las radiaciones· ionizan tes
pueden promover reacciones de apertura de anillo en
las bases, Estos cambios, modifican o eliminan .propie-
dades del apareamiento de las bases.
El DNA que contenga una base dañada puede ser
devuelto a su estado nativo mediante otra forma de
reparación por escisión. Las 'células poseen un con-
junto' de DNA glucesilasas, cada un-a de Iascuales
reconoce el enlace glucosídico correspondiente a un
tipo .específíco de nucleótido alterado (Fig. 31-30),
dejando así el resto de desoxirribosa en el, esqueleto
de la doble hélice. Estos sitios- .apurtnícos o apírímí-
dínicos (A·P) son· también creados, .en condiciones
fisiológicas normales> porla hidrólisis espontánea del
enlace glucosídico. En ambos casos, el resto de 'des-
oxírribosa es· cortado en uno 'de los lados por una
endonucleasa AP, la desoxirribosa y varios restos
' . p , ~
{.: . ., ... , \• ,. . )/, ..
El uracilo en el:D~;\- sería .al~t~m,~»t·e mutagénico
Durante. el tiempo que. siguió a Ia elucidación de las
funciones básicas-de-los ácidos .nucleicoss-no se en-
contró una razón aparente para. explicar .. por qué la
naturaleza hace un gasto metabólico considerable
usando timina en .el DNA y· uracilo en el RNA, te- .
niendo en cuenta que estas sustancias. pos,een propie-
dades virtualmente idénticas en cuanto al aparea-
~iento :del..,~btlses. Este enigma se solucionó, con el
descuhrimieate d€ Ia- tendencia de la· citosinaa con-
vertirse ·~ en -uracilo. .pur~ desaminación; bien ·es pon tá-
neamente ,o. bien -por reacción con nitritos (,See-
ción 30-lA). Si U fuera una base habitual en el DNA,
la desaminación de C sería altamente mutagénica, ya
que no habría forma de distinguir si el desaparea-
miento resultante G · U había sido inicialmente G · C
o bien A · ;U·. Sin embargo, dado que T es la base propia
del DNA, cualquier U en et DNA es casi con toda certeza
una C deeaminada. Los uracilos que aparecen en el
DNA son eliminad·os eficazmente por la DNA gluco-
silasa uracil N,5gluco·silasa y, posteriormente, susti-
tuidos poi" C mediante reparación por escisión. ,
La uracil N-glusosilasa también tiene una impor-
tante función en la replicación del DNA. El dUTP, un
intermedio .. en la síntesis del dTTP, · está presente en
peque-ñas cantidades' en: "todas las células (Sec-
ción 26 ... 4B)~ La DNA polimerasa no discrimina bien
entre dUTP y dTTP (recordar que las DNA polimera-
'" .
adyacentes son eliminados por la acción de la D-NA
polimerasa o alguna otra exonucleasa celular, y el
hueco ~ f.e_su}tante1 es rellenado y, cerrado por la D NA
, " ' • '" ;,• ,. ' .. • >,
polirile:ras~a·"-yl)Fa~~Nw1igafSa. - · ,. .
. .
Figura 31-30
Las DNA gJucosilasas hidrolizan el enlace glucosídico de
la base alterada correspondiente (rojo), generando un
sitio AP.
\
. ' \
..
OH
DNA glucosilasa
El xeroderma pigmentosum se debe a una
deficiencia genética de la reparación por escisión
En el hombre, la enfermedad hereditaria! poco co-
mún, xeroderma pigmentosum (del griego: xeros, seca
+ derma, piel) es debida a la incapacidad de las
células de la piel para reparar las lesiones en el DNA
que han sido inducidas por rayos UV. Los individuos
que padecen esta afección autosómica recesiva son
extremadamente sensibles a la luz solar. Durante la
infancia, padecen importantes cambios en su piel,
tales como sequedad, abundantes pecas y queratosis
(un tipo de tumor de la piel), además de enfermeda-
des oculares, como opacidad progresiva y ulceración
de la córnea. Finalmente, desarrollan cáncer de piel, a
menudo fatal.
Los cultivos de fibroblastos procedentes de la piel de
individuos con xeroderma pigmentosum son deficientes
,"
en la reparacion por escisión de dímeros de pirimidina.
Experimentos de fusión celular, con cultivos de célu-
las de diferentes pacientes, han demostrado que esta
enfermedad es debida a un defecto en uno de los
nueve grup~s de complementación existentes. Así
pues, el hombre posee, al menos, nueve productos
génicos implicados en la, sin duda importante, repa-
ración de los daños causados por rayos UV.
miento de las bases de su posición normal, como
ocurre en los dímeros de pirimidina, o ·por la adición
de un sustituyente voluminoso· a una base. Por su,-
puesto, la endonucleasa UvrABC es activada por la
distorsión de, la doble hélice y no por el reconoci-
miento de un determinado grupo.
Capítulo 31. Replicación, reparación y recombinación del DNA 1041
-·
· El DNA dañado puede ser .replicado- antes· de: que
los -sistemas-. de reparación descritos anteriormente
sas seleccionan una base para incorporarla al · DNA
según su -capacidad de aparearse. con la base .de la
hebra molde),· con lo queí a pesar del bajo nivel
celular.de dUTP (Sección ~26-4B),- el. DNA de nueva
síntesis-contiene aveces alguna U .. Estas son-rápida-
. mente sustituidas por T mediante .la reparación, por
escisión. Sin embargo, dado que la .eseisién ocurre
con mayor rapidez .que la reparación, el DNA de
nueva síntesis aparece fragmentado .. Cuando los frag-
mentos de Okazaki fueron descubiertos. por primera
vez (Sección 31-lC), se creyó, por tanto, que todo el
DNA era sintetizado -de forma discontinua. Esta am- ,_
bigúedad fue resuelta con el descubrimiento de 'una
cepa de E. coli deficiente en uracil N-glucosilasa. En
estos mutantes, llamados ung-, únicamente· la mitad
del DNA de nueva síntesis -aparece.fragmentado, in-
dicando Cfel~ hebraconductora del DNA se sintetiza
de forma continua. . . ·
. ;
puedan actuar. La replicación del DNA; que contiene
un.dímero de pirimidinas, es interrumpida por la dis-
torsión de. la hebra molde y sólo es· reanudada una
vez soprepasado el- sitio donde wse encuentra el díme-
ro: La hebra hija-resultante tendrá un huecofrente al
dímero de, pirimidina (Fig~- .31 ""31 ) .. Esta Iesión .genética
d el . . ad di . , . no pue -e .s~ ; .1a11n· · ·. a me· · iante reparacron por eser -
sión, y·a1qu,e en €Ste- caso se precisa una hebra comple-
mentaria intacta. Aún así,, queda una hebra intacta en
la otra doble hélice hija que se está formando en la
misma horquilla de replicación. Así pues, la· lesión
puede ser ·corregida por .un proceso conocido como
. , bi . , al . reparac1on po~ reeom macien.o, .: . ternativamente.
recombinación p.osreplicat.iva~~Fig~. 31-31). Este me-
canismo se baea -en. el. , intercambia· .. de los segmentos
homotcgoe de las hebras de DNA hermanas, colocándoee
así el segmento de DNA, que tiene el hueco, sobre la
hebra no dañada, donde La áiecontinuidad puede ser
repara-da y~ cerrada. El dímero de pirimidina, que está
asimismo asociado con .su hebra complementaria in-
tacta, puede ser eliminado entonces mediante repara-
ción ,por escisión. o· fotorreactivación, La reparación
por. recombinación fue detectada directamente gracias
..
·•
C, ·:K~para·ción. por. recombinación
. . .. . " ... . .. ·•·
;
~:~:;~~:cíón pOÍ recorn b11Yáci'ó~:~f~fi~Jatfo~ Ja'. hebra de DNA de nueva
slntesle, fre·nte a lahebra donde se enédéhtrá· er:raáño,~ es llenad-o por el?segment9
correspondíente tornado de su dúplex hermano.
•
; . ~. ' ·. DNA dúplex normal
\
;
.( . •:
.•·
DNA que coritiene un dímero de pírimidina
v. ' •. 4
,. .. . ,. ' .
,
.•
'
•.
,
Llenado
y ligación
•. '
Hebra hija normal
'- Hebra paterna con hueco
'
.,
Hebra paterna dañada
- Hebra hija reparada
Reparación por
recombinación
DNA dúplex normal
,,_ Hebra paterna dañada
~'Ji-- Hebra hija' con hueco
' . ) 2·
•
Replicación
5' 3'
DNA que contiene un dímero de pjrimidina
1
5'
,
· 1042 Sección 31-5. Reparación del DNA
La, proteína LexA. reprime la respuesta SOS
Las claves que permitieron conocer la naturaleza de
la respuesta SOS, fueron proporcionadas por la obser-
vación de que los mutantes de. E. coli en los genes
'
Los agentes .. que dañan al DNA, como la radiación
Uv, los agentes alquilantes y los agentes de entrecru-
zamiento inducen un complejo sistema de cambios
celulares en E. coli, conocido como respuesta SOS.
Cuandoello ocurre en~E. coli, cesa la división celular y
se incrementa la capacidad para reparar el DNA da-
ñado. _
D. La respuesta SOS a la observación de· que había segmento·s de ·DNA
.paterno, marcado isotópicamente, que. se transferían a
las hebras hijas. .
La reparación por recombinación se asemeja mucho a
la recombinacién genética. De hecho, .en E. coli, ambos
procesos son mediados por la proteína RecA, una
nucleasa de· 38 kD, qu-e promueve el intercambio de
hebras hermanas entre segmentos de .DNA homólo-
gos. Así pues, las E. coli que poseen mutaciones en el
gen recA. son deficientes tanto . en la reparación por
recombinación (siendo extremadamente sensibles a
las radiaciones UV) como en la recombinación genéti-
ca. El mecanismo de -la recombinación genética lo .
consideramos en la Sección 31-6A.
.,
generati~adq .ert e.~ b.~A (parte interior), RecA. se activa.
u~iendose[al :o·NA· .émonoñébra resuttante para estimular
·taautodigestróff'de t~exA~ La eonsíqutente síntesls de las
proteínas del .ststema sos. conlleva la reparación del
DNA. dañado .. ·
.. Figura 31-3-2 _ .
En una célula con el DNA no dañado (parte superior),
LexA reprime en gran parte ía'síntesls de ·LexA, RecA,. ~
RecBCD, ·uvrABC y otras proteínas implicadas en la
respuesta SOS. Cuando se ha _producido un daño
,
I
RecA activado
DNA dañado
LexA cortado
/'
RecA •••• ,. . ' \ ,·,: ,· ' ... ,t '" '" ~., ., ,·
' . . , UvrB
,.
LexA
,/
mRNA
/
uvrA · lexA
- . "
Operador
Estado Inducido
.•
proteínas implicadas
en la· respuesta SOS
LexA se une a los operad·ores, }: ~
reprimiendo la síntesis· de I!}• ~. · -i; ,
DNA no dañado
••
Hacia otros genes
controlados por LexA
( ... LexA -:
uvrB · .uvrA .. recA lexA
mRNA
Operador
Estado no inducido
Capítulo 31. -Replicacion, reparaeion ys re.combinación del DNA ~0.~3 •
El test de Ames sirve para detectar posibles . , carcmogenos
Bruce Ames diseñó un rápido y efectivo ensayo
bacteriano de carcinogenicidad, basado en la elevada
correlación entre carcinogénesis y mutagénesis. Cons-
truyó cepas especiales, para realizar el ensayo, de
Salmonella typhimurium que son hie: (no pueden sin-
tetizar histidina, con lo que son incapaces de crecer en
su ausencia), poseen envolturas celulares carentes de
la capa de lipopolisacáridos, que hace que la Salmone- ·
lla normal sea impermeable a la mayoría de las sus-
tancias (Sección 10-3B), y tienen inactivado el sistema
de reparación por escisión. En estas cepas de prueba,
la mutagénesis se detecta por la reversión al fenotipo
his',
En el test de Ames, "' 109 bacterias de estas cepas
se inoculan en placas de cultivo que carecen de histi-
dina. Normalmente, se usa una mezcla de varias ce-
pas his: de manera que puedan ser detectadas tanto
las mutaciones puntuales como las mutaciones en la
pauta de lectura. Un mutágeno añadido en el medio
de cultivo provoca la reversión de algunas de las
bacterias his: al fenotipo his', lo que se detecta por el
crecimiento de colonias visibles después de 2 días a
37 ºC (Fig. 31-33). La mutagenicidad de una sustan-
cia se mide como el número de colonias que apare-
E. Identíñcacíón de carcinógenos
Es bien sabido que muchas formas de cáncer son pro-
ducidas por la exposición a ciertos agentes· químicos que
son conocidos, por dicha razón, como carcinógenos. Se
ha estimado que el 80 °/o de los cánceres humanos se
inician de esta manera. Existen abundantes pruebas
de que el primer suceso en la carcinogénesis es a
menudo una· lesión en el· DNA (la carcinogénesis se
discute en la Sección 33-4C). Por consiguiente, es
también probable que los carcinógenos sean inducto-
res del sistema SOS en bacterias y, de esta forma,
actúen como agentes mutagénicos indirectos. De he-
cho, existe una elevada correlación entre carcinogéne-
sis y mutagénesis (recuérdese, por ejemplo, la evolu-
ción de la enfermedad xeroderma pigmentosum; Sec-
ción 31-SB).
Actualmente, existen unos 60 000 productos quími-
cos artificiales de interés comercial y "' 1000 nuevos
son introducidos cada año. Los ensayos típicos de
carcinogénesis en animales, donde se exponen ratas o
ratones a niveles elevados del presunto carcinógeno y
. se comprueba la aparición de cáncer, resultan muy
caros y tardan "' 3 años en completarse. Por estas
razones, han sido analizadas relativamente pocas sus-
tancias siguiendo este sistema.
genes del sistema SOS umuC y umuD, junto con
-RecA). El sistema de reparación SOS es, por tanto, un
claro ejemplo de la afirmación de que la superviven-
cia, aún a riesgo de la pérdida de función (y la posible
ganancia de otras nuevas) es mejor, en el sentido
darwiniano, que la muerte.
El sistema de reparación SOS es propenso
a los errores
El sistema de reparación SOS es propenso a los errores
y, por tanto, es · un proceso mutagénico. Más aún, el
daño causado al DNA, que normalmente activa la
respuesta SOS, no es mutagénico en las células de E.
coli recA- que logran sobrevivir. Ello es debido a que
el sistema de reparación SOS intacto es capaz de
volver a colocar las bases en un DNA dañado, incluso
cuando no existe información sobre las bases presen-
tes originalmente (a través de un proceso muy poco
caracterizado en el que participan los productos de los
recA o lexA tenían su sistema SOS activado de forma
permanente. Además, cuando células de E. coli de la
estirpe salvaje son expuestas a agentes que dañan el
DNA o que inhiben la replicación, RecA media la
proteolisis específica de la proteína LexA (22 kD) en
un enlace Ala-Gly. RecA es asimismo activada, al
menos in vitro, cuando se une a DNA monohebra -, (
(inicialmente, se creía que la misma RecA cortaba
proteolíticamente LexA, pero experimentos posterio-
res realizados por John Little indicaron que la RecA
activada estimulaba a LexA a fragmentarse ella mis-
ma). Análisis genéticos posteriores indicaron que una
de las funciones de LexA es actuar como represor de
algunos operones, entre ellos el de recA y el de lexA.
Cynthia Kenyon identificó estos operones controla-
dos por LexA, mediante la inserción del gen lacZ (que·
codifica la P-galactosidasa; Sección 29- lA) en posícío-
nes al azar del cromosoma de E. coli y examinando los
clones que habían incrementado la actividad P-ga-
lactosidasa en presencia de agentes que dañaban el
DNA. En conjunto, 11 genes, incluyendo los genes de
reparación por escisión, uvrA y uvrB, pierden su fun-
ción normal en estos clones (los genes son inactiva-
dos por la inserción de lacZ). El análisis de las secuen-
cias de DNA de los genes reprimidos por LexA reveló
que todos ellos están precedidos por una secuencia
homóloga de 20 nucleótidos, llamada caja SOS, que
posee la simetría palindrómica característica de los
operadores (Sección 29-3B). De hecho, se ha compro-
bado que la proteína LexA se une directamente a la
caja SOS de los genes recA y lexA.
La información precedente sugiere un modelo de
regulación de la respuesta SOS (Fig. 31-32). Durante
el crecimiento normal, LexA reprime fuertemente la
expresión de los genes del sistema SOS. Sin embargo,
cuando se han. producido discontinuidades posrepli-
cativas en el DNA dañado, este DNA monohebra se
une a la proteína RecA y ésta a su vez estimula la
rotura de LexA. Los genes reprimidos por LexA son
entonces activados y dirigen la síntesis de las proteí-
nas del sistema SOS, incluyendo la de la propia LexA
(aunque este represor sigue fragmentándose por la
influencia de RecA). Cuando las lesiones del DNA
han sido eliminadas, RecA deja de potenciar la activi-
dad autoproteolítica de LexA. La LexA recién sinteti-
zada puede entonces funcionar como un represor, lo
cual permite a la célula volver a la normalidad. ·
1044 Sección 31-5. Reparación del DNA
A. Recombinación general
La recombinación general se define como el inter-
cambio de segmentos homólogos entre dos moléculas de
El cromosoma no es únicamente una reserva de
información genética. Si fuera así, la unidad de muta-
ción habría sido el cromosoma entero, en lugar de un
solo gen, ya que no habría manera de separar el gen
mutado del resto de genes del mismo cromosoma.
Los cromosomas, así, acumularían principalmente
mutaciones nocivas hasta llegar a ser inviables. ·
7
·: Desde los primeros estudios genéticos, se conoce.
que los pares de genes alélicos pueden intercambiar
sus posiciones en el cromosoma, mediante un proceso
conocido como recombinación genética (Sección 27-
lC). De este modo, es posible analizar individual-
mente los genes mutados, ya que su propagación no
depende totalmente de la propagación de los genes
con los que se encontraban asociados previamente.
En esta sección, consideramos los mecanismos por
los cuales los elementos genéticos se pueden mover,
tanto entre los cromosomas como en el interior de
ellos.
6. RECOMBINACIÓN Y
ELEMENTOS GENÉTICOS
MÓVILES
uno de los más potentescarcinógenos conocidos, es
producido por mohos que crecen en los cacahuetes
y en el maíz. La comida tostada o quemada, como por
ejemplo la carne asada a la parrilla o el pan tostado,
contiene diversos agentes que dañan el DNA. Así,
con respecto a la carcinogénesis, tal como ya ha escri-
to Ames, "la naturaleza no es benigna".
o o
Aflatoxina B1
1
o
en los pijamas de los niños a mediados de los años
setenta, y que puede ser absorbido a través de la piel;
y la furilfuramida, que fue usada en Japón en los años
sesenta y setenta como un aditivo antibacteriano en
muchas comidas preparadas (y que había pasado dos
ensayos con animales antes de que fuera detectada su
mutagenicidad). Los carcinógenos no están confina-
dos a los compuestos sintéticos, sino que también
pueden ser naturales. Por ejemplo, algunos carcinó-
genos se encuentran en el interior de muchas plantas.
que son comunes en la dieta humana, incluyendo los
brotes de alfafa. La aflatoxina B1,
o o
Tanto las sustancias artificiales como ·
las naturales pueden ser carcínogénícas
Alrededor de un 80 °/o de los compuestos que son
detectados como carcínógenos en los ensayos con
animales son también detectados como mutagénicos
por el test de Ames. Las curvas de dosis-respuesta,
que se generan al ensayar un determinado compuesto
a varias concentraciones distintas, son casi siempre
lineales indicando que no existe un umbral de concen-
tración para la mutagénesis. Algunos compuestos, a los
cuales el hombre se ha encontrado expuesto extensa-
mente, han sido más tarde catalogados como mutagé-
nicos por el test de Ames. Entre .éstos se incluye el
tris(2,3-dibromopropil)fosfato, utilizado como inífugo
cen, descontando las pocas que revierten de forma
espontánea, las cuales aparecen en ausencia de mutá-
geno.
Muchas sustancias que no son carcinógenos . son
convertidas en carcinógenos en el hígado o en otros
tejidos mediante diversas reacciones de desintoxica-
ción (Sección 25-20). Pequeñas cantidades de homo-
genado de hígado de rata se incluyen, por tanto, en el ·
medio del test de .Ames, con la intención de imitar los
efectos del metabolismo de los mamíferos.
Figura 31-33
Test de mutagénesis de Ames. Un disco de papel de
filtro empapado con el mutágeno, en este caso el agente
alquilante etilmetanosulfonato, se coloca sobre el centro
de la placa de cultivo que contiene las cepas de prueba
his- de Salmonella typhimurium, en un medio carente de
histidina. Un halo denso de colonias bacterianas que han
revertido aparece alrededor del disco, del que ha
difundido el mutágeno. Las colonias mayores que
aparecen distribuidas por toda la placa son colonias que
han revertido espontáneamente. Las bacterias más
cercanas al disco han muerto debido a la elevada
concentraclón del mutágeno tóxico. [Tomado de
Devoret, R~. Sci. Am. 241(2): 46 (1979). Copyright ©1979
de Scientific American, lnc.]
Capítulo 31. Replicación, reparación y recombinación del DNA 1045
, , . B a
B'
b
a
• l
' ·.
La recombinación de DN-As dúplex .. circulares con-
duce a las· estructurascuyos diagramas se presentan
en la Fig. 31--36. ·En· la- Fig. 3·1-3i'a, se· muestra la
prueba, obtenida· mediante microscopia electrónica,
de 'la existencia: de la postulada "figura en Bn. Se
demostró que estas estructuras de figura en 8 no son
simples círculos retorcidos. Para ello se cortaron co·n
un enzima de restricción, generándose Ias estructuras
chi (por su semejanza con .. la letra griega X), tal· como
se muestra' en la Fig. 31-37b. - · · ·
'i - L Si se cortan las hebras que no se entrecruzaron, se
intercambian los extremosde los dúplex originales,
formándose, después de cerrarse nuevamente los
cortes, la tradicional- molécula 9-e DNA recombí-
nante (ramal derecho de la Fig. 31-34j~l), - ,
2. Si se cortan las hebras que sé ~ntrecruz.aron! _se_
intercambia un ,par de segmentos homólogos de
DNA monohebra (ramal +, izquierdo de la Figura
31-34j-l)~
alinean ·y son cortt:g.as.:Estas hebras c.ortada~ se entre-
cruzan par~ :~parear~e con las hebras casi comple-
mentarías del dúpl~~: homólogo, formando así un
segmento de DN.A heterodúplex; después· de lo cual
se cierran los cortes. (Fig. 3-li-34a-e). Los estudios de
construcción de modelos .índícan, quizás inesperada-
mente, que las bases de es.ta estructura de Holliday,
formada por cuatro hebras de' DNA, pueden aparear-
se_ por completo.sinproblemas estérícos, de tal mane-
r~ que la estructura entrecruzada es probablemente
estable (Fig. B:i_.;35). :, El, punto. de entrecruzamiento
puede desplazarse .. ~n:· Ut}a ~ ,:Ó.t]''a ·'" dirección, en Un
proceso conocido c9D1Ó la nii8J;,-.:éió~ de las· ramas
(Fig. 31-34e y .!J. ·· -- , · ., ~ · ·.. :: .,_
La estructura de Helliday puede. resolverse de dos ·
maneras con igual ,probabilidad, produciendo dos
DNAs dúplex (Fig. 3J-34g-l):
-~¡ !~~ •·rm~~~
.a b
a
A
f.~~ ~~@$S ~~-.· ·, •.. :·~
a b
A' B
k
......... , .... •~, -: ....... _~s------~-~.-. ---· -~t.¡-~,- _ •' --¡~;1rn'l;l,lfi'J~-_
~~~-- ~~ifflllllll-----
. " --~~--- b -----~ A B A
Fig~·~a 31-34 .
Modelo de Holliday para la
reoombínacíón general entre dúplex de
O-NA hornóloqos.
. '
. .
g
b a
J
B
.. B
~·
A
e ,....,~·"'·,y-:__ ... _, "''"·''l!"R.~...,,--,., ... .,,...,.,,.,,.,.,,,,,.,,....,._
""'''"· ....... ,..- ..... ~.-""~ -"""""""·""""'- ~*°W.i'!r~~~~~ ·~rn~~~ a · · b
' <.J
B A
d
B A
e
ep;tJ~i;.,..,."twf ~/11"'~,~~
~-.:n>~»,§1!,f~--~
a. b
'
B
'
A
. . ~·-1;<;¡;. ~~~-~iif~
1$.líl;;~:Lt'ief'~~~~lf~~
a · b
b
B •• A h
' .
., ~ . ------ ..... -+
A
~
La recombinación tiene lugar a través
de un intermedio de entrecruzamiento . .
El prototipo de la · recombinación general (figura
31-34) fue propuesto "en 19·64··por Robín Holliday a
partir de estudios genéticos sobre. los hongos, Las hebras
correspondientes de dos DNAs dúplex homólogos se
DNA. Tanto estudios genéticos como citológicos han
indicado desde hace tiempo que el proceso del entre-
cruzamiento tiene lugar en los organismos superiores
durante la meiosis (ver Fig. 27·-10). Las bacterias, que
'normalmente son haploides, han elaborado de una
manera parecida mecanismos par:a -el intercambio de
información genética. Así, pueden adquirir DNA exó-
geno- a través de la conjugación (Sección 27-10), la
transducción (Sección 27-lE) y la transformación· (Sec- .. .
ción 2.7-2A). En todos estos procesos, el DNA exógeno
se incorpora al cromosoma o a un plásmido de la célula
receptora mediante recombinacíón general (para ser
propagado, un segmento de DNA debe formar parte
de un replicón; es decir, debe estar asociado a un
origen de replicación, como ocurre- en un cromosoma,
un plásmido o un virus).
1046 Sección 31-6. Recombinación y elementos genéticos móviles
RecBCP inicia la recombinación· produciendo
cortes en '·una de las hebras
· Los cortes en una de las hebras, a los que se une
RecA, son producidos por la proteína RecBCD, pro-
·.
r f
g
f
.. .. ..., .. ; •: ..
•
,
' .
1· ,. .
.: .,. ,.f.' ' .!
~ ~ I •.
-. ,s.··
: ....
. . ·• •: e . , .
•f • ,·,, .• . ~ : ~
" .,· ... ~· ..
,/ ..; ... ..
>.
(
'( ' ' ·'
' ., ,.
.,.. .. ,, .... •.
' . . .•
- . :• "' 'I j,
, ..
" ... ,t_J., • ,~
< . . • .,
•. . . .;..
.. ·- ,, ' , . . < . ' ~ ": ., -. , .,.
' .. •· } ~ ... ,:,~'!,O ,;
.,
.
,, .~· (.
. ,,;. .. ,, ,·. ·"':' •.
, . .. ,. .. ..
... , .. .. ..
' .. . ·, ~
. '
. ,
l
•·
' . -
• • ·~ ,,, lo..
i, v
..
~.., >' ."
. ,
. ..
; '
.. l - ,•.
:.• ' . . •)
r: • :.
#(' •• ~
·': ~ ~- ,,·
'I· •• '!\· < ". ,-..._;.,. .,,1;/ ' . ., : • ..
. ,
.. ..; ,¡•
• 1 • JJ .: ,. . .. : ·-; , .
- ·," .
-'~· .. -, i '"- .. ,. .. . ' . .
r
• 1 ••• --~- • - '! }{.-"~;~ .
'
/.
• r
f .. . ,.;.. .. ;·: : ; .. -. . .. :, ~
.... .
..
' . .
¡, • y t -· ~ i:... • .
~ ! •
b
' -.» !' ' ; ...
!
.... • .> .( .• .,. ~
. -.
'
. , . •"•