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Análisis en toxicología forense TOXICOLOGÍA FORENSE CONCEPTOS GENERALES La ciencia forense no es otra cosa que la aplicación de la química y disciplinas afines a la ley. Pretende examinar las evidencias encontradas en la escena de un delito, para aportar las pruebas que un experto debe presentar ante un tribunal. Entre las diversas prácticas instrumentales emplea- das en el campo de la ciencia forense, particularmente en el análisis de compuestos químicos, las técnicas cromatográficas ocupan un lugar preponderante, sin detrimento de otras prácticas procedimientos de impor- tancia. Considerando esos métodos cromatográficos, la cromatografía de gases (CG) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se destacan, quizá, como las de mayor utilidad. La toxicología forense, por otra parte, es la aplica- ción de la toxicología con propósitos legales. Se dedica, por ejemplo, al examen de especímenes tomados de un individuo fallecido, con el fin de detectar, identificar y cuantificar compuestos tóxicos o sus metabolitos en el cadáver, con lo cual ayudará a esclarecer la causa de su muerte. Dentro de dichos compuestos tóxicos se consi- deran el alcohol, otras drogas de abuso, medicamentos, plaguicidas, disolventes, etcétera. Las muestras biológicas en toxicología forense inclu- yen sangre, orina, riñón, cerebro, hígado, bilis, contenidos gástricos, intestino, bazo y, más recientemente, cabello, uñas, saliva, sudor, pulmón y huesos. Últimamente se han preferido para muchos procedimientos el análisis de cabello y, en menor grado, de uñas, ya que allí per- manecen por más tiempo las drogas, lo cual hace a tales muestras más útiles para la detección a largo término de dichas sustancias. Es importante resaltar que el análisis cromato- gráfico en toxicología forense implica una cuidadosa toma y preparación de muestras, así como la selección de un banco de patrones que servirán de referencia para la confrontación de los resultados obtenidos en las técnicas de cromatografía en capa fina (ccf), CG y HPLC. PRINCIPALES TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN TOXICOLOGÍA FORENSE En el caso de la toxicología forense, como en el de la química en general, se puede hablar de dos tipos am- plios de análisis: cualitativo y cuantitativo. El primero permite conocer cuáles son los tóxicos presentes en una muestra biológica, y el segundo informa acerca de las concentraciones en que se encuentran tales sustancias en los comportamientos biológicos, dato de particular importancia si se tiene en cuenta que en muchas ocasio- nes el efecto es proporcional a la dosis administrada del compuesto en mención. Métodos de análisis cualitativo Existen algunos métodos de análisis cuyo objetivo es informar cuáles compuestos o tipos de compuestos están comprometidos en un caso particular de intoxicación. Esta forma de análisis se conoce con el nombre de análisis cualitativo. Generalmente, el análisis cualitativo es sólo un procedimiento previo en el proceso de identificación del tóxico, ya que es común y a menudo necesario, conocer la concentración en que éste se encuentra presente, pro- pósito que se logra con técnicas más sofisticadas. Entre los métodos de análisis cualitativo más utili- zados se encuentran la ccf y algunas pruebas químicas características de ciertos tipos de compuestos, grupos funcionales o iones metálicos. Cromatografía en capa fina Sobre una placa de vidrio o, más modernamente, una lámina fina de metal maleable e inerte frente a los disol- ventes comúnmente utilizados, se extiende una película 930 • Toxicología delgada de un sólido absorbente, tal como alúmina o sílica gel, sobre la cual se atraparán los compuestos por analizar. Estas placas o cromatofolios se venden comercialmente. A una altura de aproximadamente un centímetro por encima del borde inferior de la placa se aplica con un capilar fino la muestra previamente extraída y preparada. Luego se coloca la placa o cromatofolio en una cámara cromatográfica ya ambientada con el medio eluyente, constituido por el disolvente o mezcla de disolventes que han de separar la muestra que probablemente contiene el principio activo que se sospecha responsable de la in- toxicación, en forma que la superficie del líquido quede por debajo del punto de aplicación. Una vez el líquido asciende y arrastra los componentes de la mezcla en cues- tión, se separan los constituyentes a manera de manchas de formas a veces irregulares, otras regulares, sugiriendo éstas últimas un compuesto puro. En muchas ocasiones se requiere de agentes reveladores especializados para poder visualizar las manchas. Por comparación de los Rf de cada uno de los compuestos separados con los de patrones corridos en idénticas condiciones, se puede identificar la sustancia de la cual se sospecha responsabilidad en la intoxicación. Con este resultado previo, si se considera necesario, se procede a emplear técnicas de análisis cuan- titativo como CG, HPLC o espectrofotometría. La ccf es una técnica especialmente útil en el análisis de insecticidas organofosforados, carbamatos, organoclo- rados, anticoagulantes cumarínicos, barbitúricos, benzo- diacepinas, imipramina, fenotiazinas, etc. Métodos químicos Ver el capítulo pruebas rápidas para identificación de tóxicos. Métodos de análisis cuantitativo El avance de la ciencia ha llevado al desarrollo de técnicas instrumentales más precisas, rápidas y fehacientes, que permiten realizar no sólo un análisis cualitativo sino tam- bién cuantitativo de una muestra determinada. Técnicas como CG, HPLC y espectrofotometría son a menudo utilizadas en el campo de la toxicología forense para sus requerimientos analíticos cuantitativos. A continuación haremos algunos comentarios sobre CG y HPLC, que se erigen como las más usuales de estas técnicas modernas. Cromatografía de gases Esta técnica constituye una herramienta útil y versátil tanto en el análisis cualitativo como cuantitativo de di- ferentes tipos de tóxicos en fluidos y tejidos biológicos. Son candidatos a ser analizados por CG los compuestos volátiles o fácilmente derivatizables a productos rela- tivamente volátiles, cuyo peso molecular no exceda de 500. Entre éstos se encuentran drogas de abuso, etanol y otros alcoholes, agentes volátiles, plaguicidas utilizados en agricultura, disolventes (tolueno, gasolina, benceno, etc., muchas veces inhalados por los niños de la calle), fármacos o sus metabolitos, etc. Existen en la actualidad patrones cromatográficos de gases contra los cuales comparar los datos obtenidos en un análisis, con el propósito de determinar la presencia de un compuesto dado. El dato característico para cada sustancia en la de- terminación cualitativa es el tiempo de retención y el resultado cuantitativo se obtiene de la integración del área bajo la curva de cada pico, dado en los equipos modernos por información computarizada del propio aparato. En general, antes de realizar un análisis cromatográfico o de otro tipo en toxicología forense, se debe proceder a un pretratamiento a manera de preparación de la muestra, que pretende extraer de la matriz biológica el compuesto por analizar y aislarlo de sustancias que difi- cultan el procedimiento, tales como proteinas, así como ajustar el pH y la fuerza iónica para permitir eficiencias de extracción óptimas. Aunque, como se dijo, este pretratamiento es útil para todo tipo de análisis, lo comentaremos aquí por ser ésta una de las técnicas más empleadas. Este proceso abarca una primera etapa de dilución de la muestra (plasma, suero, orina, etc.). Los tejidos, por su parte, son tratados para precipitación de proteínas o digestión enzimática. Compuestos como la morfina, que muchas veces suelen encontrarse conjugados, deben someterse a hidrólisis enzimática, como partedel pretratamiento necesario. Posteriormente, la droga se extrae de la matriz biológica mediante procedimientos de extracción líquido-líquido o extracción en fase sólida. Estos métodos deben opti- mizarse para lograr un máximo de recuperación de cada compuesto en particular. Algunos factores que afectan la recuperación de una droga, son los siguientes: – Selección de la droga. – pH de la muestra. – Propiedades y volumen del disolvente. – Propiedades y volumen del eluyente. – pH y tipo del buffer. Drogas de abuso Una vez la muestra ha sido debidamente extraída, el aná- lisis se comienza con una prueba de radioinmunoensayo o puede abarcar técnicas cromatográficas. En el caso de la CG se acostumbra actualmente utilizar columnas capilares de sílica fundida, gracias a su gran eficiencia de separación, poder de resolución y sensibilidad. Se han recomendado columnas SE-30 u OV-1 como fase estacionaria. Los detectores más usuales son: detector de ionización de llama (FID), Análisis en toxicología forense • 931 detector de fósforo-nitrógeno (NPD) y detector de espectrometría de masas. Cuando se requiere confirmar un resultado croma- tográfico o no existe un patrón con tiempo de retención contra el cual comparar, se puede emplear CG acoplada a espectrometría de masas (CG/EM), con lo cual el compuesto puede ser identificado por una persona de- bidamente entrenada. Las anfetaminas Constituyen, quizás, el grupo de estimulantes del SNC más abusados y, por tanto, a menudo se encuentran en análisis toxicológicos. Generalmente estos compuestos pueden identificarse empleando columnas capilares con temperaturas de horno relativamente bajas (150ºC) y FID. Este detector, sin embargo, registra muchos com- puestos que pueden molestar en la identificación de los productos de interés. El empleo de NPD aumenta la especificidad y, así, disminuye el número de picos registrados; esto es especialmente útil en caso de que se requiera un análisis de muestras biológicas que contienen un bajo nivel de anfetaminas. Si se considera necesario, pueden derivatizarse las anfetaminas, empleando ácido trifluoroacético o, mejor aún, transformándolos en deri- vados tricloroacetil. Recientemente se ha empleado el método de CG/espectroscopia IR con transformada de fourier para la identificación de anfetaminas a nivel de picogramos. Los barbitúricos Acostumbran convertirse a sus N, N1-dimetilderivados para obtener mejores cromatogramas. Suelen emplearse columnas empacadas y columnas capilares. Las benzodiacepinas Frecuentemente prescritas como ansiolíticos, son, por lo mismo, drogas de cierto nivel de abuso. Su detección se hace principalmente en orina, ya que allí los niveles son superiores a los de plasma. Estos compuestos normalmen- te se excretan como glucurónidos y requieren hidrólisis ácida o enzimática, lo cual produce la correspondiente benzofenona, que se identifica por CG/EM. A partir de la benzofenona se puede, generalmente, deducir la benzodiacepina de origen. Sin embargo, algunas ben- zodiacepinas producen la misma benzofenona, lo que impide identificar con certeza el compuesto inicial. En tales casos, la benzodiacepina se convierte a su trimetilsilil derivado. El detector de captura de electrones (ECD) ha resultado especialmente útil en el análisis de este grupo de compuestos. Compuestos como los Aines (antiinflamatorios no esteroides), entre los que se encuentran el ácido acetilsali- cílico, ibuprofén, indometacina y otros, y el acetaminofén, son frecuentemente detectados en toxicología forense. El análisis por CG de estos compuestos requiere, preferi- blemente, la formación previa del correspondiente metil derivado empleando CH 3 I y K 2 CO 3 . El alcohol etílico Y otros agentes volátiles son fácilmente analizados por CG. A menudo resulta necesario realizar un examen de alcohol en sangre de un individuo que conduce un vehículo, con el fin de apoyar una investigación acerca de los factores contribuyentes de un accidente. Se hace indispensable conocer la concentración de alcohol en san- gre no sólo en personas que han consumido únicamente esta droga, sino cuando se ha comprobado la presencia de otros depresores del SNC, ya que el efecto depresor del alcohol se potencia con el de otras drogas también depresoras, tales como barbitúricos, benzodiacepinas, etc. En el análisis cromatográfico de gases para el etanol se pueden emplear detectores como FID, de masas y de conductividad térmica (TCD), y fases polares emplea- das con columnas empacadas. Estas fases comúnmente empleadas pueden ser Porapak Q/S, Carbomax 20 M y Carbomax 20 M sobre Carbopak B. En algunos casos deben ejecutarse maniobras previas, tales como destilación, precipitación de proteínas o ex- tracción con disolventes para separar el etanol. Entre los agentes volátiles que algunas veces son tema de análisis forense por CG se encuentran monóxido de carbono, querosene, enflurano, metanol, propano, tolueno y otros. Cromatografía líquida de alta presión (HPLC) Pese a que la cromatografía de gases es mucho más versátil que la HPLC, esta última se constituye en una herramienta fundamental cuando se trata de analizar sustancias no volátiles o de elevado peso molecular. Compuestos iónicos como aminoácidos, sales inorgá- nicas, ácidos inorgánicos no derivatizados, polímeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, pro- ductos termolábiles como vitaminas, pesticidas, este- roides, plastificantes, drogas y fármacos, son fácilmente detectables por HPLC. Un ejemplo claro de la aplicación de HPLC en to- xicología forense es la determinación de insecticidas, causa frecuente de intoxicaciones. El tratamiento previo de la muestra que ha de someterse a HPLC es similar al descrito para el caso de la CG. Los detectores más usuales en HPLC son los de índice de refracción, de luz ultravioleta y de fluorescencia. De éstos, el detector de luz ultravioleta se erige, quizá, como el más utilizado en el trabajo de análisis bioquímico y toxicológico, ya que muchos de los compuestos de inte- rés en estos terrenos absorben intensamente en la región ultravioleta (254 o 280 n.m.). 932 • Toxicología BIBLIOGRAFÍA GOB, R., et al. Modern Practice of Gas Chromatography, Tercera Edición, John-Wiley and Sons. N.Y., 1995. MCDONALD, P.A.; GONGH, T.A. Analitical Methods in Forensic Chemistry, Matt Ho (Ed.), Ellis Horwood, Chichester, UK, 1990. GONGH, T.A. The Analisis of Drug Abuse, Wiley-Interacience, NY, 1992. 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