Vista previa del material en texto
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO INDUSTRIAL Manual de Laboratorio CARRERA: Licenciatura en Química Industrial. 2024 Lic. Cyndi Páez Lic. Gloria Viveros UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 PRESENTACIÓN El presente Manual de prácticas de Análisis Microbiológico Industrial va dirigido a estudiantes que cursan la carrera de Lic. Química Industrial, el cual se utilizará como guía de las prácticas a desarrollar en la asignatura. La Facultad de Ciencias Químicas con la elaboración del Manual de prácticas, ofrece una herramienta en la que se encuentran los conocimientos básicos con los que se debe dar inicio a la investigación bibliográfica básica y/o complementaria, indicada por los profesores asignados, bajo las siguientes recomendaciones: ✔ Manejar el Manual de Prácticas como texto base informativo, acerca de los contenidos mínimos sobre la asignatura en cada sesión de clase. ✔ Utilizar el Manual de Prácticas como guía en el cumplimiento de los objetivos de la asignatura. ✔ Elaborar observaciones de las prácticas realizadas para cada unidad facilitando su estudio. ✔ Realizar tareas utilizando la bibliografía recomendada. ✔ Complementar la elaboración de las prácticas con tiempos que no interfieran con los horarios de otras asignaturas. COMPETENCIAS ● El análisis y control de calidad de materias primas e insumos nacionales e importados, productos en proceso manufacturados en industria ● El análisis y control de calidad en agua, suelo y tratamiento de efluentes industriales ● La supervisión y ejecución del control de calidad de proceso de fabricación de productos para el mercado consumidor UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 PONDERACIÓN DE NOTAS PARA PROMEDIO DE LABORATORIO Ítem Peso Informes (puntaje grupal) 15% Pruebas pre – laboratorio (puntaje individual) 15% Primer examen parcial (puntaje individual) 25% Segundo examen parcial (puntaje individual) 25% Trabajo colaborativo (puntaje grupal) 20% Total 100% CRITERIOS PARA LA PRESENTACIÓN DE INFORMES 1. Título y número de la práctica (0.1 P) 2. Nombre de la muestra (0.1 P) 3. Nombre del analista (0.1 P) 4. Fecha, día, temperatura (0.1 P) 5. Cálculos (0.3 P) 6. Resultados de la práctica (0.3 P) Nombre del microorganismo Límite máximo (citar Norma Microbiológica) Resultado Aerobios mesófilos 105 ufc/mL 106 ufc/mL Coliformes totales 102 ufc/mL 103 ufc/mL Coliformes fecales Ausencia/mL 102 ufc/mL UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 # Colocar la fuente de la cual se extrae la información, y agregar la norma o criterio microbiológico como anexo en cada informe 7. Conclusión (0.3 P) 8. Bibliografía (formato APA) (0.1 P) 9. Anexo (Norma Consultada). Resaltar determinaciones. (0.1 P) NORMAS ESPECIALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ANÁLISIS INDUSTRIAL Es imprescindible, especialmente cuando se procede a la toma de muestra, realización de siembras y otras técnicas de laboratorio similares: Es sumamente necesario protegerse con guardapolvo blanco cerrado, mangas largas. Nunca llevar puesto al salir del laboratorio. Antes de ingresar al laboratorio dejar los objetos personales (mochila, celulares, libros, etc.) en la zona indicada por el profesor. Evitar entradas y salidas en el laboratorio con una frecuencia innecesaria, procurando preparar previamente material, medios de cultivo, etc. En la cantidad que se vayan a utilizar. El lavado de manos y el cepillado de uñas serán cuidadosos y frecuentes, utilizando agua, jabón y posteriormente el rociado de las manos con alcohol de al 70%. El secado se hará con toallas desechables. En el caso de los varones que trabajasen en el laboratorio, los mismos se deben presentar al recinto de trabajo: afeitado, y con pelo corto o recogido durante el UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 trabajo. En el caso de las mujeres con pelo largo, igualmente conviene que lo lleve recogido mientras trabaja. No utilizarán reloj, pulseras, anillos, aros y las uñas deben estar cortas y sin esmalte. Evitar hablar, toser, estornudar, etc., durante las fases analíticas más delicadas (toma de muestra, siembras, etc.) siempre que no sea estrictamente inevitable y, en este caso, nunca sobre el trabajo que se esté realizando, sino fuera de su área. Evidentemente no se podrá fumar en el laboratorio ni en sus proximidades. También se evitará comer. Mientras se realiza el análisis, sobre todo en las fases más delicadas del mismo en cuanto a peligro de contaminación se refiere, se evitará tocar con las manos la ropa, cara, pelo, objetos personales como bolsos, pañuelos, etc. Se evitará estrechar la mano a posibles visitas, abrir grifos, abrir y cerrar puertas, y tocar el teléfono y todo aquello que exija contacto manual ajeno al análisis cuando se están ejecutando fases delicadas de éste. El lavado de manos y el cepillado de uñas serán cuidadosos y frecuentes. El secado se hará con toallas desechables. Los cultivos bacterianos inservibles se someterán a esterilización en autoclave para que los tubos, matraces, etc., donde estaban contenidos se puedan lavar sin peligro y ser nuevamente utilizados. La manipulación de muestras y otras operaciones delicadas se pueden llevar a cabo en cámaras de flujo laminar. Teniendo en cuenta la posibilidad de que las mesas de trabajo estén contaminadas, en ningún caso se depositarán pipetas ni objetos personales sobre ella. Para evitar la contaminación por corriente de aire, no se recomienda las salidas constantes del laboratorio. Cuando utilice el mechero el estudiante deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos así como sus cuadernillos. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificar de inmediato al profesor. En caso de derrames de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento de colocar toallas de papel sobre el material derramado y poner abundante desinfectante sobre las toallas de papel. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 Al concluir cada práctica deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contaminados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicará el profesor. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 1. OBJETIVO Describir los procedimientos para la preparación de medios de cultivo. Conocer los distintos tipos de esterilización de los materiales de laboratorio. 2. ALCANCE Este método aplica para la preparación de medios de cultivo para el análisis microbiológico de producto terminado, producto en proceso, agua tratada y no tratada. 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO Un medio constituido de compuestos químicos conocidos llamado medio químicamente definido o sintético. Agar nutriente, caldo simple y otros medios que contienen peptona y extractos de carne u otros tejidos no son químicamente definidos. Estos extractos son constituidos de una variedad compleja de sustancias, incluyendo aminoácidos, vitaminas y carbohidratos. Medios químicamente definidos para el crecimiento de algunas bacterias. Los medios de cultivo se denominan habitualmente como no selectivos, selectivos, diferenciales o selectivos – diferenciales. Los medios no selectivos son nutritivamente muy ricos y se emplean comúnmente para enumerar la microbiota total o transferir y mantener los microorganismos en cultivos puros. Un medio selectivo- La termorresistencia de esta misma flora. La temperatura óptima de crecimiento. ● .3 Incubación: La incubación se realiza posteriormente cuando el examen externo de los envases no alterados se someten al control de la estabilidad. La incubación tiene por objeto: 1- Permitir la germinación de los esporulados aletargados. 2- Conseguir el crecimiento de microorganismos mesófilos, utilizando tiempos de incubación prolongados, a temperaturas adecuadas. 3- Conseguir el crecimiento de microorganismos termófilos, utilizando tiempos de incubación limitados, a temperaturas adecuadas (55 ºC durante 10 días como máximo), para evitar el fenómeno de la auto esterilización de la conserva. Se hacen tres grupos con las unidades de muestra del mismo lote que se va analizar: - Grupo A al que se le aplica temperatura de mesófilos. - Grupo B al que se le aplica temperatura de termófilos. - Grupo C al que permanece a temperatura ambiente y sirve de testigo. 7.0 TAMAÑO DE LA MUESTRA Tomar un volumen representativo del lote de producción según tabla de muestreos aleatorios. 8.0 TRANSPORTE No es necesario el transporte refrigerado. 8.0 PROTOCOLO PARA EL ANALISIS DE AGUA -Recuento de colonias aerobias a 37ºC. -Investigación y recuento de coliformes Totales y Fecales -Identificación de Escherichia coli. -Investigación de clostridium Sulfito reductores. - Investigación de Bacillus esporulados UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 9.0 MEDIOS DE CULTIVO - Caldo triptona almidón soluble - Agar EMB: Confirmación de E. coli. - Agar. clostridium Sulfito reductores- Agar PCA- Agar Bacillus Cereus 10.0 PROCEDIMIENTO - Se extrae el producto para hacer un examen minucioso de la parte interna del envase, con el fin de descubrir posibles alteraciones del color de las paredes debidas, generalmente a reacciones químicas, así como lesiones de oxidación y desprendimiento del esmalte protector. - Examen bacteriológico: Consiste en examinar microscópicamente el contenido de las muestras incubadas y la testigo no incubada. En las conservas, los gérmenes se pueden controlar de tres formas: Vegetativas, Esporuladas, Muertos. - Seguir el protocolo de análisis para identificación microbiológica de microorganismos. 11.0 INSPECCIÓN VISUAL Consiste en observar la posible modificación de los caracteres organolépticos del producto conservado, comparando conservas incubadas con testigos sin incubar. Olor , Aspecto, Color UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES Y AMBIENTES 1. OBJETIVO ● Describir los procedimientos para el análisis microbiológico de superficies y ambiente. 2. ALCANCE Este protocolo se aplica para la toma de muestra y el análisis microbiológico de superficies y ambientes en contacto con el área de elaboración de alimentos 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los microorganismos están presente en el medio ambiente (entorno) y en las superficies donde se procesan alimentos contribuyen a la micro biota de los mismos. Un entorno extremadamente contaminado conduce a la obtención de los productos de mala calidad. Por ello, se toman muestras para realizar el análisis microbiológico del ambiente y de la superficie en vez de alimentos. Los microorganismos generalmente no están flotando en el aire sino que se encuentran sobre partículas inertes, por ejemplo polvo, gotas de agua, etc. Que le sirven como medio de transporte, y pueden encontrarse aislados o agregados. BIOFILMS: Son comunidades universales, complejas, interdependientes, de microorganismos de superficie asociado y generalmente formado por múltiples especies. Muestreo del ambiente: La técnica de muestreo depende de la naturaleza del sitio, grado de contaminación y de la información microbiológica que se pretende obtener. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Muestreo de superficies: El análisis de los contaminantes microbianos localizados en las superficies que contactan con los alimentos es muy importante. Una superficie de este tipo puede ser parte de un equipo, material envasado, sala de maduración, la mano del manipulador de alimentos y otras. Las superficies que no contactan directamente con los alimentos pueden también ocasionar la contaminación del producto. Entre estos cabe citar cierres, paredes, suelos y vestuario de los operarios 4. INTERFERENCIAS Productos químicos y sustancias inhibidoras sobre superficies a muestrear. 5. SEGURIDAD Todos los alumnos deben cumplir con los estándares de seguridad de la Facultad de Ciencias Químicas. 6. MEDIOAMBIENTE Todos los desechos generados deben llevarse al autoclave en recipientes correctamente rotulados antes de disponerlos. 9. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 1 Agar E.M.B 2 Agar P.C.A 3 Agar Saboraud .4 Agua peptonada 5 Agua Destilada estéril - 10. PROCEDIMIENTOS . 1- Método de Torunda: Habitualmente se utiliza torunda de algodón. La torunda tiene en el extremo una cabeza de algodón unida a una varilla de madera. El analista puede confeccionar la torunda de algodón y esterilizarla pero también lo puede adquirir estéril y envuelta. a) Realizar el muestreo de manos con la torunda embebida con el caldo de dilución b) Introducir solo la parte de la torunda que ha tomado la muestra dentro del frasco estéril conteniendo el caldo de dilución c) Inocular 0.1ml del caldo sobre agar PCA. Realizar el extendido. Incubar a 37º C por 24 a 48 horas UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 d) Inocular 0.1 ml del caldo sobre agar EMB. Realizar el extendido. Incubar a 37º C por 24 a 48 horas 2- Muestreo del aire: Los microorganismos pueden pasar al aire debido a ciertas actividades, como pulverización del agua, manipulación de ingredientes secos o por movimientos vigorosos del aire. Las partículas de polvo suspendidas en el aire pueden vehicular microorganismos. Los mohos y las bacterias son contaminantes muy comunes del aire. a) La sedimentación es un método muy simple de estimar la calidad del aire. El método implica la exposición al aire de placas rellenas con un medio de agar, dejándola sin tapar en los lugares en los que se desee tomar la muestra por un periodo de 15 minutos b) Incubar las placas a la temperatura y tiempo correspondientes. c) Realizar el recuento de colonias que es proporcional al nivel de contaminación del aire. 3- Método de la esponja: Si la superficie que va a muestrearse es amplia o se espera que el microorganismo que se pretende analizar tiene una baja incidencia en el entorno de instalación. (Ej. Salmonella), puede utilizarse una esponja en vez de la torunda de algodón. El analista puede introducir la esponja en la bolsa termo resistente o envolverla en hoja de aluminio para su esterilización o puede adquirir del comercio empaquetado y pre esterilizado. ANALISIS MICROBIOLOGICO DE BEBIDAS Y FERMENTACIÓN INDUSTRIAL 1. OBJETIVOS ● Describir técnica de muestreo de no alcohólicas y alcohólicas ● Determinar la presencia de microorganismos contaminante ● Realizar el conteo de microorganismos contaminantes por el método de vertido en placa. 2. ALCANCE Este procedimiento se aplica a la toma de muestra de, bebidas y fermentación industrial. Como al análisis microbiológico y la interpretación de resultados. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO Entre las bebidas no alcohólicas se encuentran las bebidas refrescantes (Zumo de frutas, concentrados de zumos de frutas, bebidas a base de zumo de frutas, bebidasa base de extractos naturales como limonadas, colas, tónica, etc.) De todas ellas, son los zumos de frutas los más ricos en sustancias nitrogenadas y vitaminas; el grupo de limonadas, sodas, poseen muy escasa cantidad de las citadas sustancias. Por su composición, es evidente que son las bebidas a base de zumos de frutaslas más sensibles a las contaminaciones. Las bebidas elaboradas con extractos naturales (limonadas, soda, etc.) debido a: Su bajo pH (3 - 4) Alta tasa de CO2 Su débil cantidad de sustancias nitrogenadas y vitaminas. Su falta de oxígeno Su concentración de Azúcar. Constituyen medios desfavorables para el desarrollo de los microorganismos. Los gérmenes presentes en las bebidas refrescantes proceden de: La materia prima La materia prima suplementaria El equipo que se utiliza en la elaboración El ambiente. La multiplicación de los microorganismos patógenos para el hombre en los zumos de frutas es prácticamente imposible, dado su bajo pH. No obstante, puede ocurrir que los posibles gérmenes patógenos sobrevivan y se desarrollen si la acidez de los zumos se neutraliza al ser mezclados con otras sustancias. Por esta razón, interesa investigar la posible presencia en estos productos de bacterias testigos de contaminación fecal y cierta flora patógena UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 4. MATERIAL NECESARIO EN EL MUESTREO. Los envases para la toma de muestra deberán estar perfectamente limpios, secos y estériles. Su tamaño guardará relación con la muestra que se vaya a tomar. Serán herméticos e inaccesibles a cualquier contaminación posterior a su esterilización. Se pueden utilizar: - Envase de vidrio de boca ancha - Envases de plásticos esterilizables. - Bolsa de plástico estériles. 5. TOMA DE MUESTRA La muestra deberá ser representativa del lote de producción. 6. TAMAÑO DE LA MUESTRA Tomar un volumen representativo del lote de producción según tabla de muestreos aleatorios. 7. TRANSPORTE No es necesario el transporte refrigerado. 8. PROTOCOLO PARA EL ANALISIS DE AGUA -Recuento de colonias aerobias a 37ºC. -Investigación y recuento de coliformes Totales y Fecales -Identificación de Escherichia coli. -Investigación de clostridium Sulfito reductores. - Investigación de mohos y levaduras 9. MEDIOS DE CULTIVO - Caldo triptona almidón soluble - Agar EMB: Confirmación de E. coli. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 - Agar. clostridium Sulfito reductores - Agar PCA – Agar Sab 10. PROCEDIMIENTO En el caso de bebidas gaseosas, el análisis se efectuará después de la desgasificación, para lo cual se vierten 50 ml aproximadamente de la muestra enun matraz erlenmeyer estéril con perlas de vidrio. Se disuelve y elimina el gas agitando el matraz durante algunos minutos a temperatura ambiente. En los productos muy ácidos, se neutralizan la muestra con fosfato tripotásico al 20 por ciento. A partir de la muestra, se prepararán las diluciones decimales, utilizando como diluyente agua de triptona CERVEZA; La fabricación de la cerveza ha dejado de ser un quehacer artesanal para convertirse en un negocio descomunal con sólidos fundamentos científicos, financieros, comerciales e industriales y que requiere para su supervivencia de un estricto control de calidad especialmente en lo referente al Control Microbiológico de la Planta. El control microbiológico se ocupa del estudio y determinación de los microorganismos diferentes a la levadura cervecera cultivada que pueden invadir nuestrasinstalaciones y producto con nefasta influencia sobre la calidad de la cerveza. Por infección microbiológica de la cervecería entendemos el trabajo indeseado de organismos extraños que desnaturalizan la calidad de nuestro producto. Para garantizar un proceso libre de gérmenes extraños siempre será mejor prevenir que curar siendo lo primero y casi único mantener los equipos e instalaciones en un perfecto estado de aseo y limpieza porque los elementos contaminantes casi siempre se ubicarán en tanques, tuberías, mangueras, etc. Es necesario también extender todos estos controles a los equipos y las materias primas incluyendo el agua, malta, triturados, lúpulos, etc. Los principales enemigos biológicos del proceso cervecero son los Mohos, las Levaduras Salvajes y las Bacterias. Y los medios de cultivo para detectarlos son: Mosto Lupulado, Agar y Gelatina UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Las levaduras cultivadas tienen, en condiciones normales, forma ovoide mientrasque si detectamos una levadura de forma esférica podemos sospechar que se trata de una levadura salvaje. En cuanto al examen microscópico de las bacterias debemos tener presente que ellas pueden ser de diferentes formas tales como: cocos, diplococos, estreptococos, pediococcus, estafilococos, bastones largos o cortos y tener también forma de sarcinas. Un Plan de Control Biológico incluye la periódica toma de muestras a lo largo de todo el proceso para su análisis directo al microscopio y a través de medios de cultivo adecuados para lograr la detección y el crecimiento de colonias que muchas veces no son observables en fresco y en directo. Las Plantas cerveceras siempre contarán con los servicios de un Microbiólogo o Bacteriólogo que se encargará de estos análisis y controles. Sin embargo la experiencia nos puede dar a los cerveceros pistas seguras como las siguientes. 1.- Una turbidez casi siempre es producida por bacterias ácido-lácticas o por cocos 2.-Una coloración roja con sedimento en el mosto cultivado será debida a bacterias. 3.-Sedimentos granulados son producidos por mohos 4.-Una película sin sedimento se deberá a levaduras Kahn o bacterias ácido-acéticas 5.-Películas con sedimentos, a levadura salvaje o bacterias. El aroma u olor nos guiará también en la identificación de los contaminaciones microbiológicas: a) Las levaduras Khan producen un olor a frutas b) Las bacterias thermo producen un olor a apio c) Las bacterias ácido-acéticas dan un olor acre a la cerveza d) Las bacterias ácido-butíricas dan un olor a sudor ANALISIS MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS FARMACEUTICOS 1- OBJETIVO UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 ● Al finalizar el trabajo práctico, el estudiante estará en capacidad, mediante la consulta bibliográfica y la aplicación de las técnicas microbiológicas, de realizar el control microbiológico de materias primas y productos farmacéuticos 2- FUNDAMENTO Consiste en determinar el número de bacterias aerobias mesófilas y el número de mohos y levaduras en materias primas y productos farmacéuticos no estériles, y realizar la investigación de los microorganismos objetables que puedan estar presentes en ese producto, mediante técnicas de siembra en placas. Durante el proceso de fabricación, almacenamiento y uso, los medicamentos son susceptibles de contaminarse con microorganismos como bacterias, mohos y levaduras, y por consiguiente se pueden deteriorar La contaminación de los productos farmacéuticos, representa un riesgo para la salud del usuario; este riesgo se relaciona con la severidad de la infección o enfermedad que los microorganismos contaminantes, patógenos u oportunistas, pueden producir .Por otra parte, el deterioro microbiano podría conllevar a cambios en las características físicas y químicas que conducirán a que el producto deteriorado no sea apto para ser usado. Es por ello, que las materias primas y los productos farmacéuticos terminados, deben ser sometidos a un análisis microbiológicoque demuestre que cumplen con ciertas especificaciones establecidas por los organismos oficiales, para garantizar que los productos son adecuados para el uso al que están destinados Este análisis o control microbiológico de las materias primas y de los productos medicamentosos no estériles, involucra la realización de dos tipos de ensayos; a. Recuentos microbianos, referidos básicamente al recuento total de bacterias aerobias mesófilas y/o recuento de mohos y levaduras. b. Investigación de microorganismos patógenos objetables, llamados también indicadores específicos, como Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus A- NUMERACIÓN DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS. RECUENTO EN PLACAS (MÉTODO DEL VACIADO EN PLACAS). MATERIALES Muestras de materias primas y medicamentos Placas estériles Pipetas estériles de 1 mL y de 10 Ml Tubos de agar soya-caseína (18-20 mL) fundido y enfriado a 45-50ºC Frascos de dilución con buffer fosfato pH 7.2 Baño de María a 45-50ºC Estufa o incubadora UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Contador de colonias PROCEDIMIENTO 1. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra homogeneizada por agitación, y añadirlos a un frasco de dilución que contiene 90 mL de buffer fosfato pH7,2 estéril. Agitar el frasco vigorosamente (25 veces). Rotular 10-1. 2. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la dilución 10-1a un frasco de dilución con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estéril. Agitar. Rotular 10—2 3. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la dilución 10-2a un frasco de dilución con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estéril. Agitar. Rotular 10--3. 4. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10-1a cada una de 2 placas de Petri estériles. 5. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10-2a cada una de 2 placas de Petri estériles. 6. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10-3a cada una de 2 placas de Petri estériles. 7. Verter en cada una de las placas, 15 mL de agar soya caseína, fundido y enfriado a 45ºC, mezclando cuidadosamente las muestras con el agar. Dejar solidificare incubar en posición invertida a 37ºC por 48 horas. B-NUMERACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS. MATERIALES Muestras de materias primas y medicamentos Placas estériles Pipetas estériles de 1 mL y 10 mL Tubos de agar Sabouraud o papa-glucosa (18-20 mL) fundido y enfriado a 45-50ºC. Frascos de dilución con buffer fosfato pH 7.2 Mechero Baño de María a 45-50ºC Estufa o incubadora Contador de colonias PROCEDIMIENTO Proceder de la misma forma descrita para la numeración de bacterias aerobias mesófilas, pero utilizando agar Sabouraud o agar papa-glucosa, en vez de agar soya caseína, e incubar las placas (sin invertir) a 20-25ºC por 5 a 7 días. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 C-INVESTIGACIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS OBJETABLES INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA (GÉNERO) Y ESCHERICHIA COLI .MATERIALES Pipetas de 10 mL y de 1 mL Placas estériles Caldo lactosado (90 mL) Caldo tetrationato Caldo selenito cistina Agar verde brillante Agar desoxicolato Agar sulfito bismuto Agar triple azúcar hierro (TSI)Agar Mac Conkey Agar Levine Asa y filamento Mechero Equipo para coloración de Gram Estufa PROCEDIMIENTO Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra a un balón que contiene 90mL de caldo lactosado. Incubar a 30 - 35ºC por 24 a 48 horas. Aislamiento de Salmonella 1. Agitar la mezcla incubada y transferir 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo selenito-cistina y 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo tetrationato. Incubar a 35ºC por 12 - 24 horas. 2. Después del período de incubación, mediante un asa, hacer aislamientos a partir de los caldos selenito-cistina y tetrationato a los agares verde brillante, desoxicolato citrato y sulfito-bismuto. Incubar a 35ºC por 24 - 48 horas. 3. Notar la presencia de colonias típicas de Salmonella : Agar verde brillante: Pequeñas, incoloras, rosadas y fucsias, transparentes u opacas, sobre el medio coloreado de rosado a rojo Aislamiento de E. coli. 1. Con un asa, hacer un aislamiento a partir de caldo lactosado, a agar Mac Conkey. Incubar a 35ºC por 24 horas. 2. Las colonias de coliformes en agar Mac Conkey son de color rojo ladrillo, even-tualmente rodeadas de zonas de bilis precipitada. 3. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de coliformes. 4. Si hay colonias típicas, trasplante una de estas colonias a agar eosina-azul de metileno-lactosa, según Levine. Incubar a 35ºC por 24-48 horas. Las colonias de E. coli en este medio, se caracterizan por dar color negro azulado al trasluz y brillo metálico dorado verdoso a la luz incidente Investigación de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa . MATERIALES Pipetas de 10 mL UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Placas estériles Caldo Soya Caseína (90 mL) Agar Vogel-Johnson (o Baird Parker o manitol sal)Agar nutritivo inclinado Plasma EDTA (para coagulasa)Caldo cerebro corazón Agar cetrimide Papel de filtro Reactivo N,N-dimetil-p-fenilen diamonio dicloruro Asa y filamento Mechero PROCEDIMIENTO Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la muestra a un balón que contiene 90mL de caldo soya-caseína. Incubar a 30 - 35ºC por 24 - 48 horas. Aislamiento de Staphylococcus aureus. 1. Agitar la mezcla incubada y mediante un asa hacer aislamiento a agar Vogel-Johnson (o agar Baird-Parker o agar manitol sal). Incubar a 35ºC por 24-48 horas Las colonias típicas de Staphylococcus aureus en agar Vogel-Johnson o enagar Baird-Parker, son pequeñas, negras, rodeadas de una zona amarilla Efectuar la prueba de coagulasa de la siguiente forma: En un tubo de Wassermann colocar 0,5 mL de Plasma EDTA (para coagulasa) reconstituido; añadir 2 gotas (0,1 mL) del cultivo de 24 horas del microorganismo desarrollado en caldo cerebro corazón. Incubar en baño de agua a 37ºC, durante 3 horas. Examinar al cabo de este tiempo y luego periódicamente durante 24 horas, para comprobar la formación de coágulos; cualquier grado de coagulación, por pequeño que se a , se considera positivo. Si no se observa coagulación, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus. 1.0 OBJETIVOS ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA SUPERFICIALES ● Describir técnica de muestreo de Aguas Superficiales ● Determinar la presencia de microorganismos contaminante ● Realizar el conteo de microorganismos contaminantes por la técnica de número más probable 2.0 ALCANCE Este procedimiento se aplica a la toma de muestras de aguas superficiales. Como el análisis microbiológico y la interpretación de resultados. 3.0 PRINCIPIO DEL MÉTODO UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Parámetros biológicos del agua: El agua es un recurso natural necesario para el desarrollo de un gran número de actividades humanas. Su creciente degradación por disminución de su calidad implica la reducción del número de usos que se le da; es por ello, lo que se hace necesario la realización de estudios que permitan determinar la calidad de esa agua. Los análisis que sepueden realizar al agua para controlar su calidad son: físicos, químicos y microbiológicos, en esta ocasión se hará una determinación microbiológica. Todos los organismos que se encuentran en el agua son importantes en el momento de establecer el control de la calidad de la misma sin considerar si tienen su medio natural de vida en el agua o pertenecen a poblaciones transitorias introducidas por el ser humano; si su crecimientolo propician los nutrientes presentes en el escurrimiento natural y en aguas residuales municipales o lo frenan los contaminantes procedentes de la actividad agrícola o industrial; y si tienen capacidad para intoxicar a las personas y a los animales superiores. Se debe conocer la forma de los patógenos hídricos y determinar su presencia y origen, la magnitud y oscilación de su número, el curso de su ciclo vital y el índice de su supervivencia. Los parámetros biológicos en las aguas potables son de mucho interés, los microorganismos que puede haber en el agua son virus, bacterias, hongos, algas y protozoos. Aquellos que son inocuos para el hombre no tienen significación sanitaria, por lo que el control microbiológico del agua se va a centrar en las especies patógenas para el nombre. Dado que buscar todo tipo de microorganismos patógenos, por su diversidad, es costoso y complicado y como la relación patógenos/no patógena es muy pequeña, se realiza un control del agua a través de indicadores microbiológicos de contaminación. Hay muchos seres vivos que se emplean como indicadores de la calidad de un agua. Así, según predominen unos organismos u otros, podremos saber el estado de un agua. Para que un microorganismo sea considerado como indicador microbiológico ha de reunir unas condiciones que son: ∗ Debe ser incapaz de desarrollarse en el agua. ∗ Debe tener una supervivencia en el agua superior a los organismos patógenos. ∗ Debe soportar mejor a los desinfectantes. ∗ Deben ser fáciles de aislar, identificar y contar. ∗ Deben ser muy abundantes en heces y escasos en otros medios. La normativa recoge una serie de análisis microbiológicos según se efectúe sobre el agua un análisis mínimo: Coliformes Totales y Fecales, bacterias aerobias a 37 ºC, Estreptococos Fecales y Clostridium Sulfito-Reductores, microorganismos parásitos y/o patógenos. 4.0 EQUIPOS, REACTIVOS Y MATERIALES Equipos portátiles para mediciones de temperatura, pH y conductividad UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Eléctrica. Antes de salir a campo verifique su funcionamiento y efectúe la Calibración preliminar (en campo se hará una nueva calibración). Neveras de hisopor con suficientes bolsas de hielo para mantener una Temperatura cercana a 5°C. Frasco lavador. Toalla de papel absorbente. Cinta de enmascarar. Marcador de tinta indeleble. 5.0 TOMA DE MUESTRAS DE AGUAS SUPERFICIALES 5.1 Condiciones del muestreo Frascos de vidrio con tapón esmerilado, frascos estériles desechables o bolsas estériles con cierre hermético y capacidad de 125 o 250 ml. Esterilización de frascos para muestras de agua sin cloro residual libre. Deben esterilizarse frascos de muestreo en estufa a 170ºC, por un tiempo mínimo de 60 min. En autoclave a 120ºC durante 15 min antes de la esterilización debe cubrirse el tapón del frasco con papel resistente a ésta, en forma de capuchón Esterilización de frascos para muestras de agua con cloro residual libre. Previo a la esterilización agregar 0.1 ml de tiosulfato de sodio al 3% por cada 120 ml de capacidad de los mismos. 5.2 Toma de muestra Deben lavarse manos y antebrazos con agua y jabón, y colocarse guantes y tapa boca. En el caso de frascos de vidrio con tapón esmerilado quitar únicamente el papel de protección evitando que se contamine, y en el caso de frascos y bolsas estériles desechables, desprender el sello de seguridad. Sumergir el frasco en el agua con el cuello hacia abajo hasta una profundidad de 15 a 30 cm, destapar y a continuación girar el frasco ligeramente permitiendo el llenado (en todos los casos debe evitarse tomar la muestra de la capa superficial o del fondo, donde puede haber nata o sedimento y en el caso de captación en cuerpos de agua superficiales, no deben tomarse muestras muy próximas a la orilla o muy distantes del punto de extracción); si existe corriente en el cuerpo de agua, la toma de muestra debe efectuarse con la boca del frasco a contracorriente. Efectuada la toma de muestra debe colocarse el tapón o tapa, sacar el frasco del agua y colocar el papel de protección en su caso. Para el caso en el que se utilice bolsa, sumergirla a la profundidad arriba indicada. Tomar la muestra y cerrar la bolsa bajo el agua, posteriormente sellar ésta fuera del agua. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 5.3 Manejo de muestras. Las muestras tomadas deben colocarse en hielera con bolsas refrigerantes o bolsas de hielo cerradas para su transporte al laboratorio, a una temperatura entre 4 y 10ºC, cuidando de no congelar las muestras. El hielo utilizado debe cumplir con las especificaciones establecidas. El periodo máximo que debe transcurrir entre la toma de muestra y el inicio del análisis es: ara análisis microbiológico en óptimas condiciones de preservación y transporte hasta 6 horas. 5.4 Identificación y control de muestras. Para la identificación de las muestras deben etiquetarse los frascos y envases con la siguiente información: Número de control para identificar la muestra, independientemente del número de registro del laboratorio. Fecha y hora de muestreo. Para el control de la muestra debe llevarse un registro en formato establecido previamente con los datos anotados en la etiqueta del frasco o envase, así como la siguiente información: 1.1 Identificación del punto o sitio de muestreo. 1.2 Temperatura del agua. 1.3 pH. 1.4 Cloro residual libre. 1.5 Tipo de análisis a efectuar. 1.6 Observaciones relativas a la toma de muestra, en su caso, de preferencia en situaciones de muestras especiales provenientes de alguna contingencia o evento ocasional. 1.7 Nombre de la persona que realizó el muestreo. 1.8 Selección de puntos de muestreo: La selección de puntos de muestreo debe considerarse para cada sistema de abastecimiento en particular. Sin embargo, existen criterios que deben tomarse en cuenta para ello. Estos criterios son: 1.8.1 Los puntos de muestreo deben ser representativos de las diferentes fuentes de agua que abastecen el sistema. 1.8.2 Debe haber una distribución uniforme de los puntos de muestreo a lo largo del sistema y, en su caso, considerar los lugares más susceptibles de contaminación: UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 1.8.3 Puntos muertos. 1.8.4 Zonas de baja presión. 1.8.5 Zonas con antecedentes de problemas de contaminación. 1.8.6 Zonas con fugas frecuentes. 1.8.7 Zonas densamente pobladas y con alcantarillado insuficiente. 6.0 PROTOCOLO DE ANÁLISIS 6.1 Determinación de microorganismos aerobios mesófilos 37 °C. 6.2 Determinación de Coliformes Totales 37°C y Fecales 44°C. 6.3 Determinación de Estreptococos Fecales 37°C. 6.4 Determinación de Clostridium Sulfito Reductores 37°C 7.0 MEDIOS DE CULTIVO - PCA: 6 diluciones - Agar KAA 37ºC. 2 diluciones - Agar SPS 37ºC. 2 diluciones - Agar EMB: Confirmación de E. coli. 44 °C - Caldo Selenito Cistina 37 ° (Salmonella) - Agar XLD (Salmonella a 37 °C). - Caldo Lauril Sulfato lactosado con campanita de Durham a 37 °C. 3 diluciones. -Caldo Verde brillante con campanita de Durham a 45 °C. 3 diluciones. 8.0 PROCEDIMIENTO Determinación de Coliformes Totales y Fecales: Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaz de fermentar la lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados por Escherichia Coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminaciónfecal. Éstos últimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad… Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua se halla exenta de organismos productores de enfermedades. Procedimiento: Vamos a seguir el mismo método para la determinación de los dos tipos de Coliformes, lo único que variará será la temperatura de incubación de cada determinación, que para los Coliformes Totales será de 37 ºC y para los fecales 44 ºC. Prueba presuntiva: Para determinar estos Coliformes Totales se va a utilizar el medio de cultivo caldo lauril sulfato (dispuesto en tubo), que es un medio selectivo y de enriquecimiento ya que inhibe el crecimiento de microorganismos distintos de los del grupo de los Coliformes a la vez que permite que éstos crezcan sin restricción, se distribuye el medio en nueve tubos (tres series de tres tubos) con diez mililitros cada uno de medio de cultivo e inoculando 1 ml de el agua de la dilución 1.10 -1 a la primera serie de 3 tubos, 1 ml de agua de la dilución 1.10 -2 a la segunda serie, y 1 ml a la tercera. Colocaremos en cada tubo una campana Durham para observar el gas producido y al medio de cultivo se le habrá añadido un indicador ácido- base. Incubar a 37°C durante 24 horas. Para los Coliformes fecales se utiliza el caldo verde Brillante con el mismo procedimiento para coliformes totales, pero incubados a 44 °C. Los Coliformes son lactosa positiva, es decir, son capaces de fermentar con producción de ácido y gas. La reacción será positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana Durham por lo menos en un 10% de su capacidad. Una reacción positiva por débil que sea, indicará la presencia y coliformes y habrá que hacer las pruebas confirmativas. Se aplicará la técnica del número más probable (NMP). Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine: En los tubos donde se den resultados positivos en la prueba presuntiva, se introduce un asa de siembra estéril y se toma una porción que va a sembrarse en estría en una placa Petri con medio EMB Levine. El EMB Levine contiene eosina y azul de metileno que inhiben parcialmente el crecimiento de los microorganismos Gram negativos, además la combinación de azul de metileno y eosina permitirá diferenciar microorganismos lactosa positiva de los negativos. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Pruebas IMVIC: Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, pueden identificarse a través de una serie de pruebas bioquímicas, que permiten determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia metabólica. Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificación, uno de los más conocidos y utilizados corresponde al IMVIC que se desarrolló para clasificar especies de la familia antes mencionada y correspondientes al grupo de bacterias coliformes (bacterias aeróbicas o anaeróbicas facultativas, Gram negativos, bacilares, no esporógenas que producen ácido y gas durante la fermentación de la lactosa). Consiste en las siguientes pruebas: - Indol: El triptófano, aminoácido suministrado por una peptona adecuada, se descompone en indol por acción de algunos microorganismos. La práctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando está en presencia de agua de peptona. El indol producido es detectado por indol de kovacs que produce una coloración al reaccionar con él. Se recoge con un asa de siembra, colonias de la placas de EMB y se siembra en un tubo con agua de peptona. Se incuba a la temperatura correspondiente según se trate de Coliformes Totales ó Fecales, 24-48 horas. Luego de la incubación se tomar los tubos de la estufa y agregar 1 ml de reactivo indol de Kovacs y se deja reposar. Si aparece una coloración roja indica que la prueba es positiva, el microorganismo produce indol. - Rojo de metilo: Esta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el crecimiento de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampón fosfato. Debido a la acidez producida, el medio virará de amarillo a rojo considerando la prueba positiva al añadir un reactivo. El procedimiento es el mismo que el del indol, con la diferencia que, en vez de añadir indol de kovacs, añadimos Rojo de Metilo. - Voges Proskauer: Algunas bacterias producen acetilmetilcarbimol (producto intermedio en la degradación de la glucosa de los hidratos de carbono), que en presencia de KOH y aire, se oxida para dar diacetilo, que reacciona con α-naftol y un producto de descomposición de la arginina de la peptona, para producir un color rojo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 En un tubo con agua de peptona y glucosa se siembran colonias de las placas EMB Levine. Se incuba a 37 ó 44 ºC 24-48 horas, luego se añade 1 ml de reactivo de Voges Proskauer, que contiene α-naftol y KOH, se añade seis gotas de reactivo y dos de KOH, se agita, se deja reposar 10-15 minutos y si aparece una coloración roja la prueba es positiva. - Citrato: Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como única fuente de carbono. En un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons, se siembra una colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estría. Si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la producción de amoníaco que lo alcaliniza), el microorganismo es citrato positivo. Tinción de Gram: La coloración de Gram tiene fundamental importancia en la diferenciación morfológica y taxonómica de las bacterias. Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos según retengan o no el colorante de base usado en la tinción, que es el violeta de genciana o el cristal violeta: • Las bacterias Gram positivas aparecen con el citoplasma teñido uniformemente de color azul o violeta. • Las bacterias Gram negativas se tiñen de rojo por el colorante usado como contraste, fuchina, safranina. Resultado de la determinación: Se han obtenido idénticos resultados tanto en la determinación de coliformes totales como fecales y éstos han sido: Determinación de Streptococcus Fecales: Los Streptococcus Fecales son bacterias anaerobias o aerobias facultativas, conocidascomo bacterias del ácido láctico, integrantes de la flora normal de los animales homeotérmicos. Actualmente se considera que pertenecen al género Enterococcus. Todos los Enterococos presentan alta tolerancia a condiciones ambientales adversas altas o bajas temperaturas, deshidratación, salinidad, luz solar…), por lo que se suelen emplear para determinar la contaminación fecal en aguas de baño marítimas, pues son las que mejor soportan esas condiciones de salinidad. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Procedimiento: Prueba presuntiva: Para determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de cultivo KAA (Kanamicina-Esculina-Azida), que es un medio para Streptococcus D de Lancefield. En ese medio de cultivo el sulfato de Kanamicina y la Azida sódica inhiben el crecimiento de la flora acompañante, mientras que los Streptococcuscrecen sin restricción. A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y esculetina la cuál reacciona con el NH4+ que lleva el medio y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco. El Agar, se incuba a 37 ºC 24-48 horas. - Tinción de Gram: En el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observarán cocos Gram positivos. - Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHI: Se trata del caldo Cerebro-corazón que tiene la característica que contiene una concentración en NaCl de 6,5%. Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentración en sales minerales, es por lo que son índice de contaminación fecal en agua marina, como ya se ha comentado anteriormente. - Prueba de la catalasa: Consiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxígeno (O2). Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxígeno lo que nos indicaría que se ha reacción se ha producido. Para realizar esta prueba se efectuará un frotís con las colonias BHI con Streptococcus, en un portaobjetos y nunca con colonias de medios que contengan Azida sódica. Una vez fijada la extensión se añade H2O2, si aparece un burbujeo, la prueba de la catalasa será positiva. Determinación de Clostridium Sulfito Reductores: Los Clostridium son un género de bacterias que se caracterizan por producir esporas terminales que deforman los bacilos. Son anaerobias y Gram positivos. Estos microorganismos son importantes por los daños que pueden provocar en las personas y por los beneficios económicos que reportan. Los géneros pertenecientes al género Clostridium tienen la característica común de poder reducir el sulfito a sulfuro, los Clostridium sulfito reductores se usan en ocasiones como índice de contaminación fecal, sobretodo para apreciar la calidad higiénico-sanitaria del agua y productos animales ó de origen animal. Este tipo de microorganismos producen esporas, lo que les confiere una gran resistencia. La detección se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducirlo a sulfuro, dando lugar, en presencia de hierro, UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 sulfuro de hierro que es de negro, con lo que la aparición de este color nos indica que existen Clostridium Sulfito reductores. La detección y recuento de Clostridium Sulfito reductores se puede hacer de dos formas: - Investigando la presencia de formas de vida vegetativas y esporuladas conjuntamente. - Investigando la presencia de formas esporuladas. Procedimiento: Determinación de formas esporuladas y viables: Se va a utilizar como medio de cultivo el Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS). Lo primero será preparar una serie de diluciones decimales. Se preparan dos tubos con medio, donde se sembrará con pipeta estéril en un tubo, un ml de la dilución 10-2 y en otro tubo 1 ml de la dilución 10-3. La siembra se efectuará introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inóculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie. Una vez solidificado el medio de cultivo se añaden 2 ml de ese mismo medio para crear anaerobiosis. Se incuba a 37 ºC 48 horas, y pasado el periodo de incubación se cuentan las colonias negras aparecidas, ese número multiplicado por el factor de dilución será el número total de formas vegetativas y esporuladas por gramos ó ml de muestra. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 BIBLIOGRAFÍA Organización Mundial de la Salud. 1995. Guías para la Calidad del Agua Potable. Volumen 1. Recomendaciones. Segunda Edición. Ginebra. Págs. 26-30; 137-150; 183; 187. SEMARNAP. 1992. Ley de Aguas Nacionales. Diario Oficial de la Federación-diciembre. México, D.F. Artículo 119 fracciones VI, VII, XIII. SECOFI. 1992. Guía para la Redacción, Estructuración y Presentación de las Normas Oficiales Mexicanas -Proyecto de Revisión. México, D.F. Instituto Mexicano de Tecnología del Agua. Comisión Nacional del Agua. SARH. 1991. Manual No. 6 1a. Edición. Págs. 10-11. Secretaría de Salud. 1988. Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios. Diario Oficial de la Federación-18 de enero. México, D.F. Artículo 214 fracciones I y V, pág. 27; artículo 216, pág. 27; artículos 218, 222 y 224. Francisco Unda Opazo. 1967. Ingeniería Sanitaria Aplicada a la Salud Pública. UTEHA. Santiago, Chile. Págs. 93-99; 176 -184. APHA. AWWA. WPCF. Standard Methods for the Examination of Water of Wastewater. PRESENTACIÓN COMPETENCIAS PONDERACIÓN DE NOTAS PARA PROMEDIO DE LABORATORIO NORMAS ESPECIALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ANÁLISIS INDUSTRIAL PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO 4. INTERFERENCIAS 5. SEGURIDAD 6. MEDIOAMBIENTE 7. EQUIPAMIENTO 8. REACTIVOS 9. MEDIOS DE CULTIVO 10.0 PROCEDIMIENTOS AGAR EMB AGAR PCA PSEUDOMONA AGAR F. AGAR SABOURAUD GLUCOSADO AGAR SALMONELLA SHIGELLA AGAR TRIPTEÍNA SOJA AGUA PEPTONADA CALDO LAURIL SULFATO CALDO VERDE BRILLANTE Bacillus Cereus Selectivo Agar. Fundamento Agar base Kanamicina Esculina Azida Fundamento (1) Agar Mac Conkey Fundamento (2) InterpretacIón de los resultados Fundamento (3) InterpretacIón de los resultados (1) ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE FRUTAS Y HORTALIZAS. TÉCNICA DE DILUCIÓN. 2. ALCANCE 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO (1) 4. INTERFERENCIAS (1) 5. SEGURIDAD (1) 6. MEDIOAMBIENTE (1) 7. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA POTABLE 2- FUNDAMENTO 3- MATERIAL NECESARIO EN EL MUESTREO. 4- CONDICIONES PARA EL MUESTREO 5- TOMA DE MUESTRA TAMAÑO DE LA MUESTRA TRANSPORTE PROTOCOLO PARA EL ANALISIS DE AGUA MEDIOS DE CULTIVO PROCEDIMIENTO TECNICA: NUMERO MÁS PROBABLE según la Norma Paraguaya NP N 208 Agua Potable 1. OBJETIVO 2. ALCANCE (1) 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO (2) 4. INTERFERENCIAS (2) 5. SEGURIDAD (2) 6. MEDIOAMBIENTE (2) 7. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS (1) 8. PROTOCOLO DE ANÁLISIS 9. PROCEDIMIENTOS ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LECHE Y DERIVADOS 2-ALCANCE PRINCIPIO DEL MÉTODO Definiciones básicas Muestreo 4. INTERFERENCIAS (3) 6. MEDIOAMBIENTE (3) 7. MEDIOS DE CULTIVO 8- PROTOCOLO DE ANÁLISIS 9. PROCEDIMIENTOS (1) ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE GRASAS COMESTIBLES 2. ALCANCE (2) 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO (3) Definiciones MUESTREO 4. INTERFERENCIAS (4) 5. SEGURIDAD (3) 6. MEDIOAMBIENTE (4) 7. MEDIOS DE CULTIVO (1) 8. PROCEDIMIENTO ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE HUEVOS Y DERIVADOS 2. ALCANCE (3) 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO (4) 3. MATERIAL NECESARIO EN EL MUESTREO. 4. CONDICIONES PARA EL MUESTREO 5. TRANSPORTE 6. PROTOCOLO PARA EL ANALISIS 7. MEDIOS DE CULTIVO (2) 8. INSPECCIÓN VISUAL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE CEREALES Y PRODUCTOS DERIVADOS 1. OBJETIVO 3.0 PRINCIPIO DEL MÉTODO Número de muestra Toma de muestra 4. INTERFERENCIAS (5) 6. MEDIOAMBIENTE (5) 7. MEDIOS DE CULTIVO (3) 8. PROCEDIMIENTOS ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ENLATADOS Y CONSERVAS 2. ALCANCE (4) 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO (5) 4.0 MATERIAL NECESARIO EN EL MUESTREO. 5.0 CONTROL MICROBIOLÒGICO DE LAS CONSERVAS 6.0 TOMA DE MUESTRA 7.0 TAMAÑO DE LA MUESTRA 8.0 TRANSPORTE 8.0 PROTOCOLO PARA EL ANALISIS DE AGUA 9.0 MEDIOS DE CULTIVO 10.0 PROCEDIMIENTO 11.0 INSPECCIÓN VISUAL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES Y AMBIENTES 2. ALCANCE (5) 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO (6) 4. INTERFERENCIAS (6) 5. SEGURIDAD (4) 6. MEDIOAMBIENTE (6) 9. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 10. PROCEDIMIENTOS ANALISIS MICROBIOLOGICO DE BEBIDAS Y FERMENTACIÓN INDUSTRIAL 1. OBJETIVOS 2. ALCANCE (6) 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO (7) 4. MATERIAL NECESARIO EN EL MUESTREO.5. TOMA DE MUESTRA 6. TAMAÑO DE LA MUESTRA 7. TRANSPORTE 8. PROTOCOLO PARA EL ANALISIS DE AGUA 9. MEDIOS DE CULTIVO (1) 10. PROCEDIMIENTO ANALISIS MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS FARMACEUTICOS 2- FUNDAMENTO (1) A- NUMERACIÓN DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS. RECUENTO EN PLACAS (MÉTODO DEL VACIADO EN PLACAS). PROCEDIMIENTO (1) B-NUMERACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS. C-INVESTIGACIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS OBJETABLES INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA (GÉNERO) Y ESCHERICHIA COLI Aislamiento de Salmonella Aislamiento de E. coli. Investigación de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa . MATERIALES Aislamiento de Staphylococcus aureus. 1.0 OBJETIVOS 3.0 PRINCIPIO DEL MÉTODO (1) 4.0 EQUIPOS, REACTIVOS Y MATERIALES 5.0 TOMA DE MUESTRAS DE AGUAS SUPERFICIALES 6.0 PROTOCOLO DE ANÁLISIS 7.0 MEDIOS DE CULTIVO 8.0 PROCEDIMIENTOpermite el crecimiento de ciertos microorganismos de interés (microorganismos seleccionados) e impide la multiplicación de microorganismos competidores. Los agentes selectivos (por ejemplo el cristal violeta que inhibe el crecimiento de las bacterias gram positivas) son componentes esenciales de estos medios. Los medios diferenciales se utilizan ocasionalmente para distinguir entre subpoblaciones presentes en un alimento basándose en una única propiedad bioquímica. Un medio que contenga tanto agentes selectivos como diferenciales es un método eficaz para la selección y diferenciación de los microorganismos que se buscan de entre los presentes en una microbiota compleja. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 Los medios de cultivo pueden ser líquidos (caldos) o sólidos (agar) dependiendo del propósito del experimento. 4. INTERFERENCIAS Se debe utilizar agua destilada estéril, y asegurarse la ausencia de cloro residual. 5. SEGURIDAD Todos los alumnos deben cumplir con los estándares de seguridad, de la Facultad de Ciencias Químicas. 6. MEDIOAMBIENTE Todos los desechos generados deben llevarse al autoclave en recipientes correctamente rotulados antes de disponerlos. 7. EQUIPAMIENTO 7.1 Balanza Analítica con precisión a 0.01 mg o equivalente. 7.2 Plancha calefactora 7.3 Autoclave 7.4 Estufa 7.5 Refrigerador 7.6 Erlenmeyer: se utilizan para preparar los medios de cultivo, o para el desarrollo de microorganismos en medio líquido con agitación o aireación. 7.7 Probetas 7.8 Varilla de vidrio 7.9 Espátula de Drigalsky: Se construye con una pipeta Pasteur larga o con una varilla de vidrio. Se calienta el extremo en la llama del mechero y se dobla en ángulo recto unos 4 cm, esta última porción se dobla nuevamente del mismo modo. Se utiliza para distribuir una muestra líquida que se siembra sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. 7.10 Tubos de ensayo: destinados a conservar medios de cultivo en pequeños volúmenes. Se utilizan tubos de vidrio de diversos tamaños, con tapa a rosca o a presión. El vidrio debe ser de buena calidad, neutro, transparente e inalterable a los tratamientos. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 7.11 Placas de Petri: cajas de vidrio o plástico de sección circular, con tapa. Existen de diferentes tamaños según su uso, aunque las más frecuentemente utilizadas tienen 10 cm de diámetro. 7.12 Pipetas graduadas: para su uso en el laboratorio de microbiología se les coloca un tapón de algodón en el extremo superior, de manera de impedir que el operador aspire líquidos potencialmente contaminados, o que contamine el medio de cultivo al aspirarlo. Se utilizan para realizar inoculaciones y diluciones. Para manejar pequeños volúmenes (menores de 1 ml) se recomienda el uso de pipetas automáticas que miden exactamente el volumen deseado (500, 150, 50 µl etc.); en el extremo se colocan puntas o tips estériles que se reemplazan cuando se desea. 7.13 Pipetas Pasteur: son tubos de vidrio terminados en capilar. Se usan para transportar pequeños volúmenes de líquido o para sembrar a partir de medios de cultivo líquidos. 7.14 Mango o cabo de Koll: sirve para sujetar al ansa, aguja o espátula de platino o aleaciones metálicas de lenta oxidación y rápido enfriamiento. Está compuesto por un mango de un material aislante, que se prolonga en un vástago metálico que sostiene mediante una tuerca un alambre. Cuando el extremo del alambre tiene forma de anillo se denomina ansa; si se deja el extremo recto se llama aguja y si se dobla en ángulo recto al extremo libre se lo llama gancho. 7.15 Tubos o “campanitas” de Durham: pequeños tubos (de unos 5x30 mm) que son colocados en forma invertida dentro de los tubos de ensayo que contienen medio de cultivo líquido, sirven para verificar la producción de gas por parte de los microorganismos. 7.16 Otros elementos y aparatos: Al material citado debe agregarse por su uso frecuente, mecheros y gradillas. Los equipos más utilizado comúnmente en el laboratorio de microbiología de alimentos son: microscopios, autoclave, estufas de esterilización, medios cultivo, baño termo regulable, balanzas, espectrofotómetro, centrífuga, heladeras, bombas al vacio, etc. 8. REACTIVOS 8.1 Agua Destilada estéril 8.2 Glicerina líquida 9. MEDIOS DE CULTIVO 9.1 Agar Baird Parker UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 9.2 Agar E.M.B 9.3 Agar P.C.A 9.4 Agar Pseudónima F. 9.5 Agar Saboraud 9.6 Agar Salmonella Shigella 9.7 Agar Tripteína de Soja 9.8 Agua peptonada 9.9 Caldo Lauril Sulfato 9.10 Caldo Selenito 9.11 Caldo Verde Brillante 10.0 PROCEDIMIENTOS 10.1 Pese la cantidad necesaria del medio 10.2 Use agua destilada o desionizada. 10.3 Si el medio contiene agar, agite continuamente y caliente el medio hasta ebullición. El agar funde (se percibe porque el medio se aclara) en solución acuosa en ebullición. Todo medio que requiera esterilización debe colocarse en envase termorresistente. Nunca llene un envase más de las tres cuartas partes de su capacidad, ya que el líquido se expandirá durante el calentamiento. Enrosque las tapas parcialmente para permitir que escape la presión del vapor. En general la tapa debe estar hacia la mitad de la rosca completa o algo más para la sujeción. 10.4 Aquellos medios que no se lleva a esterilización, se debe preparar utilizando materiales y agua estrictamente esterilizados, bajo campana y con el mechero encendido. 10.5 La esterilización se logra manteniendo el material o el medio de cultivo en el autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. 10.6 Deje enfriar el medio hasta 45ºC, luego destape la boca del frasco que contiene el medio de cultivo y pase por la llama del mechero Bunsen UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 10.7 Levante la tapa de la placa de Petri en uno de los lados, lo mínimo posible. Vierta 15 – 20 ml del medio estéril en placa estéril y deje homogeneizar el medio con movimientos circulares de la placa, a favor y en contra de las agujas del reloj. 10.8 Deje solidificar el medio, invierta las placas y guárdelas en refrigerador (0 – 5 ºC) OBSERVACIÓN - En caso de trabajar con tubos, cargar las soluciones en tubos, tapar y esterilizar en autoclave (si requiere). - Las placas se invierten para evitar condensados sobre la superficie del agar, reduciendo la posibilidad de contaminación. - El medio agar no deberá guardarse por un periodo superior a 6 (seis) días a fin de evitar la deshidratación de la superficie AGAR BAIRD PARKER Medio de alta especificidad diagnóstica y selectividad para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos. Fundamento Este medio contiene cloruro de litio y telurito de potasio para inhibir el desarrollo de la flora microbiana acompañante, mientras que el piruvato de sodio y la glicina estimulan selectivamente el crecimiento de estafilococos. El agregado de yema de huevo permite visualizar colonias convexas de color negro rodeado de una zona transparente debido a la lipólisis y proteolisis. Las mismas quedan confirmadas por la prueba de coagulasa Interpretación de resultados Microorganismos Crecimiento Apariencia E. coli Ninguno Ninguno P mirabilis Bueno Marrón S. aureus Bueno a excelente Negras, con borde blanco, rodeado de una zona clara S. epidermidis Escaso a bueno Negra, tamaño irregular. Zona opaca alrededor de la colonia sin zona clara alrededor UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 E. faecium Escaso Igual al anterior Micrococcus EscasoColonias marrones a negro. AGAR EMB Es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Fundamento La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. Como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. Crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras Acinetobacter spp., y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda. Interpretación de resultados Microorganismo Característica de la colonia Enterobacter, Klebsiella spp. Color rosa mucosa Escherichia coli Verde con brillo metálico y centro negro azulado Proteus, Salmonella, Shigella Incoloras Candida spp. Incoloras o rosadas, secas, puntiformes Acinetobacter spp. Azul lavanda, pequeñas a mediana UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 AGAR PCA Recuento en placa agar. Medio recomendado para el recuento de colonias en aguas, aguas residuales, productos lácteos y otros alimentos Fundamento La productividad de este medio está basada en el alto contenido nutricional de sus componentes que permite el desarrollo de las bacterias presentes en la muestra. PSEUDOMONA AGAR F. Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la detección y la diferenciación de especies de Pseudomonas spp. En base a la producción de fluoresceína. Conocido también como medio King B. Fundamento En el medio de cultivo, la tripteina y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigmentos, la concentración de fosfatos estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de piscina y piorrubina. Resultados Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260 nm. Se considera resultado positivo la observación de fluoresceína, que es un pigmento de color amarillo, amarillo verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a fenómenos de difusión. AGAR SABOURAUD GLUCOSADO Este medio puede ser usado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos patógenos y saprofitos. Puede ser usado en placas o en tubos con cierre hermético. Fundamento Medio de cultivo recomendado para el cultivo y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutáneas (piel, pelo). No tienen agentes selectivos los que UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 pueden ser agregados al medio de cultivo. El bajo pH favorece el crecimiento de hongos sobre bacterias. AGAR SALMONELLA SHIGELLA Es un medio selectivo para el aislamiento de Shigella spp. y Salmonella spp. de heces, alimentos y otros materiales. Es formulado para diferenciar fermentadores de la lactosa de los que no la fermentan, con inhibición de organismos coliformes sin restringir el crecimiento de bacilos gram negativos Shigella, Salmonella. Los pocos organismos que fermentan la lactosa que desarrollan se diferencian fácilmente. Fundamento La selectividad de este medio se basa en la elevada concentración de tiosulfato, citrato, sales biliares y el verde brillante, que inhibe las bacterias coliformes. Este medio diferencia los pocos microorganismos fermentadores de lactosa que son capaces de desarrollar, de los no fermentadores de lactosa. Los primeros acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH. Las colonias son rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, dan colonias transparente. Los microorganismos formadores de sulfhídrico a partir de tiosulfato dan colonias con centro negro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en caldo selenito cistina.. Microorganismo Colonias Salmonella spp. (SH2 -), Shigella Incoloras, transparentes Salmonella spp. (SH2 +), Proteus spp. Transparente, centro negro Escherichia coli Rosadas o rojas Enterobacter, Klebsiella spp. Rosada cremosas o mucosa Enterococcus spp. Incoloras, muy escaso crecimiento. AGAR TRIPTEÍNA SOJA Este medio favorecerá el desarrollo y aislamiento de una gran variedad de microorganismos, tanto aerobios como anaerobios facultativos UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 Fundamento La tripteína y la peptona de soja aportan nutrientes ricos en péptidos, aminoácidos libres, bases púricas y pirimídicas, minerales y vitaminas. La peptona de soja aporta también carbohidratos que estimulan el crecimiento de muchos microorganismos. Incubado en forma anaerobia, permite el crecimiento de Clostridium y anaerobios no esporulados. Es un medio adecuado para cultivar y mantener cepas de Aeromonas. AGUA PEPTONADA Medio usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos u otros materiales de interés sanitario. Fundamento Recomendado para ser utilizado en lugar de solución fisiológica para recuperar células de enterobacterias dañadas por proceso fisicoquímicos a que ha sido sometido el alimento. CALDO LAURIL SULFATO Medio recomendado para detección de coliformes en agua, aguas residuales y alimentos. Fundamento El alto valor nutritivo de este medio permite un rápido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa aún de los de fermentación lenta. Esta fermentación sedetecta con la campana de Durham. El lauril sulfato sirve como inhibidor de la flora acompañante. CALDO VERDE BRILLANTE Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la técnica del número más probable. Fundamento Los componentes de este medio favorecen el crecimiento de bacterias coniformes, mientras que la bilis al 2 % y el verde brillante inhiben gran parte de la flora acompañante. La fermentación de la lactosa con producción de gas caracteriza a los coniformes. Bacillus Cereus Selectivo Agar. Medio diagnóstico selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de Bacillus cereus en alimentos UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 Fundamento Bacillus cereus, ha sido implicado en toxiinfecciones alimentarias, particularmente asociado al consumo de arroz contaminado, y también en algunos procesos infecciosos en seres humanos y animales. En el medio de cultivo, el contenido de peptona es bajo (0.1%), y la adición de piruvato de sodio y emulsión de yema de huevo mejora el aislamiento y esporulación de esta bacteria. Para verificar la utilización del manitol, se usa un indicador de pH, azul de bromotimol. Este medio es selectivo, por el agregado del suplemento para Bacillus cereus (código B03-606-32) con el que se obtiene una concentración final de 100 U de Polimixina B por ml de medio. Agar base Kanamicina Esculina Azida Medio selectivo cuando se usa con suplemento Kanamicina para aislamiento de enterococos en alimentos Fundamento El medio contiene los componentes inhibidores selectivos sulfato de kanamicina y azida sódica. También contiene un sistema de indicadores para detectar el crecimientode los estreptococos que hidrolizan la esculina. Estos microorganismos producen zonas negras alrededor de las colonias por la formación de compuestos fenólicos con el hierro, derivados de la hidrólisis de la esculina y el hierro ferroso. Agar Mac Conkey Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos a partir de muestras de aguas y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Fundamento En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. El agar es el agente solidificante. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. InterpretacIón de los resultados Microorganismos fermentadores de lactosa: colonias rosadas- rojizas. Puede observarse halo de precipitación biliar. Microorganismos no fermentadores de lactosa: colonias del color del medio, incoloras. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 CALDO SELENITO CISTINA Medio utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el selenito de sodio inhibe flora Gram positiva y la mayoría de la flora entérica excepto Salmonella spp. durante las primeras 8-12 horas de incubación. La L-cistina es el agente reductor y la FDA propuso que se agregue a la formulación del Selenito Caldo porque reduce la toxicidad del selenito de sodio llevando así a una mayor recuperación de especies de Salmonella. No esterilizar en autoclave. InterpretacIón de los resultados El crecimiento microbiano se observa por turbidez- UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE FRUTAS Y HORTALIZAS. TÉCNICA DE DILUCIÓN. 1. OBJETIVO Realizar el análisis microbiológico de Frutas y hortalizas Conocer los principios básicos (manejo de los materiales y equipos) del trabajo en laboratorio de microbiología Conocer los distintos tipos de esterilización de los materiales de laboratorio. Aprender y utilizar la técnica de dilución. Enumerar las bacterias aerobias mesófilas Interpretación de los resultados y su posterior cálculo. Presentación de informes y toma de acciones correctivas. 2. ALCANCE Este protocolo se aplica para la toma de muestra y el análisis microbiológico de frutas y Hortalizas. 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO Este método se basa en la hipótesis de que las células microbianas que contiene una muestra mezclada con un medio de agar forman, cada una, colonias visibles y separadas. Para ello se mezclan diluciones decimales de la muestra del alimento homogeneizado con medio. Después de incubar las placas a 37 ºC durante 24 – 48 horas, se calcula el número de bacterias aeróbicas mesófilas por gramo de la muestra de alimento, basándose en el número de colonias obtenidas en placas de petri elegidas con diluciones que den resultados significativos. En el recuento de microorganismos aerobios mesófilos se estima la flora total, pero sin especificar tipos de gérmenes. Tasas superiores a 106 – 107 gérmenespor gramo suelen ser ya inicio de descomposición. Las frutas y hortalizas se contaminan con diversos microorganismos en el momento de la cosecha. Como las contaminaciones proceden principalmente del suelo, del agua, del polvo, etc., los recuentos aerobios más altos se registran comúnmente en los tubérculos y otras hortalizas que están en contacto con el suelo. La microflora la componen principalmente los esporeiformes, corineformes otros organismos del suelo. Dado el alto contenido de ácido y de azúcar de las frutas, predominan en ellas las levaduras y los UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 mohos, mientras que el alto contenido de hidratos de carbono de muchas hortalizas favorecen la formación de bacterias acidolácticas. Las frutas y hortalizas frescas son descompuestas generalmente por los mohos Alternaria, Botrys y Phytopthora, o por las bacterias, principalmente las del género Erwinia. Las bacterias coliformes no fecales y los enterococos forman parte de la microflora que se encuentra naturalmente en las frutas y hortalizas, pero la presencia de E. coli puede atribuirse sólo a las aguas de regadío contaminadas o a su manejo por el hombre. 4. INTERFERENCIAS Productos químicos y sustancias inhibidoras sobre la muestra. 5. SEGURIDAD Todos los alumnos deben cumplir con los estándares de seguridad, de la Facultad de Ciencias Químicas. 6. MEDIOAMBIENTE Todos los desechos generados deben llevarse al autoclave en recipientes correctamente rotulado antes de disponerlos. Agua Destilada estéril 7. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 1 Agar E.M.B 2 Agar P.C.A 3 Agar Saboraud 4 Agua peptonada 5 Agua Destilada Estéril 8- PROTOCOLO DE ANALISIS Recuento de colonias aerobias mesófilas a 37 ºC Investigación y recuento de mohos, levaduras a 25 °C Investigación y recuento de coliformes totales y fecales 9. PROCEDIMIENTOS 1. Pesar 10 gr de la muestra, agregar 90 ml de diluyente, homogenizar en el Stomacher y realizar las diluciones 10-2, 10-3. 2. Partiendo de la serie de diluciones decimales, y por duplicado, se transfiere 0,1 ml. De cada una de las diluciones a placas con agar nutritivo PCA. Desechar la pipeta o UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 puntera utilizada. El inóculo se disemina por toda la superficie del agar, sin romperlo, con ayuda de un asa estéril. 3. Después que el inóculo sea absorbido, colocar las placas en estufa regulada a 37 ºC, evitando que estén apiladas en exceso y que estén en contacto con las paredes de la estufa. El periodo de incubación es aproximadamente de 24 a 48 horas. 4. Transcurrido el tiempo de incubación, se hace el recuento de colonias en las placas. El número total de colonias contadas, dividido por el factor de dilución de la placa elegida y el volumen inoculado, da como resultado el recuento de unidad formadora decolonia por gramo del producto analizado. 5. Realizar el mismo procedimiento para el medio EMB y SAB. Las temperaturas y tiempos de incubación para cada microorganismo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA POTABLE 1- OBJETIVOS ● Determinar la presencia de microorganismos contaminantes utilizando la técnica de filtración por membrana, la técnica número más probable y el método de vertido de placa. ● -Adquirir conocimiento sobre técnica utilizado en el análisis microbiológico de agua ● Realizar análisis microbiológico utilizando la técnica de filtración por membrana y técnica número más probable. ● Realizar el conteo de microorganismos aerobios mesófilos totales por el método de vertido en placa ● -Asumir actitud crítica en la interpretación de los resultados obtenidos 2- FUNDAMENTO El agua es un recurso natural necesario para su desarrollo de una gran actividad humana, su creciente degradación afecta la calidad del agua. La calidad del agua está determinada por unconjunto de variables, físicas, químicas y biológicas y por la presencia de organismos microbianos. El análisis microbiológico del agua es fundamental para determinar el uso potencial del agua. En particular, el agua para consumo humano es la que debe cumplir con estándares más exigentes en cuanto a parámetros microbiológicos, dada su capacidad de transportar microorganismos transmisores de enfermedades. El control de calidad del agua se lleva a cabo a través de indicadores microbiológicos. Los microorganismos indicadores sirven como un sistema de alarma, ya que su presencia en el agua es una evidencia de que está contaminada. En cuanto al muestreo la finalidad del muestreo en microbiología es principalmente, obtener una muestra representativa del alimento para su análisis inmediato y conseguir UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2024 resultados fiables sobre su estado higiénico sanitario, es necesario que el producto, en el momento de su análisis, reúna las mismas condiciones microbiológicas que tenía al ser muestreado. Por esta razón, son necesarias unas pautas para conseguir la muestra idónea. La esterilización por filtración consiste en promover la eliminación de las formas vivas de un fluido por remoción, haciendo pasar a través de un filtro que las retenga. No todas las formas vivas son retenidas, bacterias de micronajes menores a 0.2 micras y ultravirus pasan a través de los filtros bacterianos. En el caso de cultivos superficiales, la membrana conteniendo células puede colocarse sobre una placa de Petri conteniendo un medio sólido y ser incubado a la temperatura de investigación de los microorganismos. Normalmente utilizado para volúmenes de muestra superior a 10 ml. Todo el material (filtro, frasco, porta filtro, etc.) usado en el proceso de la filtración debe ser esterilizado por calor. En el caso de la técnica del número más probable. El recuento es un medio de conteo líquido y, como su nombre indica, proporciona una idea aproximada del número de bacterias vivas que hay en la muestra. 3- MATERIAL NECESARIO EN EL MUESTREO. Envases para la toma de muestra deberán estar perfectamente limpios, secos y estériles. Su tamaño guardará relación con la muestra que se vaya a tomar. Serán herméticos e inaccesibles a cualquier contaminación posterior a su esterilización. Se pueden utilizar: - Envase de vidrio de boca ancha - Envases de plásticos esterilizables. - Bolsa de plástico estériles. 4- CONDICIONES PARA EL MUESTREO Para obtener la muestra representativa que se va a analizar posteriormente en el laboratorio, se deben cumplir ciertas condiciones: ● La persona destinada a hacer el muestreo debe conocer perfectamente la finalidad del muestreo, por lo que estará bien entrenada para actuar como corresponda en cada caso. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 ● Las unidades de muestra se tomarán desde sus envases originales. Cuandolos envases son muy grandes y difíciles de transportar, se toman asépticamente muestras representativas y se pasan a envases estériles más pequeños. ● Si el producto a muestrear tiene salida por un conducto, se desechan las primeras porciones antes de tomar la muestra. Si la toma es de agua de un grifo, se desinfecta este con alcohol. Luego se abre y se desecha el agua quesale en las primeras porciones. Se cierra de nuevo el grifo y se flamea la gotaque queda pendiente hasta que emita vapores. A continuación se vuelve a abrir el grifo, dejando fluir el agua durante 1 – 2 minutos antes de recogerlaen el recipiente estéril de la toma de muestra. Este será cerrado convenientemente en condiciones asépticas. 5- TOMA DE MUESTRA Para la toma de muestra deberán proveerse de botellas o frascos esterilizados, no se aceptarán frascos que no hayan sido proveídos por el laboratorio. -Limpiar la parte exterior del grifo. Flamear el grifo -Dejar que el agua corra por el grifo totalmente abierto durante medio minuto, por lo menos, antes de tomar la muestra, o durante 2 ó 3 minutos. -Abrir cuidadosamente la botella, para impedir la contaminación como en cualquier otra operación de muestreo aséptico. -No enjuagar la botella. -Llenar la botella hasta aproximadamente ¾ de su capacidad. TAMAÑO DE LA MUESTRA Mínimo 400 ml de muestra. TRANSPORTE Si no fuera posible el análisis inmediato de la muestra, la misma se transportará refrigerada. PROTOCOLO PARA EL ANALISIS DE AGUA -Recuento de colonias aerobias a 37ºC. -Investigación y recuento de coliformes Totales y Fecales UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 -Identificación de Escherichia coli. -Investigación de Pseudomonas MEDIOS DE CULTIVO - PCA: 2 placa sembrar en profundidad. - Caldo lauril sulfato: Número más probable (coliformes totales a 37ºC) -Caldo verde Brillante: Número más probable (coliformes fecales a 45ºC) - Agar EMB: Confirmación de E. coli. - Agar Cetrimide técnica de Filtración: Pseudomonas PROCEDIMIENTO TÉCNICA: FILTRACIÒN POR MEMBRANA 1- Esterilizar el vaso volumétrico, porta filtro, tapa y frasco colector. 2- Monte el sistema de filtración – sistema de vacío. 3- Esterilice una pinza por medio de la llama de un mechero Bunsen. 4- Retire la cobertura de la membrana de forma estéril. 5- Coloque la membrana sobre el porta filtro mediante la pinza 6- Coloque inmediatamente el vaso volumétrico con la tapa 7- Proceda a cargar el volumen de muestra a filtrar 8- Cierre toda abertura 9- Accione el sistema de vació 10- La solución atraviesa la membrana filtrante y es recogida en el frasco colector. 11- Retire el vaso volumétrico. 12- Retire la membrana filtrante por medio de una pinza, previamente esterilizada. 13- Coloque la membrana filtrante sobre una placa conteniendo el medio de cultivo sólido. Incubar la placa a la temperatura definida para cada medio. 14- Realice el recuento de UFC a 24 y 48 horas TECNICA: NUMERO MÁS PROBABLE según la Norma Paraguaya NP N° 208 Agua Potable UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Prueba presuntiva: Se preparan: 1°) Una serie de 5 tubos conteniendo 10 mL del medio caldo lactosado de doble concentración. 2°) Una serie de 5 tubos conteniendo 5mL del medio caldo lactosado de simple concentración 3°) Otra serie de 5 tubos conteniendo 5mL del medio caldo lactosado de simple concentración. A todos los tubos de las tres series se le coloca una campanita de Durham para observar la producción de gas. A la serie N° 1 se le inocula 10mL del agua en estudio. A la serie N° 2 se le inocula 1mL del agua en estudio. A la serie N° 3 se le inocula 0.1mL del agua en estudio. La totalidad de los tubos se incuban en estufa a 37°C durante 24-48hs. La reacción es positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana Durhan, por lo menos en 1/10 parte de su volumen, como consecuencia de la fermentación de la lactosa con formación de ácido y gas. Se tabulan los números de los tubos positivos en cada serie de cinco y se consulta la tabla sgte: UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 1. OBJETIVO ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE CARNES Y PRODUCTOS DERIVADOS. TÉCNICAS DE MUESTREO. Realizar el análisis microbiológico de carnes y productos derivados Conocer los principios básicos (manejo de los materiales y equipos) del trabajo en laboratorio de microbiología Estudiar las distintas técnicas de muestreo microbiológico. Enumerar las bacterias contaminantes de carnes y su derivados Interpretación de los resultados y su posterior cálculo.Presentación de informes y toma de acciones correctivas. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 2. ALCANCE Este protocolo se aplica para la toma de muestra y el análisis microbiológico de carnes y productos derivados 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO La carne de los animales constituye la base de la alimentación humana, ya que tiene un alto valor nutritivo, debido a la alta riqueza proteica de su constitución. La carne es uno de los alimentos más perecederos. Debido a sus características de composición, pH, y actividad agua (aw), constituye un medio muy favorable para las contaminaciones microbianas. La profundidad del músculo de un animal recién sacrificado contiene una flora muy escasa, del orden de 1 germen por gramo, la cual procede del intestino y es transportada al músculo por la sangre. La parte superficial está mucho más contaminada por una flora muy diversa, que depende de las condiciones higiénicas de manipulación, así como del ambiente del matadero Tipos de microorganismos contaminantes Los intestinos del animal son la fuente más importante de bacterias, y de ellos afloran a la superficie de la carne. Los coliformes, salmonellas, staphylococcus y Cl. perfringens. Son evidentemente algunas bacterias procedentes del exterior del animal pasen a formar parte de la flora superficial de las canales. Los nódulos linfáticos pueden contener cualquiera de los organismos que ocasionan enfermedades al animal. Como Staphylococcus, Clostridium, Streptococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Salmonella y Pseudomonas. Cuando la carne y los productos de las aves de corral se mantienen refrigerados, las bacterias mesófilas, incluidas las patógenas, no pueden desarrollarse, o se desarrollan solo muy lentamente. MUESTREO Número de muestra El procedimiento de muestreo para la carne de canales enfriadas o congeladas y para la carne sin hueso a granel, requiere el examen de 5 muestras. Se toma una muestrade cada una de las 5 muestras o paquetes de carne. Si las canales son de vaca o de cordero, la muestra se toma de la región pre pectoral, del costado, de la región sacra o UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 lumbar, o del cuello: si son de cerdo, se toman muestras del cuello y de detrás de las orejas. Cada una de estas muestras debe tener la misma cantidad de carne (alrededor de 200 gramos). El procedimiento de muestreo para la carne cruda, fresca o congelada, en paquetes para la venta al por menor, o para la carne de aves de corral, fresca o congelada, consiste en examinar 5 paquetes o cinco canales de aves de corral, que se toman de distintos recipientes del lote. Toma de muestra Para tomar las muestras se quitan del envoltorio de las canales, o se abren los paquetes cuidadosamente, sin tocar la carne. Las porciones de carne se toman con instrumentos esterilizados, y se llevan, en condiciones asépticas, a los recipientes de lamuestra. 4. INTERFERENCIAS Productos químicos y sustancias inhibidoras sobre la muestra. 5. SEGURIDAD Todos los alumnos deben cumplir con los estándares de seguridad,de la Facultad de Ciencias Químicas. 6. MEDIOAMBIENTE Todos los desechos generados deben llevarse al autoclave en recipientes correctamente rotulados antes de disponerlos. 7. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 1 Agar E.M.B 2 Agar P.C.A 3 Agar Saboraud 4 Agua peptonada 5 Agar Baird Parker 6 Caldo selenito Cistina .7 Agar Salmonella Shigella 8 Agua Destilada estéril 8. PROTOCOLO DE ANÁLISIS - Recuento de aerobio mesófilos - Investigación y recuento de coliforme fecal y total - Investigación y recuento de St. Aureus UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 - Investigación de Salmonella - Investigación y recuento de hongo y levadura 9. PROCEDIMIENTOS 1- Se toman 25 gr de la muestra, a los se le agrega 225 ml de diluyente y se procede a la homogeneización en el Stomacher. 2- Se realizan las diluciones correspondientes o necesarias. 3- El análisis se realiza en superficies . Respetando la temperatura y el tiempo de incubación. 4- En el caso de salmonella se toma 1 ml de la dilución 10-1 se le agrega al caldo de selenito o caldo de rapaport y se incuba a una temperatura de 37 °C durante 24 hs , posteriormente realizar un estriado en la placa de XLD o SS. 5- Incubar a una temperatura de 37 °C ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LECHE Y DERIVADOS 1. OBJETIVO ● Realizar el análisis microbiológico de Leche y derivados. ● Enumerar las bacterias contaminantes de Leche y derivados. ● Interpretación de los resultados y su posterior cálculo. ● Presentación de informes y toma de acciones correctivas. 2-ALCANCE Este protocolo se aplica para la toma de muestra y el análisis microbiológico de Leche y derivados. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 PRINCIPIO DEL MÉTODO La leche es la secreción mamaria normal de animales lecheros obtenida mediante uno o más ordeños sin ningún tipo de adición o extracción, destinada al consumo en forma de leche líquida o a elaboración ulterior. Se define a la leche como producto íntegro, no alterado, ni adulterado y calostros del ordeño higiénico, regular, completo e ininterrumpido de vacas sanas y bien alimentadas. La composición media de la leche de vaca es la siguiente: agua: 87%, proteínas: 3,5%, lípidos: 3,5 – 4%, glúcidos: 5,1%, entre otras. Su pH está comprendido entre 6,5 y 6,7. Precisamente por su composición la leche es un medio excelente para el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos; composición y pH permiten el desarrollo de bacterias, mohos y levaduras. La leche constituye un producto altamente perecedero que, además puede ser vehículo de bacterias patógenas para el hombre (Mycobacterium tuberculosis, Brucella, Salmonella, Escherichia coli enteropatógeno, Listeria monocytogenes y otras). Con el fin de destruir esta flora, la leche se somete a un tratamiento térmico de pasteurización (62°C durante 30 minutos: pasteurización baja; 72°C durante 15 segundos: pasteurización alta). Definiciones básicas Leche natural: es el producto íntegro, no alterado ni adulterado, de la secreción de las glándulas mamarias de las hembras del ganado bovino obtenida por el ordeño higiénico, regular, completo e ininterrumpido de vacas sanas y libre de calostro; que no ha sido sometida a ningún tratamiento a excepción del filtrado y/o enfriamiento, y está exento de color, olor, sabor y consistencia anormales; Leche pasteurizada: la leche de vaca entera, semidescremada o descremada, que ha sido sometida a un proceso de calentamiento en condiciones de temperatura y tiempo que aseguren la total destrucción de la microflora patógena y casi la totalidad de la microflora no patógena. El tratamiento térmico de la leche pasteurizada es de 72 a 75 °C durante 15 a 20 segundos o su equivalente; Leche UHT: la leche de vaca entera, semidescremada o descremada, que ha sido sometida a un proceso de calentamiento o en condiciones de temperatura y tiempo que aseguren la total destrucción de la microflora patógena y casi la totalidad de la microflora no patógena. El tratamiento térmico de la leche ultrapasteurizada debe ser de 135 a 140 °C por un tiempo mínimo de 2 a 4 segundos o su equivalente; Leche en polvo: es el producto seco y pulverulento que se obtiene mediante la deshidratación de la leche natural, entera o total o parcialmente desanatada, sometida a UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 un tratamiento térmico equivalente, al menos, a la pasteurización y realizado en estado líquido antes o duranteel proceso de fabricación. Mantequilla: es el producto graso obtenido exclusivamente de leche o de nata de vaca, higienizadas. Muestreo Leche natural y leche pasteurizada: agitar la muestra en sus envases durante unos 20 segundos. En todos los casos abrir asépticamente y tomar la muestra asimismo con material estéril. Leche UHT: homogeneizar el contenido del envase invirtiéndolo varias veces. Limpiar y desinfectar la superficie con alcohol 70°C. Repetir la operación dos veces, cambiando de algodón. Abrir asépticamente y tomar la muestra asimismo con material estéril. Yogur: antes del análisis, se fluidifica la muestra por agitación. Tomar la muestra en condiciones asépticas y utilizar como diluyente agua de triptona. Mantequilla: con la ayuda de un cuchillo o cualquier otro material estéril, colocar trozos de mantequilla en un tubo de centrífuga estéril, habiendo eliminado aproximadamente 1cm de la parte externa. Colocar la muestra en un baño maría regulado a 45°C. Cuando la mantequilla esté fundida, centrifugar la muestra a 1200 – 2000 rpm. Desechar la materia grasa y aprovechar la fase acuosa para el análisis. Queso: operar sobre la totalidad del queso, sin quitar la corteza. Con cuchillo estéril, tomar porciones de queso e introducirlas en el triturador homogeneizador. Añadir el diluyente (fosfato dipotásico al 2%) precalentando a 45 – 46°C. Triturar – homogeneizar. Número de muestra: Se deben tomar porciones o unidades de muestra de 200 mL en el caso que la muestra sea líquida y de 200 gramos como mínimo en el caso que la muestra sea sólida. Toma de muestras: Se deben tomar porciones recolectadas en recipientes estériles proveídos por el laboratorio. Deben ser transportadas en recipientes refrigerados en el caso que sea necesario. 4. INTERFERENCIAS Productos químicos y sustancias inhibidoras sobre la muestra. 5. SEGURIDAD Todos los alumnos deben cumplir con los estándares de seguridad, de la Facultad de UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Ciencias Químicas. 6. MEDIOAMBIENTE Todos los desechos generados deben llevarse al autoclave en recipientes correctamente rotulados antes de disponerlos. 7. MEDIOS DE CULTIVO Agar McC, Agar P.C.A, Agar Saboraud, Agua peptonada, Agar Baird Parker, Caldo selenito cistina, Agar Salmonella Shigella, Agar Kanamicina esculina ácida. Agua Destilada estéril 8- PROTOCOLO DE ANÁLISIS - Recuento de aerobio mesófilos - Investigación y recuento de coliforme fecal y total - Investigación y recuento de St. Aureus - Investigación de Salmonella - Investigación y recuento de hongo y levadura - Investigación y recuento de enterococos 9. PROCEDIMIENTOS 1 Se toman 25 gramos de la muestra, a los que se le agregan 225 ml de agua peptonada, y se procede según los diferentes métodos descritos. 2 Transporte: Para las muestras tales como la leche UHT, leche en polvo, las mismas se pueden transportar a temperatura ambiente. No así la leche cruda, leche pasteurizada, queso, mantequilla, etc, que se expenden en el comercio refrigerado y deben ser transportadas de ese modo hasta el laboratorio. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE GRASAS COMESTIBLES 1. OBJETIVO ● Realizar el análisis microbiológico de grasas comestibles. ● Enumerar las bacterias contaminantes de grasas comestibles. ● Interpretación de los resultados y su posterior cálculo. ● Presentación de informes y toma de acciones correctivas. 2. ALCANCE UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Este protocolo se aplica para la toma de muestra y el análisis microbiológico de grasas comestibles. 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO LAS GRASAS ALIMENTARIAS, DISTINTAS de la mantequilla, son: #Aceites y grasas vegetales: extraídos de granos oleaginosos y de frutos, se utilizan principalmente para el consumo humano como aceites de mesa y de fritura. #Grasas animales: se extraen principalmente de los tejidos adiposos de reserva. # Margarina: es una materia grasa, en gran parte de origen vegetal, que se prepara por fusión o emulsión y que tiene un aspecto de mantequilla. Contiene aproximadamente 16% de agua, y al menos 80% de materia grasa. La flora microbiana, concretamente de la margarina, es reflejo de la que se contienen las materias primas que la integran y del ambiente que rodea su proceso de elaboración. Si en su composición interviene la leche, existirán inicialmente gérmenes lácticos; si la leche es pasteurizada, sólo aportará un escaso número de bacterias esporuladas termorresistentes. La alteración más frecuente de la margarina se debe a la presencia de mohos y levaduras, aunque dicha alteración está controlada por el uso de la sal, por un pH adecuado en la fase acuosa y por la presencia de conservantes autorizados. Cladosporium butyri produce por ejemplo ranciedad cetónica y Candida lipolytica provoca hidrólisis de la grasa. Las grasas se alteran escasamente por microorganismos y sufren todo daños físico químico ajenos a la flora microbiana. Sin embargo, los gérmenes lipolíticos pueden dar lugar a hidrólisis y oxidaciones. Definiciones Grasas comestibles: son los productos de origen animal, vegetal o sus mezclas que reúnan las características y especificaciones exigidas por la Reglamentación (Real Decreto 1011/1981) y cuyos componentes principales sean glicéridos de los ácidos grasos, si bien pueden contener otros componentes menores. Grasas animales: obtenidas a partir de diversos depósitos adiposos de determinados animales en adecuado estado sanitario. Ejemplo: Manteca de cerdo: es la grasa obtenida grasas vegetales: son las obtenidas por distintos procedimientos, de frutos o semillas sanos y limpios. Margarina: es el alimento extensible, en forma de emulsión líquida o plástica, usualmente del tipo agua- aceite, obtenida principalmente a partir de grasas y aceites comestibles que no proceden fundamentalmente de la leche. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 MUESTREO La muestra de margarina se toma, asépticamente, de la misma forma que la de mantequilla. Otras materias grasas, según el caso, se toman con cuchillos asépticamente. La margarina se conservará en frío a 5°C, los otros productos se pueden mantener a temperatura ambiente. El análisis se efectuará dentro de las 24 horas. Número de muestra: Se deben tomar porciones o unidades de muestra de 200 mL en el caso que la muestra sea líquida y de 200 gramos como mínimo en el caso que la muestra sea sólida. Toma de muestras: Se deben tomar porciones recolectadas en recipientes estériles proveídos por el laboratorio. Deben ser transportadas en recipientes refrigerados en el caso que sea necesario. 4. INTERFERENCIAS Productos químicos y sustancias inhibidoras sobre la muestra. 5. SEGURIDAD Todos los alumnos deben cumplir con los estándares de seguridad de la Facultad de Ciencias Químicas. 6. MEDIOAMBIENTE Todos los desechos generados deben llevarse al autoclave en recipientes correctamente rotulados antes de disponerlos. 7. MEDIOS DE CULTIVO Agar PCA 2- Agar EMB- 3- Agar Baird Parker 5- Agar XLD 6- Agar Saboraud 8. PROCEDIMIENTO 1- Se toman 25 gramos de la muestra, a los que se le agregan 225 ml de agua peptonada, y se procede a realizar las diluciones correspondientes . ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE HUEVOS Y DERIVADOS 1. OBJETIVOS ● Describir técnica de muestreo de huevos y derivados ● Determinar la presencia de microorganismos contaminante UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 ● Realizar el conteo de microorganismos contaminantes por el método de vertido en placa. 2. ALCANCE Este procedimiento se aplica a la toma de muestra de, huevos y derivadosComo el análisis microbiológico y la interpretación de resultados. 3. PRINCIPIO DEL MÉTODO El huevo como alimento, puede ser considerado como la proteína más perfecta. Para la alimentación humana se utilizan, generalmente, huevos de gallina. El valor del pH del huevo de gallina recién puesto es de 7,6 a 7,9. El huevo de gallina en el momento de la puesta es normalmente estéril y su estructura y composición ofrecen una protección eficaz frente a las contaminaciones microbianas, a no ser que se haya infectado en forma congénita, principalmente con ciertas especies de Salmonella. La contaminación se produce habitualmente después de la puesta, cuando los microorganismos presentes en la superficie externa de la cáscara intentan vencer las barreras defensivas naturales del huevo para penetrar en su interior y así poder alterarlo. También puede ocurrir que el huevo se contamine en el ovario o en el oviducto durante su formación. La yema por su composición y otras propiedades, constituye un excelente medio de cultivo para los microorganismos y está rodeada de unas barreras de protección que evita su contacto con el exterior. Según se va envejeciendo, el huevo pierde gas carbónico y agua espontáneamente por sus poros. Esto da lugar al aumento de la cámara de gas. Aproximadamente 10 días después de la puesta, la yema, debido a su poca densidad por su riqueza en materia grasa, tiende a elevarse de tal forma que si el huevo está en posición horizontal, contactará directamente con las membrana de la cáscara y su contaminación será inmediata, al no existir protección de la clara; de lo contrario los huevos que se conservan con el extremo estrecho hacia abajo tienen la yema protegida por la cámara de aire, que la mantiene alejada de la cáscara 3. MATERIAL NECESARIO EN EL MUESTREO. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Envases para la toma de muestra deberán estar perfectamente limpios, secos y estériles. Su tamaño guardará relación con la muestra que se vaya a tomar. Serán herméticos e inaccesibles a cualquier contaminación posterior a su esterilización. Se pueden utilizar: - Envase de vidrio de boca ancha - Envases de plásticos esterilizables. - Bolsa de plástico estériles. 4. CONDICIONES PARA EL MUESTREO Para obtener la muestra representativa que se va a analizar posteriormente en el laboratorio, se deben cumplir ciertas condiciones: La persona destinada a hacer el muestreo debe conocer perfectamente la finalidad del muestreo, por lo que estará bien entrenada para actuar como corresponda en cada caso. Las unidades de muestra se tomarán desde sus envases originales. Cuando los envases son muy grandes y difíciles de transportar, se toman asépticamente muestras representativas y se pasan a envases estériles más pequeños. TOMA DE MUESTRA La muestra de productos frescos sin cáscara se debe analizar rápidamente. Si el transporte al laboratorio excede de 20 minutos, es aconsejable congelar la muestra. . Huevo con cáscara: Provistos con guantes, lavar y cepillar suavemente los huevos con agua jabonosa. Aclarar con agua limpia y sumergirlos en baño de alcohol al 70 % durante 10 minutos. Con guantes estériles. Extraer el huevo rompiendo la cáscara con material estéril. Si es necesario separar la clara y la yema. TAMAÑO DE LA MUESTRA Mínimo 200 ml o gramo de muestra. 5. TRANSPORTE Si no fuera posible el análisis inmediato de la muestra, la misma se transportará refrigerada. 6. PROTOCOLO PARA EL ANALISIS UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 -Recuento de colonias aerobias a 37ºC. -Investigación y recuento de coliformes Totales y Fecales -Identificación de Escherichia coli. -Investigación de Salmonella. -Recuento de mohos y levaduras 7. MEDIOS DE CULTIVO - PCA: 2 diluciones - Agar VRBA (coliformes totales a 37ºC) - Agar VRBA (coliformes fecales a 45ºC) - Agar EMB: Confirmación de E. coli. - Caldo Selenito Cistina 37 ° (Salmonella) - Agar XLD (Salmonella a 37 °C). -Agar Sab. 8. INSPECCIÓN VISUAL El examen del contenido en grandes recipientes de productos secos puede proporcionar valiosa información sobre las condiciones de un lote. Observar la presencia de cualquier tipo de impurezas presentes, informar y tomar las acciones correctivas UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE CEREALES Y PRODUCTOS DERIVADOS 1. OBJETIVO Realizar el análisis microbiológico de Cereales y productos derivados Enumerar las bacterias contaminantes de Cereales y productos derivados. Interpretación de los resultados y su posterior cálculo. Presentación de informes y toma de acciones correctivas. 2.0 ALCANCE Este protocolo se aplica para la toma de muestra y el análisis microbiológico de Cereales y productos derivados 3.0 PRINCIPIO DEL MÉTODO Entre los cereales que dan granos pueden citarse el maíz, el mijo, el sorgo, la cebada, el trigo y el arroz; productos a base de cereales son la harina, los copos de maíz, la sémola, el pan, que se hacen con la pasta, y los que se cuecen en el horno. La microflora que contienen los granos de cereal proviene del aire, del suelo y de los animales. El número y los tipos de organismos que pueden encontrarse en una determinada muestra de granos depende de varios factores, como el clima, el suelo, elmedio biológico (aves, insectos y roedores), los procedimientos y el material utilizados para su recolección, transporte y almacenamiento. Los mohos, levaduras y casi todas las bacterias aerobias mesófilas que se encuentran en los granos crudos son endógenos, y se desarrollan en el tejido vegetal de la propia planta; la presencia del E. coli y de las bacterias coliformes es debida a la contaminación causada por el hombre, las aves y los roedores. La supervivencia en el grano de los microorganismos depende de la humedad y de la temperatura. Una fuerte humedad es favorable al desarrollo de los mohos, aunque se ha observado que el desarrollo microbiano es más fácil en la harina que en el grano entero, siempre que la humedad sea la misma en ambos. La microflora que contienen los granos de los cereales es la principal fuente de los microorganismos de la harina y de otros productos molidos. Otras fuentes de contaminación son los medios de transporte, los aparatos de descarga de los molinos, el material de elaboración, etc. El número de bacterias contenidas en la harina, en general Flavobacterium, Aerobacter, Staphylococcus, etc., puede variar de 20.000 a 5 000 000 por gramo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 Puede contener también un número apreciable de esporas de mohos, diversos tipos de levaduras y ciertas bacterias anaeróbicas, como el Clostridium butyricum. MUESTREO Inspección visual: Para los productos tales como harina, fécula, etc., es muy importante la inspección visual. El examen contenido en sacos o grandes recipientes de productos secos es un procedimiento muy sencillo y eficaz que puede proporcionar valiosa información sobre las condiciones de un lote de alimentos. Para ello, el inspector que toma la muestra, emplea un tamiz portátil grande provisto de un marco de metal como soporte, vacía el contenido del saco o el recipiente sobre el tamiz, poco a poco agitándolo a mano. Cualquier insecto vivo o muerto, heces de roedores, caerá a través de la malla sobre una bandeja o un trozo de papel y se podrá examinar macroscópicamente. Debe examinarse el contenido completo del saco, lata o recipiente donde sea probable que ciertos tipos de suciedad se encuentren en el fondo. El inspector debe informar además, sobre cualquierade los adulterantes que sean demasiado grandes para pasar el tamiz. El resultado del tamizado debe enviarse como muestra o prueba aparte, junto con las observaciones del inspector. Número de muestra Tamaño: Se deben tomar porciones o unidades de muestra de 200 gramos como mínimo. Toma de muestra Se deben tomar porciones recolectadas en recipientes estériles proveídos por el laboratorio. En caso de las muestras rellenas con crema o las pastas frescas rellenas, es importante tomar la parte del relleno, ya que es en esa porción donde se encuentra el mayor riesgo 4. INTERFERENCIAS Productos químicos y sustancias inhibidoras sobre la muestra. 5. SEGURIDAD Todos los alumnos deben cumplir con los estándares de seguridad de la Facultad de Ciencias Químicas. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 6. MEDIOAMBIENTE Todos los desechos generados deben llevarse al autoclave en recipientes correctamente rotulados antes de disponerlos. 7. MEDIOS DE CULTIVO .1 Agar E.M.B .2 Agar P.C.A 3 Agar Saboraud 4 Agua peptonada 5 Agar Baird Parker 6 Caldo selenito Cistina 7 Agar Salmonella Shigella 8 Agar Bacillus Cereus 8. PROCEDIMIENTOS 1 Se toman 25 gramos de la muestra, a los que se le agregan 225 ml de agua peptonada, y se procede según los diferentes métodos descritos. 2 Transporte: Para las muestras tales como la harina, fécula, productos de panadería o de confitería, las muestras se pueden transportar a temperatura ambiente. No así las pastas frescas rellenas, que se expenden en el comercio refrigeradas y deben ser transportadas de ese modo hasta el laboratorio. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ENLATADOS Y CONSERVAS 1. OBJETIVOS ● Describir técnica de muestreo de enlatados y conservas ● Determinar la presencia de microorganismos contaminante ● Realizar el conteo de microorganismos contaminantes por el método de vertido en placa. 2. ALCANCE Este procedimiento se aplica a la toma de muestra de, enlatados y conservas. Como al análisis microbiológico y la interpretación de resultados. 3.PRINCIPIO DEL MÉTODO Con respecto a la calidad higiénica sanitaria de las conservas, por lo general solo existen riesgos de toxiinfección alimentaria en aquellas de pH superior a 4.5 (no ácidas). Las de pH inferior a 4,5 sólo excepcionalmente permite el crecimiento de bacterias patógenas o toxigénicas. El crecimiento de gérmenes patógenos en una conserva altera, habitualmente, sus caracteres organolépticos por lo que el propio consumidor lo rechaza. Esto no siempre es así, puesto que a veces aunque el producto no esté alterado aparentemente, contiene flora patógena, circunstancia que supone un enorme riesgo. Es el caso, por ejemplo de la presencia de Clostridium botulinum tipo A,B y E, capaces de multiplicarse y elaborar toxinas, así como de Staphylococcus aureus enterotoxigénico que, igualmente, podría producir enterotoxina estafilocócica al tener oportunidad de multiplicarse en el producto. Respecto al Clostridium botulinum, concretamente, si el microorganismo logra multiplicarse abundantemente en una conserva que reúna las condiciones óptimas para ello, se produce la alteración de los caracteres organolépticas del producto envasado, modificándose su consistencia por desintegración de las proteínas dando lugar a olor pútrido y desprendimiento de gas que ocasiona el abombamiento del envase. Si por el contrario, el crecimiento de Clostridium botulinum es moderado, puede ocurrir que los caracteres organolépticos del contenido sean aparentemente normales, a pesar deque la cantidad de toxina botulínica elaborada sea suficientemente para producir intoxicación. Esto puede darse en cualquier tipo de conserva de pH superior a 4,5 y es interesante señalar que en conservas de pescado causantes de brotes de botulismo, la mayoría de las veces no existe alteración del envase ni del producto envasado. Para el UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 desarrollo y multiplicación de Cl. Botulinum en las conservas influyen decisivamente algunas condiciones: a- Capacidad del alimento para que se pueda desarrollar en él esta especie bacteriana, de acuerdo con: - La calidad nutritiva del sustrato - El valor del pH. - Característica del material de envase: existen datos sobre la influencia favorable del lacado de la superficie interna del envase para la elaboración de toxina botulínica. b- Características Toxígenas de la cepa de Cl. Botulinum. Unas toxinas ejercen efecto a diluciones más altas que otras. c- Cantidad de inóculo presente en la conserva d- Posibilidad de asociación microbiana acompañante que, al crecer, modifique el pH del sustrato haciendo posible el crecimiento de Cl. Botulinum inhibido por el pH anterior. e- Inhibición por causas ajenas al pH: Baja actividad de agua, tasa de cloruro de sodio y nitrito incompatibles con el crecimiento de Cl. Botulinum, concentración elevada de azúcar, etc. La presencia de Staphylococcus aureus enterotoxigènico revivificable en una conserva se debe a fisuras o micro fugas en el envase al igual que otra flora bacteriana como coliformes. Hay que señalar que, respecto a otras bacterias, existen datos en cuanto a la presencia de Salmonella en productos conservados que han sido causa de brotes de toxiinfecciones alimentarias, a veces por Salmonella tiphy presente en el agua de enfriado y que penetró en la conserva a través de micro fugas. 4.0 MATERIAL NECESARIO EN EL MUESTREO. Los envases para la toma de muestra deberán estar perfectamente limpios, secos y estériles. Su tamaño guardará relación con la muestra que se vaya a tomar. Serán UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022 herméticos e inaccesibles a cualquier contaminación posterior a su esterilización. Se pueden utilizar: - Envase de vidrio de boca ancha - Envases de plásticos esterilizables. - Bolsa de plástico estériles. 5.0 CONTROL MICROBIOLÒGICO DE LAS CONSERVAS Este control se establece a dos niveles: Control de rutina para comprobar que las conservas no han sufrido modificaciones después de haber sido sometidas a una incubación previa: Control de Estabilidad. Control completo realizado generalmente cuando existan problemas de alteración o si se desea poner a punto un baremo de esterilización: Control de esterilidad. 6.0 TOMA DE MUESTRA 6.1 Control de Estabilidad: Se trata de un control simplificado con el que se logra analizar un considerable número de muestras. Consiste en someter a incubación parte de las muestras del mismo lote que se va a controlar, con el fin de comprobar posteriormente si se han producido modificaciones sensibles cuando se compara con una muestra del mismo lote no incubada y que sirve como testigo. Pasado el tiempo de incubación se procede: - Estudiar el aspecto del envase incubado - Comprobar si existe variación del pH. - Realizar un examen bacterioscópico del alimento con recuento de gérmenes. 6.2 Control de esterilidad: Constituye un análisis completo reservado, habitualmente a laboratorios especializados. Está indicado cuando, después del control de estabilidad, se ha manifestado una alteración positiva dudosa, o cuando se parte de conservas alteradas espontáneamente. Este control consiste en comprobar si el alimento conservado alberga microorganismos revivificables y, en caso positivo, determinar su naturaleza para poder explicar la falta de estabilidad. En el examen se comprueba: - La morfología de la flora microbiana revivificable UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN Facultad de Ciencias Químicas Lic. Química Industrial 2022
