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Princípios de Bioquímica de Lehninger - 6ª Ed. 2014

Exercícios resolvidos: Princípios de Bioquímica de Lehninger - 6ª Ed. 2014

David L Nelson, Michael M MIBSN: 9788582710722

Elaborado por professores e especialistas

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Exercício

Produção de DNA clonado. Quando liga dois ou mais fragmentos de DNA, um pesquisador pode ajustar a sequência na junção de vários modos diferentes, como será visto nos exercícios a seguir.

(a) Desenhe a estrutura de cada extremidade de um fragmento linear de DNA produzido por digestão com a enzima de restrição EcoRI (inclua aquelas sequências remanescentes da sequência de reconhecimento da enzima EcoRI).


(b) Desenhe a estrutura resultante da reação dessa sequência final com a DNA-polimerase I e os quatro desoxinucleosídeos trifosfatos (ver Figura 1).


(c) Desenhe a sequência produzida na junção que se forma se as duas extremidades com a estrutura obtida em (b) forem ligadas (ver Figura 2).


(d) Desenhe a estrutura produzida se a estrutura obtida em (a) for tratada com uma nuclease que degrade apenas DNA de fita simples.


(e) Desenhe a sequência da junção produzida se uma extremidade com a estrutura (b) for ligada a uma extremidade com a estrutura (d).


(f) Desenhe a estrutura da extremidade de um fragmento linear de DNA que foi produzido por digestão com a enzima de restrição PvuII (inclua aquelas sequências remanescentes da sequência de reconhecimento da enzima PvuII).


(g) Desenhe a sequência da junção produzida se uma extremidade com estrutura (b) estiver ligada a uma extremidade com a estrutura (f).


(h) Suponha que você sintetize um fragmento de DNA duplo curto com qualquer sequência desejada. Com esse fragmento sintético e os procedimentos descritos de (a) até (g), crie um protocolo que permita remover um sítio de restrição de EcoRI de uma molécula de DNA e incorporar um novo sítio de restrição de BamHI aproximadamente no mesmo local (ver Figura 3).


(i) Desenhe quatro fragmentos sintéticos curtos diferentes de DNA de fita dupla que permitam a ligação da estrutura (a) com um fragmento de DNA produzido por digestão com a enzima de restrição PstI. Em um desses fragmentos, desenhe a sequência de modo que a junção final contenha as sequências de reconhecimento tanto para EcoRI quanto para PstI. No segundo e terceiro fragmentos, desenhe a sequência de modo que a junção contenha apenas a sequência de reconhecimento EcoRI e PstI, respectivamente. Desenhe a sequência do quarto fragmento, de modo que nem EcoRI ou PstI apareçam na junção.

Passo 1 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

Neste exercício, o nosso objetivo é compreender como se dá a clonagem do DNA. Vamos então, recordar, de maneira geral, que a clonagem de DNA envolve os seguintes passos, preste muita atenção:

1. Cortar o DNA alvo em locais precisos;

2. Selecionar as moléculas transportadoras de DNA que vão realizar a autoreplicação (vetores de clonagem);

3. Juntar fragmentos de DNA a partir de ligações covalente (DNAs combinantes);

4. Adicionar o DNA em uma célula hospedeira;

5. Selecionar as células em que o hospedeiro realmente tem o DNA de interesse.

Passo 2 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

As técnicas necessárias para estes processos são chamadas de tecnologia de DNA recombinante.

Dois processos básicos ocorrem para produzir DNA recombinantes, relembre:

1. Endonucleases de restrição reconhecem algumas sequências específicas e clivam o DNA;

2. DNA-ligases são utilizadas para ligar as moléculas de DNA.

Para resolver o exercício é necessário observar as sequências de DNA pedidas, você pode verificar as estruturas básicas na figura 9-2, página 316. Então, acompanhe!

Passo 3 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

Primeiro, a partir das estruturas observadas na figura 9-2 tente desenhar as estruturas pedidas:

Passo 4 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

(a)

Estrutura linear de um DNA produzido pela digestão com a enzima de restrição EcoRI:

(5’) - - - G (3’)

(3’) - - - CTTAA (5’)

(5’) AATTC - - - (3’)

(3’) G - - - (5’)

Passo 5 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

(b)

Reação da estrutura resultante da sequência final com DNA-polimerase I e quatro ATPs:

(5’) - - - GAATT (3’)

(3’) - - - CTTAA (5’)

(5’) AATTC - - - (3’)

(3’) TTAAG - - - (5’)

Passo 6 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

(c)

Observe a figura 25-16, página 1024.

Desenhe a sequência produzida pela união de duas extremidades com a estrutura obtida na alternativa (b):

(5’) - - - GAATTAATTC - - - (3’)

(3’) - - - CTTAATTAAG - - - (5’)

Passo 7 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

(d)

Sequência produzida quando a estrutura obtida é tratada com nuclease e degrada uma fita do DNA:

(5’) - - - G (3’)

(3’) - - - C (5’)

(5’) C - - - (3’)

(3’) G - - - (5’)

Passo 8 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

(e)

União da extremidade da estrutura da alternativa (b) ligada à extremidade da alternativa (a):

(5’) - - - GAATTC - - - (3’)

(3’) - - - CTTAAG - - - (5’)

Passo 9 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

(f)

Extremidade de um fragmento linear de DNA que foi obtido a partir da digestão com a enzima de restrição PvuII:

(5’) - - - CAG (3’)

(3’) - - - GTC (5’)

(5’) CTG - - - (3’)

(3’) GAC - - - (5’)

Passo 10 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

(g)

União produzida pela extremidade da estrutura da alternativa (b) ligada a extremidade da estrutura da alternativa (f):

(5’) - - - CAGAATTC - - - (3’)

(3’) - - - GTCTTAAG - - - (5’)

(h)

Resolva este exercício agora, de acordo com os cinco passos descritos na introdução, não se esqueça de que há duas possibilidades de métodos.

Método 1:

1. Clive o DNA da EcoRI como na alternativa (a) deste exercício;

2. Ligue um fragmento de DNA produzido em laboratório. Use a sequência de reconhecimento da enzima BamHI.

Passo 11 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

Método 2:

1. Sintetize um fragmento como o mostrado abaixo:

(5’) AATTGGATCC (3’)

(3’) CCTAGGTTAA (5’)

2. Ligue este fragmento as extremidades coesivas geradas pela clivagem da EcoRI.

3. Os sítios serão introduzidos ao da BamHI.

Passo 12 de 12keyboard_arrow_downkeyboard_arrow_up

(): Observe a figura 9-2, página 16;

Note as estruturas básicas;

Monte as oito possibilidades de fragmentos mostradas abaixo:

(5’) AATTCNNNNCTGCA (3’)

(3’) GNNNNG (5’)

(5’) AATTCNNNNGTGCA (3’)

(3’) GNNNNC (5’)

(5’) AATTGNNNNCTGCA (3’)

(3’) CNNNNG (5’)

(5’) AATTGNNNNGTGCA (3’)

(3’) CNNNNC (5’)

Depoimentos de estudantes que já assinaram o Exercícios Resolvidos

Nathalia Nascimento fez um comentárioCEFET/RJ • Engenharia
Foi um apoio àquelas aulas que não acabam totalmente com as dúvidas ou mesmo naquele momento de aprender o conteúdo sozinha. Além disso, dispensou a necessidade de um orientador e por isso, permitiu que eu estudasse em qualquer local e hora.
Valdivam Cardozo fez um comentárioUFRB • Engenharia
Tive uma sensação maior de autonomia nos estudos, as vezes era frustante não conseguir resolver uma determinada questão e nem sempre os professores corrigem as listas que passam.