A molécula de glicose sofre inúmeras reações até se transformar em ácido pirúvico, gerando 2 ATPs e 2 NADH.
As etapas de produção de energia da glicólise envolvem reações de compostos de carbono 3 para produzir ATP e reduzir equivalentes como NADH. O primeiro substrato para a produção de energia é o gliceraldeído-3-fosfato, que reage com ADP, fosfato inorgânico e NAD em uma reação catalisada pela enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
A reação tem várias etapas. No primeiro, um carbono tiol da enzima ataca o carbono aldeído do gliceraldeído-3-fosfato para formar um intermediário tio-hemiacetal. (Lembre-se da química orgânica de que carbonos carbonos são pobres em elétrons e, portanto, podem se ligar a nucleófilos, incluindo tióis dos quais o próton é removido.) Em seguida, NAD aceita dois elétrons do gliceraldeído ‐ 3 ‐ fosfato ligado à enzima. O aldeído do substrato é oxidado ao nível de um ácido carboxílico neste passo. O fosfato inorgânico então desloca o grupo tiol no carbono oxidado (carbono 1 do gliceraldeído-3-fosfato) para formar o 1,3-bisfosfoglicerato.
Esta fase da glicólise traz o saldo de energia da glicose de volta a zero. Dois fosfatos de ATP foram investidos na produção de frutose ‐ 1,6 ‐ bisfosfato e dois agora são devolvidos, um de cada uma das unidades de 3 ‐ carbono resultantes da reação de aldolase.
O piruvato de fosfoenol, o produto da enolase, é incapaz de tautomerizar para a forma ceto devido ao grupo fosfato. (Lembre-se de química orgânica que tautômeros são compostos que reagem como se fossem compostos de dois componentes, diferindo apenas na colocação de um substituinte, como um átomo de hidrogênio.) Portanto, há uma grande mudança de energia livre negativa associada à liberação de o fosfato; a liberação de fosfato permite a formação do tautômero keto - isto é, do piruvato. Esta mudança de energia livre é mais que suficiente para fosforilar ADP para produzir ATP na reação catalisada pela piruvato quinase.
Assim, essa reação, que é altamente favorecida termodinamicamente, leva a glicólise a um saldo de energia positivo, porque são feitas duas ligações de ATP - uma de cada uma das unidades de 3-carbono da glicose.
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