Como ocorre o processo da técnica de pareamento de Frederick Sanger?

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A sequenciação de Sanger é o processo de incorporação seletiva de didesoxinucleotídeos de terminação de cadeia pela DNA polimerase durante a replicação do DNA in vitro; é o método mais amplamente utilizado para a detecção de SNVs. Como ambos os alelos de um locus autossômico são sequenciados concomitantemente e são exibidos como um eletroferograma analógico, o sequenciamento de Sanger é incapaz de detectar alelos em mosaico abaixo de um limiar de 15-20% e pode perder uma proporção significativa de baixa.

Como um método ortogonal, o sequenciamento Sanger fornece um meio para confirmar as variantes identificadas pelo NGS. Seria impraticável confirmar todas as variantes, dado o grande número de primers, reações e interpretações que seriam necessárias. No entanto, pode haver casos em que a veracidade de uma variante específica esteja em dúvida; por exemplo, chamadas variantes que são biologicamente implausíveis ou suspeitas de serem espúrias. O sequenciamento Sanger é o método mais fácil de resolver essas incertezas e, portanto, é um protocolo inestimável em qualquer laboratório de genômica clínica.

Em segundo lugar, o sequenciamento da Sanger fornece um meio de “corrigir” a cobertura de regiões que são mal cobertas pelo NGS. Nos testes de NGS direcionados, pode haver regiões que são resistentes ao sequenciamento, devido à má captação, amplificação ou outras idiossincrasias. Essas regiões geralmente são ricas em conteúdo de GC. Uma abordagem para restaurar a cobertura dessas áreas é aumentar a quantidade de DNA de entrada, mas a quantidade disponível pode ser limitada. Pode ser possível reprojetar a etapa de amplificação ou capturar reagentes ou, de outra forma, solucionar problemas da tecnologia NGS.