Explique o que são os efeitos “off-target” das nucleases Cas9 e quais as possíveis consequências destes efeitos.

Off-targets são tipo uma edição genética fora da sequencia escolhida. Ele edita fora da sequencia em que você queria deletar. Ela consegue editar a sequencia escolhida e ainda outras partes do DNA. Isso ocorre principalmente por causa do tamanho dos primers, já que é necessário poucos pares de bases. Isso proporciona um maior risco dele emparelhar-se com outra parte do DNA.

CRISPR-Cas9 é uma ferramenta excepcional, mas a tecnologia não é perfeita. Quando usado, às vezes produz inserções e deleções, conhecidos como indels, nos involuntários locais fora do alvo. Desde genes clivagens involuntários podem resultar em uma mutação inesperada, é crucial para detectar quaisquer erros no processo de CRISPR-Cas9.

No estudo, os investigadores identificaram locais dentro e fora do alvo clivado em vitro e frequências indefinidas medidas em centenas de locais alvos em células que poderiam tornar-se mutações não intencionais. Sua precisão é então registados com um sistema da equipa na IBS, que desenvolveu chamado o (índice de efeito fora do alvo) OTI singla em ingles de (Off-target Effect Index) que compara a proporção que está fora das frequências do alvo.

Ao contrário dos processos monoplex usados ​​anteriormente que só pode trabalhar com um sgRNA de cada vez, o multiplex Digenome-seq realiza a análise simultânea de vários sgRNAs para detectar todos os seus locais do alvo ativo e fora do alvo simultaneamente. Este processo multiplex é mais rápidos, mais eficiente e mais rentável do que métodos anteriores.